Waiting
로그인 처리 중...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Hücre Kültüründe ve Drosophila melanogaster'de Çinko Oksit Nano partiküllerinin Toksisite Çalışması

Published: September 19, 2019 doi: 10.3791/59510
Automatic Translation
1, 2, 3, 4, 4
1NUS Environmental Research Institute & Department of Anatomy, National University of Singapore, 2NUS Environmental Research Institute & School of Public Health, National University of Singapore, 3Department of Civil and Environmental Engineering, National University of Singapore, 4Department of Anatomy, National University of Singapore

Summary

Biz çinko oksit nano tanecikleri toksikolojik profilleri değerlendirmek için ayrıntılı bir protokol tarif (ZnO NPs) özellikle, insan MRC5 akciğer fibroblastları hücre ölümü türü ve meyve sinek DrosophilaROS oluşumu .

Abstract

Çinko oksit nano tanecikleri (ZnO NPs) uygulamaları geniş bir yelpazede var, ancak ZnO NP ilişkili toksisite rapor sayısı son yıllarda hızla artmıştır. Ancak, ZnO NP kaynaklı toksisite için altta yatan mekanizmaları açıklığa kavuşturan çalışmalar yetersizdir. Hem in vitro hem de in vivo deneysel modelleri kullanarak ZnO NP'lerin toksisite profillerini belirledik. ZnO NP'ye maruz kalan MRC5 akciğer fibroblastlarında hücre canlılığında önemli bir azalma gözlendi ve ZnO NP'lerin sitotoksik etkiler uyguladığı nı gösterdi. Benzer şekilde, ilginç, Bağırsak ZnO NPs maruz meyve sinek Drosophilareaktif oksijen türleri düzeylerinde dramatik bir artış sergiledi (ROS). ZnO NP'lerinin tüketiciler tarafından artan kullanımı için bir risk değerlendirmesi oluşturmak için daha derinlemesine çalışmalar agereklidir.

Introduction

Nanoteknoloji tıp, malzeme bilimi ve biyokimya da dahil olmak üzere tüm bilimsel alanlarda kullanılan nanoboyutlu malzemelerin uygulanması anlamına gelir. Örneğin, ultraviyole saçılma, kimyasal algılama ve anti-mikrobiyal özellikleri nin yanı sıra yüksek elektriksel iletkenlikleriyle bilinen ZnO NP'leri, gıda ambalajı, kozmetik, kozmetik, tekstil, kauçuk, pil, otomobil kuyruk gazı tedavisi için katalizör ve biyomedikal ile ilgili uygulamalar1,2,3.

Ancak, ZnO NP tabanlı ürünlerin gelişen uygulamaları, ZnO NPs artan insan maruziyetine yol açan, insan sağlığı üzerindeki potansiyel olumsuz etkileri hakkında endişeler emdi. In vitro hücresel çalışmaların bir dizi ZnO NPs oksidatif stres, otofaji ile ilgili sitotoksisite, inflamasyon ve genotoksisite4,5,6,7,8 neden olabileceğini göstermiştir . Özellikle, ZnO NPs toksisitesi Zn serbest Zn2 + iyonları için çözülmesi, hem de ZnO yüzey reaktivitesi, bozulmuş iyonik homeostaz ve bir bağlı hücresel iyonik ve metabolik dengesizlikler sonuçlanan neden olduğu varsayılır iyon taşıma nın inhibisyonu4,7,9,10. Daha da önemlisi, çalışmalar reaktif oksijen türlerinin (ROS) neslinin ZnO NP'lerle ilişkili toksisitenin altında yatan birincil mekanizmalardan biri olduğunu göstermiştir. ROS hakareti sonrası yetersiz anti-oksidatif aktivitesi sitotoksisite ve DNA hasarı nın ortaya çıkarılmasından sorumlu olduğu gösterilmiştir9. ZnO NPs toksik etkileri de hayvan modellerinde bildirilmiştir, kemirgen dahil1, zebra balığı11,12, yanı sıra omurgasız Drosophila13.

