Summary
Nós descrevemos um sistema novo da análise do porte, análise da pata-cópia de gravações contraste-realçadas (PrAnCER), um sistema automatizado do abrir-acesso para a quantificação de características do porte nos ratos que utiliza um assoalho semitransparente novo para automaticamente quantificar a marcha. Este sistema foi validado usando o modelo Haloperidol da doença de Parkinson.
Abstract
A análise da marcha é utilizada para quantificar as alterações na função motora em muitos modelos de roedores da doença. Apesar da importância da avaliação da marcha e da função motora em muitas áreas de pesquisa, as opções comerciais disponíveis têm várias limitações, como o alto custo e a falta de código aberto e acessível. Para abordar essas questões, desenvolvemos o PrAnCER, a análise Paw-Print de gravações com contraste aprimorado, para quantificação automatizada da marcha. As gravações contrastadas são produzidas usando um piso translúcido que obscurece objetos que não estão em contato com a superfície, isolando efetivamente as pegadas da pata do rato enquanto caminha. Usando esses vídeos, nosso programa de software simples mede de forma confiável uma variedade de parâmetros de marcha espaciotemporal. Para demonstrar que o PrAnCER pode detectar com precisão as alterações na função motora, empregamos um modelo Haloperidol da doença de Parkinson (DP). Foram testados ratos em duas doses de Haloperidol: dose elevada (0,30 mg/kg) e dose baixa (0,15 mg/kg). Haloperidol aumentou significativamente a duração da postura e a área de contato da pata traseira na condição de dose baixa, como pode ser esperado em um modelo de PD. Na condição de dose elevada, nós encontramos um aumento similar na área de contato mas igualmente um aumento inesperado no comprimento do Stride. Com mais pesquisas, descobrimos que esse aumento do comprimento da passada é consistente com o fenômeno de escape de órgude comumente observado em doses mais elevadas de Haloperidol. Assim, o PrAnCER foi capaz de detectar alterações esperadas e inesperadas nos padrões de marcha de roedores. Adicionalmente, nós confirmamos que PrAnCER é consistente e exato quando comparado com a pontuação manual de parâmetros do porte.
Introduction
Os roedores são comumente usados como modelos para estudar uma ampla gama de doenças e lesões, incluindo artrite1, doença de Parkinson (PD)2,3, distúrbiosneuromusculares4,5, hidrocefalia6 e lesão medular7. Nessas condições, sintomas como dor, equilíbrio e função motora podem ser medidos estudando-se os padrões de marcha dos animais. Esses padrões são quantificados usando um conjunto de parâmetros de marcha espaciotemporal que resumem a localização e o tempo das estampas de pata, bem como a área de contato da pata no solo.
Embora existam muitas opções para a análise da marcha, os sistemas atuais têm várias desvantagens. No teste tradicional de tinta e papel, as patas de um animal são revestidas com tinta antes de atravessar uma folha de papel branco (Figura 1a). As impressões de pata resultantes podem ser medidas para o comprimento da passada e a largura da postura, mas os parâmetros da marcha temporal chave, como velocidade ou duração da etapa, não podem ser avaliados. Os modernos sistemas baseados em vídeo são mais confiáveis, mas a análise de vídeo requer uma pontuação laboriosa quadro a quadro, a menos que um sistema automatizado adequado seja usado8. Há muitos sistemas de Pontuação automatizados comerciais atualmente disponíveis, mas esses sistemas podem ser proibitivamente caros. Adicionalmente, estes sistemas confiam no revestimento desobstruído ou em alguns casos, esteiras, que alteram o movimento natural. As esteiras foram mostradas para mascarar deficits do motor em alguns modelos9da doença, quando o revestimento desobstruído (Figura 1b) fizer com que os ratos passem mais tempo no perímetro de um campo aberto, indicando a ansiedade aumentada10. Idealmente, um instrumento da análise da marcha não confiaria em tampouco, produzindo os testes padrões os mais naturais do movimento com menos esforço ao animal.
Opções disponíveis de código aberto e comerciais usam uma variedade de métodos para superar a dificuldade de isolar uma pegada do corpo do animal, apesar das condições de iluminação variável, cor animal e formas de impressão. Alguns melhoram o contraste de contato patas usando superfícies que liberam luz em resposta à pressão7,11,12, masestes são caros e tecnicamente difícil de construir. Outros sistemas utilizam ângulos múltiplos da vista que permitem a observação da coordenação do inteiro-corpo8,13. Quando estas opções oferecerem vantagens para medir parâmetros adicionais do motor além do porte, são desnecessariamente complexas para a análise simples do porte. Além disso, todas essas técnicas dependem de pisos claros, o que altera o comportamento natural.
