Summary
Interaktioner av transkriptionsfaktorer (TFs) med RNA-polymeras studeras vanligtvis med PULLDOWN-analyser. Vi tillämpar en teknik för Biolayer interferometri (BLI) för att karakterisera interaktionen mellan GrgA och klamydial RNA-polymeras. Jämfört med PULLDOWN-analyser upptäcker BLI realtids Association och dissociation, ger högre känslighet och är mycket kvantitativ.
Abstract
En transkriptionsfaktor (TF) är ett protein som reglerar genuttryck genom att interagera med RNA-polymeras, en annan TF, och/eller mall-DNA. GrgA är en roman transkription Activator finns specifikt i obligate intracellulära bakteriella patogenen klamydia. Protein PULLDOWN-analyser med affinitet pärlor har avslöjat att GrgA binder två σ-faktorer, nämligen σ66 och σ28, som erkänner olika uppsättningar av promotorer för gener vars produkter differentially krävs i utvecklingsstadier. Vi har använt BLI för att bekräfta och ytterligare karakterisera samspelet. BLI visar flera fördelar jämfört med PULLDOWN: 1) det avslöjar realtid Association och dissociation mellan bindande partners, 2) Det genererar kvantitativa kinetiska parametrar, och 3) det kan upptäcka bindningar som PULLDOWN analyser ofta misslyckas med att upptäcka. Dessa egenskaper har gjort det möjligt för oss att härleda de fysiologiska rollerna för GrgA i gen uttrycks reglering i klamydia, och eventuella detaljerade interaktionsmekanismer. Vi ser att denna relativt överkomliga teknik kan vara mycket användbar för att studera transkription och andra biologiska processer.
Introduction
Transkription, som producerar RNA-molekyler som använder DNA som mall, är det första steget i genuttrycket. Bakteriell RNA-syntes börjar efter bindningen av RNA-polymeras (rnap) holoenzym till en mål promotor1,2. Den RNAP holoenzym (RNAPholo) består av en multi-subunit katalytisk kärna (RNAPcore) och en σ Factor, som krävs för att erkänna promotorn sekvensen. Transkription aktivatorer och repressorer, kollektivt kallas TFs, reglera genuttrycket genom de bindande komponenterna i RNAPcore, σ faktorer, och/eller DNA. Beroende på organismen kan en betydande del av arvsmassan ägnas åt TFs som reglerar transkription som svar på fysiologiska behov och Miljösignaler3.
Klamydia är en obligate intracellulär bakterie som ansvarar för en mängd olika sjukdomar hos människor och djur4,5,6,7,8. Till exempel är Chlamydia trachomatis utan tvekan den främsta sexuellt överförbara patogenen i människor över hela världen, och en ledande orsak till blindhet i vissa underutvecklade länder4,5. Klamydia har en unik utvecklingscykel som kännetecknas av två omväxlande cellulära former kallas den elementära kroppen (EB) och nätaktigt Body (RB)9. Medan EBs kan överleva i en extracellulär miljö, de är oförmögna att spridning. EBS ange värdceller genom endocytos och differentiera till större RBS i en vakuol i värdens cytoplasma inom några timmar efter inympning. Inte längre infektiösa, RBS föröka sig genom binär fission. Runt 20 h, börjar de att differentiera tillbaka till EBs, som lämnar värdcellerna runt 30-70 h.
Progression av klamydia utvecklingscykeln regleras genom transkription. En supermajoritet av de nästan 1 000 klamydial generna uttrycks under den midcycle under vilken RBs aktivt replikerar, men endast ett litet antal gener transkriberas omedelbart efter det att EBs har inträtt i värdcellerna för att initiera omvandlingen av EBs till RBs, och en annan liten uppsättning gener transkriberas eller alltmer transkriberas för att möjliggöra differentiering av RBs i EBs10,11.
Klamydia arvsmassan kodar för tre σ-faktorer, nämligen σ66, σ28 och σ54. σ66, som motsvarar den städ-σ70 av E. coli och andra bakterier, är ansvarig för att erkänna initiativtagarna till tidiga och medelcyklande gener samt vissa sena gener, medan σ28 och σ54 krävs för transkription av vissa sena gener. Flera gener är kända för att bära både en σ66-beroende promotor och en σ28-beroende promotor12.
