Summary
Biz yeni bir yürüyüş analiz sistemi, Pati-Baskı Analizi Kontrast-Gelişmiş Kayıtların (PrAnCER), otomatik olarak yeni bir yarı saydam zemin kullanan sıçanlarda yürüyüş özelliklerinin sayısallaştırılması için bir açık erişimotomatik sistem açıklar yürüyüş miktarını ölçün. Bu sistem Parkinson Hastalığı haloperidol modeli kullanılarak doğrulandı.
Abstract
Yürüyüş analizi, birçok kemirgen hastalığı modelinde motor fonksiyondaki değişiklikleri ölçmek için kullanılır. Araştırma birçok alanda yürüyüş ve motor fonksiyonu değerlendirmenin önemine rağmen, mevcut ticari seçenekler yüksek maliyet ve erişilebilir, açık kod eksikliği gibi çeşitli sınırlamalar vardır. Bu sorunları gidermek için, yürüyüş otomatik olarak niceleme için PrAnCER, Pati-Baskı Kontrast-Gelişmiş Kayıtların Analizini geliştirdik. Kontrastı artırılmış kayıtlar, yüzeyle temas halinde olmayan nesneleri gizleyen yarı saydam bir zemin kullanılarak üretilir ve yürürken farenin pençe izlerini etkin bir şekilde izole eder. Bu videoları kullanarak, bizim basit yazılım programı güvenilir spatiotemporal yürüyüş parametreleri çeşitli ölçer. PrAnCER'ın motor fonksiyondaki değişiklikleri doğru bir şekilde tespit edebildiğimizi göstermek için Parkinson hastalığının haloperidol modelini (PH) çalıştırdık. Sıçanları iki doz haloperidol ile test ettik: yüksek doz (0.30 mg/kg) ve düşük doz (0.15 mg/kg). Haloperidol önemli ölçüde düşük doz durumda duruş süresi ve arka pençe temas alanı arttı, bir PD modelinde beklendiği gibi. Yüksek doz durumunda, temas alanında benzer bir artış değil, aynı zamanda adım uzunluğu beklenmedik bir artış bulundu. Daha fazla araştırma ile, bu artan adım uzunluğu yaygın haloperidol yüksek dozlarda gözlenen destekleyici-kaçış fenomeni ile tutarlı olduğunu bulundu. Böylece PrAnCER, kemirgen yürüyüş desenlerinde hem beklenen hem de beklenmeyen değişiklikleri tespit edebildi. Ayrıca, PrAnCER'ın yürüyüş parametrelerinin manuel skorlama ile karşılaştırıldığında tutarlı ve doğru olduğunu doğruladık.
Introduction
Kemirgenler yaygın artrit1dahil olmak üzere hastalık ve yaralanmaların geniş bir yelpazede çalışma modelleri olarak kullanılır 1 , Parkinson Hastalığı (PD)2,3, nöromüsküler bozukluklar4,5, hidrosefali6 , ve omurilik yaralanması7. Bu koşullarda, ağrı, denge ve motor fonksiyon gibi belirtiler hayvanların yürüyüş desenleri incelenerek ölçülebilir. Bu desenler, pati izlerinin yerini ve zamanlamasını ve yerdeki pençe temas alanını özetleyen bir dizi spatiotemporal yürüyüş parametresi kullanılarak ölçülür.
Yürüyüş analizi için birçok seçenek mevcut olsa da, geçerli sistemlerin çeşitli dezavantajları vardır. Geleneksel mürekkep ve kağıt testlerinde, bir hayvanın pençeleri bir beyaz kağıt tabakasında yürümeden önce mürekkeple kaplanır (Şekil 1A). Ortaya çıkan pençe baskıları daha sonra adım uzunluğu ve duruş genişliği için ölçülebilir, ancak hız veya adım süresi gibi anahtar zamansal yürüyüş parametreleri değerlendirilemez. Modern video tabanlı sistemler daha güvenilirdir, ancak uygun bir otomatik sistem kullanılmadığı sürecevideo analizi zahmetli kare kare puanlama gerektirir 8. Şu anda mevcut olan birçok ticari otomatik puanlama sistemi vardır, ancak bu sistemler son derece pahalı olabilir. Ayrıca, bu sistemler net döşeme veya bazı durumlarda, koşu bandı, her ikisi de doğal hareketi değiştirmek güveniyor. Koşu bantları bazı hastalık modellerinde motor açıkları maske gösterilmiştir9, net döşeme ise (Şekil 1B) fareler açık bir alanın çevresinde daha fazla zaman harcamak neden olur, artan anksiyete gösteren10. İdeal olarak, bir yürüyüş analiz cihazı hayvan için en az stres ile en doğal hareket desenleri üreten, ya güvenmek olmaz.
Mevcut açık kaynak ve ticari seçenekler, değişken ışık koşullarına, hayvan rengine ve baskı şekillerine rağmen hayvanın vücudundan bir ayak izini yalıtma nın zorluğunun üstesinden gelmek için çeşitli yöntemler kullanır. Bazı basınç7yanıt olarak ışık serbest yüzeyleri kullanarak pençeleri temas kontrast geliştirmek,11,12, ama bu pahalı ve teknik olarak inşa etmek zordur. Diğer sistemler tüm vücut koordinasyonu gözlem izin birden fazla görüş açıları kullanmak8,13. Bu seçenekler yürüyüş ötesinde ek motor parametreleri ölçmek için avantajlar sunarken, basit yürüyüş analizi için gereksiz yere karmaşıktır. Ayrıca, tüm bu teknikler doğal davranışı değiştiren net döşeme, güveniyor.
