Summary
Descriviamo un protocollo dettagliato per la valutazione dei profili tossicologici delle nanoparticelle di ossido di zinco (NO NP) in particolare, il tipo di morte cellulare nei fibroblasti polmonari MRC5 umani e la formazione di ROS nel farro della frutta Drosophila.
Abstract
Le nanoparticelle di ossido di zinco (NO NP) hanno un'ampia gamma di applicazioni, ma il numero di rapporti sulla tossicità associata a NP è cresciuto rapidamente negli ultimi anni. Tuttavia, gli studi che chiariscono i meccanismi sottostanti per la tossicità indotta da NP nO sono scarsi. Abbiamo determinato i profili di tossicità degli NP di nO utilizzando modelli sperimentali sia in vitro che in vivo. È stata osservata una significativa diminuzione della vitalità cellulare nei fibroblasti polmonari MRC5 esposti da NP, dimostrando che le NP di NO esercitano effetti citotossici. Allo stesso modo, è interessante notare che l'intestino esposto alle NP di NP ha mostrato un drammatico aumento dei livelli di specie reattive dell'ossigeno (ROS) nel moscerino della frutta Drosophila. Sono necessari studi più approfonditi per stabilire una valutazione del rischio per l'aumento dell'utilizzo da parte degli NP di NO da parte dei consumatori.
Introduction
La nanotecnologia si riferisce all'applicazione di materiali di dimensioni nanometriche che vengono utilizzati in tutti i campi scientifici, tra cui la medicina, la scienza dei materiali e la biochimica. Ad esempio, gli NP nO, noti per la loro dispersione ultravioletta, il rilevamento chimico e le proprietà antimicrobiche, nonché l'elevata conduttività elettrica, sono utilizzati nella produzione di vari prodotti di consumo come imballaggi alimentari, cosmetici, tessuti, gomme, batterie, catalizzatore per il trattamento del gas coda di automobili e applicazioni biomediche1,2,3.
Tuttavia, le fiorenti applicazioni dei prodotti basati su NP di NO, che hanno portato ad una maggiore esposizione umana alle NP di NO, hanno sollevato preoccupazioni sui loro potenziali effetti negativi sulla salute umana. Una serie di studi cellulari in vitro hanno dimostrato che nO NP può indurre stress ossidativo, citobilsia autofagia, infiammazione, e genotossicità4,5,6,7 . In particolare, si presume che la tossicità degli NP di NP sia causata dalla dissoluzione di n2 o 2 o più ioni, nonché dalla reattività superficiale di inibizione del trasporto iosilio4,7,9,10. È importante sottolineare che gli studi hanno dimostrato che la generazione di specie reattive dell'ossigeno (ROS) è uno dei meccanismi primari alla base della tossicità associata a NPs. È stato dimostrato che un'insufficiente attività antiossidante a seguito di un insulto AL ROS è stato dimostrato di essere responsabile di suscitare la citotossicità e il danno al DNA9. Gli effetti tossici delle NP di NO sono stati riportati anche in modelli animali, tra cui roditore1, pesce zebra11,12, così come l'invertebrato Drosophila13.
La Drosophila funge da modello animale alternativo consolidato per lo screening della tossicità di entità chimiche e nanomateriali (MN)14,15. È importante sottolineare che esistono alti livelli di somiglianza genetica e fisiologica tra l'uomo e la Drosophila che giustifica l'uso della Drosophila come modello in vivo per valutare le risposte biologiche ai contaminanti ambientali come le MMM 16. Inoltre, ci sono molti vantaggi dell'uso della Drosophila a causa delle sue piccole dimensioni, della sua breve durata, dell'amenabilità genetica e del mantenimento facile ed economico. Inoltre, la Drosophila è stata ampiamente adottata per lo studio della genetica, della biologia molecolare e dello sviluppo, sin da quando il suo genoma completo è stato completamente sequenziato anni fa nel 2000, rendendolo quindi adatto per una varietà di screening ad alto valore e per affrontare questioni biologiche irrisolte17,18,19,20,21. Negli ultimi anni, una serie di studi relativi all'immunotossicità utilizzando diversi tipi di NP in Drosophila sono stati segnalati15,22,23,24. Queste nuove conoscenze fondamentali ottenute dagli studi che utilizzano la Drosophila hanno contribuito a fornire maggiori informazioni sulla nostra comprensione della nanotossicologia.