Trots en komplicerad utvecklingscykel har endast ett litet antal TFs hittats i Chlamydiae13. GrgA (tidigare kommenterade som ett hypotetiskt protein CT504 i c. trachomatis serovar D och CTL0766 i c. trachomatis L2) är en KLAMYDIA-specifik TF initialt erkänd som en aktivare av σ66-beroende gener14. Affinitet PULLDOWN-analyser har visat att GrgA aktiverar sin transkription genom att binda både σ66 och DNA. Intressant, det var senare hittades med att GrgA också Co-fällates med σ28, och aktiverar transkription från σ28-beroende initiativtagare in vitro-15. För att undersöka om GrgA har liknande eller olika tillhörighet för σ66 och σ28så använder vi bli. BLI-analyser har visat att GrgA interagerar med σ66 vid en 30-faldig högre affinitet än med σ28, vilket tyder på att Grga kan spela differential roller i σ66-beroende transkription och σ28-beroende transkription 15.
BLI upptäcker interferensmönstret av vitt ljus som reflekterar från ett skikt av immobiliserat protein på spetsen av en biosensor och jämför det med en intern referensskikt16. Genom analysen av dessa två störnings mönster, kan BLI ge värdefull och realtidsinformation om mängden proteinbundet till spetsen av biosensorn. Proteinet den där er immobiliserade till spets om bio sensoren är benämn så den ligand, och är vanligvis immobiliserade med det hjälp av en gemensam kropp eller epitop tag (e.g., en poly-hans-eller biotin-tag) så pass har en affinitet för en förbundet partikel (sådan som nta eller Streptavidin) på spetsen av biosensorn. Bindningen av ett sekundärt protein, kallad analyten, med ligand vid spetsen av biosensorn skapar förändringar i bio sensorns opacitet och leder därför till förändringar i störnings mönstren. Vid upprepad över olika koncentrationer av analyten kan BLI ge inte bara kvalitativ utan även kvantitativ information om affinitet mellan ligand och analyt16.
Till det bästa av vår kunskap var vi de första att anställa BLI att karakterisera protein-protein interaktioner i transkription15. I den här publikationen visar vi att ett GrgA-fragment, som tidigare visats vara obligatoriskt för σ28-bindande, faktiskt förmedlar bindningen. Detta manuskript fokuserar på steg i BLI-analyser och generering av BLI grafer och parametrar för bindningskinetik. Metoder för produktion (och rening) av ligander och analyter täcks inte här.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. beredning av proteiner
- Använd en dialys påse (med lämplig cut-off-storlek) för att dialysera varje protein som ska användas för BLI-analyser (inklusive både den hans-märkta ligand och analyten) mot 1 000 volymer av BLI-bufferten (25 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 0,1 mM EDTA, 10 mM MgCl2 , 0,1 mM DTT, pH 8,0, förkyld till 4 ° c) vid 4 ° c i 4 h.
Anmärkning: BLI-analyser kräver att ligand är närvarande vid koncentrationer som mättat de bindningsställen på biosensorn och analyten som är mycket renade så att de molara koncentrationerna av analyten som reagerar med ligand är kända. Metoder för uttryck och rening av hans-och STREP-märkta proteiner täcks inte här, men finns i tidigare publikationer14,15. Även om detta system inte kräver ligand att vara i höggradig form, är det viktigt att dialyze även orenade ligander till BLI buffert för att minimera förändringar i vitt ljusstörningar mönster som orsakas av eventuella buffert förändringar under analysen. - Byt till färsk BLI buffert och fortsätt dialysen i ytterligare 4 timmar.
2. biosensor hydrering och assay set-up
- Cirka 10 min innan en analys påbörjas, Pipettera 200 μL av BLI-bufferten till ett PCR-rör.
- Ta bort en ni-NTA-biosensor från originalförpackningen genom att hålla den breda delen av biosensorn med en handgjord hand.
- Placera biosensorn över PCR-röret så att endast glas spetsen på biosensorn är nedsänkt i BLI-bufferten.
- Håll biosensor spetsen nedsänkt i minst 10 minuter för att säkerställa full återfuktning.
