Summary
该协议提供了一种无酶方法,用于使用外植方法从腹肌成形和脂质酶样本中分离中质性干细胞。没有苛刻的酶或离心步骤提供了临床相关的干细胞,可用于体外研究或转回诊所。
Abstract
中位干细胞 (MSCs) 是一种多能细胞,可以从各种成人和胎儿组织(包括脂肪组织)中分离出来。作为临床相关的细胞类型,需要最佳方法在体外分离和扩展这些细胞。大多数分离脂肪衍生MSCs(ADSCs)的方法都依赖于苛刻的酶,如胶原酶,来消化脂肪组织。然而,虽然这些酶能有效地分解脂肪组织并产生高ADSC回收率,但价格昂贵,可能对ADSC产生不利影响,包括临床应用中使用异种基因成分的风险。该协议详细说明了从没有酶的新鲜脂化和腹肌成形样品中分离ADSCs的方法。简单地说,这种方法依赖于任何散装组织的机械分离,然后是外植型培养系统。ADSC 允许从组织迁移到组织培养板上,之后 ADSC 可在体外培养和扩展,用于任意数量的研究和/或临床应用。
Introduction
中位干细胞 (MSCs) 是一类多能的成人干细胞,可以从各种成人和胎儿组织(包括脂肪组织)中分离出来。这些细胞是一个有吸引力的细胞类型,无论是基础研究和临床应用,由于其可塑性,分化成所有生殖层在体外细胞,跨越异体屏障,家炎症区,并抑制炎症(在谢尔曼等人1)。脂肪衍生的MSCs(ASCs)特别有吸引力,因为它们易于获得,因为脂肪组织通常被认为是在常规抽脂和腹肌成形术后丢弃组织。然而,一旦获得,样品通常受到苛刻的条件 - 或酶条件或离心 - 以隔离ASCs2,3。此方法说明了在没有苛刻的酶或离心步骤的情况下,使用外植方法隔离 ASC 的简单过程。
分离ASC的最常见方法包括清洗脂肪样品,用胶原酶酶酶消化样品,使样品离心,最后在培养ASCs4之前裂解红血球。虽然有效隔离高产量的ASC,使用异种基因成分(例如,酶消化胶原酶)被认为是超过"最小操纵"由美国食品和药物管理局,并可能构成风险,如免疫反应,禁止在诊所5,6使用细胞。为了尽量减少异种性成分的风险,许多小组建议非动物衍生的,制造酶来消化脂肪组织。然而,这些酶仍然是苛刻的,并可以改变细胞表型7。
其他隔离ASC的方法包括高速离心,使用高达1,200 x g的力,以及涡旋来隔离ASC8。即使低至400 x g的力也足以隔离可行的ASCs9。虽然这些细胞确实产生大量的活细胞,但许多协议未能在14天8之后增殖。此外,机械分离产生的恢复细胞比酶消化少,但与其他细胞内源性到脂肪组织在通过0 10时,分离细胞的ASCs比例更高。
在更纯净、更可行的ASC种群的隔离,加上异种成分的成本和风险,使得酶消化对临床的翻译的吸引力越来越小。虽然机械隔离最初是一种有利的方法,但所使用的方法存在显著差异,加工的组织体积仅限于专用离心单元的大小,并且可能取决于操作员的一致性2。
虽然酶消化和离心都迅速产生大量的ASCs,这些孤立的细胞显示型板状变化,产生关于他们的行为的问题,当返回到患者2。因此,一些群体采用一种基于植物的ASC分离方法,即ASC从小块固体脂肪组织3、11、12中迁移出来。这种迁移可能是细胞被吸引到营养丰富的介质的影响。与其他MSC种群一样,ASC坚持使用塑料,在用过的组织培养基(下称成分)中存活和增殖,允许它们从其他细胞类型与脂肪组织分离。虽然最初恢复的细胞较少——通常需要>1周,直到细胞在组织培养板上可见——这些未操纵的ASC将在体外增殖,允许细胞扩展到临床相关卷11、12、13。
Protocol
罗格斯大学纽瓦克校区机构审查委员会(IRB)已批准使用脂吸性和腹肌成形性样品。
1. 组织培养的制备
- 在隔离 ASC 之前,无菌地准备 500 mL 的组织培养培养。要制备培养基,在 Dulbeco 的最小必需介质 (DMEM) 中加入 10% 定义的胎儿小牛血清 (FCS) 和青霉素-链霉素 (10,000 U/100 mL), 以及高葡萄糖和 2 mM L-谷氨酰胺。介质可在 4°C 下存储长达 3 周,应始终使用加热(室温至 37°C)。