Drosophila kimyasal varlıklar ve nanomalzemeler (NMs)14,15toksisite tarama için iyi kurulmuş bir alternatif hayvan modeli olarak hizmet vermektedir. Daha da önemlisi, Insan ve Drosophila arasında, NM gibi çevresel kirleticilere verilen biyolojik tepkilerin değerlendirilmesi nde drosophila'nın in vivo model olarak kullanılmasını haklı gösteren yüksek düzeyde genetik ve fizyolojik benzerlik vardır. 16. Ayrıca, drosophila kullanarak küçük boyutu, kısa ömrü, genetik amenability ve kolay ve uygun maliyetli bakım nedeniyle birçok avantajı vardır. Dahası, Drosophila genetik, moleküler ve gelişimsel biyoloji çalışmaları için yaygın olarak benimsenmiştir, çünkü tam genomu yıllar önce 2000 yılında tam olarak sıralanmıştır, bu nedenle çeşitli yüksek iş gücü taraması için uygundur. ve çözülmemiş biyolojik sorular la mücadele için17,18,19,20,21. Son yıllarda, Drosophila NPs farklı türleri kullanılarak immüntoksisite ile ilgili çalışmaların bir dizibildirilmiştir 15,22,23,24. Drosophila kullanarak çalışmalardan elde edilen bu temel yeni bilgi nanotoksikoloji anlayışımız hakkında daha fazla bilgi sağlamak için yardımcı olmuştur.

ROS, özellikle metal bazlı NPs25,NPs neden sitotoksisite ve genotoksisite için iyi bilinen bir suçludur. ROS moleküler oksijenden daha yüksek reaktif özelliklere sahip oksijen içeren kimyasal türlerdir. Süperoksit radikal (O 2-) ve hatta hidrojen peroksit (H2O2)gibi radikal olmayan moleküller ROS olarak hareket edebilir. Normal fizyolojik durum altında, onlar hücresel homeostaz korumak için gereklidir26, Ancak, aşırı ROS aşırı üretim veya antioksidan savunma sisteminin disregülasyonu nedeniyle oksidatif strese neden olabilir, proteinlere zarar yol açan, lipidler ve deoksiribonükleik asit (DNA)27. Örneğin, ROS düzeyleri arttıkça ve glutatyon (GSH) düzeyi eşlik eden azalır, adenozin trifosfat bozulması (ATP) sentezi gerçekleşir ve laktat dehidrogenaz (LDH) düzeyi orta artar, hücre ölümü ile sonuçlanan27.

Burada, ZnO NPs'nin potansiyel yan etkilerini belirlemek için kültürlü memeli hücreleri ve Drosophila kullanarak hücresel ve genetik analizler yapmak için protokoller salıyoruz. ZnO NPs toksisite çalışması için kullanılan yöntemin genel bir bakış Şekil 1gösterilmiştir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Floresan Aktif Hücre Sıralama (FACS) Yaşanmış/Sabit hücreler üzerinde analiz

