Summary
Здесь мы представляем протокол для обработки свежего костного мозга (БМ), изолированного от мыши или человека для высокомерной массовой цитометрии (Цитометрия Time-Of-Flight, CyTOF) анализ нейтрофил-линии клеток.
Abstract
В этой статье мы представляем протокол, который оптимизирован для сохранения нейтрофил-линии клеток в свежем БМ для всего анализа BM CyTOF. Мы использовали миелоидно-предвзятый 39-антитела CyTOF панели для оценки гематопоитической системы с акцентом на нейтрофил-линии клеток с помощью этого протокола. Результат CyTOF был проанализирован с помощью алгоритма уменьшения измерения с открытым ресурсом, viSNE, и данные были представлены, чтобы продемонстрировать результаты этого протокола. Мы обнаружили новые популяции нейтрофилов линий клеток на основе этого протокола. Этот протокол свежего целого препарата БМ может быть использован для 1), анализ CyTOF, чтобы обнаружить неопознанные популяции клеток из всего БМ, 2), исследуя целые дефекты БМ для пациентов с заболеваниями крови, такими как лейкемия, 3), помогая оптимизации Флуоресценция активированный поток цитометрии протоколы, которые используют свежий весь БМ.
Introduction
В последние несколько десятилетий, методы цитометрии были мощным инструментом для исследования гематопоетической системы в БМ. Эти методы включают флуоресценцию активированный поток цитометрии и новый метод CyTOF с использованием тяжелых металлов помечены антителами. Они привели к открытиям многих типов клеток в неоднородном биологическом образце, идентифицируя их уникальные профили выражения поверхностных маркеров. Увеличенное перекрытие спектра, связанное с большим количеством каналов, приводит к более высокой неточности данных в приложениях цитометрии с активацией флуоресценции. Таким образом, нежелательные клетки регулярно удаляются для того, чтобы обогатить группы клеток, представляющих интерес для флуоресценции активированный анализ цитометрии потока. Например, Ly6G (или Gr-1) и CD11b считаются зрелыми маркерами миелоидных клеток, а Ly6G (или Gr-1) и CD11b - клетки обычно удаляются из образцов БМ с помощью комплектов магнитного обогащения до анализа цитометрии гематопоитических стволовых и прародителей клеток (HSPCs) или путем объединения этих маркеров в одном канале свалки коктейль1,2,3. Другим примером является то, что нейтрофилы обычно удаляются из образца крови человека, чтобы обогатить периферические моноядерные клетки крови (PBMC) для иммунологических исследований. Весь костный мозг, изолированный от мыши или человека, однако, редко исследуются нетронутыми для анализа цитометрии.
В последнее время CyTOF стал революционным инструментом дляисследования гематопойтической системы 4,5,6. С CyTOF, флюорофор-маркированные антитела заменены тяжелыми антителами репортер-маркированного элемента. Этот метод позволяет замерить более 40 маркеров одновременно без беспокойства перекрытия спектра. Это позволило провести анализ нетронутых биологических образцов без предистоистой меры или канала свалки. Таким образом, мы можем просматривать гематопоиетическую систему комплексно с высокой объемностью содержания из обычных 2-D потока цитометрии участков. Популяции клеток, опущенные в прошлом во время процесса истощения или gating, теперь могутбыть выведены на свет с помощью высокомерных данных, генерируемых CyTOF 4,5. Мы разработали антителой панели, которая одновременно измеряет 39 параметров в гематопоетической системе с акцентом на миелоидный linage7. По сравнению с обычными данными цитометрии потока, интерпретация и визуализация беспрецедентных одноклеточных высокомерных данных, генерируемых CyTOF, является сложной задачей. Вычислительные ученые разработали методы уменьшения размерности для визуализации высокомерных наборов данных. В этой статье мы использовали алгоритм viSNE, который использует t-Distributed Stochastic Neighbor Embedding (t-SNE) для анализа данных CyTOF и представления высокомерного результата на 2-мерной карте, сохраняя при этом высокомерную структуру данных8,9,10. На участке tSNE похожие ячейки группируются в подмножества, и цвет используется для выделения особенностей ячеек. Например, на рисунке 1 миелоидные клетки распределены по нескольким подмножествам клеток на основе сходства их моделей выражения 33 поверхностных маркеров в результате CyTOF (Рисунок 1)4. Здесь мы исследовали мыши костного мозга с нашими ранее сообщалось 39-маркер CyTOF панели viSNE анализа7. ViSNE анализ наших данных CyTOF показал неопознанную популяцию клеток, которые показали, как HSPC (CD117)и нейтрофил (Ly6G)характеристики (Рисунок 2)7.