- Kontrollera att glas spetsen på ni-NTA-biosensorn inte vidrör något annat än BLI-bufferten under ovanstående steg.
Anmärkning: detta protokoll använder en ni-NTA-biosensor i samband med en his-märkta ligand. Vid behov kan en sa-streptavidin-biosensor användas tillsammans med en biotinylerad ligand i stället om: (i) både ligand och analyt bär en tagg eller (II) ingen av dem gör det.
- Kontrollera att glas spetsen på ni-NTA-biosensorn inte vidrör något annat än BLI-bufferten under ovanstående steg.
- Vrid BLItz maskinen på.
- Kontrollera att enheten är ansluten till datorn via en USB-datakälla på maskinens bak.
- På datorn, öppna den tillhörande programvaran (t. ex. BLItz Pro), och klicka på Avancerad Kinetics på vänster sida av skärmen.
- På programvaran skriver du ut all lämplig information om experimentet (inklusive experimentets namn, beskrivning, prov-ID och protein koncentration) under respektive rubrik.
- Klicka på biosensor typ och välj ni-nta i rullgardinsmenyn.
- Under rubriken Kör inställningar kontrollerar du att skakapparaten är inställd på Aktivera.
- Kontrollera att det finns 5 objekt i listan under rubriken stegtyp : ursprunglig baslinje, inläsning, baslinje, Association och dissociation.
Observera: varaktigheten för varje steg kan ändras från standard vid behov. För optimala resultat, Använd minst 30 s för initial baslinje och baslinje; och 120 s för Association och dissociation. Varaktigheten av lastning steg (mellan 120 till 240 s) kommer att bero på koncentrationen av ligand och affinitet av hans-Epitope tag på ligand till ni-NTA-biosensor.
- Ta bort den hydrerade ni-NTA-biosensorn från PCR-röret och fäst den på bio sensorns fäste på maskinen genom att skjuta den breda delen av biosensorn på fästet.
Obs: Låt inte biosensorn torka ut under experimentet. - Placera ett 0,5 mL svart microcentrifugerör i röret innehavaren av maskinen och Pipettera 400 μL av BLI buffert i den.
- Kontrollera att reglaget på maskinen är placerat så att rörhållaren är placerad framför den svarta pilen på maskinen.
- Stäng locket på maskinen så att bio sensorns spets blir nedsänkt i bufferten i microcentrifugeröret.
- Klicka på Nästa på programvaran för att börja spela in den ursprungliga baslinjen.
3. lastning av ligand på biosensor
- När det initiala baslinje steget har slutförts, öppnar du locket på enheten.
- Flytta skjutreglaget till höger så att dropp hållaren (i stället för röret hållaren) är placerad framför den svarta pilen.
- Pipettera över 4 μL av en dialyserad hans-märkta ligand (från steg 1,1) till dropp hållaren och Stäng locket på maskinen.
Obs: den optimala koncentrationen av ligand som skall användas kan variera för varje protein. En koncentration mellan 1,0 till 2,0 mg/mL är vanligtvis tillräcklig för att mätta den NTA vid spetsen av biosensorn i 240 s. - På programvaran klickar du på Nästa för att börja läsa in.
4. tvätta bort ytterligare ligand
- När laddningssteget har avslutats öppnar du locket på maskinen.
- Flytta skjutreglaget till vänster så att röret hållaren återigen ligger framför den svarta pilen.
- Stäng locket på maskinen och se till att biosensor spetsen är nedsänkt i BLI-bufferten på röret i rörhållaren.
- Klicka på Nästa igen på programvaran för att börja registrera baslinjen.
5. sammanslutning av analyt till ligand
- När baslinje steget har avslutats öppnar du locket på enheten.
- Ta bort dropp hållaren och rengör den genom att Pipettera ut vilket protein som helst och skölja det med dubbelavjoniserat vatten (ddH2O) i totalt 5 gånger.
- Använd en vävnads rensning för att rengöra dropp hållarens yta efter tvätten.
- Sätt tillbaka dropp hållaren på maskinen.
- Flytta reglaget på maskinen till höger så att släpp hållaren återigen ligger framför den svarta pilen.
- Pipettera över 4 μL av en dialyserad analyt (från steg 1,1) till dropp hållaren och Stäng locket på maskinen.