ROS è un noto colpevole di citotossicità e genotossicità causata da NP, in particolare, NP a base metallica25. I ROS sono specie chimiche contenenti ossigeno con proprietà reattive più elevate rispetto all'ossigeno molecolare. I radicali liberi come il superossido radicale (O2-) e anche molecole non radicali come il perossido di idrogeno (H2O2)possono agire come ROS. In condizioni fisiologiche normali, sono tenuti a mantenere l'omeostasi cellulare26, tuttavia, un ROS eccessivo a causa della sovrapproduzione o della disregolazione del sistema di difesa antiossidante può causare stress ossidativo, che porta a danni alle proteine, lipidi e acido deossiribonucleico (DNA)27. Ad esempio, con l'aumento dei livelli di ROS e l'aumento del livello di glutathione (GSH) concomitante, l'interruzione della sintesi del triposfato di adenosina (ATP) avviene e il livello di dehydrogenasi in lattato (LDH) aumenta nel mezzo, culminando nella morte cellulare27.
Qui, forniamo protocolli per l'esecuzione di analisi cellulari e genetiche utilizzando cellule di mammiferi coltivati e Drosophila per determinare i potenziali effetti negativi delle NP nO. Nella figura 1è riportata una panoramica del metodo utilizzato per lo studio di tossicità degli NP nO.
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Protocol
1. Fluorescenza Activated Cell Sorting (FACS) Analisi su celle vissute / fisse
- Sonicato NP nO in sospensione per 15 min.
- Preparare gli NP nO a varie concentrazioni (ad esempio, 0, 10, 25, 50.100 e 200 g/mL) utilizzando una soluzione di stock di 1 mg/mL nO NP per il trattamento delle cellule coltivate.
- Semina MRC5 fibroblasti polmonari umani (1 x 105 cellule/bene) su una piastra di coltura 6-pozzio un giorno in anticipo, e poi trattare le cellule con 2 mL di NP nO (in triplicati) per 8 h, 16 h, e 24 h.
- Ad ogni punto temporale, raccogliere le cellule centrifugando a 300 x g per 5 min.
- Lavare i pellet cellulari due volte con salina tamponata da fosfato (PBS).
- Risospendere le celle con buffer di rilegatura 1x, composto da 0,1 M di idrossido di hePES/sodio (NaOH), 1,4 M di cloruro di sodio (NaCl) e 25 mM di cloruro di calcio (CaCl2), a una concentrazione di 1 x 105 celle per 100 .
- Aggiungere 5 -L L di isotoniociocianate (FITC) Annexin V macchia e 5 -L di macchie di DNA di iodio di propidium iodide (PI), e incubare le cellule per 15 min a temperatura ambiente (RT; 25 ) al buio.
- Ricaricare i campioni con un buffer di rilegatura aggiuntivo di 400 l of 1x prima di ordinare le celle in base alla citometria di flusso. Per ogni campione viene analizzato un minimo di 10.000 cellule.
- Tabulazione il grafico a barre utilizzando l'intensità mediana ottenuta.
2. Esposizione delle NP di znO alla Drosophila
- Aggiungere 1 mL di nanoparticelle a concentrazioni diverse in fiale, seguito da 9 mL di cibo a mosca per fare una concentrazione finale di 0,1 mg/mL, 0,25 mg/mL o 0,5 mg/mL nP.
- Mescolare accuratamente le nanoparticelle con il cibo nelle fiale utilizzando la pipetta.
- Lasciare raffreddare gli alimenti a mosca contenenti NP nO per almeno 2-3 h prima dell'uso.
- Introdurre adulti maschio e femmina vola nelle fiale per 5 giorni, e consentire loro di accoppiarsi e deporre le uova (che appaiono come macchie bianche) sulla superficie del cibo.
- Rimuovere le mosche parentali e consentire alle uova di subire un ulteriore sviluppo, che consiste in 4 diversi stadi di sviluppo (stadio embrionale, larvale, pupale e adulto).
3. Dissezione del volo
- Raccogliere larve a tarda 3rd instar dalla parete delle fiale per le analisi. Le uova appena deposte normalmente si sviluppano in larve instelle alla fine 3rd dopo 72-120 h a RT.