В заключение, мы представляем протокол для обработки свежего костного мозга для анализа CyTOF. В этой статье мы использовали костный мозг мыши в качестве примера, в то время как этот протокол также может быть использован для обработки образцов костного мозга человека. Детали, характерные для образцов костного мозга человека, также отмечены в протоколе. Преимущество этого протокола в том, что он содержит такие детали, как время инкубации и температура, которые были оптимизированы для сохранения нейтрофил-линии клеток в целом костного мозга, чтобы исследование на нетронутыми весь костный мозг. Этот протокол также может быть легко изменен для флуоресценции активированный поток цитометрии приложений.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все эксперименты следовали утвержденным руководящим принципам Института аллергии и иммунологии Ла Хойя по уходу за животными и использованию комитета, и разрешение на использование грызунов было получено от Института аллергии и иммунологии Ла Хойя в соответствии с критериями, изложенными в Руководство по уходу и использованию лабораторных животных от Национальных институтов здравоохранения.
1. Урожай мышь костного мозга (BM)
- Покупка c57BL/6J мышей от коммерческого поставщика. Кормите стандартный грызун чау диеты и дома в микроизолатор клетки в патоген-бесплатно объекта.
- Используйте мышей мужского пола, возраст 6-10 недель, для экспериментальных целей. Эвтаназия путем вдыхания CO2 с последующим вывихом шейки матки.
- Поместите мышь на стерильную хирургическую площадку с стороной живота вверх. Стерилизовать кожу живота и задних конечностей области путем распыления 70% этанола. Используйте пару вскрытия хирургических ножниц, чтобы сократить брюшной полости открытым.
- Удалите кожу, чтобы разоблачить задние конечности. Используйте пару тупых наконечников одевания щипцы держать мышь голени прямо под лодыжкой. Используйте еще одну пару изогнутых щипцы для стабилизации голени ниже тупой кончик одевания щипцы. Перерыв голени и разоблачить кости, срывая мышцы с тупым наконечником одевания щипцы.
ПРИМЕЧАНИЕ: Голени свободно прилагается к коленному суставу и может быть легко выбрал с помощью тупой кончик одевания щипцы. - Поместите голени в холодный 1x PBS.
- Затем переместите стабилизирующие изогнутые декораты вниз к бедренной кости. Слайд тупой кончик одевания щипцы ниже коленного сустава и удерживайте коленную чашу. Вывихните коленную чашечку, осторожно потянув его вверх. Разоблачить бедренную киша, срывая мышцы, прикрепленные к коленной чашечке. Держите подвергаются бедренной кости на изогнутые щипцы и отрезать бедренную кость от нижней части кости с помощью вскрытия хирургических ножниц.
- Поместите бедренную княженку в холодный 1x PBS.
- Пробить отверстие в 0,5 мл микроцентрифуговой трубки с 18 G иглы.
- Поместите обе голени и бедренной кости в тот же 0,5 мл микроцентрифуговой трубки с открытым концом костей, обращенных вниз к отверстию.
- Поместите трубку 0,5 мл, содержащую как голени и бедренной кости, в микроцентрифугную трубку 1,7 мл.
- Вращайте двухслойные трубки, содержащие как голени, так и бедренную кишну при 5510 х г на 30 с в микроцентрифуге.
- Убедитесь, что БМ извлекается из костей и гранулирует в нижней части трубки. Подготовьте трубку 0,5 мл, содержащую священные кости. Мышь BM готова к следующим шагам.