PrAnCER, baskıların algılanmasını geliştirmek için aydınlatma ve yarı saydam bir zeminin birleşimini kullanan Kontrastlı Gelişmiş Kayıtlar dediğimiz şeye dayanmaktadır. Aşağıdan bakıldığında, bu yüzeyle temas olmayan nesnelerin (hayvanın vücudu) görünümünü gizlerken yüksek kontrastlı bir görüntü (pençe izi) oluşturur (Şekil 1D). Yukarıdan bakıldığında, zemin opak görünür. Yöntemimizde pençelerin belirginliği, yeni geliştirilen otomatik sistemimiz tarafından çeşitli yürüyüş ve lokomotor özelliklerin doğru tanımlanmasına izin verir. Bu çalışmada, cihazı, yürüyüş analiz protokolümüzü ve otomatik puanlama sistemimiz PrAnCER'ı tanımlıyoruz. Cihazlarımız kolayca monte edilir ve PrAnCER çok çeşitli hastalık ve yaralanma modellerinde motor açıklarını değerlendirmek için kullanılabilir.
PrAnCER anormal yürüyüş desenleri tespit etmek için kullanılabilir göstermek için, biz PD bir haloperidol modeli, lokomotor değişikliklerin geçici indüksiyon için basit bir model kullanılır14. Haloperidol yaygın bir antipsikotik olarak kullanılan bir dopamin reseptör antagonistolduğunu 1. Bu striatum dopamin sinyali değiştirerek motor sistemleri etkiler, bazal gangliyon motor yolunun önemli bir bileşeni14. Haloperidol bile tek bir doz hızla striatum ekstrasellüler dopamin düzeylerini azaltır, Parkinson benzeri motor defecits neden15. Davranışsal etkileri kas sertliği, akinesia, ve catalepsy, alışılmadık bir pozisyonda yerleştirildikten sonra normal bir duruş dönmek için bir yetersizlik olarak tanımlanır11,16. Haloperidol'un akut dozları motor fonksiyonunun rotarod testinde tanımlanabilir lokomotor açıklara neden olur17. Haloperidol aracılı lokomotor bozuklukların otomatik yürüyüş analizine erişilebilen bir dizi özellikte de belirgin olacağını gerekçelendik.
Haloperidol'a verilen tepkiler çalışmalarda büyük farklılıklar gösterse de haloperidol'un kattaleptik etkileri 0.5 mg/kg ve üzeri dozlarda ortaya çıkarken, düşük dozlarda azalma duyarlılığı ve motor bozukluğu saptanabilir (0.1 - 0.3 mg/kg)16, 17- Haloperidol'un cataleptik etkilerinden kaçınmak amacıyla iki doz haloperidol'u test etmeye karar verdik: yüksek doz (0.30 mg/kg) ve düşük doz (0.15 mg/kg). Tablo1'de gösterildiği gibi, Deney 1 yüksek doz haloperidol'un etkilerini incelerken, Deney 2 düşük doz haloperidol'un etkilerini test etti. Biz her sıçan yüksek doz, düşük doz ve kontrol (tuzlu) koşullarda test edildi bir iç konu tasarımı kullanılır. Durum sırası fareler arasında dengelendi. Haloperidol'un akut uygulamasının, hız azalması, azalmış adım uzunluğu ve daha uzun duruş süresi3,14,18 gibi ph'ın diğer modellerinde bulunanlara benzer yürüyüş bozukluklarına neden olacağını öngörmüştük. ,19. Her iki dozda da haloperidol uygulaması sonrası akinezisi de dahil olmak üzere davranış değişiklikleri gözlemledik. Düşük doz durumunda, sıçanlar önemli ölçüde duruş süresi ve arka pençe temas alanı artmıştı, beklendiği gibi. Bu yürüyüş değişiklikleri PD hastaları arasında yaygın yavaş, karıştırmaadımları karşılaştırılabilir 2,20. Yüksek doz durumunda, ancak, biz adım uzunluğu bir artış yanı sıra pençe temas alanında bir artış gördüm. Adım uzunluğundaki artış beklenmeyen bir durum olsa da, literatürde yapılan daha fazla inceleme bunun haloperidol kaynaklı destekleyici kaçış yanıtının bir parçası olduğunu göstermiştir. PrAnCER'ın nöroleptik kullanımıyla tutarlı kemirgen yürüyüşündeki Parkinson benzeri değişiklikleri tespit edebildiği sonucuna varıyoruz.
Protocol
Tüm prosedürler Brown Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi yönergelerine uygun idi.
1. Yürüyüş analiz cihazları
- Açık pleksiglas zeminüzerine yerleştirilen net pleksiglas kapalı geçitten (36" L x 3" W x 4.5" H) oluşan yürüyüş analizi yürüyüş yolunu hazırlayın (Şekil2A). 16 LB pamuk lif iplemi vellum yürüyüş yolu ile aynı genişliğe kesilmiş bir parça ile kaplayarak pleksiglas zemin yarı saydam olun.
NOT: Zemini yarı saydam yapmak için başka yöntemler de vardır. - Parçanın ortasını yakalamak için saniyede en az 30 kare kare (fps) kare hızına sahip bir kamerayı kaldırım yolunun hemen altına yerleştirin (Şekil2B).
- Pisti aydınlatmak için 18 LED/ayak yaklaşık 2 inç uzaklıkta ve geçit zemininden 1 inç yukarıda 12 V LED ışıklı bir şerit tutun.
2. Hayvan hazırlığı
- Hayvanların işleme den önce en az 1 hafta boyunca canlı hayata alışmalarına izin verin. Deneybaşlamadan önce fareleri en az 5 gün boyunca tayın. Bu çalışmada yaklaşık 3 aylık 8 erkek Long Evans sıçan kullanılmıştır.
-
Hayvanları test odasına ve oda ışıkları kapalı yürüyüş yoluna alışmak
- Bir hedef kutusu olarak hizmet etmek için yürüyüş yürüyüş yolu sonunda yüzey seviyesinde sıçan ev kafesi yerleştirin. Ev kafesi derin, yaşlı veya lokomotor engelli fareler ev kafesi daha kolay erişim sağlamak için bir rampa veya adım yararlanabilir unutmayın.
- Farenin deneycinin elinden yürümesine izin ver.
- Fareler genellikle ev kafesi içine atlama dan önce etrafa bakmak için geçit sonunda duracak. Bir sıçan geçit çıkmak için 1 dakikadan daha uzun sürerse, nazik bir itme ile ev kafesi girmek için teşvik edin.