PrAnCER baseia-se no que chamamos de contraste-Enhanced Recordings, que usam uma combinação de iluminação e um piso semitransparente para melhorar a detecção de impressões. Quando visualizado a partir de baixo, isso cria uma imagem de alto contraste (impressão de pata), enquanto obscurecendo a visão de objetos que não estão em contato com a superfície (o corpo do animal) (Figura 1D). Quando visto de cima, o piso aparece opaco. O saliência resultante das patas em nosso método permite a identificação exata de uma variedade de características do porte e do locomotor por nosso sistema automatizado recentemente desenvolvido. No presente estudo, descrevemos o aparato, nosso protocolo de análise da marcha e nosso sistema de Pontuação automatizado, o PrAnCER. Nosso aparelho é facilmente montado e PrAnCER pode ser usado para avaliar os déficits motores em uma ampla gama de modelos de doenças e lesões.
Para demonstrar que o PrAnCER pode ser usado para detectar padrões anormais de marcha, utilizou-se um modelo Haloperidol de DP, modelo simples para indução transitória de mudanças locomotoras14. Haloperidol é um antagonista do receptor de dopamina amplamente utilizado como um antipsicótico1. Afeta os sistemas motores alterando a sinalização da dopamina no estriado, um componente importante da via motora nos gânglios da base14. Mesmo uma dose única de Haloperidol reduz rapidamente os níveis de dopamina extracelular no estriado, causando defecits do motor de Parkinsonian-like15. Os efeitos comportamentais são rigidez muscular, acinesia e catalepsia, que é definida como uma incapacidade de retornar a uma postura normal após ser colocada em uma posição incomum11,12. As doses agudas de Haloperidol causam déficits locomotores identificáveis no teste de do da função motora17. Nós raciocinamos que os prejuízos locomotores Haloperidol-negociados seriam igualmente evidentes em um número de características acessíveis à análise automatizada do porte.
Embora as respostas ao Haloperidol variem extensamente através dos estudos, os efeitos catalépticos do Haloperidol emergem em doses de 0,5 mgs/quilograma e mais altamente, quando a resposta reduzida e o prejuízo do motor forem detectáveis em umas doses mais baixas (0,1-0,3 MGS/quilograma)16, 17. em um esforço para evitar os efeitos catalépticos do Haloperidol, decidimos testar duas doses de Haloperidol: uma dose alta (0,30 mg/kg) e uma dose baixa (0,15 mg/kg). Como mostrado na tabela 1, o experimento 1 examinou os efeitos do Haloperidol de alta dose, enquanto o experimento 2 testou os efeitos da dose baixa de Haloperidol. Nós usamos um projeto do dentro-assunto em que cada rato foi testado nas condições elevadas da dose, da baixa dose, e do controle (Saline). A ordem de condição foi contrabalançada em ratos. Nós previmos que a administração aguda de Haloperidol causaria prejuízos da marcha similares àqueles encontrados em outros modelos do paládio tais como a velocidade diminuída, o comprimento diminuído da passada, e a duração mais longa da posição3,14,18 ,19. Nós observamos mudanças comportáveis que incluem o acinesia depois da administração do Haloperidol em ambas as dosagens. Na condição de dose baixa, os ratos tinham aumentado significativamente a duração da postura e a área de contato da pata posterior, como esperado. Estas mudanças da marcha são comparáveis às etapas lentas, baralhar comuns entre pacientes do paládio2,20. Na condição de dose elevada, entretanto, nós vimos um aumento no comprimento do Stride assim como um aumento na área de contato da pata. Embora o aumento no comprimento do Stride fosse inesperado, uma revisão mais adicional da literatura indicou que é parte provável de uma resposta Haloperidol-induzida do bracing-escape. Nós concluímos que PrAnCER é certamente capaz de detectar Parkinsonian-como mudanças na marcha do roedor consistente com o uso dos neurolépticos.
Protocol
Todos os procedimentos estavam de acordo com as diretrizes institucionais da Brown University Care animal e use Committee.
1. aparelho de análise da marcha
- Prepare a passarela de análise de marcha constituída por uma passarela de plexiglass clara fechada (36 "L x 3" W x 4,5 "H) colocada em um piso de plexiglass claro (Figura 2a). Faça o assoalho do plexiglass semitransparente cobrindo o com um pedaço de 16 LB fibra de algodão desenho Vellum corte para a mesma largura que a passarela.
Nota: existem outros métodos para tornar o piso semitransparente. - Coloque uma câmera com uma taxa de quadros de pelo menos 30 frames por segundo (FPS) diretamente abaixo da passarela para capturar o meio da faixa (Figura 2b).