ПРИМЕЧАНИЕ: Человек БМ собирают на клинических ресурсах, как ранее описано11.
2. Пятно БМ клетки для CyTOF
- Resuspend БМ в 1 мл 1x Красная кровяная клетка (РБК) лиза буфера. Для человека БМ, resuspend весь БМ в 10-х объем1x Красная кровяная клетка (РБК) лиза буфера. Инкубировать в течение 10 минут при комнатной температуре (RT).
- Спин трубки на 350 х г в течение 5 мин при 4 c. Для человека БМ, повторить шаг 2.1 и 2.2, прежде чем приступить к шагу 2.3.
- Тщательно аспирируйте супернатант и оставьте гранулы ненарушенными. Отрежь гранулы с 1 мл холодного 1x PBS. Фильтр гранулы в 15 мл конической трубки через 70 мкм ячейки ситечко. Клетки BM теперь вполне изолированы в пробку от твердых частиц мышцы и косточки. Вымойте клетки, добавив 9 мл холодного 1x PBS в трубку.
- Спин 15 мл трубки на 350 х г в течение 5 минут при 4 градусах Цельсия.
- Тщательно аспирируйте супернатант и resuspend клетки BM с 10 мл холодной PBS. Возьмите аликвот клеток для подсчета. Подсчитайте клетки с помощью гемоситометра.
- Aliquot 5 x 106 БМ-клеток в новую трубку 15 мл для окрашивания CyTOF.
- Спин 15 мл трубки aliquot на 350 х г в течение 5 мин при 4 c.
- Тщательно аспирируйте супернатант и повторно езмите бМ-клетки с 125 нм цисплатин в 1 мл CyTOF окрашивания буфера в качестве индикатора жизнеспособности для образца. Инкубировать в течение 5 мин на RT.
- После инкубации добавьте 4 мл буфера окрашивания CyTOF в трубку. Спин трубки на 350 х г в течение 5 мин при 4 c. Для человека БМ, добавить 10% человека AB сыворотки в CyTOF окрашивая буфер.
- Тщательно аспирируйте супернатант и повторно ездовые клетки БМ с 50 ЗЛ Fc Receptor блокируя решение. Инкубировать в течение 10 мин при 4 градусах По Цельсию. Пропустить этот шаг для человека БМ.
- Добавьте 50 зл домашних антител CyTOF5 к образцу, так что общий объем окрашивания составляет 100 л. Аккуратно пипетка для смешивания. Инкубировать в течение 30 мин при 4 градусах Цельсия. Окончательный объем коктейля антитела составляет 100 л как для мыши БМ, так и для образцов БМ человека.
- Добавьте 2 мл буфера окрашивания CyTOF к каждой трубке после инкубации, чтобы вымыть клетки, вращайте трубку при 350 х г в течение 5 минут при 4 градусах Цельсия.
- Повторите шаг 2.12 для в общей сложности двух стир.
- Приготовьте свежий раствор формальдегида 1,6% из 16% бульонного ампулы. Разбавить 1 часть бульона формальдегидом с 9 частями 1x PBS.
- Тщательно аспирируйте супернатант и resuspend гранулы с 1 мл свежий 1,6% FA раствор. Инкубировать в течение 15 минут на RT.
- Спин трубки на 800 х г в течение 5 мин при 4 c.
- Тщательно аспирируйте супернатант и resuspend клеточной гранулы с 125 нм интеркалации раствора в 1 мл исправить / пермский буфер.
- Инкубировать образец в растворе интеркалации на ночь при 4 градусах Цельсия.
3. Подготовка ячеек для приобретения CyTOF
- Аккуратно вихревые и спиновые клетки при 800 х г в течение 5 мин при 4 градусах По цельсию.
- Вымойте клетки, добавив 2 мл буфера окрашивания CyTOF, спиновые клетки на 800 х г в течение 5 минут при 4 кв с и удалить супернатант с помощью аспирации.
- Resuspend клетки в 1 мл diH2O. Зарезервируйте небольшой объем (примерно 10 л) из каждой трубки для подсчета клеток.