- 如果干细胞培养首选不同的介质,请改为准备该介质。
2. 从脂肪组织分离ASC
- 获取脂吸量或腹肌成形样品。IRB批准后,按照各种外科手术获取丢弃组织等样本。将脂吸气者运送到实验室,无论外科医生在哪个容器内取出组织;在手术室标本袋或容器中运输腹肌切片。
- 如果不立即处理,将样品在室温下储存长达 6 小时或 4°C,长达 24 小时。超过上述时间处理的组织样本可能会降低细胞产量。通过添加1x无菌磷酸盐缓冲盐水,保持腹膜成形样品湿润。
- 从此时起,在无菌条件下,在层流罩中执行所有步骤。戴手套以进行人身保护。保持10%的漂白剂,70%的乙醇,和纸巾附近,以迅速清理任何生物泄漏。将任何多余的组织作为生物医学废物处理。
- 将样品切成 < 1 mm 件。如果腹肌块太大,无法使用,则在切碎之前,将可管理的组织大小从块中切下。将腹肌整形组织转移到无菌 100 mm 板的盖子上。使用无菌针头将一块组织放在原位,并使用无菌手术刀将大块切碎,通过切割或轻轻切碎散装组织来切碎。
- 脂分子通常不需要此步骤。然而,如果在脂蛋白中观察到大组织块,用无菌钳子去除这些块,并按照上述处理。
- 将组织转移到新鲜的管子中,将样品反转或摇动 5~6 次,以确保所有层的混合。可选:如果脂吸气已完全稳定,在混合前取出并丢弃油层。
- 将2.5~5 mL的组织转移到100毫米真空-气体血浆处理的组织培养板(材料表)。通过倒入新的离心管测量样品的体积。如有必要,使用无菌铲子帮助转移组织。
- 向板中加入同等体积的组织培养培养物。轻轻旋转板以混合内容物。
- 在5%CO2中孵育37°C的拍片,直到在板的底座上看到足够数量的细胞。随着时间的推移,细胞会从组织内迁移到板表面,此时它们会粘附在塑料上。当细胞离开组织时,细胞会以组织碎片周围的小簇出现。
- 每 24 小时,清除尽可能多的液体,并更换具有类似数量的介质。如果可能,将组织块留在原位。
- 一旦在板上记录到足够数量的细胞(>10组>15-25个细胞在板上)或7天后(以较早者为准),取出所有剩余的组织。
- 在组织培养基培养基培养中培养ASC,直到它们达到70%的汇合,或直到簇变得致密(在板上有5个密集的细胞簇,每个细胞的直径约为>500 μm),此时细胞将被传递。
3 ASC 文化
- 当母板达到约 70% 的汇合时,通过 ASC。注意避免 ASC 区域性的汇合。
- 用1倍磷酸盐缓冲盐水轻轻冲洗盘子,并试穿粘附细胞。为了试穿细胞,吸出磷酸盐缓冲盐水,并在每个板中加入1 mL的0.25%EDTA的胰蛋白酶,并在37°C孵育5分钟。5分钟后,通过显微镜确认去粘坚持。如果细胞仍然粘附,将细胞返回到孵化器再延长5分钟。
- 向板中加入少量介质(约占试金总体积的 25%),以停用胰蛋白酶,并使用介质/胰蛋白酶轻轻清洗板底。要洗净板,请以轻微角度握住板,然后轻轻地将介质/胰蛋白酶从板顶部向下移移,从板上松开任何每周连接的细胞。细胞可以以1:3的比例重新镀层,或以每板120,000-500,000个细胞的密度播种。
- 如果根据细胞计数进行播种,将胰蛋白酶/培养基从板转移到圆锥形离心管中,并在300 x g下离心7分钟,将细胞悬浮在组织培养基中(每个初始板约1 mL),并在播种前对细胞进行计数。要对细胞进行计数,将细胞悬浮液的 10 μL 转移到血细胞计中,并计算网格每个角落的 4 x 4 象限中的细胞。将这些值平均一起,并将该值乘以 104以计算单元格数。
- 在播种细胞之前,向板中添加介质。以滴落的方式加入细胞,然后旋转板,以确保均匀分布在板上。
注:在3个通道后,附着细胞应出现不对称和主轴形状。ASC表型和行为可以通过流式细胞测定和分化测定来确认。
- 使用流式细胞测定和微分测定确认ASC表型和行为
- 流动细胞仪
- 如上所述,收集和颗粒细胞。用1倍磷酸盐缓冲盐水清洗颗粒,用制造商推荐的抗体量标记细胞。流动细胞学的详细方案,一种常见的实验室程序,可以在这里找到12,14,15。
- 从下面选择表面标记面板以确认 ASC 表型:CD14、CD31、CD34、CD45 和 CD106 的负极;CD29、CD36、CD44、CD73、CD90 和 CD10516、17、18、19。CD36的存在和CD106的缺失从骨髓衍生的MSCs20中分辨ASCs。
- 差别化检测:使用MSC分化试剂盒确认多系分化。多个制造商提供试剂盒,用于确认异质性、骨性和软骨性分化能力。根据制造商的协议,每 3⁄4 天更换一次套件提供的介质,为期 3 周或直到观察到形态分化。
- 流动细胞仪
- 培养多个段落的细胞;所需的段落数量取决于应用程序。在每个段落中,使用上述细胞表面标记确认MSC细胞形态和表型,并确保多系分化能力没有丧失。虽然捐助者的扩张潜力不同,但大多数样本可以扩大至多6-9个段落。
- 冷冻保存细胞并储存在液氮中,以供将来使用。
4 ASC 的冷冻保存
- 准备 10 mL 的冷冻溶液 A 和 B。
- 对于冷冻溶液A,在高血糖的DMEM中加入20%的FCS。
- 对于冷冻溶液B,在高血糖的DMEM中加入20%的FCS和20%的二甲基硫化物(DMSO)。
- 在300 x g下离心5分钟,将细胞悬浮在少量冷冻溶液A中,并使用血细胞计对细胞进行计数,如步骤3.3.1。
- 计算细胞被重新悬浮的最终体积,最终细胞浓度达到500,000~1,000,000细胞/mL。使用冷冻溶液 A 将颗粒重新悬浮到最终体积的 50%。缓慢地加入相等体积的冷冻溶液B滴落,同时搅拌管达到最终细胞浓度。
- 立即将细胞冷冻在1⁄2 mL冷冻室中。将冷冻液冷冻在受控速率的冰柜或置于-80°C的冷冻容器中,使温度降低1°C/分钟。在受控冷冻(冷冻容器过夜)后,将细胞转移到液氮中,以便长期储存。
Representative Results
使用此处详细介绍的方法,ASC 成功地从脂质和腹肌成形性样本中分离出来(图 1)。在三个通道后,分离的细胞被发现具有MSC形态(不对称,主轴形状)和表型,类似于酶消化后的ASC(图2)。我们小组和其他小组先前的研究表明,这些ASC与其他MSC一样分化成脂肪细胞、骨细胞和神经元,包括通过其他方法分离的ASCs11,21。
在大多数情况下,ASC 迁移到组织培养板可以在 3-5 天内通过明亮的场显微镜进行可视化。但是,在某些情况下,只有稀疏的单元格在 7 天后可见。在极少数情况下,细胞不会迁移到板上和/或不会增殖,直到第三通道。这一结果通常与组织样本处理延迟相关。
图1:ASC分离与腹肌成形和脂量样品的原理表。在常规外科手术后,作为弃置组织获得腹肌和脂吸血样品。Abdominoplasty样品被切碎,之后在组织培养基中,将腹肌成形或脂花样作为外植。ASC 从组织中迁移出来,向营养丰富的介质迁移。1周后,去除外植,并培养ASCs,用于下游实验和/或临床应用。请点击此处查看此图的较大版本。
图2:具有MSC形态和表型的隔离ASC。通过无酶、除植方法分离的ASCs在通道3处具有MSC形态和表型。(A) 与其他 MSC 一样,这些 ASC 具有不对称的主轴形状,无论是通过外植方法还是酶法(例如胶原酶)进行隔离。使用酶法分离的ASCs与分离的ASC相比,产生更长、更窄的形态;后者更接近于从其他无酶分离方法衍生的MSCs,如骨髓衍生MSCs.(B)与其他MSCs一样,分离的分离ASC对CD45为阴性,对CD73、CD90和CD105为正。请点击此处查看此图的较大版本。
Discussion
ASC 是 MSC 的一个有吸引力的来源,因为组织易于访问。对于临床和研究应用,科学家在隔离和培养这些细胞时必须牢记捐赠者的变异性。由于尚未阐明的原因,来自不同捐助者的MSC表现出不同的体外增殖能力,这将随后影响ASC从脂肪外移和扩散能力中迁移。虽然从这些无酶外植株分离的ASCs达到汇合时间可以观察到变异性,但样品在体外不增殖的情况很少。
除了供体变异性之外,细胞在组织外迁移和/或体外增殖的最可能来源是组织在加工前储存的时间长度。当样品在加工前可坐至>12h时,或在收获和加工之间未保持湿润时,观察到较差的迁移和增殖率。唯一经常未能增殖的样本是未用盐水溶液保持湿润的腹肌分体样品:在这些情况下,组织块中心的组织通常足够潮湿,需要处理,但偶尔需要丢弃。因此,通过加工保持组织在收获时保持湿润至关重要。
在1周标记处未在板上观察到ASC的情况下,仍应从组织培养板中取出脂肪外植,以免发生组织坏死。有时,细胞太少,难以识别,但少数细胞能够在培养系统内扩展。如果细胞在3周内仍未观察到,隔离应视为失败。
在某些情况下,特别是腹肌整形,由于手术领域的局限性,不可能获得真正的无菌样品。如果无法使用无菌容器将组织从手术室运送到层流罩,则去除组织外部 1 厘米通常足以防止微生物污染。如果腹肌成形性样品附着在皮肤上,可以使用70%的乙醇擦拭皮肤,在切碎脂肪组织之前对表面进行消毒。
在切碎过程中,将组织切成小块,切成细碎,这一点至关重要。如果外植量过大,ASC 的表面面积将不足以从组织迁移到板中。此外,至关重要的是,组织不要留在板中任何时间超过必要的,以免组织成为坏死。
此方法的一个限制是使用酶(在所述协议中,胰蛋白酶)在组织培养过程中分离 ASCs。其他非动物衍生酶,如阿库塞酶,可以替代,以消除动物衍生产品的需求,然而,这将增加组织培养的成本。为此,许多团体正在研究非二维组织培养方法,如生物反应器和脚手架系统,以增加MSC的生长潜力,同时尽量减少从基质分离细胞22的需要。
将 ASC 转移到诊所时,植物外移隔离方法的一个主要限制是依赖于良好的制造实践 (GMP) 水平组织培养设施,而许多医疗中心缺乏这种设施。在这些情况下,需要采用任何自封闭、基于酶或离心的方法。然而,随着GMP设施越来越普遍,这种影响预计会受到限制。同时,即使缺乏GMP组织培养设施的此类设施也可以考虑使用外植方法在体外研究ASCs:操作越少,这些细胞就越类似于体内的同类细胞。
该方法提供了一种简单的方法,在没有苛刻的酶或离心步骤的情况下,将ASCs从脂肪组织(包括脂吸气和腹肌)中分离出来。虽然ASCs的初始产量低于其他方法,但ASC将在体外增殖,从而最大限度地减少初始产量降低的影响。缺乏过度或有力的操作使得ASCs以特别相关的方式被隔离,因为问题较少(即观察到的效果是细胞本身还是细胞在隔离过程中的操纵造成的).
Disclosures
作者没有什么可透露的
Acknowledgments
作者没有承认
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Dimethyl Sulfoxide | Fisher Bioreagents | BP231 | |
Dulbecco's Modified Eagle's Medium - high glucose | Sigma-Aldrich | D5671 | |
Falcon 3003 tissue culture plates | Corning | Corning | |
Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F2442 | serum is batch tested to ensure it supports MSC growth |
L-Glutamine solution | Sigma-Aldrich | G7513 | |
Mr. Frosty | Nalgene | 5100-0001 | |
Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
Trypsin-EDTA solution | Sigma-Aldrich | T4049 |
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