- Sıçan etrafında dönerse, geçit "başlangıç" ucunu engellemek için pleksiglas küçük bir parça kullanın. Toplam 3 tur için tekrarlayın.
- En az 2 gün veya fareler donma olmadan sabit bir hızda yürüyüş rahat geçene kadar alışkanlık.
3. Yürüyüş test prosedürü
- Pençe baskılarının en net resmini elde etmek için web kamerası yazılımındaki ayarları ayarlayın. Tüm yürüyüş testleri için oda ışıklarını kapatın.
- Her çalıştırmayı ayrı ayrı kaydedin ve otomatik analiz programıyla kullanıma uygun şekilde etiketlendi.
- Vellum üzerinde hiçbir nokta veya enkaz olmadığından emin olun. Fare geçit girmeden önce birkaç saniye kaydetmeye başlayın ve sıçan geçitten çıkıp ev kafesine girdiğinde durun.
- Kabul edilebilir üç çalıştırma tamamlanana veya 10 dakika geçene kadar devam edin.
- Her sıçan arasında etanol ile geçit aşağı silin ve gerektiği gibi vellum değiştirin.
NOT: Kabul edilebilir bir deneme, hayvanın koşunun ilk 4 adımı için sürekli ve duraksamadan yürüdükleri deneme olarak tanımlanır. Bunu başarmak zorsa, ölçütleri, çalışmasırasında duraklamalar veya ani hızlanma olmadan meydana gelen herhangi bir noktada art arda 4 adım ın bulunduğu denemeleri içerecek şekilde ayarlayın.
4. PrAnCER otomatik analizi
- Tüm videoları bir klasöre çözümlenecek şekilde koyun.
- Python komut dosyası PrAnCERçalıştırarak PrAnCER başlatın. PrAnCER videoları Şekil 3 ve Şekil4'te gösterilen adımlara göre analiz edecektir.
- Açılan menüde, klasör seç düğmesine basarak belirtilen klasörü seçin. İstenirseniz çözümleme için özel seçenekleri seçin. Her parametrenin ayrıntılı açıklamaları, yanlarındaki soru işaretini tıklatarak bulunabilir. Tamamlandığında Devam'ı tıklatın.
- Görünen geçit görüntüsünde ilgi çekici bir bölge (YG) tanımlayın. Bunu yapmak için, bir alt kenarı tanımlamak için bir üst kenarı tanımlamak için sol tıklatın ve sağ tıklatın. Görünen kutu doğruysa, devam etmek için N tuşuna basın. Değilse, geri almak için Z tuşuna basın. N tuşuna basıldığında program otomatik olarak çalışır.
- PrAnCER tamamlandıktan sonra terminale Enter tuşuna basarak programı sonlandırın.
- PrAnCER tarafından sonuç çıktısını el ile gözden geçirmek için Python komut dosyası GaitEditorGUI'yi çalıştırın ve her video için uygun .mp4 dosyasını seçin. Gerekirse, yanlış tanımlanmış veya birleştirilmiş baskıları düzeltin.
- Uzamsal ve zamansal yürüyüş parametrelerini ayıklamak için Python komut dosyası ParameterAnalyzer'ıçalıştırın. Analiz etmek için arka yazdırma sayısını ve analiz etmek için video klasörünü seçin, sonra Devam'ı tıklatın. Bu, Tablo 2'de açıklanan ve Şekil5'te gösterilen bir dizi ortak yürüyüş parametreleri içeren her video için bir .csv dosyası çıkaracaktır.
NOT: Tam komut dosyalarının yanı sıra verileri okuma ve analiz etme talimatları yazarın GitHub'ında (www.github.com/hayleybounds) mevcuttur. Bu algoritmayı ücretsiz, açık kaynak Python kitaplığıOpenCV 21'i kullanarak uyguladık. Ayrıca GitHub bizim yürüyüş analizi geçit bina için talimatlar dahildir.
Representative Results
Haloperidol prosedürü
Bu yürüyüş analiz sistemini, kontrol farelerinde yürüyüş parametrelerini çeşitli lokomotor, yürüyüş ve denge bozuklukları göstermesi beklenen deneysel sıçanlarla karşılaştırmak için geliştirdik. Biz her sıçan tuzlu, yüksek doz haloperidol ve düşük doz haloperidol koşullarda test edildi bir konu içinde tasarım kullanılır. Sıçanlar dengelemeye izin vermek için iki gruba (A ve B) ayrıldılar; yürüyüş testi günün saati ve koşul sırası için dengelendi. Her test 48 h. Sıçanlar hafifçe saline veya haloperidol intraperitoneal (IP) enjeksiyonları almadan önce izofluran ile anestezi ile ayrıldı. Yürüyüş test edildi 1 h post-enjeksiyon, hangi noktada haloperidol pik seviyelerde olmalıdır15,16,17.
Davranışsal sonuçlar
Haloperidol ile tedavi edilen hayvanlarda belirgin davranış değişiklikleri gözlemledik. Yüksek doz durumunda, sekiz sıçandan beşi, geçitin başında hareketsizlik dönemleri geçirdi ve bu esnada deneycinin onlara dokunmasına tepki vermiyorve hareket etmeye karşı dirençliydiler. Bazı durumlarda, bu durum fare geçitten çıkarılana kadar birkaç dakika devam etti. Diğer durumlarda, hareketsiz sıçan aniden hızla hareket edecek ya da geçit boyunca "bağlı" ve daha sonra sonuna yakın hareketsiz duruma geri dönecekti. Düşük doz durumunda, 8 sıçandan 3'ü benzer hareketsizlik dönemleri geçirdi. Bu dozda, sınırlayıcı davranışın sadece bir örneği vardı. Hayvanlara tuzlu su ile tedavi edildiğinde sınırlama gözlenmedi.