- Pulire il piatto di dissezione e riempire il pozzo con il mezzo di dissezione/PBS.
- Dissezionare le larve (più tardi 3rd instar) sotto lo stereoscopio, utilizzando un paio di pinze.
- Utilizzare la punta delle pinze per fare un piccolo foro e rompere aprire lo strato cuticola delle larve. Estrarre con attenzione l'intestino e metterlo in un tubo di microcentrifuga da 1,5 ml contenente il mezzo Drosophila di Schneider, prima della fase di fissaggio utilizzando 1 mL di 4% di paraformaldeide (PF).
- 3.5Fissare l'intestino in PF per 10 min a RT, per esperimenti successivi, come l'immunostaining.
4. Rilevamento ROS utilizzando la colorazione diHydroethidium (DHE)
- Trattare le larve con varie concentrazioni di NP nO come descritto al punto 2.1.
- Dopo la dissezione dell'intestino da 3rd larve instelle come descritto nella sezione 3, incubare l'intestino nel mezzo Drosophila di Schneider a RT prima di colorare i tessuti. Sciogliere 1 l l di colorante DHE (dalla concentrazione di magazzino di 30 mM) in 1 mL del mezzo di Schneider, facendo una concentrazione di lavoro finale di 10-30 M dy e DHE colorante.
- Incubare l'intestino per 5 min al buio, quindi lavare tre volte utilizzando il mezzo di Schneider per ogni 5 min.
- Fissare l'intestino con il 4% PF (passo opzionale) e montare l'intestino su vetrini di vetro, con un supporto di montaggio anti-dissolvenza contenente 4,6-diamidino.2-fenilondole (DAPI). Acquisire immagini al microscopio confocale.
5. Misurazione della fluorescenza mediante il software ImageJ
- Importare le immagini a fluorescenza acquisite mediante microscopia a fluorescenza o microscopia a scansione laser confocale nel software ImageJ.
- Fare clic sul menu Analizza e selezionare Imposta misure.
- Selezionare la misura di output, ad esempio l'intensità integrata dell'area e il valore medio del grigio.
- Fare clic su Misura.
- Selezionare un'area senza fluorescenza per impostare lo sfondo.
- Esportare i dati nel foglio di calcolo di Excel e determinare la fluorescenza totale delle celle (CTCF) corretta, utilizzando il calcolo come illustrato di seguito.
CTCF - Densità integrata - (Area della cella selezionata X Media fluorescenza delle letture di fondo) - Costruire un grafico a barre ed eseguire analisi statistiche.
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Representative Results
Le cellule esposte np sono state elaborate con il kit di reagente di colorazione delle cellule, seguito dallo smistamento delle celle utilizzando la citometria di flusso. Le celle trattate con NP nO (in basso, pannello destro) presentano una percentuale più alta di celle apoptotiche anticipate (R3) / tardive (R6) rispetto alle celle di controllo (R5, in basso, pannello sinistro). La morte necrotica delle cellule è indicata da R4 (in alto, pannello destro) (Figura 2). I risultati del test FITC/Annexin V sui fibroblasti MRC-5 trattati con NP sono riportati nella Figura 2.
Per gli esperimenti della Drosophila, sono stati aggiunti NP di tipo NO a varie concentrazioni per far volare il cibo in tubi da 10 mL e poi misti bene utilizzando un controller pipetta (Figura 3). Le larve del terzo posto più tardi raccolte dalle fiale sono state sezionate sotto lo stereoscopio. Le larve sono state prima lavate per rimuovere i resti del cibo rimanente (Figura 4). Lo strato di cuticola esterno è stato lacerato per esporre gli organi interni. L'intestino è stato identificato dal caratteristico aspetto lungo e semitrasparente (mentre altri organi appaiono opachi e giallochiaro chiaro al microscopio) (Figura 5). L'intestino è stato accuratamente rimosso, senza rompersi, e trasferito in un nuovo tubo di microcentrifuga contenente fissativo sul ghiaccio (Figura 6).