- Fixe uma tira de 12 V luzes LED com 18 LEDs/pé aproximadamente 2 centímetros de distância e 1 polegada acima do chão da passarela para iluminar a pista.
2. preparação animal
- Permitir que os animais aclimatar ao biotério por pelo menos 1 semana antes do manuseio. Manuseie os ratos durante pelo menos 5 dias antes do início do experimento. Este estudo utilizou 8 ratos machos Long Evans com aproximadamente 3 meses de idade.
-
Habituar os animais para a sala de testes e passagem da marcha com as luzes do quarto desligado
- Coloc a gaiola Home do rato a nível de superfície na extremidade da passagem da marcha para serir como uma caixa do objetivo. Observe que, se a gaiola de casa for profunda, os ratos com comprometimento de idade ou locomotor podem se beneficiar de uma rampa ou passo para facilitar o acesso à gaiola de casa.
- Permita que o rato ande da mão do experimentador para baixo o comprimento da passagem para alcangar sua gaiola Home.
- Os ratos pararão frequentemente na extremidade da passagem para olhar ao redor antes de saltar para baixo na gaiola Home. Se um rato demorar mais do que 1 min para sair da passarela, incentive-o a entrar na sua gaiola de casa com um impulso suave.
- Se o rato gira ao redor, use uma parte pequena de plexiglass para obstruir a extremidade do "começo" da passagem. Repita para um total de 3 execuções.
- Habituar por pelo menos 2 dias ou até que os ratos são confortáveis cruzando a passarela em um ritmo constante, sem congelamento.
3. procedimento de teste da marcha
- Ajuste as configurações no software da webcam para obter a imagem mais clara das impressões da pata. Desligue as luzes do quarto para todos os testes de marcha.
- Registre cada execução separadamente e rotule apropriadamente para uso com o programa de análise automatizada.
- Certifique-se de que não há manchas ou detritos no Vellum. Começar a gravar alguns segundos antes que o rato entra na passarela e parar uma vez que o rato sai da passarela e entra em sua gaiola de casa.
- Continue até que três execuções aceitáveis sejam concluídas ou 10 min tenham decorrido.
- Limpe a passarela com etanol entre cada rato e substitua o Vellum conforme necessário.
Nota: uma avaliação aceitável é definida como uma em que o animal caminha consistentemente e sem pausa para os primeiros 4 passos da corrida. Se isso for difícil de alcançar, ajuste os critérios para incluir ensaios em que há 4 etapas consecutivas em qualquer ponto na execução que ocorrem sem pausas ou aceleração abrupta.
4. análise automatizada de PrAnCER
- Coloque todos os vídeos a serem analisados em uma pasta.
- Inicie o PrAnCER executando o script Python Prancer. O PrAnCER analisará os vídeos com base nas etapas ilustradas na Figura 3 e na Figura 4.
- No menu pop-up, selecione a pasta especificada pressionando o botão escolher uma pasta . Selecione opções personalizadas para análise, se desejado. Descrições detalhadas de cada parâmetro podem ser encontradas clicando no ponto de interrogação ao lado deles. Clique em continuar quando terminar.
- Defina uma região de interesse (ROI) na imagem da passarela que aparece. Para fazer isso, clique esquerdo para definir uma borda superior e clique com o botão direito para definir uma borda inferior. Se a caixa que aparece estiver correcta, prima N para continuar. Se não, pressione Z para desfazer. Uma vez N é pressionado, o programa será executado automaticamente.
- Após a conclusão do PrAnCER, encerre o programa pressionando Enter no terminal.
- Para revisar manualmente a saída de resultados por PrAnCER, execute o script Python Gaiteditorgui e selecione o arquivo. mp4 apropriado para cada vídeo. Se necessário, corrija qualquer impressão mis-identificada ou mesclada.
- Para extrair parâmetros espaciais e temporais da marcha, execute o script Python Parameteranalyzer. Escolha o número de impressões posteriores para analisar e a pasta de vídeos a serem analisados e clique em continuar. Isso irá gerar um arquivo. csv para cada vídeo contendo um número de parâmetros comuns de marcha, que são descritos na tabela 2 e ilustrados na Figura 5.
Nota: os scripts completos, bem como instruções para leitura e análise de dados, estão disponíveis no GitHub do autor (www.github.com/hayleybounds). Implementamos esse algoritmo usando a Biblioteca Python de código aberto livre OpenCV21. Também incluído no GitHub são instruções para a construção de nossa passarela de análise de marcha.