Haloperidol'un aşağıdaki yürüyüş parametreleri üzerindeki etkilerini analiz ettik: destek tabanı, adım uzunluğu, adım hızı, duruş süresi, salıncak oranına duruş oranı, maksimum temas alanı ve şehirlerarası mesafe. Ön ve arka ekstremiteler için birçok yürüyüş parametreleri aynı olduğundan ve haloperidol genellikle tüm uzuvlar üzerinde tek tip etkileri vardır, biz sadece arka ekstremiteler için parametreleri hesaplanan ve sol ve sağ ekstremiteler için veri ayrı vermedi. Her sıçan için, her test gününden tüm kullanılabilir çalıştırmalardan her yürüyüş parametresinin ortalamasını hesapladık. Tüm parametreler (hız değişkenliği dışında) bir çalıştırmanın ilk 4 kullanılabilir adımının ortalaması olarak hesaplanmıştır. Haloperidol'un her dozunun yürüyüşü önemli ölçüde etkileyip etkilemediğini değerlendirmek için eşleştirilmiş bir örnek t-testi kullandık. Deney 1'de, yüksek doz haloperidol ile tedavi edilen hayvanlarda (Şekil6A; t(7) = -2.962, p = 0.021) ve maksimum temas alanında (Şekil6A; t(7) = -2.51, p = 0.04) önemli bir artış görüldü. Destek tabanı, hız, duruş süresi ve duruş oranı önemli değildi. Deney 2'de, düşük doz haloperidol verilen hayvanlar da serum un durumuna göre duruş süresinde (Şekil6B; t(7) = -2.444, p = 0.044) ve maksimum temas alanında (Şekil6B; t(7) = -3.085, p = 0.018) anlamlı bir artış gösterdi. Başka yürüyüş parametreleri anlamlı değildi. Buna ek olarak, destek tabanındaki yüksek doz ve düşük doz haloperidol koşulları (Şekil6C; t(7) =2.651, p = 0.033), maksimum temas alanı (Şekil6C; t(7) = 4.635, p = 0.002) ve interlimb mesafesi arasında anlamlı bir fark vardı ( Şekil 6C; t(7) = 3.098, p = 0.017).
Konum doğruluğunuz ve otomatik sistemdeki hatalar
PrAnCER'ın doğruluğunu değerlendirmek için, otomatik analizini 6 kontrol faresinden oluşan ayrı bir gruptan rastgele seçilmiş 21 videonun manuel puanlaması ile karşılaştırdık. Elle puanlama amacıyla, videolar daha sonra baskı ların konumlarını el ile işaretlemek için kullanılan bir görüntü dizisine dönüştürüldü. Verimlilik için, analizlerimizi sadece arka baskılardan ölçülen uzamsal verilere odakladık. Biz her video için ortalama adım uzunluğu ve BOS ayıklanır ve otomatik değerleri ile karşılaştırıldı. Ortalama adım uzunluğu manuel puanlama ve PrAnCER analizi arasında anlamlı olarak farklı olmasa da (Şekil7B; t(20) = -0.01, p = 0.99), destek tabanı anlamlıydı (Şekil7A; t(20) = -2.21, p = 0.038). Otomatik ve manuel puanlama genellikle iyi korelasyon olmasına rağmen, otomatik sistem ortalama% 5 daha büyük BOS bildirdi. Bu fark algılama hatalarından çok santrifüj seçimindeki farklılıklardan kaynaklanıyor olabilir. El ile puanlama için, baskı konumu, PrAnCER'ın kütle tahmini merkezi yöntemini el ile çoğaltmak zor olacağından, her arka baskının tabanının etrafında bir oval çizimle işaretlenmiştir. Açık eğilim PrAnCER BOS abartmak için, belki de bazı hayvanlar asimetrik bir şekilde ayak oyun olabilir çünkü, PrAnCER manuel puanlama daha aşırı santriomlar gözlemlemek için neden oldu. Diğer sistemler de tutarlı adım uzunluğu önlemler17rağmen manuel ve otomatik puanlama arasında BOS önemli artışlar kaydetti. Gözlenen küçük farklılıklar ve diğer sistemlerle tutarlılık göz önüne alındığında, PrAnCER'ın yürüyüş parametrelerinin güvenilir bir ölçüsü olduğu sonucuna varıyoruz.
PrAnCER GUI kullanılarak otomatik çıktının manuel olarak düzeltilmesi yapıldıktan sonra tüm doğruluk analizlerinin gerçekleştiğini belirtmek önemlidir. Mevcut ticari sistemlerde olduğu gibi, bu adım hem puanlama hatalarının düzeltilmesi hemde 22 kriterlerine uymayan çalıştırmaların ortadan kaldırılması için gereklidir. PrAnCER'ı yanlış pozitiflerin yanında hata yapacak şekilde ayarladık, çünkü bunlar post-hoc'u düzeltmek daha kolaydır. PrAnCER'ın 500'den fazla videonun manuel olarak düzeltilmesi sırasında gerçek bir baskıyı tespit edemediğini hiç gözlemlemedik. Ancak diğer hata türleri gözlendi. Bunlar 3 kategoriye ayrılmıştır: yanlış algılamalar (baskı olarak yazdırılmayan bir tespit), yanlış sınıflandırmalar (ön/arka veya sol/sağ olarak yanlış etiketlenmiş baskı) ve yanlış kombinasyonlar (iki baskı yanlış birleştirilmiş). Bu hatalar, eşlik eden GUI'de kolayca düzeltilir ve genellikle normal koşullarda çekilen videoların yalnızca küçük bir yüzdesinde görülür. Bu tür düzeltmelerle bile PrAnCER, yürüyüş analizinde yer alan el emeği miktarını belirgin bir şekilde azaltır. Her video için PrAnCER'ı çalıştırmak ve çıktı hatalarını düzeltmek için yaklaşık 3 dakika sürdüğünü tahmin ediyoruz (gerekirse), aynı videoyu elle puanlamak ve analiz etmek yaklaşık 10 dakika sürer.