- På programvaran klickar du på Nästa för att starta Association.
6. dissociation av analyt från ligand
- När Associations steget har avslutat inspelningen öppnar du locket på enheten.
- Flytta reglaget på maskinen till höger så att röret hållaren återigen ligger framför den svarta pilen.
- På programvaran klickar du på Nästa för att börja dissociation.
- När Dissociationssteget har avslutats öppnar du locket på maskinen.
- Ta bort dropp hållaren och rörhållaren.
- Skölj båda med ddH2O noggrant för att tvätta bort eventuellt protein.
- Ta bort biosensorn och kassera den på ett säkert sätt.
7. upprepad interaktion med olika koncentrationer
- Upprepa steg 2-7 för samma ligand-analytpar med olika analytkoncentrationer.
Anm.: analytekoncentrationen kan behöva justeras över flera körningar innan optimala resultat nås. Enligt vår erfarenhet är ett förhållande på 1:5:10 av analytkoncentrationer, som börjar med 75 nM, vanligtvis adekvat.
8. analysera data med hjälp av programvaran
- När alla körningar har slutförts, spara data på programvaran genom att klicka på Arkiv och sedan Spara experiment som på vänster sida av skärmen.
- Under rubriken kör data väljer du steg korrigering och anpassning (1:1) och klickar på analysera för att generera kinetiska data.
- För att extrahera de kvantitativa data till ett kalkylblad och generera grafer, klicka på Exportera till CSV och spara de inspelade data som en. csv-fil. Öppna. csv-filen med kalkylbladsprogram varan.
- För att mest effektivt Visa Association och dissociation kinetik, ta bort alla Plot punkter före baslinjen steg, och normalisera alla efterföljande observationspunkter från det slutliga utgångs värdet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Genom BLI assays har vi tidigare fastställt att bindning av GrgA till σ28 är beroende av en 28 Amino Acid mellersta region (rester 138-165) av Grga15. Följaktligen, jämfört med N-terminally hans-märkta full längd GrgA (NH-GrgA), en GrgA radering konstruera saknar denna region (NH-GrgAΔ 138-165) hade en minskad associerings takt och en ökad dissociation takt, vilket leder till en 3 000 000-faldig förlust av totala affinitet (tabell 1). Här visar vi att denna mellersta region direkt binder σ28 i avsaknad av resten av Grga-proteinet. I dessa experiment, den mellersta regionen märkta med en N-terminally hans-tagg (NH-GrgA138-165) användes som ligand, som först immobiliserades till spetsen av en ni-NTA biosensor (figur 1a). Efter tvättning obunden NH-GrgA138-165 av biosensorn registrerades realtids Association med analyten σ28 efter tillägg av σ28. Slutligen registrerades realtids dissociation efter tvätten. Inspelningar av experiment med tre olika analytkoncentrationer som börjar 30 s före ligand-bindningen och slutar 2 minuter efter att tvätten har börjat visas i figur 1a. För att bättre visualisera interaktionen mellan ligand och analyte tar vi bort data före tillägg av ligand och nollställer baslinjen till 0 för att härleda figur 1b.
Värden för kinetiska parametrar för interaktion mellan NH-GrgA138-165-fragmentet med σ28 presenteras i tabell 1. Jämfört med samspelet NH-GrgA X σ28 uppvisade NH-GrgA138-165 X σ28 interaktion en trend statistiskt signifikant 60% reduktion av ka, en mycket statistiskt signifikant ökning på 64% i kd , och en mycket statistiskt signifikant 3,5-faldig ökning av KD. Dessa förändringar visar att jämfört med NH-GrgA, binder NH-GrgA138-165 σ28 långsammare, separerar från σ28 snabbare, och har en minskad total affinitet med σ28. Därför binder rester 138-165 i GrgA till σ28 men med reducerad affinitet jämfört med full längd Grga.
Figur 1: en 28 Amino Acid mellersta region av GrgA binder σ28 in vitro.