Representative Results
Procedimento de Haloperidol
Desenvolvemos este sistema de análise da marcha para comparar os parâmetros da marcha em ratos controle àqueles em ratos experimentais esperados para mostrar uma variedade de locomotores, marcha e prejuízos de equilíbrio. Nós usamos um projeto do dentro-assunto em que cada rato foi testado na solução salina, no Haloperidol da dose elevada e em baixas condições do Haloperidol da dose. Os ratos foram separados em dois grupos (A e B) para permitir o contrabalo; o teste do porte era contrabalançado para a hora do dia e a ordem da circunstância. Cada teste foi separado por 48 h. os ratos foram levemente anestesiados com isoflurano antes de receberem injeções intraperitoneal (IP) de soro fisiológico ou Haloperidol. A marcha foi testada 1 h pós-injeção, altura em que o haloperidol deve estar nos níveis de pico15,16,17.
Resultados comportamentais
Observamos alterações de comportamento proeminentes em animais tratados com Haloperidol. Na condição de alta dose, cinco dos oito ratos tiveram períodos de imobilidade no início da passarela, durante os quais não responderam ao experimentador tocando-os e resistentes a serem movidos. Em alguns casos, este estado persistiu por vários minutos até que o rato foi removido da passarela. Em outros casos, o rato imóvel, de repente, mover-se rapidamente ou "ligado" através da passarela e, em seguida, retornar ao estado imóvel perto do final. Na condição de dose baixa, 3 dos 8 ratos tiveram períodos similares de imobilidade. Nessa dosagem, havia apenas uma instância de comportamento delimitador. Nenhum delimitador foi observado quando os animais foram tratados com soro fisiológico.
Foram analisados os efeitos do Haloperidol nos seguintes parâmetros de marcha: base de suporte, comprimento da passada, velocidade da passada, duração da postura, postura para relação de oscilação, área máxima de contato e distância intermembro. Como muitos parâmetros de marcha para os membros dianteiro e traseiro são idênticos e o haloperidol geralmente tem impactos uniformes em todos os membros, calculamos os parâmetros para apenas os membros posteriores e não separámos os dados para os membros esquerdos e certos. Para cada rato, calculamos a média de cada parâmetro de marcha de todas as execuções utilizáveis de cada dia de testes. Todos os parâmetros (com excepção da variabilidade da velocidade) foram calculados como a média para os primeiros 4 passos utilizáveis de uma corrida. Para avaliar se cada dosagem de Haloperidol impactou significativamente a marcha, foi utilizado um teste t de amostra pareada. No experimento 1, houve aumento significativo do comprimento da passada (Figura 6a; t (7) =-2,962, p = 0, 21) e área de contato máxima (Figura 6a; t (7) =-2,51, p = 0, 4) em animais tratados com Haloperidol de alta dose. A base de suporte, velocidade, duração da postura e postura para relação de oscilação não foram significativas. No experimento 2, os animais que receberam Haloperidol de baixa dose mostraram um aumento significativo na duração da postura (Figura 6B; t (7) =-2,444, p = 0, 44) e área de contato máxima (Figura 6B; t (7) =-3, 85, p = 0, 18) em relação à condição salina. Nenhum outro parâmetro de marcha foi significante. Adicionalmente, houve diferença significativa entre as condições de dose alta e baixa dose de Haloperidol na base de apoio (Figura 6C; t (7) = 2,651, p = 0, 33), área de contato máxima (Figura 6C; t (7) = 4,635, p = 0, 2) e distância intermembro ( Figura 6C; t (7) = 3, 98, p = 0, 17).
Sua precisão de localização e erros no sistema automatizado
Para avaliar a exatidão do PrAnCER, comparamos sua análise automatizada com a pontuação manual de 21 vídeos selecionados aleatoriamente de um grupo separado de 6 ratos controle. Para fins de Pontuação de mão, os vídeos foram convertidos em uma seqüência de imagens, que foram usadas para marcar manualmente os locais de impressões. Para a eficiência, nós focamos nossa análise em dados espaciais medidos das cópias traseiras somente. Extraímos o comprimento médio da passada e BOS para cada vídeo e comparamos com os valores automatizados. Enquanto o comprimento médio da passada não foi significativamente diferente entre a pontuação manual e a análise de PrAnCER (Figura 7B; t (20) =-0, 1, p = 0,99), a base de apoio foi significativa (Figura 7a; t (20) =-2,21, p = 0, 38). Embora a pontuação automatizada e manual tenha sido geralmente bem correlacionada, o sistema automatizado relatou um BOS 5% maior em média. Essa diferença pode ser devido a variâncias na seleção de centroides em vez de erros de detecção. Para a pontuação manual, o local de impressão foi marcado desenhando uma elipse ao redor da base de cada impressão posterior, pois seria difícil replicar manualmente o método de estimativa de centro de massa do PrAnCER. A tendência clara era para o Prancer superestimar Bos, talvez porque alguns animais podem splay seus dedos do pé para fora em uma forma assimétrica, fazendo com que Prancer Observe centróides mais extremos do que a pontuação manual. Outros sistemas também observaram aumentos significativos no BOS entre a pontuação manual e automatizada, apesar das medidas de comprimento de passada consistentes17. Considerando as pequenas diferenças observadas e a consistência com outros sistemas, conclui-se que o PrAnCER é uma medida confiável dos parâmetros da marcha.