  1. Sonicate ZnO NPs süspansiyon içinde 15 dakika.
  2. Kültürlü hücrelerin tedavisi için 1 mg/mL ZnO NP stok çözeltisi kullanarak Çeşitli konsantrasyonlarda (örneğin, 0, 0, 10, 25, 50,100 ve 200 μg/mL) ZnO NP'leri hazırlayın.
  3. Tohum MRC5 insan akciğer fibroblastları (1 x 105 hücre / iyi) bir 6-iyi kültür plaka üzerine bir gün önceden, ve sonra 8 saat, 16 saat ve 24 saat znO NPs 2 mL (üç aylık) ile hücreleri tedavi.
  4. Her zaman noktasında, 5 dakika için 300 x g santrifüj ederek hücreleri toplamak.
  5. Hücre peletlerini iki kez fosfat tamponlu salin (PBS) ile yıkayın.
  6. 0,1 M HEPES/sodyum hidroksit (NaOH), 1,4 M sodyum klorür (NaCl) ve 25 m kalsiyum klorür (CaCl2)oluşan 1x bağlayıcı tampon ile hücreleri 100 μL başına 1 x 105 hücre konsantrasyonu ile askıya alın.
  7. 5 μL Floresan isotiyoyanat (FITC) Annexin V lekesi ve 5 μL propidium iyodür (PI) DNA lekesi ekleyin ve hücreleri 15 dakika boyunca oda sıcaklığında (RT; 25 °C) karanlıkta kuluçkaya yatırın.
  8. Hücreleri akış sitometrisine göre sıralamadan önce numuneleri 400 μL'lik 1x bağlama tamponu ile toplayın. Her örnek için en az 10.000 hücre analiz edilir.
  9. Elde edilen ortanca yoğunluğu kullanarak çubuk grafiği tabloya alın.

2. Drosophila ZnO NPs maruz kalma

  1. Şişelere farklı konsantrasyonlarda 1 mL nano partikül ler ekleyin, ardından 9 mL sinek gıdası 0.1 mg/mL, 0.25 mg/mL veya 0.5 mg/mL ZnO NP'lik son konsantrasyonu yapın.
  2. Pipet kullanarak şişelerde iyice gıda ile nano tanecikleri karıştırın.
  3. Kullanmadan önce En az 2-3 saat soğuması için ZnO NPs içeren sinek gıda izin verin.
  4. Yetişkin erkek ve dişi 5 gün boyunca şişeler içine sinekler tanıtmak ve onları çiftleşmek ve yumurtlamak için izin (beyaz noktalar olarak görünür) gıda yüzeyinde.
  5. Ebeveyn sinekleri çıkarın ve yumurta 4 farklı gelişim aşamalarında (embriyonik, larva, pupal ve yetişkin aşaması) oluşur daha fazla gelişme geçmesine izin.

3. Sinek Diseksiyonu

  1. Analizler için şişelerin duvarından3. Taze yumurtlu yumurtalar normalde RT'de 72-120 saat sonra3'ün sonlarında instar larvalarına dönüşür.
  2. Diseksiyon kabını temizleyin ve kuyuyu diseksiyon ortamı/PBS ile doldurun.
  3. Bir çift forceps kullanarak larvaları (3inç'in sonlarında) stereomikroskop altında inceleyin.
  4. Küçük bir delik yapmak ve larvalar için manikür tabakası açık kırmak için forceps ucu kullanın. Dikkatle bağırsak çekin ve Schneider'ın Drosophila orta içeren bir 1.5 mL mikrosantrifüj tüp içine yerleştirin, sabitleme adımı önce 1 mL kullanarak 4% paraformaldehit (PF).
  5. 3.5 Immunostaining gibi sonraki deneyler için, RT'de 10 dakika boyunca PF'deki bağırsağı sabitle.

4. Dihidroethidyum (DHE) Boyama Kullanarak ROS Algılama

  1. Adım 2.1'de açıklandığı gibi larvaları çeşitli ZnO NPs konsantrasyonlarıyla tedavi edin.
  2. Bölüm 3'te açıklandığı gibi3.instar larvasından bağırsak diseksiyonu yapıldıktan sonra, doku boyama işlemi yapılmadan önce SCHNEIDER'ın Drosophila ortamında bağırsakları RT'de kuluçkaya yatırın. Schneider'ın orta 1 mL'sinde 1 μL DHE boyasını (30 mM'lik stok konsantrasyonundan) eritin ve 10-30 μM DHE boyası üzerinde son çalışma konsantrasyonu elde edin.
  3. Karanlıkta RT'de 5 dakika boyunca bağırsağı kuluçkaya yatırın ve her 5 dakika schneider'ın orta sını kullanarak üç kez yıkayın.
  4. % 4 PF (isteğe bağlı adım) ile bağırsak düzeltmek ve cam slaytlar üzerine bağırsak monte, anti-fade montaj ortamı içeren 4′, 6-diamidino-2-fenilindole (DAPI). Konfokal mikroskop altında görüntüleri yakalayın.