A) förändringar i real tid i ljus störnings mönster som registrerats i fyra etapper: (i) bindning av NH-GrgA138-165 (ligand) till en ni-nta-biosensor, (II) tvätta, (III) bindning av ns-σ28 (analyt) vid olika koncentrationer till den immobiliserade NH-GrgA-138-165 (ligand), och (IV) efterföljande tvätt. Bförbättrad visualisering av ligand-analytassociation och dissociation efter avlägsnande av värden i de två första stadierna frånaoch nollställning av baslinjen. Panel B är modifierad från Desai et al., 201815. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Liganden | N | ka | kd | KD | Referenser | |||||||||||
| 1/MS | % kontroll | 1/s | % kontroll | M | % kontroll | |||||||||||
| NH-GrgA | 8 | (1,5 ± 1,7) x 104 | 100 | (2,8 ± 0,8) x 10-3 | 100 | (2,2 ± 0,3) x 10-7 | 100 | Desai et al, 2018 | ||||||||
| NH-GrgAΔ 138-165 | 2 | (5,6 ± 0,1) x 103 | 37 | (4,1 ± 0,3) x 102 | 1,5 x 107 | (6,9 ± 4,5) x 10-2 | 3,1 x 108 | Desai et al, 2018 | ||||||||
| p = 0,125 | p < 0,002 | p < 0,001 | ||||||||||||||
| NH-GrgA138-165 | 3 | (6,0 ± 1,0) x 103 | 40 | (4,6 ± 0,4) x 10-3 | 164 | (7,7 ± 0,3) x 10-7 | 350 | Denna studie | ||||||||
| p = 0.074 | p = 0.006 | p < 0,001 | ||||||||||||||
Tabell 1: en muterad av GrgA, som endast innehåller aminosyrerester 138-165, binder σ28 trots lägre affinitet jämfört med full längd Grga.
BLI analyser utfördes med ni-nta biosensorer med hans taggade fullängds Grga eller strykningar mutanter som ligander och renas STREP-märkta σ28 som en analyt. Grafer av inspelningar visas i figur 1. Värden för kinetiska parametrar (medelvärden ± standardavvikelser) genererades med tillhörande programvara17. k a (Associations hastighet konstant) definieras som antalet komplex som bildas per s i en 1 molar lösning av a och B. kd (dissociationshastighet konstant) definieras som antalet komplex som förfaller per sekund. K D (dissociationjämvikts konstant), definierad som den koncentration vid vilken 50% av ligand-bindningsplatser upptas av analyterna, är kD dividerat med ka. n, antal experimentella upprepningar. p -värden beräknades med hjälp av 2-sidiga Students t -test. Kinetiska parametrar för NH-GrgA och NH-GrgAΔ 138-165 var från Desai et al., 201815.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protein-proteininteraktioner är avgörande för regleringen av transkription och andra biologiska processer. De är vanligast studeras genom PULLDOWN analyser. Även PULLDOWN analyser är relativt lätt att utföra, de är dåligt kvantitativa och kan misslyckas med att upptäcka svaga men biologiskt meningsfulla interaktioner. I jämförelse, genom att upptäcka realtid Association och dissociation mellan en ligand och en analyt, ger BLI Association och dissociation Rate konstanter, samt, övergripande tillhörighet.
Jämfört med PULLDOWN-analyser ger BLI-analyser högre känslighet. Till exempel, Grga-σ28 interaktioner upptäcks med lägre nm koncentrationer av analyter av bli men inte av PULLDOWN analyser (opublicerade data). Till skillnad från PULLDOWN förlitar sig BLI inte på en detektionsantikropp, vilket kan signifikant påverka känsligheten.
Ännu viktigare är att BLI-analyser kan ge mekanistiska insikter i samspelet mellan proteiner, medan PULLDOWN-analyserna inte kan. Detta exemplifieras av samspelet mellan σ28 med olika Grga konstruktioner. Jämfört med NH-GrgA, NH-GrgAΔ 138-165 och NH-GrgA138-165 drabbas endast en 60% förlust i ka i bindningen σ28. Dessa fynd överensstämmer med våra tidigare BLI-uppgifter som visar att GrgA saknar sina N-Terminal 64-rester har en minskad affinitet med σ28, vilket tyder på att N-terminalsekvensen av Grga bidrar till σ28 -bindning. Även NH-GrgAΔ 138-165 och NH-GrgA138-165 har liknande ka värden i bindning σ28, har den förra en 91 000-faldigt högre kd än den senare. Dessa resultat indikerar att bindningen av 138-165 utlöser strukturella förändringar i GrgA, vilket kraftigt stabiliserar komplexet.