Şekil 1. Yürüyüş analizi yöntemlerinin karşılaştırılması. (A) Geleneksel mürekkep ve kağıt yöntemi pençe şekli ve konumu kesin olmayan baskılar üretir. (B) Şeffaf bir zeminile video kayıt pençe baskılar ayrıntılı bir görünüm verir ama otomatik puanlama karmaşıklaştıran sıçan vücudundan birçok belirgin özellikleri içerir. (C) Açık bir zemin üzerinde hafif kağıt gürültülü bir görüntü oluşturur ve ayrıntıları kaybeder. (D) Yarı saydam bir zemin oluşturmak için vellum kullanımı görsel vücut ortadan kaldırırken son derece ayrıntılı baskılar üretir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2. Yürüyüş geçit aparatı ve video kaydı şematik illüstrasyon. (A) Fare aşağıdan kaydedilirken ev kafesi hedef kutusuna yarı saydam bir zemin ile açık bir geçit ten yürür. Bu durumda, vellum saydam yapmak için şeffaf bir zemin kapsar. Geçit, uzunluğu boyunca hayvanın ayakları ile gövdesi arasında bir düzeyde yerleştirilen LED şeritler ile aydınlatılır. (B) Yarı saydam zeminin etkilerini gösteren bir video kaydının ekran görüntüsü. İki pati açıkça görülüyor, ama farenin vücudu aslında tespit edilemez. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3. Bir pençe baskı bir kare için algılama işlemi. (A) Orijinal görüntü gürültüden arındırılır ve arka plan çıkarma (B)tabi tutulur. (C) Bir kenar algılama algoritması uygulanır ve sonuçlar bir dizi X, Y koordinatlarına dönüştürülür ve konturlar (D)adı verilir. (E) Konturlar yakınlık la gruplanır ve grubun konveks gövdesi (sınırlayıcı kutu) baskıyı kapsayan tek bir kontur üretmek için alınır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4. Bireysel algılamaların gizli bir baskıya dönüştürülmesi. (A) Pençe baskıları ilk olarak bir çerçeve kümesinde tanımlanır. (B) Tek tek nesne algılamalarına, bir patinin (C)tek bir yerleşimini temsil eden, baskı olarak tanımlayan bir sayı verilir. (D) Son olarak, hayvanın yolunun orta çizgisine göre konumlarına göre sol veya sağ, önceki pati izinlere göre konumlarına göre ön veya arka olarak sınıflandırılırlar. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5. Yürüyüş parametrelerinin çizimi analiz edildi. (A) Pençe baskılarının kimliğini ve konumunu gösteren bir örnek çıktı. Özgün algılanan kenarlar siyah renkte gösterilir. Son tespit pençeleri ve yaklaşık alan pençe sınıflandırması gösteren renklerde gösterilir. Bu şekilde, sarı: ön sol, yeşil: arka sol, camgöbeği: ön sağ ve macenta: arka sağ. Ancak, python komut dosyasında kullanıcı tercihine göre renkler değiştirilebilir. (B) Iki ana zamansal parametreleri gösteren bir arsa: her pençe zemin (duruş aşaması) ve havada (salıncak faz) temas süresi miktarı. Renkli bloklar duruş aşamasını, beyaz boşluklar ise salıncak aşamasını gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6. Haloperidol'un yürüyüş üzerindeki etkileri. (A) Deney Sonuçları 1: yüksek dozhaloperidol (Hal H) önemli ölçüde tuzlu durum (Sal) ile karşılaştırıldığında adım uzunluğu ve maksimum temas alanı arttı. (B) Deney 2 daha tipik parkinson semptomları ile sonuçlandı; düşük doz haloperidol(Hal L) önemli ölçüde duruş süresi ve maksimum temas alanı arttı. (C) Her iki deneyden haloperidol tedavi koşulları karşılaştırılırken, yüksek doz haloperidol düşük doz durumuna göre destek tabanı, maksimum temas alanı ve interlimb mesafesi arttı. Veri , ± SEM, n =8 anlamına gelir. Eşleştirilmiş örnekler t-test farklılıkları aşağıdaki gibidir: # p < 0.05, ## p < 0.01. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 7. Otomatik analizin doğruluğu. (A) Otomatik sistem BOS ölçüm yaparken manuel puanlama önemli ölçüde farklıdır, bu algılama hataları yerine manuel santridik seçimi varyasyonları nedeniyle olabilir, ancak. (B) Otomatik sistem, adım uzunluğu için manuel puanlamadan önemli ölçüde farklı değildir. Bu doğruluk sonuçları, mevcut diğer sistemlerden elde edilenlerle tutarlıdır. Veriler ± SEM, n = 21 anlamına gelir. Eşleştirilmiş örnekler t-test farklılıkları aşağıdaki gibidir: # p < 0.05. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 8. Zamansal parametrelerin karşılaştırılması. Salin (A) ve düşük doz haloperidol (B) ile tedavi edilen bir hayvan için temporal yürüyüş desenleri. (C) Yüksek doz haloperidol verilen bir sıçan dan destekleyici kaçış yanıtı bir örnek. Şekil5'te olduğu gibi, renkli bloklar pençenin zeminle ne zaman temas ettiğini (duruş fazı) ve beyaz boşlukların pençenin havada (salıncak fazı) ne zaman olduğunu gösterir. Kısaltmalar: FL, ön sol; HL, arka sol; FR, ön sağ; HR, sağa hind. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Deney 1 | Deney 2 | |||||||
| Test 1 | Test 2 | Test 3 | Test 4 | Test 5 | Test 6 | Test 7 | Test 8 | |
| A Grubu | HalH | Sal | HalH | Sal | Sal | HalL | Sal | HalL |
| B Grubu | Sal | HalH | Sal | HalH | HalL | Sal | HalL | Sal |
Tablo 1. Deneysel tasarım. Bu tablo, bu çalışmada kullanılan deneysel tasarımı göstermektedir. Biz her sıçan yüksek doz haloperidol test edildi bir içkonu tasarımı kullanılan (Hal H), düşük doz haloperidol (HalL)ve tuzlu (Sal) koşulları. Sıçanlar iki gruba ayrıldı; test, günün saati ve koşul sırası için dengelendi.