5. ImageJ Yazılımını Kullanarak Floresan Ölçme

  1. Floresan mikroskobu veya konfokal lazer tarama mikroskobu kullanılarak elde edilen yakalanan floresan görüntülerini ImageJ yazılımına aktarın.
  2. Analiz menüsüne tıklayın ve ölçümleri ayarla'yıseçin.
  3. Alan tümleşik yoğunluğu ve ortalama gri değeri gibi çıktı ölçüsünü seçin.
  4. Ölçü'yetıklayın.
  5. Arka planı ayarlamak için floresan olmayan bir bölge seçin.
  6. Verileri Excel elektronik tablosuna aktarın ve aşağıda gösterildiği gibi hesaplamayı kullanarak düzeltilmiş toplam hücre floresansını (CTCF) belirleyin.
    CTCF = Entegre Yoğunluk - (Seçilen hücrenin alanı X Arka plan okumalarının ortalama floresansı)
  7. Bir çubuk grafik oluşturve istatistiksel analiz gerçekleştirin.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

NP'ye maruz kalan hücreler hücre boyama reaktif kiti ile işlendi, ardından akış sitometrisi kullanılarak hücre sıralaması yapıldı. ZnO NP ile tedavi edilen hücreler (alt, sağ panel) kontrol hücrelerine (R5, alt, sol panel) göre erken (R3)/ geç apoptotik hücreler (R6) daha yüksek bir yüzdesi sergiler. Nekrotik hücre ölümü R4 (üst, sağ panel) ile gösterilir (Şekil 2). ZnO NP ile tedavi edilen MRC-5 fibroblastlar üzerinde FITC/Annexin V TahtSonuçları Şekil 2'degösterilmiştir.

Drosophila deneyleri için, çeşitli konsantrasyonlarda sonicated ZnO NPs 10 mL tüpler gıda uçmak için eklendi ve daha sonra iyi bir pipet denetleyicisi kullanılarak karıştırılır(Şekil 3). Şişelerden toplanan üçüncü yıldız larvaları stereomikroskop altında kesildi. Larvalar ilk olarak kalan gıda kalıntılarını gidermek için yıkandı (Şekil 4). Dış manikür tabakası iç organları açığa çıkarmak için paramparça edildi. Bağırsak karakteristik uzun ve yarı saydam görünüm (diğer organlar mikroskop altında opak ve açık sarımsı görünürken)(Şekil 5)ile tanımlanmıştır. Bağırsak dikkatlice çıkarıldı, kırılmadan, ve buz üzerinde fiksatif içeren yeni bir mikrosantrifüj tüp içine transfer(Şekil 6).

Bağırsaktaki DHE sondasının yoğunluğu gibi floresan yoğunluğunun ölçülmesi için, görüntüler JPEG veya TIFF formatlarında ihraç edildi ve ImageJ yazılımı ile açıldı. Analiz için bağırsak parçası seçilmiş ve tespit edildi, örneğin, midgut veya hindgut bölge, ve ilgi bölgenin floresan yoğunluğu (ROI) ölçüldü. Farklı deney gruplarının göreceli yoğunluklarını karşılaştırmak için bir önceki bölümde tanımlanan aynı kantitatif konfokal mikroskopi yöntemini kullanılmıştır. Floresan yoğunluklarının karşılaştırılması için, parametre negatif işlenmemiş denetim kullanılarak ayarlandı. İşleme edilmeyen kontrolün kalibrasyon yoğunlukları temelinde sinyal yoğunluğunun hesaplamaları farklı deney grupları arasında doğrudan bir karşılaştırmaya olanak sağlamıştır. Şekil 7, farklı konsantrasyonlarda ZnO NP'lerine maruz kalan3.yıldız larva bağırsandaki DHE sinyalinin ortalama yoğunluğunu göstermektedir. ZnO NP tedavisinin 0.5 mg/mL ile tedavi edilen larvaların bağırsakları en yüksek floresan yoğunluğunu gösterdi.