- Спиновые клетки при 800 х г в течение 5 мин при 4 градусах По цельсию.
- Повторите шаг 3.3 и 3.4.
- Тщательно аспирируйте супернатант и оставьте клетки в гранулах. Клетки БМ теперь готовы к повторной приостановке до концентрации 1 х 106 ячеек/мл для приобретения CyTOF.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Рисунок 1 представлен в качестве примера экспериментов CyTOF. На этом участке tSNE клетки через несколько тканей мыши были сгруппированы в подмножества на основе сходства их профилей выражения поверхности маркера, измеренных 33-параметрной панелью CyTOF. Клетки с более похожими свойствами были автоматически сгруппированы вместе, такие как нейтрофилы, макрофаги или DCs на основе выражения 33 маркеров на каждой клетке.
Рисунок 2 представлен в качестве примера для мыши BM CyTOF эксперимент с использованием протокола, представленного в данном исследовании. Протокол сохранил целостность всего БМ, что привело к открытию ранее неизвестной популяции клеток, которая совместно выражает нейтрофил (Ly6G , Рисунок 2A) и HSPC (CD117, Рисунок 2B) подписи поверхностных маркеров Одновременно. Эта популяция клеток показывает четкую картину выражения поверхностного маркера, измеренного нашей панелью CyTOF(рисунок 2C)и была опущена предыдущими исследованиями миелоидных прародителей из-за истощения клеток Ly6Gи 1,2, 3. Что еще более важно, этот результат привел к открытию небольшого подмноза кластера в левую сторону карты viSNE, которая не выражает Ly6G, однако, была тесно сгруппирована с клетками CD117иLy6G, что говорит о сходстве этих клетки нейтрофильной линии на основе выражения 39 маркеров, используемых для этого эксперимента CyTOF.
Мы использовали профиль выражения маркера из данных CyTOF, показанных на рисунке 2C, чтобы построить 13-цветную панель FACS (флуоресцентно-активированная сортировка клеток), которая позволяет нам изолировать нейтрофил-прародителей по цитометрии потока для функциональных анализов вниз по течению ( Рисунок 3).
Рисунок 1: Пример сюжета tSNE получен в результате CyTOF. Агрегированная размерность tSNE уменьшила одноклеточные данные из всех проанализированных тканей мышей, были построены и закодированы 28 «неконтролируемыми» кластерами. Грубые идентификаторы каждого кластера были аннотированы на основе различных опубликованных анализов. Эта цифра была изменена из ссылки4. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2 : Автоматизированный одноклеточный анализ Лин-CD117-Ly6A/E- клетки HSPC в костном мозге идентифицируют различные нейтрофильные популяции прародителей. карты viSNE Lin-CD117-Ly6A/E- клетки HSPC отображаются в виде точечных накладок для отображения 5 автоматизированных кластеров. (A) Ly6G и (B) шаблон выражения CD117 показан на карте viSNE Lin-CD117-Ly6A/E- клетки HSPC как цветные точки спектра. (C) Шаблоны выражения указанных маркеров отображаются как накладки гистограмм каждого кластера. Эта цифра была изменена из ссылки7. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3 : Стратегия FACS gating продемонстрирована с помощью набора данных массового цитометрии (CyTOF). Ручно закрытой целевой популяции был обратно закрыто на автоматизированной карте viSNE для проверки. Эта цифра была изменена из ссылки7. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В последние десятилетия цитометрия на основе флуоресценции была использована вкачестве основного метода изучения клеточных линий и неоднородности 1,2,3. Хотя цитометрия потока предоставила многомерные данные, этот метод ограничен выбором параметров и спектральным перекрытием. Чтобы преодолеть слабость цитометрии потока, мы воспользовались CyTOF, который использует изотопы тяжелых металлов вместо фторофоров для обозначения антител, которые устраняют перекрестный разговор между детекторными каналами или аутофлюоресценции клеток, поэтому могут измерять многие больше параметров одновременно на одноклеточном уровне и генерировать гораздо более глубокую оценку клеточного разнообразия12. Популяции клеток опущены в прошлом во время истощения или gating процесса, особенно важные иммунные клетки, как нейтрофил-линии клеток, которые долгое время считались однородными13,14, может быть лучше характеризуется CyTOF 2 ,3,7.