É importante notar que toda a análise da exatidão ocorreu depois que a correção manual da saída automatizada foi executada usando o GUI de PrAnCER. Como nos sistemas comerciais existentes, essa etapa é necessária tanto para corrigir erros na pontuação quanto para eliminar execuções que não atendem aos critérios22. Nós sintonizados PrAnCER para errar no lado de falsos positivos, como estes são mais fáceis de corrigir post-hoc. Nós nunca observamos PrAnCER não conseguem detectar uma impressão real durante a correção manual de mais de 500 vídeos. Outros tipos de erros, entretanto, foram observados. Estes caíram em 3 categorias: detecções falsas (detecção de um não-impressão como uma impressão), erros de classificação (impressão erroneamente como frente/Hind ou esquerda/direita), e combinações falsas (duas impressões incorretamente mescladas). Esses erros são facilmente corrigidos na GUI acompanhante, e normalmente ocorrem em apenas uma pequena porcentagem de vídeos filmados em condições normais. Mesmo com tais correções, o PrAnCER diminui acentuadamente a quantidade de trabalho manual envolvido na análise da marcha. Estimamos que para cada vídeo demora aproximadamente 3 min para executar o PrAnCER e corrigir quaisquer erros de saída (se necessário), enquanto que levaria quase 10 min para marcar manualmente e analisar o mesmo vídeo.
Figura 1. Comparação dos métodos de análise da marcha. (A) o método tradicional da tinta e do papel produz cópias imprecisas da forma e da posição da pata. (B) a gravação video com um assoalho transparente dá uma vista detalhada das cópias da pata mas contem muitas características salientes do corpo do rato que complica a pontuação automatizada. (C) papel leve sobre um piso claro cria uma imagem barulhenta e perde detalhes. (D) o uso do Vellum para criar um assoalho translúcido produz impressões altamente detalhadas ao eliminar visualmente o corpo. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Ilustração esquemática do instrumento da passagem do porte e da gravação video. (A) o rato anda através de uma passagem desobstruída com um assoalho translúcido à caixa Home do objetivo da gaiola ao ser gravado de abaixo. Neste caso, o Vellum cobre um piso transparente para torná-lo translúcido. A passarela é iluminada por tiras de LED colocadas ao longo de seu comprimento em um nível entre os pés e o corpo do animal. (B) uma captura de tela de uma gravação de vídeo demonstrando os efeitos do piso translúcido. Duas patas são claramente visíveis, mas o corpo do rato é essencialmente indetectável. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. Processo de detecção para um quadro de uma impressão de pata. (A) a imagem original é de-noised e submetida então à subtração do fundo (B). (C) um algoritmo de detecção de aresta é aplicado e os resultados são convertidos em uma série de coordenadas X, Y chamadas contornos (D). (E) os contornos são agrupados por proximidade e o casco convexo (caixa delimitadora) do grupo é tomado para produzir um único contorno que abrange a impressão. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4. Conversão de detecções individuais em uma impressão classificada. (A) as impressões de pata são identificadas pela primeira vez em um conjunto de quadros. (B) detecções de objetos individuais recebem um número que os identifica como uma impressão, representando um único posicionamento de uma pata (C). (D) finalmente, eles são classificados como esquerda ou direita com base em sua localização em relação à linha média do caminho do animal, e frente ou Hind com base em sua localização em relação às impressões de pata anterior. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5. Ilustração dos parâmetros de marcha analisados. (A) um exemplo de saída mostrando a identificação e localização de impressões de pata. As bordas detectadas originais são mostradas em preto. As patas detectadas finais e a área aproximada são mostradas nas cores que indicam a classificação da pata. Nesta figura, amarelo: esquerdo dianteiro, verde: parte traseira esquerda, ciano: direita dianteira, e magenta: direita do Hind. No entanto, as cores podem ser alteradas no script Python de acordo com a preferência do usuário. (B) um enredo ilustrando dois parâmetros temporais principais: a quantidade de tempo que cada pata está em contato com o solo (fase de postura) e no ar (fase de oscilação). Os blocos coloridos indicam a fase da postura e os espaços brancos indicam a fase do balanço. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6. Efeitos do Haloperidol na marcha. (A) resultados do experimento 1: Haloperidol de alta dose (HalH) aumentou significativamente o comprimento da passada e a área de contato máxima em comparação com a condição salina (sal). (B) experimento 2 resultou em sintomas parkinsonianos mais típicos; Haloperidol de baixa dose (HalL) aumentou significativamente a duração da postura e a área máxima de contato. (C) ao comparar as condições tratadas com Haloperidol de ambos os experimentos, o haloperidol de alta dose aumentou a base de suporte, a área máxima de contato e a distância entre membros em comparação com a condição de dose baixa. Os dados são médias ± SEM, n = 8. As diferenças de teste t de amostras pareadas foram as seguintes: # p < 0, 5, # # p < 0, 1. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 7. Exatidão da análise automatizada. (A) o sistema automatizado difere significativamente da Pontuação manual ao medir Bos, embora isso possa ser devido a variações na seleção de centroides manual em vez de erros de detecção. (B) o sistema automatizado não é significativamente diferente da Pontuação manual para o comprimento da passada. Esses resultados de precisão são consistentes com os de outros sistemas disponíveis. Os dados são médias ± SEM, n = 21. As diferenças do teste t das amostras pareadas foram as seguintes: # p < 0, 5. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 8. Comparação de parâmetros temporais. Padrões de marcha temporal para um animal tratado com soro fisiológico (A) e haloperidol de baixa dose (B). (C) uma ilustração do bracing-escape resposta de um rato dado o haloperidol elevado da dose. Como na Figura 5, os blocos coloridos indicam quando a pata estava em contato com o solo (fase de postura) e os espaços brancos indicam quando a pata estava no ar (fase de oscilação). Abreviaturas: fl, frente esquerda; HL, Hind esquerda; Fr, frente direita; HR, direita do Hind. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Experiência 1 | Experiência 2 | |||||||
| Teste 1 | Teste 2 | Teste de 3 | Teste de 4 | Teste 5 | Teste 6 | Teste de 7 | Teste 8 | |
| Grupo A | (SãoFernando ) | Sal | (SãoFernando ) | Sal | Sal | PatriciaLacerda | Sal | PatriciaLacerda |
| Grupo B | Sal | (SãoFernando ) | Sal | (SãoFernando ) | PatriciaLacerda | Sal | PatriciaLacerda | Sal |
Tabela 1. Projeto experimental. Esta tabela ilustra o delineamento experimental utilizado neste estudo. Nós usamos um projeto do dentro-assunto em que cada rato foi testado no Haloperidol elevado da dose (HalH), no Haloperidol da baixa dose (HalL) e em circunstâncias Salinas (sal). Os ratos foram divididos em dois grupos; o teste foi contrabalançado para a hora do dia e a ordem de condição.
| Parâmetro | Definição |
| Comprimento da passada | Distância entre contatos sucessivos da mesma pata |
| Comprimento da etapa | Distância entre contatos sucessivos da frente contralateral ou patas traseiras ao longo do eixo da direção do movimento |
| Base de apoio (BOS) | Distância entre a frente contralateral sucessiva ou patas traseiras perpendiculares ao eixo da direção do movimento |
| Área de contato máxima | A área máxima detectada de uma impressão Hind |
| Distância entre membros | Distância entre a frente ipsilateral e patas traseiras |
| Duração da postura | O período de tempo em que uma pata estava em contato com o solo |
| Duração do balanço | O período de tempo que uma pata não estava no chão |
| Postura para swing Ratio (SSR) | Duração da postura/duração do balanço |
| Velocidade discreta | Comprimento da passada/(duração da postura + duração do balanço) para uma pata |
| Velocidade média | Média de velocidades discretas no período utilizado na análise |
| Variabilidade da velocidade | Variação percentual em velocidades discretas durante uma corrida |
| Velocidade de execução | Tempo para atravessar o túnel/comprimento do túnel |
Tabela 2. Descrição dos parâmetros da marcha. Esta tabela descreve os parâmetros os mais de uso geral da marcha; os utilizados neste estudo são indicados em negrito.
Discussion
Neste estudo, testamos o PrAnCER, um novo sistema automatizado de análise de marcha que utiliza vídeos com contraste produzido usando um piso translúcido para obscurecer o corpo do animal e produzir impressões de pata claramente definidas para uma detecção automatizada simples. O PrAnCER identifica com precisão as impressões de pata e é sensível às mudanças na função motora. Utilizou-se o PrAnCER para avaliar as alterações da marcha em um modelo agudo de Haloperidol da DP. Embora o haloperidol não induziu os deficits esperados do motor de um modelo robusto do paládio, nós éramos não obstante capazes de demonstrar que PrAnCER pode exatamente detectar mudanças em testes padrões do porte. Por fim, quantificamos a acurácia do PrAnCER e demonstramos que sua mensuração dos parâmetros-chave da marcha é comparável à da Pontuação manual.