Tüm deney grupları arasındaki göreceli yoğunluk farklılıkları daha da tablolandı ve hem nitel hem de nicel sonuçlar vererek istatistiksel analizler yapıldı(Şekil 8).

Figure 1
Şekil 1: ZnO NP'lerinin toksisite çalışmasında kullanılan yönteme genel bakış. In vitro çalışma için, ZnO NP ile tedavi edilen hücreler akış sitometri analizi öncesinde lekelendi. In vivo çalışma için, bağırsak3 instar larvaları, DHE boya ve görüntü edinimi ile boyama izledi diseksiyon kesildi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Şekil 2: FITC ve PE boyamalarına göre farklı popülasyonlara ayrılmış hücrelerin nokta çizimi. Piktogramlar MRC-5'te ZnO-NP'lerin 24 saat tedavi ile FITC/Annexin V tahtının sonuçlarını göstermektedir. Daha sonra farklı aşamalarda hücrelerin istatistiksel analizi yapılabilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 3
Şekil 3: ZnO NP içeren sinek lik ortamının hazırlanması. (A) Sinek likörü için malzemeler suya eklenir, şişmesine izin verilir ve 5 dk.(B) 50 °C'ye kadar karıştırılarak soğutulduktan sonra Nipagin eklenir ve iyice karıştırılır. (C) Nano tanecikler için bir ana karışım hazırlayın (toplam hacim son gıda hacminin %10'undan fazla değil). (D) Orta sonra aliquoted, çeşitli konsantrasyonlarda ZnO NPs ile karıştırılır ve depolama önce tamamen soğumasına izin verilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 4
Şekil 4: Tüm bağırsak diseksiyon prosedürü. (A) 3inci yıldız larvalarını bir diseksiyon diskine aktarın. (B) Bir larvayı hafifçe tutmak için forceps kullanın ve (C) tuzlu su kullanarak gıda kalıntısını yıkayın. (D) Yavaşça bağırsak ve diğer iç organlara dokunmadan ayrı cuticle gözyaşı. (E) Sonraki işlem için bağırsakları tuzlu ya doğru yerleştirin. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 5
Şekil 5: Sindirim sistemi/bağırsak anatomisi. Drosophila larvaçıkarılan bağırsak farklı gelişimsel kökenli üç ayrı etki yani foregut, midgut ve hindgut ayrılır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 6
Şekil 6: DHE ile bağırsak dokusunun boyanışı. (A) Büyüme ortamı ve DHE (son konsantrasyon 30 μM) içeren bir ana karışım hazırlayın. (B) Ana karışımı bir diseksiyon diskinin kuyuya ekleyin. (C) DHE ana karışımını içeren kuyuya parçalanmış bağırsak dokusunu aktarın. (D) RT'de 5 dakika kuluçkaya yatveliyi ışıktan koruyun; 5dk. (E) 10 dakika boyunca % 4 PF fix PBS / salin 3x yıkayın; PBS (isteğe bağlı) ile üç kez doku yıkayın. (F) Yavaşça bir cam slayt üzerine bağırsak aktarın, herhangi bir doku katlanmış ve kapak cam ile kaplamadan önce montaj ortamı ile monte olmadan düz yatıyordu. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 7

Şekil 7: ZnO NPs Drosophila larvalarının bağırsaklarında ROS indükler. (a) Kontrol bağırsadaki DHE lekesi ROS'un bazal seviyesini gösterir. (b ve c) Tedavi bağırsak hücreleri doza bağlı bir şekilde DHE yoğunluğunda kademeli bir artış göstermektedir.  Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 8
Şekil 8: ImageJ kullanarak floresan görüntülerin sayısallaştırılması. (A) Yakalanan görüntüleri içeri aktarın. (B) Analiz menüsüne tıklayın ve ölçümleri ayarla'yıseçin. (C) Alan tümleşik yoğunluğunu ve ortalama gri değeri seçin. Arka planı ayarlamak için floresan olmayan bir bölge seçin. (D) Verileri Excel'e aktarın ve sonraki istatistiksel analizler için CTCF'yi hesaplayın. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