Для размещения этого мощного инструмента цитометрии CyTOF для изучения неоднородности клеток и характеристики редких популяций клеток, протоколы, которые сохраняют целостность биологических образцов, чрезвычайно практичны для исследований неоднородности. Здесь мы описали протокол для обработки всего БМ для CyTOF, что позволяет всеобъемлющей характеристики новых популяций клеток в нетронутой целом БМ, которые могут быть использованы для мыши или человеческих исследований. Весь костный мозг, изолированный от мыши и человека, содержит популяции клеток, особенно нейтрофиловые линии клеток, которые очень хрупки и чувствительны к изменениям окружающей среды, таким как температурные и культурные условия. В этом протоколе мы оптимизировали температуру и условия инкубации для каждого шага, чтобы сохранить эти чувствительные популяции до максимального уровня. Поступая таким образом, целостность всех клеток костного мозга хорошо защищена. С персонализированной маркерной панелью, включенной в этот протокол, исследователи могут определить больше клеток, представляющих интерес в различных областях исследований.
Хотя CyTOF является мощным конечным аналитическим инструментом для открытия новых популяций клеток и способен прогнозировать функции новых популяций по их маркерным характеристикам, эта технология ограничена для дальнейших функциональных исследований вниз по течению. Для обеспечения функциональных исследований ниже по течению мы использовали viSNE для всестороннего характеристики каждого кластера путем изучения уровня их экспрессии каждого 39 маркеров и обнаружили различные комбинации маркеров, как показано на рисунке 2C. Хотя данные CyTOF не могут быть применены к современным технологиям сортировки, их преимущество в измерении многих параметров одновременно может помочь нам определить наилучшее сочетание маркеров в ограниченных параметрах. Этот критический этап анализа данных помог нам в полной мере воспользоваться результатами CyTOF для разработки совместимой с Фуоресценции на основе FACS. Например, в этом эксперименте мы использовали эту информацию на рисунке 2C для создания 13-цветной панели FACS, которая позволяет нам изолировать нейтрофил-прародитель (NeP) цитометрией потока для функциональных анализов вниз по течению(рисунок 3). Используя CyTOF и FACS в конвейере, эти методы вместе могли бы позволить изоляцию вновь обнаруженных типов клеток для функциональных исследований, таких как морфология, универсальность, анализы in vitro и исследования in vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Мы хотели бы поблагодарить ядро Цитометрии Потока LJI за помощь в процедуре массовой цитометрии. Эта работа была поддержана грантами NIH R01HL134236, P01HL136275 и R01CA202987 (все до C.C.H) и ADA7-12-MN-31 (04) (в C.C.H. и Y.P.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CyTOF Antibodies (mouse) | |||
| Anti-Mouse CD45 (Clone 30-F11) -89Y | Fluidigm | Cat# 3089005B | |
| Anti-Human/Mouse CD45R/B220 (Clone RA36B2)-176Yb | Fluidigm | Cat# 3176002B | |
| Anti-mouse CD105 (Clone MJ7/18)-Purified | Biolegend | Cat# 120402; RRID:AB_961070 | |
| Anti-mouse CD115 (CSF-1R) (Clone AFS98)-Purified | Biolegend | Cat# 135502; RRID:AB_1937293 | |