Per la quantificazione dell'intensità della fluorescenza come l'intensità della sonda DHE nell'intestino, le immagini sono state esportate in formato JPEG o TIFF e aperte con il software ImageJ. La parte dell'intestino per l'analisi è stata selezionata e identificata, ad esempio, la regione midgut o hindgut, ed è stata misurata l'intensità di fluorescenza della regione di interesse (ROI). Per confrontare le intensità relative dei diversi gruppi sperimentali, abbiamo impiegato lo stesso metodo quantitativo di microscopia confocale descritto nella sezione precedente. Per il confronto delle intensità di fluorescenza, il parametro è stato impostato utilizzando il controllo negativo non trattato. I calcoli dell'intensità del segnale sulla base delle intensità di calibrazione del controllo non trattato hanno permesso un confronto diretto tra diversi gruppi sperimentali. La figura 7 mostra l'intensità media del segnale DHE nell'intestino larvale a 3rd esposta a NP nO a concentrazioni diverse. L'intestino delle larve trattate con 0,5 mg/mL di trattamento con NP ha mostrato la più alta intensità di fluorescenza.
Le differenze di intensità relativa tra tutti i gruppi sperimentali sono state ulteriormente puntellate e sono state eseguite analisi statistiche, fornendo risultati sia qualitativi che quantitativi (Figura 8).
Figura 1: Panoramica del metodo utilizzato per lo studio di tossicità degli NP nO. Per il lavoro in vitro, le cellule trattate np di NO sono state macchiate prima dell'analisi della citometria di flusso. Per il lavoro in vivo, l'intestino è stato sezionato da 3larve instelle, seguito da colorazione DHE e acquisizione di immagini. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: grafico a punti di cellule separate in popolazioni diverse in base alla colorazione FITC e PE. I pittogrammi mostrano i risultati dell'analisi FITC/Annexin V con un trattamento di 24 ore su MRC-5. È quindi possibile eseguire un'analisi statistica delle cellule in fasi diverse. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Preparazione del mezzo di cibo a mosca contenente NP nO. (A) Gli ingredienti per il cibo a mosca vengono aggiunti all'acqua, lasciati gonfiare e bolliti per 5 min. (B) Dopo il raffreddamento a 50 gradi centigradi con agitazione, Nipagin è stato aggiunto e mescolato accuratamente. (C) Preparare un mix master per le nanoparticelle (volume totale non superiore al 10% del volume alimentare finale). (D) Il mezzo viene quindi sottoposto a una qualità, mescolato con NP nO a varie concentrazioni e lasciato raffreddare completamente prima dello stoccaggio. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: L'intera procedura di dissezione intestinale. (A) Trasferire 3rd larve instelle su un disco di dissezione. (B) Utilizzare pinze per tenere delicatamente una larva, e (C) lavare via il resto del cibo con salina. (D) Strappare delicatamente la cuticola senza toccare l'intestino e altri organi interni. (E) Mettere l'intestino nella salina per la procedura successiva. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: L'anatomia del tratto/intestino digestivo. L'intestino estratto dalla larva della Drosophila è diviso in tre domini discreti di diversa origine dello sviluppo, vale a dire il avvaccettato, il budello e il budello. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6: Colorazione del tessuto intestinale con DHE. (A) Preparare un mix master contenente il mezzo di crescita e DHE (concentrazione finale di 30 M). (B) Aggiungere il master mix nel pozzo di un disco di dissezione. (C) Trasferire il tessuto intestinale sezionato nel pozzo contenente il mix master DHE. (D) Incubare a RT per 5 min e proteggere il tessuto dalla luce; lavare 3x in PBS/salina per 5min. (E) Fissare in 4% PF per 10 min; lavare il tessuto tre volte con PBS (opzionale). (F) Trasferire delicatamente l'intestino su uno scivolo di vetro, giaporre piatto senza avere alcun tessuto piegato e montare con supporto di montaggio prima di coprire con vetro di copertura. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 7: Gli NP di nO inducono ROS nell'intestino delle larve di Drosophila. (a) la macchia DHE nell'intestino di controllo mostra il livello basale di ROS. (b e c) Le cellule intestinali trattate mostrano un aumento graduale dell'intensità DHE in modo dipendente dalla dose. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 8: Quantitazione di immagini fluorescenti utilizzando ImageJ. (A) Importare le immagini acquisite. (B) Fare clic sul menu Analizza e selezionare Imposta misure. (C) Selezionare l'intensità integrata dell'area e il valore grigio medio. Selezionare un'area senza fluorescenza per impostare lo sfondo. (D) Esportare i dati in Excel e calcolare il CTCF per analisi statistiche successive. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Al fine di valutare se l'NP nO può indurre l'apoptosi nei fibroblasti MRC5, usiamo la citometria di flusso per distinguere le cellule dalla morte cellulare necrotica o apoptotica. Nelle cellule vive normali, la fosfatidilaselserina (PS) è localizzata nella membrana cellulare. Se si verifica l'apoptosi, PS viene traslocato al volantino extracellulare della membrana plasmatica, consentendo il legame dell'annessione V etichettata con fluoresceina (FITC Annexin V)29. D'altra parte, lo iodio propidio rosso-fluorescente (PI), un colorante legante acido nucleico, è impermeabile alle cellule viventi e alle cellule apoptotiche, ma macchia le cellule morte30. Questo ci permette di identificare le cellule morte (rosso e verde), le cellule apoptotiche (fluorescenza verde) e le cellule vive (poca o nessuna fluorescenza), utilizzando un citometro di flusso con la linea di 488 nm di un laser argon-ion per l'eccitazione.