| Parametre | Tanımı |
| Adım Uzunluğu | Aynı pençenin ardışık kontakları arasındaki mesafe |
| Adım Uzunluğu | Hareket yönü ekseni boyunca kontralateral ön veya arka pençelerin ardışık temasları arasındaki mesafe |
| Destek Tabanı (BOS) | Hareket yönünde eksene dik ardışık kontralateral ön veya arka pençeleri arasındaki mesafe |
| Maksimum İletişim Alanı | Bir arka baskının en fazla algılanan alanı |
| Interlimb mesafesi | Ipsilateral ön ve arka pençeleri arasındaki mesafe |
| Duruş Süresi | Bir pençenin toprakla temas halinde olduğu süre. |
| Salıncak Süresi | Bir pençenin yerde olmadığı süre. |
| Duruş-Salıncak Oranı (SSR) | Duruş süresi/salıncak süresi |
| Ayrık Hız | Bir pati için adım uzunluğu/(duruş süresi + salıncak süresi) |
| Ortalama Hız | Analizde kullanılan dönemdeki ayrık hızların ortalaması |
| Hız Değişkenliği | Çalışma sırasında ayrık hızlarda yüzde değişim |
| Çalışma Hızı | Tünelin tünelini/uzunluğunu geçme zamanı |
Tablo 2. Yürüyüş parametrelerinin açıklaması. Bu tabloda en sık kullanılan yürüyüş parametreleri açıklanır; bu çalışmada kullanılan kalın gösterilir.
Discussion
Bu çalışmada, hayvanın vücudunu gizlemek ve basit otomatik algılama için net bir şekilde tanımlanmış pençe baskıları elde etmek için yarı saydam bir zemin kullanılarak üretilen kontrastlı gelişmiş videoları kullanan yeni bir otomatik yürüyüş analiz sistemi olan PrAnCER'ı test ettik. PrAnCER, pençe baskılarını doğru bir şekilde tanımlar ve motor işlevindeki değişikliklere karşı hassastır. Pd'nin akut haloperidol modelinde yürüyüş değişikliklerini değerlendirmek için PrAnCER kullandık. Haloperidol sağlam bir PH modelinin beklenen motor açıklarını tetiklemese de, PrAnCER'ın yürüyüş desenlerinde ki değişiklikleri doğru bir şekilde tespit edebildiğini gösterdik. Son olarak, PrAnCER'ın doğruluğunu ölçtük ve anahtar yürüyüş parametrelerinin ölçümünün manuel puanlama ile karşılaştırılabilir olduğunu gösterdik.
Haloperidol'un her iki tedavi koşulunda da, yüksek bir donma davranışı insidansı (akinezisi) ve ardından ileri doğru koşma nın veya sınırlamanın kaçış yanıtını gözlemledik. Akinesia benzer bir dozda gözlenmiştir iken (0.25 mg /kg) çeşitli çalışmalarda16,23, Bu sınırlayıcı davranış tipik Parkinson belirtileri ile tutarlı değildir3,14,19, 24. yıl. İlginçtir, biz yüksek doz haloperidol tedavisi önemli ölçüde artış adım uzunluğu ile sonuçlandı bulundu. PD diğer haloperidol modelleri adım uzunluğu3bir azalma göstermiştir çünkü bu bulgu başlangıçta şaşırtıcı oldu ,19. Ancak, de Ryck ve ark.'nın (1980) açıkladığı ve farelerin benzer dönemlerden sonra kaçmak için koştuklarını ve koşma ve bağlama gibi yüksek hızlı yürüyüşlerin artan adımlarla ilişkili olduğunu bildiren 'destekleyici-kaçış' davranış modeli ışığında anlamlıdırlar. uzunluk4,25 (Şekil 8C). Yüksek doz tedavi de önemli ölçüde arka pençeleri maksimum temas alanı artmış sonuçlandı. Düşük doz haloperidol tedavisi duruş süresi ve maksimum temas alanında önemli bir artış da dahil olmak üzere daha karakteristik PH yürüyüş değişiklikleri ile sonuçlandı (Şekil8A-B). Bu sonuçlar haloperidol kaynaklı akinesia ile ilişkili kas sertliğinin bir yansıması olabilir.
Alışılmadık destekleyici kaçış davranışına rağmen, PrAnCER'ın yürüyüşteki değişiklikleri gerçekten tespit edebildiğini gösterdik. Biz doğru aydınlatma koşullarında, yarı saydam bir zemin pençeleri son derece kontrastlı ve ayrıntılı bir görüntü üretebilir gösterdi. Bu çalışmada, şeffaf bir zemin vellum ile kaplayarak yarı saydam yaptı. Aynı etki, Mylar gibi başka bir yarı saydam kaplamanın şeffaf bir zeminüzerine yerleştirilmesiyle elde edilebilir. Alternatif olarak, zemin kendisi kullanarak yarı saydam olabilir, örneğin, buzlu pleksiglas. Yarı saydam zemin ve basit pleksiglas geçit ucuzdur ve öğleden sonra inşa edilebilir. Kenar algılama tabanlı analiz sistemimiz cihazdaki birçok değişikiğe dayanıklıdır ve sistemi farklı kurulumlara, hastalık modellerine veya fare gibi küçük hayvanlara uyarlamak için ayarlanabilir eşikler sunar.
Bazı yürüyüş parametresi analizleri, geçitin yönleri nedeniyle geleneksel formüllerden değiştirildi. Örneğin, hız hesaplama yöntemimiz diğer yürüyüş çalışmalarından farklıdır; LED aydınlatma ile birlikte yarı saydam zemin gövde nin görünümünü gizler, bu nedenle genellikle yapılır hızı hesaplamak için vücut konumunu izlemek mümkün değildir. Bu çalışmada hız, aynı pençenin iki kontağı arasında kat edilen mesafenin ilk temastan ikinci temasa bölünmesi yle hesaplanmıştır. Tabii ki, diğer formüller kullanılabilir. Örneğin, genel bir hız ölçüsü gerekiyorsa, koşunun başındaki ve sonundaki forepaw konumlarının ortalamasından, çalışma süresine göre mesafe bölünebilir.
Analizlerimiz, manuel skorlama ile aynı olmamakla birlikte, otomatik sistemimizin yüksek doğrulukla performans gösterdiğini ve güvenilir yürüyüş önlemleri ürettiğini doğrulamaktadır. Burada açıklanan cihaz, motor fonksiyonunun basit, düşük maliyetli analizi için optimize edildi. Ancak, PrAnCER kullanışlılığını genişletecek çeşitli değişiklikler yapılabilir. Sistemimizin bir sınırlaması, yarı saydam zeminin, mükemmel pençe tespitine izin verirken, hayvanların vücut eksenini gizlemesidir. Biz gerekli bulamadık rağmen, bu sisteme bir havai kamera ekleyerek ele alınabilir. Başka bir gelişme daha yüksek bir kare hızı ile bir video kamera kullanımı olacaktır. Zamansal parametrelerin tutarlı tahminlerini elde etmeyi başardık, ancak bu önlemlerin doğruluğu 100fps 8'in altındaki kare hızlarda tehlikeye atılabilir. Yüksek hızlı video kamera eklemek, zamansal önlemlerin doğruluğunu ve hassasiyetini artırırken analiz yazılımında hiçbir değişiklik gerektirmez. Ayrıca, diğer birçok yürüyüş sistemleri aynı anda sıçan2,8,13lateral ve ventral görünümleri kaydetmek için bir ayna kullanın. Bu özelliği niçin cihaza eklemek, koşular sırasında hızın daha doğru ölçülmesi ve davranışın daha iyi gözlemlenmesine izin verir.
Bu çalışmada, yarı saydam bir zeminin kullanılmasının, geçit zemini ile temas eden nesnelerin görünürlüğünü engelleyerek pençe izlerini etkili bir şekilde izole ettiğini gösterdik. Pençeleri doğru bir şekilde tanımlamak için bu yüksek kontrastlı pençe baskısından yararlanan otomatik bir puanlama sistemi geliştirdik. Bu sistemin, PrAnCER'ın, ticari sistemlerle karşılaştırılabilir bir doğrulukla, ölçülü yürüyüş parametrelerini ölçtektik. Yüksek dozda haloperidol uygulamasının tuzluya göre adım uzunluğu ve maksimum temas alanının arttığını belirledik. Bu değişiklik beklediğimizin tam tersi olmakla birlikte, mevcut literatürün daha fazla gözden geçirilmesi haloperidol'un akut uygulamasına yanıt olarak gözlenen kaçış davranışının bir parçası olduğunu göstermektedir. Düşük doz haloperidol tedavisi artmış duruş süresi ve maksimum temas alanı gibi daha tipik PH semptomları ile sonuçlandı. Akut yüksek doz haloperidol uygulamasının PH ile ilişkili yürüyüş bozukluklarını incelemek için kötü bir model olduğu sonucuna varırken, çalışmamız prancer'ın motor fonksiyondaki değişiklikleri doğru bir şekilde tespit etme yeteneğini göstermiştir. Gelecekte, diğer hastalık modellerindeki lokomotor değişiklikleri inceleyerek PrAnCER'ı daha da doğrulamayı umuyoruz.
Disclosures
Yazarların ifşa etmesi gereken çıkar çatışmaları yok.
Acknowledgments
Bu çalışma Brown Üniversitesi'ndeki Carney Beyin Bilimi Enstitüsü tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gait Walkway Apparatus | |||
| 1/4" clear plexiglass | RISD 3D Store, Providence, RI | Approximate Price: $50 1 piece cut to 3 1/2" W x 36" L; 2 pieces cut to 4 1/2" W x 36" L Note: We made our walkway 36" long based off of an exisiting plexiglass table we had in house, it could easily be made longer if desired. |
|
| 1/4" clear plexiglass | RISD 3D Store, Providence, RI | Approximate Price: $10 4 pieces, cut to 1" W by 4" L These will be used to keep the tunnel in place |
|
| 10 series 80/20 framing pieces, 1" x 1" T-Slotted Profile | 80/20 Inc. | 1010-S | Approximate Price: $16 2 pieces cut to 36" L |
| 12V Flexible LED Strip Lights, 16.4ft/5m LED Light Strips, Daylight White | Amazon | Approximate Price: $10 | |
| Bostik Blu-Tack Adhesive | Amazon | Approximate Price: $8 | |
| Clearprint 1000H drafting vellum, 16 LB cotton fiber | Dick Blick Art Supplies | 11101-1046 | Approximate Price: $50 Cut to 4" W x 36" L Note: This particular vellum comes as a roll; we kept it on the roll and cut it to 4" W. Mylar or frosted plexiglass could also be used in place of the vellum, but the camera software detection settings would need to be adjusted. |
| Logitech HD Pro Webcam C920, 1080p | Amazon | Approximate Price: $50 | |
| Mobile Laptop Computer Desk Cart Height-Adjustable | Amazon | Approximate Price: $40 Small table to place the animals' home cage on at the end of the walkway. |
|
| Plastic ramp | Pets Warehouse | Approximate Price: $6 Optional: Ramp to assist the animals descend into home cage |
|
| RetiCAM Tabletop Tripod with 3-Way Pan/Tilt Head | Amazon | Approximate Price: $30 | |
| SCIGRIP #16 solvent cement for acrylic - clear, medium bodied | Amazon | Approximate Price: $8 | |
| Plexiglass table | Approximate Price: $ | ||
| 15 series 80/20 framing pieces, 1.5" x 1.5" T-Slotted Profile | 80/20 Inc. | 1515 | Approximate Price: $110 6 pieces cut to 36" L, 2 pieces cut to 12" With both ends tapped with standard 5/16-18 threads Framing for the plexiglass table top and table legs |
| 15 series 3 Way - Light Squared Corner Connector | 80/20 Inc. | 14177 | Approximate Price: $24 4 connectors To connect the table top and legs |
| 1/4" clear plexiglass sheet | RISD 3D Store, Providence, RI | Approximate Price: $50 Cut at 15" W x 39" L |
|
| 5/16-18 x 1" Button Head Socket Cap Screw | 80/20 Inc. | 3118 | Approximate Price: $5 Quantity = 12 |
| Deluxe Leveling Feet, 5/16-18 x 2" | 80/20 Inc. | 2194 | Approximate Price: $50 Quantity = 4 For table legs |
| “T” Handle Ball End Hex Wrench, 3/16" | 80/20 Inc. | 6000 | Approximate Price: $5 |
References
- Lakes, E. H., Allen, K. D. Gait analysis methods for rodent models of arthritic disorders: reviews and recommendations. Osteoarthritis and Cartilage. 24 (11), 1837-1849 (2016).
- Lee, H. Y., Hsieh, T. H., Liang, J. I., Yeh, M. L., Chen, J. J. Quantitative video-based gait pattern analysis for hemiparkinsonian rats. Medical & Biological Engineering & Computing. 50 (9), 937-946 (2012).
- Zhou, M., et al. Gait analysis in three different 6-hydroxydopamine rat models of Parkinson’s disease. Neuroscience Letters. 584, 184-189 (2015).
- Batka, R. J., Brown, T. J., Mcmillan, K. P., Meadows, R. M., Jones, K. J., Haulcomb, M. M. The need for speed in rodent locomotion analyses. Anatomical Record. 297 (10), 1839-1864 (2014).
- Guillot, T. S., Asress, S. A., Richardson, J. R., Glass, J. D., Miller, G. W. Treadmill gait analysis does not detect motor deficits in animal models of Parkinson’s disease or amyotrophic lateral sclerosis. Journal of Motor Behavior. 40 (6), 568-577 (2008).
- Williams, M. T., et al. Kaolin-induced ventriculomegaly at weaning produces long-term learning, memory, and motor deficits in rats. International Journal of Developmental Neuroscience. 35, 7-15 (2014).
- Hamers, F. P. T., Koopmans, G. C., Joosten, E. A. J. CatWalk-assisted gait analysis in the assessment of spinal cord injury. Journal of Neurotrauma. 23 (3-4), 537-548 (2006).
- Kloefkorn, H. E., et al. Automated Gait Analysis Through Hues and Areas (AGATHA): A Method to Characterize the Spatiotemporal Pattern of Rat Gait. Annals of Biomedical Engineering. 45 (3), 711-725 (2017).
- Pereira, J. E., et al. A comparison analysis of hindlimb kinematics during overground and treadmill locomotion in rats. Behavioural Brain Research. 172 (2), 212-218 (2006).
- Nakamura, A., et al. Low-cost three-dimensional gait analysis system for mice with an infrared depth sensor. Neuroscience Research. 100, 55-62 (2015).
- Hamers, F. P., Lankhorst, A. J., van Laar, T. J., Veldhuis, W. B., Gispen, W. H. Automated quantitative gait analysis during overground locomotion in the rat: its application to spinal cord contusion and transection injuries. Journal of Neurotrauma. 18 (2), 187-201 (2001).
- Mendes, C. S., Bartos, I., Márka, Z., Akay, T., Márka, S., Mann, R. S. Quantification of gait parameters in freely walking rodents. BMC Biology. 13 (50), (2015).
- Machado, A. S., Darmohray, D. M., Fayad, J., Marques, H. G., Carey, M. R. A quantitative framework for whole-body coordination reveals specific deficits in freely walking ataxic mice. eLife. 4, (2015).
- Duty, S., Jenner, P. Animal models of Parkinson’s disease: a source of novel treatments and clues to the cause of the disease. British Journal of Pharmacology. 164 (4), 1357-1391 (2011).
- Kulkarni, S. K., Bishnoi, M., Chopra, K. In vivo microdialysis studies of striatal level of neurotransmitters after haloperidol and chlorpromazine administration. Indian Journal of Experimental Biology. 47 (2), 91-97 (2009).
- Jain, N. S., Tandi, L., Verma, L. Contribution of the central histaminergic transmission in the cataleptic and neuroleptic effects of haloperidol. Pharmacology Biochemistry and Behavior. 139 (Part A), 59-66 (2015).
- Steinpreis, R. E., Anders, K. A., Branda, E. M., Kruschel, C. K. The Effects of Atypical Antipsychotics and Phencyclidine (PCP) on Rotorod Performance. Pharmacology Biochemistry and Behavior. 63 (3), 387-394 (1999).
- Baptista, P. P. A., et al. Physical exercise down-regulated locomotor side effects induced by haloperidol treatment in Wistar rats. Pharmacology, Biochemistry, and Behavior. 104, 113-118 (2013).
- Chuang, C. S., Su, H. L., Cheng, F. C., Hsu, S., Chuang, C. F., Liu, C. S. Quantitative evaluation of motor function before and after engraftment of dopaminergic neurons in a rat model of Parkinson’s disease. Journal of Biomedical Science. 17 (9), (2010).
- Bugalho, P., Alves, L., Miguel, R. Gait dysfunction in Parkinson’s disease and normal pressure hydrocephalus: a comparative study. Journal of Neural Transmission. 120 (8), 1201-1207 (2013).
- Bradski, G. The OpenCV Library. , (2000).
- Chen, H., Du, J., Zhang, Y., Barnes, K., Jia, X. Establishing a Reliable Gait Evaluation Method for Rodent Studies. Journal of Neuroscience Methods. 283, 92-100 (2017).
- De Ryck, M., Hruska, R. E., Silbergeld, E. K. Estrogen and haloperidol-induced versus handling-related catalepsy in male rats. Pharmacology, Biochemistry, and Behavior. 17 (5), 1027-1035 (1982).
- Bellardita, C., Kiehn, O. Phenotypic Characterization of Speed-Associated Gait Changes in Mice Reveals Modular Organization of Locomotor Networks. Current Biology. 25 (11), 1426-1436 (2015).
- De Ryck, M., Schallert, T., Teitelbaum, P. Morphine versus haloperidol catalepsy in the rat: a behavioral analysis of postural support mechanisms. Brain Research. 201 (1), 143-172 (1980).