Med en längre historia än bli, yta Plasmon resonans (SPR) kan också kvantifiera realtid protein-protein interaktioner18,19. Även om känsligheten hos BLI tros vara lägre än för SPR20, överträffar den förstnämnda för närvarande den senare i kostnadseffektivitet. Till exempel är kostnaderna för SPR biosensorer mycket högre än för BLI biosensorer.
På grund av arten av den underliggande principen för SPR, det är starkt påverkad av mikrofluidik av media som omger proteinet. Därför kräver experiment med vissa spr-instrument avsevärd perception från forskarens sida för att säkerställa optimala buffertförhållanden21,22,23,24. Å andra sidan har de nuvarande BLI-instrumenten ett mycket begränsat temperaturkontroll område25 och är som sådana dåligt utrustade för bestämning av termodynamiska parametrar (såsom entalpi och Gibbs fri energi) för en given interaktion.
Glycerol, ett vanligt använt kryoprotectant, är oförenligt med BLI, trots dess breda kemiska kompatibilitet. Därför är det viktigt att ta bort glycerol från ligand och analyt genom dialys. De resulterande glycerolfria proteinerna måste förvaras vid 4 ° c, vilket kan leda till ökad instabilitet och felaktiga kinetiska parametrar. Vi rekommenderar att BLI-analyser utförs strax efter dialys, särskilt om inkonsekventa kinetiska parametrar erhålls från vid olika tidpunkter. Den exakta tidsramen inom vilken BLI-analyser skall slutföras kommer att variera mellan proteiner och påverkas av deras koncentrationer.
Som med SPR, har BLI använts för små molekyl screening26. Med tanke på att nyare BLI-instrument erbjuder hög genomströmnings alternativ för screening, ser vi att BLI kan bli mycket användbart för identifiering och karakterisering av små molekyler som underlättar eller stör protein-proteininteraktioner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av National Institutes of Health (bidrag # AI122034 och AI140167) och New Jersey Health Foundation (Grant # PC 20-18).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BLItz machine | ForteBio | 45-5000 | |
| Dialysis tubing cellulose membrane | MilliporeSigma | D9652 | |
| Dip and Read Ni-NTA biosensor tray | ForteBio | 18-5101 | Ready-to-use Ni-NTA biosensors for poly-His-tagged Proteins |
| Drop holder | ForteBio | 45-5004 | |
| PCR tubes (0.2 mL) | Thomas Scientific | CLS6571 | |
| Microcentrifuge tubes (black) | Thermo Fisher Scientific | 03-391-166 | |
| Kimwipes | Thermo Fisher Scientific | 06-666A | |
| DTT | Thermo Fisher Scientific | R0861 | |
| EDTA | MilliporeSigma | E6758 | |
| MgCl2 | MilliporeSigma | M8266 | |
| NaCl | MilliporeSigma | S9888 | |
| Tris-HCl | GoldBio | T095100 |
References
- Vvedenskaya, I. O., et al. Interactions between RNA polymerase and the core recognition element are a determinant of transcription start site selection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the U.S.A. 113 (21), E2899-E2905 (2016).
- Feklistov, A., Sharon, B. D., Darst, S. A., Gross, C. A. Bacterial sigma factors: a historical, structural, and genomic perspective. Annual Review of Microbiology. 68, 357-376 (2014).
- Visweswariah, S. S., Busby, S. J. Evolution of bacterial transcription factors: how proteins take on new tasks, but do not always stop doing the old ones. Trends in Microbiology. 23 (8), 463-467 (2015).
- Taylor, H. R., Burton, M. J., Haddad, D., West, S., Wright, H.
- WHO. Global incidence and prevalence of selected curable sexually transmitted infections: 2008. Sexual and Reproductive Health Matters. 20, (2012).
- Schmidt, S. M., Muller, C. E., Mahner, B., Wiersbitzky, S. K. Prevalence, rate of persistence and respiratory tract symptoms of Chlamydia pneumoniae infection in 1211 kindergarten and school age children. The Pediatric Infectious Disease Journal. 21 (8), 758-762 (2002).
