Summary
यह प्रोटोकॉल एक एक्सप्लांट विधि का उपयोग करके एडोमिनोप्लास्टी और लिपोएस्पिरेट नमूनों से मेसेनचिमल स्टेम कोशिकाओं को अलग करने के लिए एक एंजाइम-मुक्त विधि प्रदान करता है। कठोर एंजाइमों या केंद्रीकरण चरणों की अनुपस्थिति चिकित्सकीय रूप से प्रासंगिक स्टेम कोशिकाओं के लिए प्रदान करती है जिनका उपयोग विट्रो में अध्ययन के लिए किया जा सकता है या क्लिनिक में वापस स्थानांतरित किया जा सकता है।
Abstract
मेसेनचिमल स्टेम सेल (एमएससी) बहुशक्तिशाली कोशिकाओं की आबादी है जिसे विभिन्न वयस्क और भ्रूण ऊतकों से अलग किया जा सकता है, जिसमें एडीपोस ऊतक शामिल हैं। एक चिकित्सकीय प्रासंगिक सेल प्रकार के रूप में, इन कोशिकाओं को विट्रो में अलग-थलग और विस्तारित करने के लिए इष्टतम तरीकों की आवश्यकता होती है। एडीपोज-व्युत्पन्न एमएससी (एडीएससी) को अलग करने के अधिकांश तरीके एडीपोज ऊतक को पचाने के लिए कोलेजेनेस जैसे कठोर एंजाइमों पर भरोसा करते हैं। हालांकि, जबकि नीचे एडीपोज ऊतक को तोड़ने और एक उच्च ADSC वसूली उपज पर प्रभावी, इन एंजाइमों महंगे है और एडीएससी पर हानिकारक प्रभाव हो सकता है-नैदानिक अनुप्रयोगों में xenogeneic घटकों का उपयोग करने के जोखिम भी शामिल है । यह प्रोटोकॉल एंजाइमों के बिना ताजा लिपोएस्पिरेट और एडोमिनोप्लास्टी नमूनों से एडीएससी को अलग करने की विधि का विवरण देता है। संक्षेप में, यह विधि किसी भी थोक ऊतक के यांत्रिक असंबद्धता पर निर्भर करती है जिसके बाद एक एक्सप्लांट-प्रकार की संस्कृति प्रणाली होती है। एडीएससी को ऊतक से बाहर और ऊतक संस्कृति प्लेट पर स्थानांतरित करने की अनुमति है, जिसके बाद एडीएससी को अनुसंधान और/या नैदानिक अनुप्रयोगों की संख्या के लिए विट्रो में सुसंस्कृत और विस्तारित किया जा सकता है ।
Introduction
मेसेनचिमल स्टेम सेल (एमएससी) बहुशक्तिशाली वयस्क स्टेम कोशिकाओं का एक वर्ग है जिसे विभिन्न वयस्क और भ्रूण ऊतकों से अलग किया जा सकता है, जिसमें एडीपोस ऊतक शामिल हैं। ये कोशिकाएं दोनों बुनियादी अनुसंधान और नैदानिक अनुप्रयोगों के लिए एक आकर्षक सेल प्रकार के लिए अपनी प्लास्टिसिटी के कारण विट्रो में सभी रोगाणु परतों की कोशिकाओं में अंतर करने के लिए, एलोजेनिक बाधाओं को पार, सूजन के क्षेत्रों के लिए घर, और सूजन को दबाने (शेरमेन, एट अल1में समीक्षा की) । एडीपोज-व्युत्पन्न एमएससी (एएससी) विशेष रूप से प्राप्त करने में आसानी के कारण अपील कर रहे हैं, क्योंकि एडीपोस ऊतक को आम तौर पर नियमित लिपोसक्शन और एडोमिनोप्लास्टी प्रक्रियाओं के बाद ऊतक को त्यागने माना जाता है। हालांकि, एक बार प्राप्त होने के बाद, नमूनों को आम तौर पर कठोर परिस्थितियों के अधीन किया जाता है - या तो एंजाइमैटिक स्थिति या केंद्रीकरण - एएससी2,3को अलग करने के लिए। यह विधि कठोर एंजाइमैटिक या सेंट्रलाइज्ड चरणों की अनुपस्थिति में एक्सप्लांट विधि का उपयोग करके एएससी को अलग करने के लिए एक सरल प्रक्रिया दिखाती है।