Per la colorazione DHE dell'intestino Drosophila, è importante ricostituire il colorante con DMSO poco prima di iniziare l'esperimento, poiché lo stoccaggio prolungato può portare ad un'auto-ossidazione del colorante che trasforma il colorante in colore scuro / violaceo31, 32. Inoltre, anche le soluzioni azionarie ricostituite tendono a scadere piuttosto rapidamente, quindi bisogna prestare attenzione alla "data di scadenza". In alternativa, le sonde fluorogeniche come la versione verde della sonda fototavoloa, che ha l'ulteriore capacità di essere multiplexata di macchie e produce segnali molto più chiari di DHE, potrebbero essere utilizzate. L'intestino sezionato è stato trasferito al mezzo di Schneider contenente il tinrito alla concentrazione desiderata senza aggiungere fissativo. Questo per consentire l'incorporazione del colorante nelle cellule vive, e quindi la colorazione viene eseguita nel mezzo di coltura, per consentire una migliore respirazione delle cellule.
Per quanto riguarda la quantificazione della colorazione DHE, per cominciare, evitare la saturazione dei pixel nelle celle non trattate. Il programma software di imaging è stato utilizzato per determinare il tempo di esposizione segnalando visivamente i pixel saturi. Il campione non trattato è stato utilizzato per impostare il tempo di esposizione e mantenere gli stessi parametri durante l'acquisizione di immagini per il confronto dell'intensità tra diversi gruppi di trattamento, che è importante per la quantificazione dell'intensità dell'immagine a fluorescenza in seguito. E 'essenziale acquisire tutte le immagini (controllo e campioni trattati) utilizzando lo stesso sistema e impostazioni/parametri di acquisizione, e lo sfondo deve essere standardizzato per tutte le immagini (in modo che ci sia coerenza per la sottrazione di sfondo)33.
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Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.
Acknowledgments
Lo studio è stato sostenuto dal numero di sovvenzione R706-000-043-490. Lo studio non rappresenta il parere dello sponsor della sovvenzione.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15% Methyl 4-Hydroxybenzoate | Sigma Aldrich | ||
| 4% Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148 | |
| Bacto Agar | BD biosciences | ||
| cncCK6/TM3, Sb | a gift from Dr. Kerppola T | ||
| Cornmeal, glucose, yeast brewer | Sigma Aldrich | ||
| CyAn ADP with Summit Software | DAKO | https://flow.usc.edu/files/2014/07/BC-Cyan-ADP-User-Guide-2016.pdf | |
| Dihydroethidium (Hydroethidine) | Thermo Fisher Scientific | D11347 | |
| FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit I | BD biosciences | 556547 | |
| Fluorescent microscope | Olympus | ||
| Glucolin | Supermarket | ||
| ImageJ software | NIH | ||
| MRC5 human lung fibroblast | ATCC | CCL-171 | |
| Schneider’s Drosophila medium | Thermo Fisher Scientific | 21720-024 | |
| Vectashield antifade mounting medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
| Wild-type Canton-S; Sod2N308/CyO | NIG-FLY | ||
| Zinc Oxide Nanoparticles | Sigma Aldrich | 721077 | Refer Sheet 2 |
References
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