Em ambas as condições tratadas com Haloperidol, observou-se uma alta incidência de comportamento de congelamento (acinesia) seguida de uma resposta de escape de corrida ou limite para frente. Embora a acinesia tenha sido observada em uma dose semelhante (0,25 mg/kg) em vários estudos16,23, esse comportamento delimitador não é consistente com os sintomas típicos de parkinsonianos3,14,19, a 24. Curiosamente, descobrimos que o tratamento com Haloperidol de alta dose resultou em um aumento significativo do comprimento da passada. Este achado foi inicialmente surpreendente porque outros modelos de Haloperidol de PD mostraram uma diminuição no comprimento da passada3,19. No entanto, eles fazem sentido à luz do padrão de comportamento ' órbito-escape ' descrito por de Ryck et al. (1980), que relataram que os ratos correm para escapar após períodos acinéticos, e que as andamentos de alta velocidade, como corrida e delimitação, estão associadas com o aumento da passada comprimento4,25 (Figura 8C). O tratamento da dose elevada igualmente conduziu à área de contato máxima significativamente aumentada das patas traseiras. O tratamento com Haloperidol de baixa dose resultou em alterações mais características da marcha do PD, incluindo um aumento significativo na duração da postura e na área de contato máxima (figura 8a-B). Estes resultados podem ser uma reflexão da rigidez do músculo associada com o akinesia Haloperidol-induzido.
Apesar do comportamento incomun do bracing-escape, nós pudemos demonstrar que PrAnCER pode certamente detectar alterações no porte. Nós mostramos que nas condições de iluminação corretas, um assoalho translúcido pode produzir uma imagem altamente contrastada e detalhada das patas. No presente estudo, fizemos um pavimento transparente translúcido, cobrindo-o com Vellum. O mesmo efeito poderia ser conseguido colocando uma outra cobertura translúcida, como Mylar, sobre um piso transparente. Alternativamente, o assoalho próprio poderia ser translúcido usando, por exemplo, o plexiglass geado. O assoalho translúcido e a passagem simples do plexiglass são baratos e podem ser construídos em uma tarde. Nosso sistema de análise baseado em detecção de borda é resiliente a muitas variações no aparelho e oferece limiares ajustáveis para adaptar o sistema a diferentes configurações, modelos de doenças ou animais menores, como camundongos.
Algumas análises do parâmetro do porte foram alteradas das fórmulas convencionais por causa dos aspectos da passagem. Por exemplo, nosso método de cálculo da velocidade difere de outros estudos de marcha; o assoalho translúcido combinado com a iluminação do diodo emissor de luz obscurece a vista do corpo, assim que não é possível seguir a posição do corpo para calcular a velocidade como é feito geralmente. Para este estudo, a velocidade foi calculada dividindo-se a distância percorrida entre dois contatos da mesma pata no momento do primeiro contato ao segundo contato. Claro, outras fórmulas podem ser usadas. Por exemplo, se uma medida geral de velocidade for necessária, pode-se dividir a distância da média de locais do forepaw no início e no final da execução pela duração da execução.
Nossa análise confirma que, embora não seja idêntica à pontuação manual, nosso sistema automatizado executa com alta precisão e gera medidas confiáveis de marcha. O aparelho aqui descrito foi otimizado para uma análise simples e de baixo custo da função motora. No entanto, várias alterações poderiam ser feitas que expandiriam a utilidade do PrAnCER. Uma limitação de nosso sistema é que o assoalho semitransparente, ao permitir a deteção excelente da pata, obscurece o eixo do corpo dos animais. Embora não tenhamos encontrado necessário, isso pode ser resolvido através da adição de uma câmera aérea para o sistema. Outra melhoria seria o uso de uma câmera de vídeo com uma taxa de quadros maior. Embora tenhamos sido capazes de obter estimativas consistentes de parâmetros temporais, a precisão dessas medidas é comprometida a taxas de quadros abaixo de 100 fps8. Adicionar uma câmara de vídeo de alta velocidade não exigiria nenhuma alteração do software da análise ao aumentar a exatidão e a precisão de medidas temporais. Além disso, vários outros sistemas de marcha usam um espelho para registrar simultaneamente as visões laterais e ventrais do rato2,8,13. Adicionar este recurso ao nosso aparelho permitiria uma quantificação mais precisa da velocidade e uma melhor observação do comportamento durante as corridas.