एएससी को अलग-थलग करने की सबसे आम विधि में एक एडिपोस नमूना धोना, नमूना कोलेजेनेस के साथ नमूना को पचाने, नमूने को केंद्रित करना, और अंत में एएससी4को अलग करने से पहले लाल रक्त कोशिकाओं को लाइजन करना शामिल है। जबकि ASCs की एक उच्च उपज को अलग करने में कुशल, विद्वेष घटकों के उपयोग (जैसे, कोलेजेनेज़ के साथ एंजाइमैमेटिक पाचन) से अधिक माना जाता है "ंयूनतम हेरफेर" अमेरिकी खाद्य एवं औषधि प्रशासन द्वारा, और इस तरह के प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के रूप में जोखिम पैदा कर सकते हैं, क्लिनिक5,6में कोशिकाओं के उपयोग पर रोक । ज़ेनोजेनिक घटकों के जोखिमों को कम करने के लिए, कई समूहों ने गैर-पशु व्युत्पन्न, निर्मित एंजाइमों को एडीपोस ऊतक को पचाने का सुझाव दिया है। हालांकि, ये एंजाइम अभी भी कठोर हैं, और सेल फेनोटाइप7को बदल सकते हैं।
एएससी को अलग-थलग करने के अन्य तरीकों में उच्च गति से केंद्रीकरण, 1,200 x ग्रामके रूप में उच्च बलों का उपयोग करना और एएससी8को अलग-थलग करने के लिए भंवर शामिल है। यहां तक कि 400 x ग्राम के रूप में कम के रूप में बलों व्यवहार्य ASCs9अलग करने में पर्याप्त थे । हालांकि ये कोशिकाएं बड़ी मात्रा में व्यवहार्य कोशिकाओं का उत्पादन करती हैं, लेकिन कई प्रोटोकॉल 14 दिनों8से अधिक पैदा करने में विफल रहे । इसके अलावा, यांत्रिक अलगाव एंजाइमैटिक पाचन की तुलना में कम बरामद कोशिकाओं की पैदावार करता है, लेकिन अलग-थलग कोशिकाओं का एक उच्च अनुपात एएससी था, जबकि अन्य कोशिकाएं 010के मार्ग पर ऊतक को कम करने के लिए एंडोजेनियस थीं।
कम समय में एएससी की एक शुद्ध, अधिक व्यवहार्य आबादी का अलगाव, ज़ेनोजेनिक घटकों की लागत और जोखिमों के साथ मिलकर, एंजाइमैटिक पाचन को कम और क्लिनिक में अनुवाद के लिए कम आकर्षक बनाता है। जबकि यांत्रिक अलगाव शुरू में एक अनुकूल दृष्टिकोण है, उपयोग किए जाने वाले तरीकों में महत्वपूर्ण असमानता है, और संसाधित ऊतक की मात्रा विशेष अपकेंद्रित्र इकाइयों के आकार तक सीमित है, और ऑपरेटर स्थिरता2पर निर्भर हो सकती है।
जबकि एंजाइमैटिक पाचन और केंद्रीकरण दोनों जल्दी से एएससी की उच्च मात्रा देते हैं, ये अलग-थलग कोशिकाएं फेनोटाइपिक परिवर्तन दिखाती हैं, जब एक रोगी2में लौटने पर उनके व्यवहार के बारे में सवाल उठते हैं। एएससी अलगाव की एक एक्सप्लांट-आधारित विधि, जैसा कि इस प्रोटोकॉल में वर्णित है, इस प्रकार कुछ समूहों द्वारा नियोजित किया जा रहा है, जिससे एएससी ठोस एडीपोस ऊतक3,11,12के छोटे टुकड़ों से बाहर निकल ते हैं। इस प्रवास की संभावना कोशिकाओं का एक प्रभाव है पोषक तत्वों से भरपूर मीडिया के लिए तैयार किया जा रहा है । एमएससी की अन्य आबादी की तरह, एएससी प्लास्टिक का पालन करते हैं, और उपयोग किए गए ऊतक संस्कृति मीडिया (नीचे घटकों) में जीवित और पैदा होते हैं, जो एडीपोस ऊतक से अन्य कोशिका प्रकारों से उनके अलगाव की अनुमति देते हैं। जबकि शुरू में कम कोशिकाएं बरामद की जाती हैं - अक्सर ऊतक संस्कृति प्लेट पर कोशिकाएं दिखाई न दें - ये अनछेड़छाड़ एएससी विट्रो में पैदा होंगे, कोशिकाओं को चिकित्सकीय रूप से प्रासंगिक मात्रा में विस्तारित करने की अनुमति देंगे11,12,13।