- De Puysseleyr, K., et al. Evaluation of the presence and zoonotic transmission of Chlamydia suis in a pig slaughterhouse. BMC Infectious Diseases. 14 (560), (2014).
- Hulin, V., et al. Host preference and zoonotic potential of Chlamydia psittaci and C. gallinacea in poultry. Pathogens and Disease. 73 (1), 1-11 (2015).
- Belland, R., Ojcius, D. M., Byrne, G. I.
- Belland, R. J., et al. Genomic transcriptional profiling of the developmental cycle of Chlamydia trachomatis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 100 (14), 8478-8483 (2003).
- Nicholson, T. L., Olinger, L., Chong, K., Schoolnik, G., Stephens, R. S. Global stage-specific gene regulation during the developmental cycle of Chlamydia trachomatis. Journal of Bacteriology. 185 (10), 3179-3189 (2003).
- Tan, M. Intracellular pathogens I: Chlamydiales. Tan, M., Bavoil , P. M. , ASM Press. 149-169 (2012).
- Domman, D., Horn, M. Following the Footsteps of Chlamydial Gene Regulation. Molecular Biology and Evolution. 32 (12), 3035-3046 (2015).
- Bao, X., Nickels, B. E., Fan, H. Chlamydia trachomatis protein GrgA activates transcription by contacting the nonconserved region of σ66. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 109 (42), 16870-16875 (2012).
- Desai, M., et al. Role for GrgA in regulation of σ28-dependent transcription in the obligate intracellular bacterial pathogen Chlamydia trachomatis. Journal of Bacteriology. 200 (20), (2018).
- Joy, C., et al. Label-Free Detection of Biomolecular Interactions Using BioLayer Interferometry for Kinetic Characterization. Combinatorial Chemistry & High Throughput Screening. 12 (8), 791-800 (2009).
- Abdiche, Y., Malashock, D., Pinkerton, A., Pons, J. Determining kinetics and affinities of protein interactions using a parallel real-time label-free biosensor, the Octet. Analytical Biochemistry. 377 (2), 209-217 (2008).
- Szabo, A., Stolz, L., Granzow, R. Surface plasmon resonance and its use in biomolecular interaction analysis (BIA). Current Opinion in Structural Biology. 5 (5), 699-705 (1995).
- Nelson, R. W., Krone, J. R. Advances in surface plasmon resonance biomolecular interaction analysis mass spectrometry (BIA/MS). Journal of Molecular Recognition. 12 (2), 77-93 (1999).
- Yang, D., Singh, A., Wu, H., Kroe-Barrett, R. Comparison of biosensor platforms in the evaluation of high affinity antibody-antigen binding kinetics. Analytical Biochemistry. 508, 78-96 (2016).
- Visentin, J., et al. Overcoming non-specific binding to measure the active concentration and kinetics of serum anti-HLA antibodies by surface plasmon resonance. Biosensors and Bioelectronics. 117, 191-200 (2018).
- Baba, A., Taranekar, P., Ponnapati, R. R., Knoll, W., Advincula, R. C. Electrochemical surface plasmon resonance and waveguide-enhanced glucose biosensing with N-alkylaminated polypyrrole/glucose oxidase multilayers. ACS Applied Materials & Interfaces. 2 (8), 2347-2354 (2010).
- Del Vecchio, K., Stahelin, R. V. Using Surface Plasmon Resonance to Quantitatively Assess Lipid-Protein Interactions. Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). 1376, 141-153 (2016).
- Wang, D. S., Fan, S. K. Microfluidic Surface Plasmon Resonance Sensors: From Principles to Point-of-Care Applications. Sensors (Basel, Switzerland). 16 (8), 1175 (2016).
- Shah, N. B., Duncan, T. M. Bio-layer interferometry for measuring kinetics of protein-protein interactions and allosteric ligand effects. Journal of visualized experiments : JoVE. (84), e51383 (2014).
- Wartchow, C. A., et al. Biosensor-based small molecule fragment screening with biolayer interferometry. Journal of Computer-Aided Molecular Design. 25 (7), 669-676 (2011).