Neste estudo, mostramos que o uso de um pavimento semitransparente efetivamente isola as estampas de pata, bloqueando a visibilidade dos objetos que não estão em contato com o piso da passarela. Desenvolvemos um sistema de Pontuação automatizado que aproveita essa impressão de pata de alto contraste para identificar com precisão as patas. Nós mostramos que este sistema, PrAnCER, quantificou parâmetros da marcha com uma exatidão comparável aos sistemas comerciais. Nós determinamos que a administração de uma dose elevada de Haloperidol aumentou o comprimento da passada e a área máxima do contato comparada ao soro fisiológico. Quando esta mudança for o oposto do que nós esperávamos, uma revisão mais adicional da literatura existente indica que é provavelmente parte do comportamento do escape observado em resposta à administração aguda do Haloperidol. O tratamento do Haloperidol da baixa dose conduziu aos sintomas mais típicos do paládio tais como a duração aumentada da postura e a área máxima do contato. Nós concluímos que quando a administração elevada aguda do Haloperidol da dose for um modelo pobre para estudar prejuízos da marcha associados com o paládio, nosso estudo entretanto demonstrou a habilidade de PrAnCER de detectar exatamente mudanças na função de motor. No futuro, esperamos validar ainda mais o PrAnCER estudando as mudanças locomotoras em outros modelos de doenças.
Disclosures
Os autores não têm conflitos de interesse para divulgar.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pelo Instituto Carney para a ciência do cérebro na Universidade de Brown.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gait Walkway Apparatus | |||
| 1/4" clear plexiglass | RISD 3D Store, Providence, RI | Approximate Price: $50 1 piece cut to 3 1/2" W x 36" L; 2 pieces cut to 4 1/2" W x 36" L Note: We made our walkway 36" long based off of an exisiting plexiglass table we had in house, it could easily be made longer if desired. |
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| 1/4" clear plexiglass | RISD 3D Store, Providence, RI | Approximate Price: $10 4 pieces, cut to 1" W by 4" L These will be used to keep the tunnel in place |
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| 10 series 80/20 framing pieces, 1" x 1" T-Slotted Profile | 80/20 Inc. | 1010-S | Approximate Price: $16 2 pieces cut to 36" L |
| 12V Flexible LED Strip Lights, 16.4ft/5m LED Light Strips, Daylight White | Amazon | Approximate Price: $10 | |
| Bostik Blu-Tack Adhesive | Amazon | Approximate Price: $8 | |
| Clearprint 1000H drafting vellum, 16 LB cotton fiber | Dick Blick Art Supplies | 11101-1046 | Approximate Price: $50 Cut to 4" W x 36" L Note: This particular vellum comes as a roll; we kept it on the roll and cut it to 4" W. Mylar or frosted plexiglass could also be used in place of the vellum, but the camera software detection settings would need to be adjusted. |
| Logitech HD Pro Webcam C920, 1080p | Amazon | Approximate Price: $50 | |
| Mobile Laptop Computer Desk Cart Height-Adjustable | Amazon | Approximate Price: $40 Small table to place the animals' home cage on at the end of the walkway. |
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| Plastic ramp | Pets Warehouse | Approximate Price: $6 Optional: Ramp to assist the animals descend into home cage |
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| RetiCAM Tabletop Tripod with 3-Way Pan/Tilt Head | Amazon | Approximate Price: $30 | |
| SCIGRIP #16 solvent cement for acrylic - clear, medium bodied | Amazon | Approximate Price: $8 | |
| Plexiglass table | Approximate Price: $ | ||
| 15 series 80/20 framing pieces, 1.5" x 1.5" T-Slotted Profile | 80/20 Inc. | 1515 | Approximate Price: $110 6 pieces cut to 36" L, 2 pieces cut to 12" With both ends tapped with standard 5/16-18 threads Framing for the plexiglass table top and table legs |
| 15 series 3 Way - Light Squared Corner Connector | 80/20 Inc. | 14177 | Approximate Price: $24 4 connectors To connect the table top and legs |
| 1/4" clear plexiglass sheet | RISD 3D Store, Providence, RI | Approximate Price: $50 Cut at 15" W x 39" L |
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| 5/16-18 x 1" Button Head Socket Cap Screw | 80/20 Inc. | 3118 | Approximate Price: $5 Quantity = 12 |
| Deluxe Leveling Feet, 5/16-18 x 2" | 80/20 Inc. | 2194 | Approximate Price: $50 Quantity = 4 For table legs |
| “T” Handle Ball End Hex Wrench, 3/16" | 80/20 Inc. | 6000 | Approximate Price: $5 |
References
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