ZnO NP'nin MRC5 fibroblastlarında apoptozisi tetikleyip tetiklemeyebileceğini değerlendirmek için hücreleri nekrotik veya apoptotik hücre ölümlerinden ayırt etmek için akış sitometrisini kullanırız. Normal canlı hücrelerde, fosfatidilserin (PS) hücre zarında lokalize. Apopoz oluşursa, PS plazma membranın hücre dışı broşüre geçirilir, floresan ile etiketlenmiş Annexin V bağlanmasını sağlayan (FITC Annexin V)29. Öte yandan, kırmızı floresan propidium iyodür (PI), bir nükleik asit bağlayıcı boya, canlı hücreler ve apoptotik hücreler için geçirimsiz ama lekeler ölü hücreleri30. Bu bize ölü hücreleri tanımlamak için izin verir (kırmızı ve yeşil), apoptotik hücreler (yeşil floresan) ve canlı hücreler (çok veya hiç floresan), uyarma için bir argon-iyon lazer 488 nm hattı ile bir akış sitometre kullanarak.

Drosophila bağırsağı DHE boyama için, uzun depolama koyu / morumsu renk31içine boya döner boya otomatik oksidasyona yol açabilir gibi, deneme başlamadan hemen önce DMSO ile boya yeniden oluşturmak için önemlidir, 32- Buna ek olarak, yeniden konan stok çözümleri de oldukça hızlı bir şekilde sona erme eğilimindedir, bu yüzden bir "son kullanma tarihi" dikkat etmek zorundadır. Alternatif olarak, lekelerle çok katlı olma özelliğine sahip ve DHE'den çok daha net sinyaller üreten fototablo sondasının yeşil versiyonu gibi florojenik problar kullanılabilir. İncelenen bağırsak Schneider'ın ortamına transfer edildi ve istenilen konsantrasyonda boya içeren hiçbir fiksatif eklenmeden. Bu canlı hücrelerde boya dahil izin vermektir, ve bu nedenle boyama kültür ortamda yapılır, hücrelerin daha iyi solunum sağlamak için.

DHE boyamanın nicelikselliği ile ilgili olarak, başlangıç olarak, işlem işlenmemiş hücreleri kontrol eden piksellerin doygunlaşmasından kaçının. Görüntüleme yazılımı programı, doymuş pikselleri görsel olarak işaretleyerek pozlama süresini belirlemek için kullanılmıştır. İşlenmemiş numune, daha sonra floresan görüntü yoğunluğunun ölçülmesi için önemli olan farklı tedavi grupları arasında yoğunluğun karşılaştırılması için görüntüleri yakalarken pozlama süresini ayarlamak ve aynı parametreleri korumak için kullanılmıştır. Aynı sistem ve edinme ayarları/parametreleri kullanarak tüm görüntüleri (kontrol ve tedavi örnekleri) elde etmek esastır ve arka plan tüm görüntüler için standartlaştırılmalıdır (böylece arka plan çıkarma için tutarlılık vardır)33.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarları olduğunu beyan.