Protocol
लिपोएस्पिरेट और एडोमिनोप्लास्टी नमूनों के उपयोग को रटगर्स विश्वविद्यालय -नेवार्क कैंपस के संस्थागत समीक्षा बोर्ड (आईआरबी) द्वारा अनुमोदित किया गया है।
1. ऊतक संस्कृति मीडिया की तैयारी
- एएससी को अलग-थलग करने से पहले टिश्यू कल्चर मीडिया के 500 मिली0 मीटर को बाँझ तैयार करें। संस्कृति मीडिया को तैयार करने के लिए, उच्च ग्लूकोज और 2 एमएम एल-ग्लूटामाइन के साथ Dulbecco के न्यूनतम आवश्यक मीडिया (DMEM) में 10% परिभाषित भ्रूण बछड़ा सीरम (एफसीएस) और पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन (10,000 यू/100 एमएल) जोड़ें। मीडिया को 3 सप्ताह तक 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है और हमेशा गर्म (कमरे के तापमान के बीच 37 डिग्री सेल्सियस) का उपयोग किया जाना चाहिए।
- यदि स्टेम सेल की संस्कृति के लिए एक अलग मीडिया पसंद किया जाता है, तो उसके बजाय मीडिया तैयार करें।
2. एडीपोज ऊतक से एएससी का अलगाव
- लिपोएपाइरेट्स या एब्डोमिनोप्लास्टी नमूना (एस) प्राप्त करें। आईआरबी अनुमोदन के बाद, विभिन्न शल्य चिकित्सा प्रक्रियाओं के बाद ऊतक को त्यागने जैसे नमूने प्राप्त करें। लिपोएसमुद्री डाकुओं को प्रयोगशाला में ले जाएं जिस भी पोत सर्जन ने ऊतक को हटा दिया; एक ऑपरेटिंग रूम नमूना बैग या कंटेनर में परिवहन एडोमिनोप्लास्टी नमूने।
- यदि तुरंत प्रसंस्करण न हो तो 24 घंटे तक के लिए कमरे के तापमान पर या 4 डिग्री सेल्सियस तक नमूना स्टोर करें। उपरोक्त समय से परे संसाधित ऊतक नमूनों में कोशिका उपज कम होने की संभावना होगी। 1x बाँझ फॉस्फेट बफर्ड खारा के अलावा एडोमिनोप्लास्टी नमूनों को नम रखें।
- इस बिंदु के बाद से, असेप्टिक परिस्थितियों में एक लैमिनार प्रवाह हुड में सभी चरणों का संचालन करें। व्यक्तिगत सुरक्षा के लिए दस्ताने पहनें। किसी भी जैविक रिसाव को जल्दी से साफ करने के लिए 10% ब्लीच, 70% इथेनॉल और पेपर तौलिए को पास में रखें। बायोमेडिकल कचरे के रूप में किसी भी अतिरिक्त ऊतक का निपटारा किया।
- नमूनों को 1 मिमी टुकड़ों में कीमा। यदि एडोमिनोप्लास्टी ब्लॉक के साथ काम करने के लिए बहुत बड़ा है, तो कीमा से पहले ब्लॉक के ऊतकों के प्रबंधनीय आकार को काट दें। एडोमिनोप्लास्टी ऊतक को बाँझ 100 मिमी प्लेट के ढक्कन पर स्थानांतरित करें। जगह में ऊतक का एक टुकड़ा पकड़ और एक बाँझ स्केलपेल का उपयोग करने के लिए या तो काटने या धीरे थोक ऊतक के बंद टुकड़े काटने से टुकड़े कीमा का उपयोग करें ।
- यह कदम आम तौर पर lipoaspirates के लिए की जरूरत नहीं है । हालांकि, यदि लिपोएस्पिरेट में बड़े ऊतक का हिस्सा देखा जाता है, तो ऊपर की तरह बाँझ संदंश और प्रक्रिया के साथ ऐसे हिस्से को हटा दें।
- ऊतक को एक ताजा ट्यूब में स्थानांतरित करें और उलटा करें या सभी परतों का मिश्रण सुनिश्चित करने के लिए नमूना 5-6 बार हिलाएं। वैकल्पिक: यदि लिपोएस्पिरेट पूरी तरह से बस गया है, तो मिश्रण करने से पहले तेल की परत को हटा दें और त्याग दें।