| Anti-Mouse CD117/c-kit (Clone 2B8)-166Er | Fluidigm | Cat# 3166004B | |
| Anti-mouse CD11a (Clone M17/4)-Purified | Biolegend | Cat# 101101; RRID:AB_312774 | |
| Anti-Mouse CD11b (Clone M1/70)-148Nd | Fluidigm | Cat# 3148003B | |
| Anti-Mouse CD11c (Clone N418)-142Nd | Fluidigm | Cat# 3142003B | |
| Anti-mouse CD127 (IL-7Rα) (Clone A7R34)-MaxPar Ready | Biolegend | Cat# 133919; RRID:AB_2565433 | |
| Anti-Mouse CD150 (Clone TC1512F12.2)-167Er | Fluidigm | Cat# 3167004B | |
| Anti-mouse CD16.2 (FcγRIV) (Clone 9E9)-Purified | Biolegend | Cat# 149502; RRID:AB_2565302 | |
| Anti-Mouse CD162 (Clone 4RA10 (RUO))-Purified | BD Biosciences | Cat# 557787; RRID:AB_647340 | |
| Anti-mouse CD169 (Siglec-1) (Clone 3D6.112)-Purified | Biolegend | Cat# 142402; RRID:AB_10916523 | |
| Anti-mouse CD182 (CXCR2) (Clone SA044G4)-Purified | Biolegend | Cat# 149302; RRID:AB_2565277 | |
| Anti-mouse CD183 (Clone CXCR3-173)-Purified | Biolegend | Cat# 126502; RRID:AB_1027635 | |
| Anti-mouse CD335 (NKp46) (Clone 29A1.4)-MaxPar Ready | Biolegend | Cat# 137625; RRID:AB_2563744 | |
| Anti-mouse CD34 (Clone MEC14.7)-Purified | Biolegend | Cat# 119302; RRID:AB_345280 | |
| Anti-mouse CD41 (Clone MWReg30)-MaxPar Ready | Biolegend | Cat# 133919; RRID:AB_2565433 | |
| Anti-Mouse CD43 (Clone S11)-146Nd | Fluidigm | Cat# 3146009B | |
| Anti-Mouse CD48 (Clone HM48.1)-156Gd | Fluidigm | Cat# 3156012B | |
| Anti-mouse CD62L (Clone MEL-14)-MaxPar Ready | ThermoFisher | Cat# 14-1351-82; RRID:AB_467481 | |
| Anti-mouse CD71 (Clone RI7217)-Purified | Biolegend | Cat# 113802; RRID:AB_313563 | |
| Anti-mouse CD90 (Clone G7)-Purified | Biolegend | Cat# 105202; RRID:AB_313169 | |
| Anti-Mouse F4/80 (Clone BM8)-159Tb | Fluidigm | Cat# 3159009B | |
| Anti-mouse FcεRIα (Clone MAR-1)-MaxPar Ready | Biolegend | Cat# 134321; RRID:AB_2563768 | |
| Anti-mouse GM-CSF (MP1-22E9 (RUO))-Purified | BD Biosciences | Cat# 554404; RRID:AB_395370 | |
| Anti-Mouse I-A/I-E (Clone M5/114.15.2)-174Yb | Fluidigm | Cat# 3174003B | |
| Anti-Mouse Ki67 (Clone B56 (RUO))-Purified | BD Biosciences | Cat# 556003; RRID:AB_396287 | |
| Anti-Mouse Ly-6A/E (Sca-1) (Clone D7)-169Tm | Fluidigm | Cat# 3169015B | |
| Anti-Mouse Ly6B (Clone 7/4)-Purified | abcam | Cat# ab53457; RRID:AB_881409 | |
| Anti-mouse Ly-6G (Clone 1A8)-MaxPar Ready | Biolegend | Cat# 127637; RRID:AB_2563784 | |
| Anti-Mouse NK1.1 (Clone PK136)-165Ho | Fluidigm | Cat# 3165018B | |
| Anti-Mouse Siglec-F (Clone E50-2440 (RUO))-Purified | BD Biosciences | Cat# 552125; RRID:AB_394340 | |
| Anti-Mouse TCRβ (Clone H57-597)-143Nd | Fluidigm | (Clone H57-597)-143Nd | |
| Anti-mouse TER-119/Erythroid Cells (Clone TER-119)-MaxPar Ready | Biolegend | Cat# 116241; RRID:AB_2563789 | |
| Chemicals, Peptides and Recombinant Proteins | |||
| Antibody Stabilizer | CANDOR Bioscience | Cat# 130050 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | Cat# A4503 | |
| Cisplatin-194Pt | Fluidigm | Cat# 201194 | |
| eBioscience 1x RBC Lysis Buffer | ThermoFisher | Cat# 00-4333-57 | |
| eBioscience Foxp3 / Transcription Factor Staining Buffer Set | ThermoFisher | Cat# 00-4333-57 | |
| EQ Four Element Calibration Beads | Fluidigm | Cat# 201078 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | ThermoFisher | Cat# AM9260G | |