Acknowledgments

Çalışma, R706-000-043-490 hibe numarası ile desteklenmiştir. Çalışma hibe sponsorunun görüşünü temsil etmez.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
15% Methyl 4-Hydroxybenzoate Sigma Aldrich
4% Paraformaldehyde Sigma Aldrich P6148
Bacto Agar BD biosciences
cncCK6/TM3, Sb a gift from Dr. Kerppola T
Cornmeal, glucose, yeast brewer Sigma Aldrich
CyAn ADP with Summit Software DAKO https://flow.usc.edu/files/2014/07/BC-Cyan-ADP-User-Guide-2016.pdf
Dihydroethidium (Hydroethidine) Thermo Fisher Scientific D11347
FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit I BD biosciences 556547
Fluorescent microscope Olympus
Glucolin Supermarket
ImageJ software NIH
MRC5 human lung fibroblast ATCC CCL-171
Schneider’s Drosophila medium Thermo Fisher Scientific 21720-024
Vectashield antifade mounting medium with DAPI Vector Laboratories H-1200
Wild-type Canton-S; Sod2N308/CyO NIG-FLY
Zinc Oxide Nanoparticles Sigma Aldrich 721077 Refer Sheet 2

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kim, Y. R., et al. Toxicity of 100 nm zinc oxide nanoparticles: a report of 90-day repeated oral administration in Sprague Dawley rats. International Journal of Nanomedicine. 9 Suppl 2, 109-126 (2014).
  2. Xie, Y., He, Y., Irwin, P. L., Jin, T., Shi, X. Antibacterial activity and mechanism of action of zinc oxide nanoparticles against Campylobacter jejuni. Applied and Environmental Microbiology. 77, 2325-2331 (2011).
  3. Colvin, V. L. The potential environmental impact of engineered nanomaterials. Nature Biotechnology. 21, 1166-1170 (2003).
  4. De Angelis, I., et al. Comparative study of ZnO and TiO(2) nanoparticles: physicochemical characterisation and toxicological effects on human colon carcinoma cells. Nanotoxicology. 7, 1361-1372 (2013).
  5. Johnson, B. M., et al. Acute exposure to ZnO nanoparticles induces autophagic immune cell death. Nanotoxicology. 9, 737-748 (2015).
  6. Singh, N., et al. NanoGenotoxicology: the DNA damaging potential of engineered nanomaterials. Biomaterials. 30, 3891-3914 (2009).
  7. Song, W., et al. Role of the dissolved zinc ion and reactive oxygen species in cytotoxicity of ZnO nanoparticles. Toxicology Letters. 199, 389-397 (2010).
  8. Wahab, R., et al. ZnO nanoparticles induced oxidative stress and apoptosis in HepG2 and MCF-7 cancer cells and their antibacterial activity. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 117, 267-276 (2014).
  9. Namvar, F., et al. Cytotoxic effects of biosynthesized zinc oxide nanoparticles on murine cell lines. Evidence-Based Complementary and Alternative. 2015, (2015).
  10. Wong, S. W., Leung, P. T., Djurisic, A. B., Leung, K. M. Toxicities of nano zinc oxide to five marine organisms: influences of aggregate size and ion solubility. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 396, 609-618 (2010).
  11. Hua, J., Vijver, M. G., Richardson, M. K., Ahmad, F., Peijnenburg, W. J. Particle-specific toxic effects of differently shaped zinc oxide nanoparticles to zebrafish embryos (Danio rerio). Environmental Toxicology and Chemistry. 33, 2859-2868 (2014).
  12. Zhao, X., Wang, S., Wu, Y., You, H., Lv, L. Acute ZnO nanoparticles exposure induces developmental toxicity, oxidative stress and DNA damage in embryo-larval zebrafish. Aquatic Toxicology. 136-137, 49-59 (2013).
  13. Alaraby, M., Annangi, B., Hernandez, A., Creus, A., Marcos, R. A comprehensive study of the harmful effects of ZnO nanoparticles using Drosophila melanogaster as an in vivo model. Journal of Hazardous Materials. 296, 166-174 (2015).
  14. Rand, M. D. Drosophotoxicology: the growing potential for Drosophila in neurotoxicology. Neurotoxicology and Teratology. 32, 74-83 (2010).