- ऊतक के 2.5-5 मिलील को 100 मिमी वैक्यूम-गैस प्लाज्मा इलाज ऊतक संस्कृति प्लेट(सामग्री की तालिका)में स्थानांतरित करें। एक ताजा अपकेंद्रित्र ट्यूब में डालने के द्वारा नमूने की मात्रा को मापें। यदि आवश्यक हो, तो ऊतक को स्थानांतरित करने में सहायता करने के लिए बाँझ स्पैटुला का उपयोग करें।
- थाली में ऊतक संस्कृति मीडिया के बराबर मात्रा जोड़ें। सामग्री को मिलाने के लिए प्लेट को धीरे-धीरे भंवर करें।
- प्लेट के आधार पर पर्याप्त संख्या में कोशिकाएं देखने तक 5% सीओ2 में 37 डिग्री सेल्सियस पर पैट्स को इनक्यूबेट करें। समय के साथ, कोशिकाएं ऊतक के भीतर से प्लेट की सतह पर स्थानांतरित हो जाएंगी, जिस बिंदु पर वे प्लास्टिक का पालन करेंगे। जैसे ही वे ऊतक से बाहर निकलते हैं, कोशिकाएं ऊतक के टुकड़ों के चारों ओर छोटे समूहों के रूप में दिखाई देंगी।
- हर 24 एच, जितना संभव हो उतना तरल पदार्थ निकालें और मीडिया की एक समान राशि के साथ बदलें । यदि संभव हो तो ऊतक के टुकड़ों को जगह में छोड़ दें।
- एक बार प्लेट (प्लेट पर 15-25 कोशिकाओं के 10 समूह) या 7 दिनों के बाद, जो भी जल्दी हो, ऊतक के सभी शेष टुकड़ों को हटा दें।
- ऊतक संस्कृति मीडिया में एएससी संस्कृति जब तक वे ७०% संदेह तक पहुंचने या समूहों घने हो जाते है (>5 थाली पर कोशिकाओं के घने समूहों, लगभग > ५०० μm के व्यास के साथ प्रत्येक), जिस बिंदु पर कोशिकाओं को पारित किया जाना है ।
3 एएससी की संस्कृति
- एएससी पारित जब माता पिता की थाली लगभग 70% प्रवाह तक पहुंचता है। एएससी संस्कृतियों की अधिक से अधिक होने से बचने के लिए ध्यान रखें।
- धीरे-धीरे प्लेट को 1x फॉस्फेट बफर्ड खारा के साथ कुल्ला करें और अनुयायी कोशिकाओं को ट्रिप्सिने। कोशिकाओं को आप्फिंके करने के लिए, फॉस्फेट बफर्ड खारा को एस्पिरेट करें और प्रत्येक प्लेट में 0.25% ईटीए के साथ ट्राइप्सिन का 1 मिलील जोड़ें और 5 न्यूनतम के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। 5 मिन के बाद माइक्रोस्कोपी से डी-पालन की पुष्टि करें। यदि कोशिकाएं अभी भी अनुयायी हैं, तो कोशिकाओं को अतिरिक्त 5 मिन के लिए इनक्यूबेटर में वापस करें।
- ट्राइप्सिन को निष्क्रिय करने के लिए प्लेट में मीडिया की एक छोटी राशि (कुल ट्राइप्सिन वॉल्यूम का लगभग 25%) जोड़ें, और धीरे-धीरे मीडिया/ट्राइप्सिन का उपयोग करके प्लेट के आधार को धोएं। थाली को धोने के लिए, प्लेट को थोड़ा कोण पर पकड़ें और प्लेट के ऊपर से मीडिया/ट्राइप्सिन को धीरे से पिपेट करें, प्लेट से किसी भी साप्ताहिक संलग्न कोशिकाओं को ढीला करें। कोशिकाओं को 1:3 अनुपात में फिर से चढ़ाया जा सकता है या प्रति प्लेट 120,000-500,000 कोशिकाओं के घनत्व पर वरीयता दी जा सकती है।
- यदि कोशिका गणना के आधार पर सीडिंग करें, तो प्लेट से ट्राइप्सिन/मीडिया को शंकुअप ट्यूब में स्थानांतरित करें, और 7 मिन के लिए 300 x ग्राम पर केंद्रीकरण द्वारा कोशिकाओं को गोली मार दें। ऊतक संस्कृति मीडिया (लगभग 1 mL प्रति प्रारंभिक प्लेट) में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें और सीडिंग से पहले कोशिकाओं की गणना करें। कोशिकाओं को गिनने के लिए, सेल निलंबन के 10 माइक्रोन को हीमोसाइटोमीटर में स्थानांतरित करें और ग्रिड के प्रत्येक कोने में 4 x 4 क्वाड्रंट में मौजूद कोशिकाओं को गिनें। इन मूल्यों को एक साथ औसत करें और सेल संख्या की गणना करने के लिए मूल्य को 104 से गुणा करें।
- कोशिकाओं को बोने से पहले प्लेट में मीडिया जोड़ें। कोशिकाओं को ड्रॉपवाइज तरीके से जोड़ें और फिर प्लेट में वितरण सुनिश्चित करने के लिए प्लेट को भंवर करें।
नोट: 3 मार्ग के बाद, अनुयायी कोशिकाओं विषम और धुरी के आकार का दिखाई देना चाहिए । एएससी फेनोटाइप और व्यवहार प्रवाह साइटोमेट्री और भेदभाव परख का उपयोग कर पुष्टि की जा सकती है।
- प्रवाह साइटोमेट्री और भेदभाव परख ों का उपयोग करएएससी फेनोटाइप और व्यवहार की पुष्टि
- फ्लो साइटोमेट्री
- ऊपर वर्णित कोशिकाओं को इकट्ठा करें और गोली दें। 1x फॉस्फेट बफर्ड खारा के साथ पेलेट धोएं और निर्माता द्वारा एंटीबॉडी की अनुशंसित मात्रा के साथ कोशिकाओं को लेबल करें। प्रवाह साइटोमेट्री के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल, एक आम प्रयोगशाला प्रक्रिया, यहां12,14,15पाया जा सकता है ।
- एएससी फेनोटाइप की पुष्टि करने के लिए निम्नलिखित से सतह मार्कर पैनलों का चयन करें: सीडी 14, सीडी 31, सीडी 34, सीडी45 और सीडी 106 के लिए नकारात्मक; और CD29, CD36, CD44, CD73, CD90, और CD10516,17,18,19के लिए सकारात्मक . सीडी 36 की उपस्थिति और अस्थि मज्जा-व्युत्पन्न एमएससी20से सीडी 106 विचार एएससी की अनुपस्थिति।
- भेदभाव परख: एमएससी विभेदन किट का उपयोग करके बहुवंशीय भेदभाव की पुष्टि करें। किट कई निर्माताओं से उपलब्ध है एडीपोजेनिक, ऑस्टियोजेनिक, और कोन्ड्रोजेनिक भेदभाव क्षमता की पुष्टि करने के लिए । 3 सप्ताह के लिए निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार या रूपात्मक भेदभाव देखे जाने तक किट-प्रदान किए गए मीडिया को हर 3-4 दिनों में बदलें।
- फ्लो साइटोमेट्री
- कई मार्ग ों के लिए कोशिकाओं को संस्कृति; आवश्यक मार्ग की संख्या आवेदन (एस) पर निर्भर करेगी। प्रत्येक मार्ग पर, उपरोक्त सेल सतह मार्कर का उपयोग करके एमएससी सेल आकृति विज्ञान और फेनोटाइप की पुष्टि करें, और यह सुनिश्चित करें कि बहुवंशीय भेदभाव क्षमता खो नहीं गई है। जबकि विस्तार क्षमता दाताओं के बीच अलग है, सबसे नमूनों को 6-9 मार्ग तक के लिए विस्तारित किया जा सकता है ।
- क्रायोरनेस कोशिकाओं को संरक्षित करता है और भविष्य के उपयोग के लिए तरल नाइट्रोजन में स्टोर करता है।
4 एएससी का क्रायोप्रिजर्वेशन
- फ्रीजिंग सॉल्यूशंस ए और बी के 10 mL तैयार करें ।
- ठंड समाधान ए के लिए, उच्च ग्लूकोज के साथ डीएमईएम में 20% एफसीएस जोड़ें।
- फ्रीजिंग सॉल्यूशन बी के लिए, उच्च ग्लूकोज के साथ डीएमईएम में 20% एफसीएस और 20% डिमेथिल सल्फाइड (डीएमएसओ) जोड़ें।
- 5 मिन के लिए 300 x ग्राम पर अपकेंद्री द्वारा कोशिकाओं को गोली मार ें। ठंड समाधान ए की एक छोटी मात्रा में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें और चरण 3.3.1 के रूप में हीमोसाइटोमीटर का उपयोग करके कोशिकाओं को गिनें।
- अंतिम मात्रा की गणना करें कि कोशिकाओं को 500,000-1,000,000 कोशिकाओं/mL की अंतिम कोशिका एकाग्रता तक पहुंचने के लिए फिर से निलंबित किया जाएगा। उस अंतिम मात्रा के 50% में गोली को फिर से निलंबित करने के लिए ठंड समाधान ए का उपयोग करें। अंतिम सेल एकाग्रता तक पहुंचने के लिए ट्यूब को उत्तेजित करते हुए धीरे-धीरे ठंड समाधान बी ड्रॉपवाइज की बराबर मात्रा जोड़ें।
- कोशिकाओं को तुरंत 1-2 mL क्रायोवियल्स में फ्रीज करें। क्रायोवियल्स को नियंत्रित दर फ्रीजर में या -80 डिग्री सेल्सियस पर रखे गए फ्रीजिंग कंटेनर में फ्रीज कर दें, जिससे तापमान 1 डिग्री सेल्सियस/मिनट तक कम हो जाता है। नियंत्रित फ्रीज (ठंड कंटेनर के लिए रात भर) के बाद, कोशिकाओं को दीर्घकालिक भंडारण के लिए तरल नाइट्रोजन में स्थानांतरित करें।
Representative Results
यहां विस्तृत विधि का उपयोग करते हुए, एएससी को सफलतापूर्वक लिपोएस्पिरेट और एडोमिनोप्लास्टी नमूनों(चित्रा 1)से अलग किया गया था। तीन मार्गों के बाद, अलग कोशिकाओं में एमएससी आकृति विज्ञान (विषम, धुरी आकार) और फेनोटाइप पाया गया, जो एंजाइमैटिक पाचन(चित्रा 2)के बाद एएससी के समान है। हमारे समूह और अन्य लोगों के पूर्व अध्ययनों ने इन एएससी को अन्यसाधनों 11,21द्वारा अलग एएससी सहित अन्य एमएससी जैसे आदिपोसाइट्स, ऑस्टियोसाइट्स और न्यूरॉन्स में अंतर करने के लिए दिखाया है।
ज्यादातर मामलों में, ऊतक संस्कृति प्लेट पर एएससी माइग्रेशन उज्ज्वल क्षेत्र माइक्रोस्कोपी द्वारा 3-5 दिनों के भीतर कल्पना की जा सकती है। हालांकि, कुछ मामलों में, 7 दिनों के बाद केवल विरल कोशिकाएं दिखाई देंगी। दुर्लभ मामलों में, कोशिकाओं को थाली पर प्रवास नहीं होगा और/ यह परिणाम आम तौर पर ऊतक नमूने को संसाधित करने में देरी के साथ संबंधित होता है।
चित्रा 1: एएससी अलगाव का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व एडोमिनोप्लास्टी और लिपोएस्पिरेट नमूनों से। नियमित शल्य प्रक्रियाओं के बाद त्यागऊतक ऊतक के रूप में एब्डोमिनोप्लास्टी और लिपोएस्पिरेट नमूने प्राप्त किए गए थे। एडोमिनोप्लास्टी के नमूनों को कटा हुआ था, जिसके बाद या तो एब्डोमिनोप्लास्टी या लिपोएस्पिरेट नमूने ऊतक संस्कृति मीडिया में एक्सप्लांट के रूप में चढ़ाया गया था। एएससी ऊतक से बाहर चले गए, पोषक तत्वों से भरपूर मीडिया की ओर । 1 सप्ताह के बाद, एक्सप्लांट्स को हटा दिया गया और एएससी को डाउनस्ट्रीम प्रयोग और/या नैदानिक आवेदन के लिए सुसंस्कृत किया गया । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 2: एमएससी आकृति विज्ञान और फेनोटाइप के साथ अलग एएससी। एंजाइम मुक्त, एक्सप्लांट विधि से अलग एएससी में एक एमएससी आकृति विज्ञान और मार्ग 3 पर फेनोटाइप होता है। (क)अन्य एमएससी की तरह, इन एएससी में एक विषम, धुरी आकार होता है, चाहे वह एक्सप्लांट या एंजाइमेटिक विधि (जैसे, कोलेजेनेज) से अलग हो। एंजाइम विधि का उपयोग करअलग एएससी एक्सप्लांट अलग एएससी की तुलना में एक लंबी, संकरी आकृति विज्ञान उपज; बाद के करीब अन्य एंजाइम मुक्त अलगाव विधियों से प्राप्त एमएससी के समान है, जैसे बोन मैरो व्युत्पन्न-MSCs ।(B)अन्य एमएससी की तरह, एक्सप्लांट अलग एएससी CD45 के लिए नकारात्मक और CD73, CD90 और CD105 के लिए सकारात्मक हैं । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
Discussion
एएससी ऊतक की आसान पहुंच के कारण एमएससी का एक आकर्षक स्रोत है। दोनों नैदानिक और अनुसंधान अनुप्रयोगों के लिए, वैज्ञानिकों को ध्यान में दाता परिवर्तनशीलता सहन करना चाहिए जब अलग और इन कोशिकाओं को सफ़र । कारणों के लिए अभी तक स्पष्ट नहीं किया जाना है, विभिन्न दानदाताओं से MSCs विभिन्न क्षमताओं को दिखाने के लिए विट्रो में पैदा, जो बाद में एडीज एक्सप्लांट और प्रसार क्षमता से बाहर ASC के प्रवास को प्रभावित करेगा । जबकि परिवर्तनशीलता इन एंजाइम मुक्त explants से अलग ASCs के लिए लेता है में देखा जा सकता है संक्षेप तक पहुंचने के लिए, यह एक नमूना के लिए दुर्लभ था विट्रो में पैदा नहीं है ।
दाता परिवर्तनशीलता से परे, कोशिकाओं की विफलता का सबसे अधिक संभावना स्रोत ऊतक से बाहर प्रवास और/या विट्रो में पैदा समय की लंबाई है कि ऊतक प्रसंस्करण से पहले संग्रहीत किया गया था । जब नमूनों को प्रसंस्करण से पहले >12 h के लिए बैठने की अनुमति दी गई थी या कटाई और प्रसंस्करण के बीच नम नहीं रखा गया था, तो गरीब प्रवास और प्रसार दरों को देखा गया था । केवल नमूने जो अक्सर पैदा करने में विफल रहते थे, वे एडोमिनोप्लास्टी नमूने थे जिन्हें खारे समाधान के साथ नम नहीं रखा गया था: इन मामलों में, ऊतक ब्लॉक के केंद्र में ऊतक अक्सर प्रक्रिया करने के लिए पर्याप्त नम था, लेकिन कभी-कभी त्यागने की आवश्यकता होती थी। इस प्रकार प्रसंस्करण के माध्यम से फसल के समय से ऊतक को नम रखना महत्वपूर्ण है।
ऐसे मामलों में जहां एएससी 1 सप्ताह के निशान पर प्लेट पर नहीं देखे जाते हैं, एडिपोज एक्सप्लांट्स को अभी भी ऊतक संस्कृति प्लेटों से हटा दिया जाना चाहिए ऐसा न हो कि ऊतक परिगलन हो। कई बार आसानी से पहचानकरने के लिए बहुत कम कोशिकाएं होती हैं, लेकिन वे कुछ कोशिकाएं संस्कृति प्रणाली के भीतर विस्तार करने में सक्षम होंगी । यदि कोशिकाओं को अभी भी 3 सप्ताह में नहीं मनाया जाता है, तो अलगाव को विफल माना जाना चाहिए।
कुछ मामलों में, विशेष रूप से एडोमिनोप्लास्टी के, शल्य चिकित्सा क्षेत्र के भीतर सीमाओं के कारण वास्तव में असेप्टिक नमूना प्राप्त करना संभव नहीं है। यदि ऑपरेटिंग रूम से ऊतक को लेमिनार प्रवाह हुड तक ले जाने के लिए बाँझ पोत का उपयोग करना संभव नहीं है, तो ऊतक के बाहरी 1 सेमी को हटाना आम तौर पर सूक्ष्मजीव संदूषण को रोकने के लिए पर्याप्त है। यदि एडोमिनोप्लास्टी नमूना त्वचा से जुड़ा हुआ है, तो त्वचा को एडीपोज ऊतक की माँग करने से पहले उस सतह को स्टरलाइज करने के लिए 70% इथेनॉल के साथ मिटाया जा सकता है।
कीमा बनाने की प्रक्रिया के दौरान, यह महत्वपूर्ण है कि ऊतक छोटे, ठीक टुकड़ों में कीमा बनाया हुआ है। यदि एक्सप्लांट बहुत बड़े हैं, तो एएससी के लिए ऊतक से बाहर और प्लेट पर माइग्रेट करने के लिए अपर्याप्त सतह क्षेत्र होगा। इसके अलावा, यह महत्वपूर्ण है कि ऊतक प्लेट में आवश्यक से अधिक समय तक नहीं रहता है ऐसा न हो कि ऊतक परिगलित हो जाएं।
इस विधि की एक सीमा ऊतक संस्कृति प्रक्रिया के दौरान एएससी को अलग करने के लिए एंजाइम (वर्णित प्रोटोकॉल, ट्रिप्सिन में) का उपयोग है। पशु व्युत्पन्न उत्पादों की आवश्यकता को दूर करने के लिए अन्य गैर-पशु व्युत्पन्न एंजाइमों, जैसे कि एक्यूटेस को प्रतिस्थापित किया जा सकता है, हालांकि, इससे ऊतक संस्कृति की लागत में वृद्धि होगी। इस कारण से, दूसरों के अलावा, कई समूह एमएससी विकास क्षमता बढ़ाने के लिए गैर-दो आयामी ऊतक संस्कृति विधियों की जांच कर रहे हैं, जबकि कोशिकाओं को उनके सब्सट्रेट22से अलग करने की आवश्यकता को कम कर रहे हैं।
जब क्लिनिक के लिए ASCs चलती है, एक्सप्लांट अलगाव विधि की एक प्रमुख सीमा एक अच्छा विनिर्माण अभ्यास (जीएमपी) स्तर ऊतक संस्कृति सुविधा है, जो कई चिकित्सा केंद्रों की कमी पर निर्भरता है । इन मामलों में, किसी भी स्व-संलग्न वाणिज्यिक रूप से उपलब्ध एंजाइम-या केंद्रीकरण आधारित तरीकों को नियोजित करने की आवश्यकता होगी । हालांकि, जीएमपी सुविधाएं अधिक प्रचलित हो जाती हैं, इसलिए यह प्रभाव सीमित होने की उम्मीद है। इस बीच, जीएमपी ऊतक संस्कृति सुविधाओं की कमी वाली ऐसी सुविधाएं भी विट्रो में एएससी का अध्ययन करने के लिए एक्सप्लांट विधि का उपयोग करने पर विचार कर सकती हैं: कम हेरफेर, इन कोशिकाओं के समान उनके वीवो समकक्षों11में हैं।
कठोर एंजाइमों या केंद्रीकरण चरणों के अभाव में यह विधि एएससी को एडीपोस ऊतक से अलग करने का एक सरल तरीका प्रदान करती है - लिपोएपाइरेट्स और एडोमिनोप्लास्टी दोनों। जबकि एएससी की प्रारंभिक उपज अन्य तरीकों की तुलना में कम है, एएससी विट्रो में पैदा होगी, जिससे कम प्रारंभिक उपज के प्रभाव को कम किया जा सकेगा। अत्यधिक या सशक्त हेरफेर की कमी ASCs इस तरह के एक तरह से विशेष रूप से प्रासंगिक में अलग बनाता है, क्योंकि वहां कम सवाल कर रहे है (यानी, कि क्या मनाया प्रभाव कोशिकाओं को खुद को या अलगाव की प्रक्रिया के दौरान कोशिकाओं के हेरफेर के कारण कर रहे है ).
Disclosures
लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है
Acknowledgments
लेखकों को कोई पावती नहीं है
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dimethyl Sulfoxide | Fisher Bioreagents | BP231 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium - high glucose | Sigma-Aldrich | D5671 | |
| Falcon 3003 tissue culture plates | Corning | Corning | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F2442 | serum is batch tested to ensure it supports MSC growth |
| L-Glutamine solution | Sigma-Aldrich | G7513 | |
| Mr. Frosty | Nalgene | 5100-0001 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| Trypsin-EDTA solution | Sigma-Aldrich | T4049 |
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