| Fetal Bovine Serum | Omega Scientific | Cat# FB-02 | |
| HyClone Phosphate Buffered Saline solution | GE Lifesciences | Cat#SH30256.01 | |
| Intercalator-Ir | Fluidigm | Cat# 201192B | |
| MAXPAR Antibody Labeling Kits | Fluidigm | http://www.dvssciences.com/product-catalog-maxpar.php | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | Cat# 158127 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | Cat# S2002 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | Cat# X100 | |
| Trypsin EDTA 1x | Corning | Cat# 25-053-Cl | |
| Experimental Model: Organism/Strains | |||
| Mouse: C57BL/6J | The Jackson Laboratory | Stock No: 000664 | |
| Software Alogrithm | |||
| Bead-based Normalizer | Finck et al., 2013 | https://med.virginia.edu/flow-cytometry-facility/wp-content/uploads/sites/170/2015/10/3_Finck-Rachel_CUGM_May2013.pdf | |
| Cytobank | Cytobank | https://www.cytobank.org/ | |
| Cytofkit v1.r.0 | Chen et al., 2016 | https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/cytofkit.html | |
| t-SNE | van der Maaten and Hinton, 2008 | https://cran.r-project.org/web/packages/Rtsne/index.html | |
References
- Akashi, K., Traver, D., Miyamoto, T., Weissman, I. L. A clonogenic common myeloid progenitor that gives rise to all myeloid lineages. Nature. 404, 193-197 (2000).
- Iwasaki, H., Akashi, K. Myeloid lineage commitment from the hematopoietic stem cell. Immunity. 26, 726-740 (2007).
- Manz, M. G., Miyamoto, T., Akashi, K., Weissman, I. L. Prospective isolation of human clonogenic common myeloid progenitors. Proceedings of the National Academy of Sciences. 99, 11872-11877 (2002).
- Becher, B., et al. High-dimensional analysis of the murine myeloid cell system. Nature Immunology. 15, 1181-1189 (2014).
- Bendall, S. C., et al. Single-cell mass cytometry of differential immune and drug responses across a human hematopoietic continuum. Science. 332, 687-696 (2011).
- Samusik, N., Good, Z., Spitzer, M. H., Davis, K. L., Nolan, G. P. Automated mapping of phenotype space with single-cell data. Nature Methods. 13, 493-496 (2016).
- Zhu, Y. P., et al. Identification of an Early Unipotent Neutrophil Progenitor with Pro-tumoral Activity in Mouse and Human Bone Marrow. Cell Reports. 24, 2329-2341 (2018).
- Van der Maaten, L. J. P., Hinton, G. E. Visualizing High-Dimensional Data Using t-SNE. Journal of Machine Learning Research. 9, 2579-2605 (2008).
- Amir, E. A. D., et al. viSNE enables visualization of high dimensional single-cell data and reveals phenotypic heterogeneity of leukemia. Nature Biotechnology. 31, 545-552 (2013).
- van der Maaten, L., Hinton, G.
- Cloos, J., et al. Comprehensive Protocol to Sample and Process Bone Marrow for Measuring Measurable Residual Disease and Leukemic Stem Cells in Acute Myeloid Leukemia. Journal of Visualized Experiment. 133, 56386 (2018).
- Bendall, S. C., Nolan, G. P., Roederer, M., Chattopadhyay, P. K. A deep profiler’s guide to cytometry. Trends in Immunology. 33, 323-332 (2012).
- Ley, K., et al. Neutrophils: New insights and open questions. Science Immunology. 3 (30), 4579 (2018).
- Ng, L. G., Ostuni, R., Hidalgo, A.