  15. Ong, C., Yung, L. Y., Cai, Y., Bay, B. H., Baeg, G. H. Drosophila melanogaster as a model organism to study nanotoxicity. Nanotoxicology. 9, 396-403 (2015).
  16. Hoffmann, J. A., Reichhart, J. M. Drosophila innate immunity: an evolutionary perspective. Nature Immunology. 3, 121-126 (2002).
  17. Hughes, T. T., et al. Drosophila as a genetic model for studying pathogenic human viruses. Virology. 423, 1-5 (2012).
  18. Jennings, B. H. Drosophila - a versatile model in biology & medicine. Materials Today. 14, 190-195 (2011).
  19. Adams, M. D., Sekelsky, J. J. From sequence to phenotype: reverse genetics in Drosophila melanogaster. Nature Reviews Genetics. 3, 189-198 (2002).
  20. Adams, M. D., et al. The genome sequence of Drosophila melanogaster. Science. 287, 2185-2195 (2000).
  21. Ong, C., et al. Silver nanoparticles disrupt germline stem cell maintenance in the Drosophila testis. Scientific Reports. 6, (2016).
  22. Alaraby, M., Demir, E., Hernandez, A., Marcos, R. Assessing potential harmful effects of CdSe quantum dots by using Drosophila melanogaster as in vivo model. Science of the Total Environment. 530-531, 66-75 (2015).
  23. Barik, B. K., Mishra, M. Nanoparticles as a potential teratogen: a lesson learnt from fruit fly. Nanotoxicology. , 1-27 (2018).
  24. Jovanovic, B., et al. The effects of a human food additive, titanium dioxide nanoparticles E171, on Drosophila melanogaster - a 20 generation dietary exposure experiment. Scientific Reports. 8, (2018).
  25. Cao, Y. The Toxicity of Nanoparticles to Human Endothelial Cells. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1048, 59-69 (2018).
  26. Akhtar, M. J., Ahamed, M., Alhadlaq, H. A., Alshamsan, A. Mechanism of ROS scavenging and antioxidant signalling by redox metallic and fullerene nanomaterials: Potential implications in ROS associated degenerative disorders. Biochimica Et Biophysica Acta-General Subjects. 1861, 802-813 (2017).
  27. Akter, M., et al. A systematic review on silver nanoparticles-induced cytotoxicity: Physicochemical properties and perspectives. Journal of Advanced Research. 9, 1-16 (2018).
  28. Vecchio, G. A fruit fly in the nanoworld: once again Drosophila contributes to environment and human health. Nanotoxicology. 9, 135-137 (2015).
  29. Marino, G., Kroemer, G. Mechanisms of apoptotic phosphatidylserine exposure. Cell Research. 23, 1247-1248 (2013).
  30. Stoddart, M. J. Cell Viability Assays: Introduction. Mammalian Cell Viability: Methods and Protocols. , Chapter 1 (2011).
  31. Yazdani, M. Concerns in the application of fluorescent probes DCDHF-DA, DHR 123 and DHE to measure reactive oxygen species in vitro. Toxicology in Vitro. 30, 578-582 (2015).
  32. Chen, J., Rogers, S. C., Kavdia, M. Analysis of kinetics of dihydroethidium fluorescence with superoxide using xanthine oxidase and hypoxanthine assay. Annals of Biomedical Engineering. 41, 327-337 (2013).
  33. Hartig, S. M. Basic image analysis and manipulation in ImageJ. Current Protocols in Molecular Biology. , Chapter 14, Unit14.15 (2013).

Tags

İmmünoloji ve Enfeksiyon Sayı 151 çinko oksit nano tanecikleri toksisite hücre ölümü oksidatif stres MRC5 hücreleri Drosophila
Hücre Kültüründe ve <em>Drosophila melanogaster'de</em> Çinko Oksit Nano partiküllerinin Toksisite Çalışması
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ng, C. T., Ong, C. N., Yu, L. E.,… More

Ng, C. T., Ong, C. N., Yu, L. E., Bay, B. H., Baeg, G. H. Toxicity Study of Zinc Oxide Nanoparticles in Cell Culture and in Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (151), e59510, doi:10.3791/59510 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter