Summary
우리는 세균성 시토크롬을 사용하여 아라키돈산(AA), 도코사헥사에노산(DHA), 에이코사펜테노산(EPA)의 특정 상악제 및 레지오이좀의 대규모 효소 합성 및 정제에 유용한 방법을 제시합니다. P450 효소 (BM3).
Abstract
다양한 불포화 지방산 (PUFAs)의 에폭시화 대사 산물은 에폭시 지방산이라고 불리우며 인간 생리학에서 광범위한 역할을 합니다. 이 대사 산물은 효소의 시토 크롬 P450 클래스에 의해 내인성으로 생산됩니다. 그들의 다양 하 고 강력한 생물학적 효과 때문에, 이러한 대사 산물 공부에 상당한 관심이 있다. 에폭시 지방산이 먼저 상당한 양과 높은 순도로 얻어져야하기 때문에 신체에서 이러한 대사 산물의 독특한 역할을 결정하는 것은 어려운 작업입니다. 천연 공급원으로부터 화합물을 얻는 것은 종종 노동 집약적이며 수용성 에폭사이드 하이드로 라제 (sEH)는 대사 산물을 빠르게 가수 분해합니다. 다른 한편으로는, 화학 반응을 통해 이러한 대사 산물을 얻는 것은 매우 비효율적입니다, 순수한 regioisomers 및 상체 물질을 얻기의 어려움으로 인해, 낮은 수율, 광범위한 (고가의) 정제. 여기에서, 우리는 BM3를 가진 에폭시를통해 DHA에서 19(S),20(R)-및 16(S),17(R)-에폭시도코펜타에노산(EDPs)의 효율적인 효소 합성을 제시합니다, 원래 바실러스에서 분리된 세균 CYP450 효소 megaterium (즉, 쉽게 대장균에표현된다). 순도의 특성화 및 측정은 핵 자기 공명 분광법 (NMR), 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC) 및 질량 분석법 (MS)으로 수행됩니다. 이 절차는 PUFA 에폭시 대사 산물의 효소 합성의 이점을 설명하고, 유사한 에폭시에이코사이코노레이노어를 생성하는 아라키돈산(AA) 및 에이코사펜타에노산(EPA)을 포함한 다른 지방산의 에폭시화에 적용가능하다. 산 (EETs) 및 에폭시에이코에테라에노산(EEQs).
Introduction
고도 불포화 지방산 (특히 오메가-3 및 오메가-6 불포화 지방산)이 인간 생물학에서 재생하는 역할에 대한 관심이 최근 몇 년 동안 증가함에 따라, 연구자들은 자신의 대사 산물이 매력적인 혜택의 넓은 범위의 주의를 촬영하고있다 전시. 특히, 효소의 시토크롬 P450 클래스에 의해 생성된 에폭시 지방산 대사산물은 큰 초점포인트가 되어 왔다. 예를 들어, 에폭시에코사트리노산(EETs), 에폭시도코사펜타에노산(EDPs) 및 에폭시코사테라에노산(EEQs)을 포함한 많은 PUFA 에폭산화물은 혈압 및 염증조절에 중요한 역할을 합니다 1,2 , 3개 , 4개 , 5. 흥미롭게도, AA 및 EPA 에폭사이드의 특정 상체및 레지오머는 혈관 수축에 다양한효과를 가지는 것으로 알려져 있다 6,7. EET및 EEQs의 상체및 레지오좀의 생리학적 효과는 문서화되었지만, DHA로부터 형성된 유사한 에폭시도코사펜타에노산(EDPs)의 효과에 대해서는 거의 알려져 있지 않다. EPA와 DHA가 풍부한 피시 오일8의광범위한 사용은 EDP9에대한 관심을 불러 일으켰습니다. 이러한 보충제의 혜택은 부분적으로 다운스트림 DHA 대사 산물로 인해 것으로 추정된다 (16,17-EDP 와 19,20-EDP는 가장 풍부한 되는) EDP의 생체 내 수준은 다이어트에 DHA의 양과 아주 잘 조정하기 때문에10, 11.
대사체학, 화학 생물학 및 기타 방법에 의한 이러한 에폭시 지방산의 메커니즘과 표적을 연구하는 것은 레지오-및 스테레오 이성물질의 혼합물로 존재하기 때문에 부분적으로 도전적인 것으로 입증되었으며, 순수한 양의 지방을 얻는 방법 적분자 및 레지아이좀이 필요합니다. 화학적으로 이러한 화합물을 합성 하기 위한 전통적인 수단 효과가 입증 되었습니다. 에폭시화를 위한 메타-클로로페록시벤조산과 같은 페록시산의 사용은 많은 단점, 특히 개별 레지오이좀제와 상각체의 고가의 고된 정제를 필요로 하는 에폭시화 선택성의 부족이 있다. DHA 및 EPA 대사산물의 총 합성이 가능하지만, 또한 높은 비용과 낮은 수율12,13과같은 대규모 합성에 비실용적만드는 단점을 앓고 있다. 효소 반응이 레지오-및 스테레오셀렉티브(14)이기 때문에 효소합성으로 효율적인 전체 생산을 달성할 수 있다. 연구 결과에 따르면 AA와 EPA(BM3)의 효소 에피시형성은 재지오선택적 및 enantioselective15,16,17,18,그러나 이 절차는 DHA로 시험되지 않았거나 큰 규모. 우리의 방법의 전반적인 목표는 그들의 개별 enantiomers로 순수한 에폭시 지방산의 상당한 양을 급속하게 생성하기 위하여 이 화학 요법 에폭시를 확장하고 낙관하는 것이었습니다. 여기에 제시 된 방법을 사용하여, 연구원은 EDP 및 기타 PUFA 에폭시 대사 산물의 합성을위한 간단하고 비용 효율적인 전략에 액세스 할 수 있습니다.
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Protocol
주의: 나열된 화학물질을 사용하기 전에 모든 관련 물질 안전 데이터 시트(MSDS)를 참조하십시오.
1. 야생형 BM3의 식
- 접종 pBS-BM3 DH5α 대장균 (박사 F. 앤 워커의 관대 한 기부) 5 mL의 멸균 LB 국물 0.5 mg의 암피실린을 20 mL 배양 튜브에 첨가했습니다.
- 200 rpm에서 24 시간 동안 37 °C에서 셰이커에서 세포 배양을 배양합니다. 펀바흐 또는 에를렌마이어 플라스크에 밤새 스타터 배양(5 mL)과 암피실린 100 mg을 멸균 LB 국물 1L에 넣습니다. 200 rpm에서 6 시간 동안 37 °C에서 흔들어, 200 rpm에서 18 시간 동안 30 °C에서 흔들어.
- 세포 배양을 4°C에서 10분 동안 1,000 x g에서수집하고 원심분리한다. 상온액을 버리고 효소 가정제될 때까지 세포 펠릿을 -78°C에서 저장한다.
참고 : 상판은 표백제로 처리하여 화학적으로 살균되거나 오토 클레이브를 사용하여 살균 한 다음 배수구를 부어 줄 수 있습니다.
2. BM3의 정화.
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세포 라해스
- 얼음에 세포 펠릿을 해동하고 얼음 감기 (4 °C) 용해 완충제 (10 mM Tris, 0.01 mM 페닐메틸설포닐 불소 (PMSF;), 0.01 mM EDTA; pH 7.8)의 40 mL에서 다시 중단합니다.
주의: PMSF는 접촉시 독성이 있습니다. - 얼음 위에있는 동안 초음파 균질화 (출력 전력 설정 10, 의무 100 %)로 1 분 동안 세포를 초음파 처리한 다음 세포를 용해시키기 위해 얼음에 1 분 간 휴식을 취합니다. 이 절차를 6번 반복합니다. 세포를 4°C에서 30분 동안 11,000 x g에서 펠릿 세포 파편으로 용해시한다.
- 얼음에 세포 펠릿을 해동하고 얼음 감기 (4 °C) 용해 완충제 (10 mM Tris, 0.01 mM 페닐메틸설포닐 불소 (PMSF;), 0.01 mM EDTA; pH 7.8)의 40 mL에서 다시 중단합니다.
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선호도 크로마토그래피
- 4°C에서 완충A(10 mM Tris, pH 7.8)의 5개의 컬럼 부피(CV)로 세척하여 강한 음이온 교환 크로마토그래피 컬럼(재료 표참조, 직경: 2.8 cm x 6 cm, 컬럼 부피: 37 mL)을 준비합니다.
- 세포가 평형 컬럼에 용해를 추가하고 차가운 버퍼 A. 차가운 버퍼 B (10 mM Tris, 600 mM NaCl, 6 CV)로 컬럼을 세척하여 BM3를 용이시성하는 3 CV로 컬럼을 세척합니다.
- 적갈색 용리액 분율을 수집합니다. 단백질을 즉시 사용하지 않는 경우, 글리세롤의 동일한 부피와 혼합하고 액체 질소와 플래시 동결. 냉동 용액을 -78 °C에 보관하십시오.
3. BM3에 의한 DHA의 에폭증
- 18.8 mL의 디메틸설폭사이드(DMSO)에 DHA 0.308 g(0.940 mmol)을 첨가하여 2L의 교반 반응 완충액(0.12 M 칼륨인산염, 5 mM MgCl 2, pH 7.4)과 함께 해동된 BM3 효소의 20 nM을 첨가하여 반응을 준비한다. 상기 효소 농도는 일산화탄소/디티오네이트 스펙트럼 분석법19에의해 결정될 수 있다.
- 용액이 교반되는 동안, 반응 완충액에 용해된 NADPH(니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 인산염 감소, 테트라소듐 염, 0.808 g, 0.940 mmol)의 1동등한 를 첨가하여 반응을 시작한다. 주사기와 바늘에 부착된 공기 채워진 풍선으로 반응 혼합물을 통해 공기를 버블링하면서 30 분 동안 반응을 저어줍니다.
- 분광광도계(재료 표참조)를 사용하여 340 nm에서 반응 혼합물의 흡광도를 확인하여 NADPH가 고갈되었는지 확인합니다. NADPH의 소비를 나타내는 남은 흡광도가 없는 경우, 반응이 완료됩니다.
참고 : 일반적으로 반응은 30 분 후에 완료됩니다. - 용액의 pH가 4에 도달 할 때까지 1 M 옥살리산을 드롭 와이즈로 천천히 첨가하여 반응 혼합물을 담금질하십시오.
4. EDP 추출
- 2 L의 디에틸 에테르 (무수, 과산화수소가없는)로 담금질 완충액을 3 회 추출합니다. 에테르층(6L)을 수집하고 무수 황산마그네슘(MgSO 4)으로 건조한다.
- 용액으로부터 MgSO 4를 걸러내고 건조된 에테르 층을 로터리 증발기 위에 농축하여 조EDP 잔류물을 생성한다.
- 플래시 컬럼 크로마토그래피로 잔류물을 정화합니다(40 g 실리카 카트리지가 충분함). 헥산에서 10% 에틸 아세테이트(EtOAc)에서 시작하여 22분 이상 헥산에서 최대 60% EtOAc까지 램프합니다.
참고 : 세 가지 주요 피크를 획득하고 수집, 1의 순서로 용리. 미반응 DHA; 2. EDP 이소미의 혼합물; 3. 디에폭사이드(일반 과산화 제품)(그림 1참조). - 분수를 결합하고 회전 증발기에 집중. 이 예에서, 0.074 g, (24%) 반응하지 않은 DHA, 0.151 g (47%) EDP 이소미, 0.076 g, (22%) 디에폭사이드를 얻었다.
5. EDP의 에스테르화, 16 (S),17 (R)- 및 19 (S), 20 (R)-EDP 및 에스테르의 사포화의 분리
주의: 트리메틸실릴디아조메탄(TMS-디아조메탄)은 접촉과 흡입 모두에 의해 매우 독성이 있습니다. 적절한 개인 보호 장비가있는 연기 후드에서만 사용하십시오.
- 무수 탄올(MeOH) 및 무수 톨루엔 3 mL의 2 mL로 둥근 바닥 플라스크 또는 작은 바이알에 에폭신(0.151 g, 0.435 mmol)을 희석하고, 교반바를 추가하고, TMS-다이아조메탄(1.2 어금니골 등가물, 또는 0.26 ml의 2m) 아액에 넣은 다.
- 10분 간 기다렸다가 옅은 노란색이 유지될 때까지 TMS-디아조메탄(0.050 mL)을 추가합니다.
- 30 분 후, 조심스럽게 회전 증발기를 사용하여 혼합물을 농축하고 플래시 컬럼 크로마토그래피에 의해 잔류 물을 정화한다. 헥산에 4% EtOAc(실리카 젤 컬럼 또는 카트리지 40g 사용)을 22분 동안 사용하여 용루합니다. 이 예에서, 19,20-EDP 메틸 에스테르 (0.116 g, 74%) 및 16,17-EDP 메틸 에스테르(0.029 g, 19%), 투명 오일(총 수율, 93%)으로 수득하였다.
- 정제된 EDP 메틸 에스테르 레지아좀을 함유하는 분획물을 수집한다. 19(S),20(R)-EDP 메틸 에스테르를 먼저, 16(S),17(R)-EDP 메틸 에스테르가 뒤따른다.
- 혼합 분획이 남아 있는 경우(이성물질을 모두 함유하고, 8:1 헥산/EtOAc에서 박층 크로마토그래피(TLC)로 평가할 수 있고, 과망간산 칼륨(KMnO 4)으로 염색됨)을 이전과 동일한 용매 시스템으로 다시 크로마토그래피합니다.
- 개별 레지오이솜을 함유하는 분획을 집중시다.
참고: 이 시점에서, 정체성 및 순도는 NMR에 의해 평가될 수 있다(CDCl 3을 용매로 사용; 도2에 대한 범례 참조). - 개별 EDP 메틸 에스테르 regioisomers를 그들의 산 형태로 변환하려면, THF에서 EDP 에스테르를 희석 : 물 (에스테르의 약 0.7 mL / 0.1 mmol). 수성 LiOH 2M(어금니 3개)을 넣고 밤새 저어줍니다.
참고 : 반응의 완전성은 TLC에 의해 평가 될 수있다, 사용하여 3:1 헥산 / EtOAc, KMnO 염색4; 제품의 유지율은 ~0.3입니다. - 혼합물의 pH가 3-4에 도달 할 때까지 포믹 산으로 천천히 반응을 담금질하십시오. 물과 에틸 아세테이트 (에스테르의 1-2 mL / 0.100 mmol)를 추가하고 층을 분리합니다. EtOAc (3 x 5 mL)로 물 층을 추출하고 포화 염수 (NaCl) 용액으로 씻고 무수황산 나트륨 (Na2 SO 4)을 통해 EtOAc 층을 건조시십시오.
- 회전 증발기로 에틸 아세테이트 용액을 농축하고 헥산 (10 mL)을 추가하고 다시 농축하십시오. 잔류 포산을 제거하여 아제오열대지방으로 두 번 반복합니다. 15분 동안 10-30% EtOAc로 용출하여 플래시 컬럼 크로마토그래피로 잔류물을 정화합니다.
- 원하는 분획을 농축하고 정제산을 감당하기 위해 진공에서 건조시다.
참고: 이 단계에서, 영항성 순도는 평가될 수 있다(키랄 HPLC에 의해, 도 3에 대한 범례 참조 - 열 및 조건에 대한 그림 4). 화학적 순도는 C18(chiral) HPLC에 의해 평가될 수 있다(재료 표 및 참조 14 참조 참조).
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Representative Results
효소 에폭시화로부터 원유 혼합물의 정제시 얻어진 플래시 컬럼 크로마토그램(아래와 같이 자동화된 플래시 정제 시스템을 사용하여 수행됨)은 도1에 나타내었다. 레지오이머의 에스테르화 및 분리에 이어,순수한 16(S),17(R)-EDP 및 19(S),20(R)-EDYl 에스테르를 수득하였다. 전형적으로, 이들은 대략 1:4 대 1:5 비율로 존재하며, 주요 제품은19(S),20(R)-EDP이다. 다른 EDP 레지오이솜제(예를 들어, 13,14- 또는 10,11-EDP)는 얻어진 적이 없다. 1H-NMR 스펙트럼 16(S), 17(R)-EDP(도2A)및 19(S), 20(R)-EDP(도2B)메틸 에스테르는 그들의 구조와 함께 아래와 같이, 이들 중 높은 순도를 나타낸다. 화합물; 산 형태의 C18 (chiral) HPLC는 또한 순도 및 gt;98%를 나타냈다. 그들의 정체성은 확인된 EDP와 일치하는 질량/전하 비율 및 단편화 패턴을 산출한 고분해능 질량 분광법 (산및 에스테르 양식 둘 다)에 의해 추가로 확인되었습니다. 상항성 순도는 EDP의 본격적인 상항및 혼합 표준과 비교하여 키랄 HPLC를 사용하여 결정하였다(그들의 산 형태, 도 3A 및 도 4A). 도 3B 및 도 4B에서관찰할 수 있는 바와 같이, 효소 에폭시에 의해 얻어진 두 EDP는 사포화(>99% 1 enantiomer)에 이어 고도로 에난티오퓨어이다. 이들 영체의 신원은 이전에 16(S),17(R)-및 19(S), 20(R)-EDP18로보고되었다.
그림 1 . DHA의 효소 에폭증에서 얻은 원유 혼합물의 정제로부터 크로마토그램 (관련 구조와 함께). 중간 피크(모노에폭사이드)는 원하는 EDP를 함유한다. 정제는 자동 플래시 정제 시스템을 사용하여 수행하였다(재료 표참조). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 . 실시예 1순16(S),17(R)-EDP메틸 에스테르(2A) 및 19(S),20(R)-EDP메틸 에스테르(2B)의 H-NMR스펙트럼. 스펙트럼은 CDCl 3에서 500 MHz에서 기록되었습니다 (용매는 7.26 ppm에서 볼 수 있고 잔류 물은 1.6 ppm에서). 화학적 시프트는 다음과 같다:16(S),17(R)-EDP 메틸 에스테르: 1H-NMR (500 MHz; CDCl3): δ 5.57-5.35 (m, 10 H), 3.68 (s, 3 H), 2.99-2.95 (m, 2 H), 2.87-2.83 (m, 6 H), 2.47-2.37 (m, 6 H), 2.29-2.21 (m, 2 H), 2.11-2.05 (m, 2 H), 0.99 H, 0.99 H, H, 3.99 H 19(S),20(R)-EDP 메틸 에스테르: 1H-NMR (500 MHz; CDCl3): δ 5.54-5.35 (m, 10 H), 3.68 (s, 3 H), 2.97 (td, J = 6.4, 4.2 Hz, 1 H), 2.91 (td, J = 6.3, 4.2 Hz, 1 H), 2.85-2.82 (m, 8 H), 2.44-2.36 (m, 5 H), 2.27-2.21 (m, 1 H), 1.65-1.51 (m, 3), 1.06 Hz, 1.06 Hz, 5.06 Hz, 1.06 Hz, 5.06 Hz , 3 H). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3. BM3에 의해 생성된 16,17-EDP(산성 형태)의 상항성순도를 나타내는 키랄 HPLC. 그림 3A는 "라세믹" 16,17-EDP(두 상체체체(14)의 본격적인 표준의 인공혼합물인 키랄 HPLC 크로마토그램을 나타낸 반면, 그림 3B는 에난티오퓨어 16(S)의 키랄 HPLC 크로마토그램을 나타낸다(S),17(R). )-EDP는 BM3를 함유한 DHA의 에폭시에 의해 생성되었으며, >99% S,R 이소머로 평가되었다. 열은 셀룰로오스 계(재료 표 참조, 250 x 4.6 mm, 5 μm, 1,000 Å)를 이소크라틱 45% 50 mM 암모늄 중탄산염(NH4HCO 3)으로 용출하고, 메탄올(30분)에서 0.5 mMM의 시료 농도및 1 mL/min의 유속을 확인하시기 바랍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4. BM3에 의해 생성된 19,20-EDP(산성 형태)의 상항성순도를 나타내는 키랄 HPLC. 그림 4A "racemic" 19,20-EDP(두 상체체(14)의 본격적인 표준의 인공 혼합물인 키랄 HPLC 크로마토그램을 보여주는 반면, 그림 4B는 에난티오퓨어 19(S),20(R)-EDP 생산의 키랄 HPLC 크로마토그램을 나타낸다. BM3를 가진 DHA의 에폭시에 의해, >99% S,R 이성모(도 3에대해 설명된 방법)로 평가하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5 . 이 방법에 의해 생성된 AA, EPA, EET 및 EEQ의 전반적인 효소 에피시레이션 반응 방식 및 관련 구조는 여기를 클릭하여 이 그림의 더 큰 버전을 확인하십시오.
그림 6 . BM3에 의해 생성된 17,18-EEQ(산성 형태)의 상항성순도를 나타내는 키랄 HPLC. 그림 6A는 "라세믹" 17,18-EEQ(두 enantiomers14의본격적인 표준의 인공 혼합물)의 키랄 HPLC 크로마토그램을 나타낸 반면, 그림 6B는 에난티오퓨어 17(S)의 키랄 HPLC 크로마토그램을 나타낸다(S),18(R). )-EEQ는 BM3를 이용한 EPA의 에폭시에 의해 생성되며, >99% S,R 이성모(도 3에대해 기재된 방법)로 평가된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
우리는 DHA의 두 가지 가장 풍부한 에폭시 대사 산물을 준비하기위한 운영적으로 간단하고 비용 효율적인 방법을 제시 - 19,20 및 16,17-EDP. 이러한 에폭시 지방산은 야생형 BM3 효소를 사용하여 고도로 에난티오퓨어(S,R-이솜) 형태로 제조될 수 있다. 문제 해결에 사용될 수 있는 몇 가지 중요한 점과 AA 및 EPA의 enantiopure 에폭시 대사 산물을 준비하는 우리의 방법의 확장은 아래에 설명되어 있습니다.
BM3 스토리지 지침
정제된 BM3 효소를 저장하는 것은 -78°C 냉동고에 저장하기 전에 동일한 부피의 글리세롤및 플래시 동결액과 액체 질소를 혼합하여 가능하다. 효소가 동결되면 최대 1 년 동안 보관 할 수 있습니다. 효소는 한 번만 해동될 수 있고, 얼음위에 해동되어야 하며, 얼음위에 4시간 동안만 방치할 수 있으며, 얼음 목욕없이 해동되는 효소를 허용하면 효소가 비활성화됩니다.
화학물질 저장 지침
절차에 필요한 화합물의 대부분은 공기에 민감한. 이들은 DHA및 그밖 PUF, EDP 및 그밖 에폭시 대사 산물 및 NADPH를 포함합니다. 이러한 화합물의 과산화 (및 기타 산화 공정)를 방지하기 위해 항상 아르곤 또는 질소와 함께 저장되는 용기를 씻어 내고 -78 °C에 보관하십시오.
또 다른 중요한 점은 DHA가 저장되는 솔루션입니다. DHA는 DMSO에서 매우 안정적이지 않지만 BM3는 에탄올 및 메탄올과 호환되지 않으므로 DMSO를 사용해야 합니다. 낮은 안정성을 상쇄하기 위해, DHA 혼합물은 에폭시화와 같은 날에 신선하게 제조되어야 한다. 반응 혼합물의 총 DMSO 백분율은 효소를 비활성화하지 않도록 1% 미만으로 유지되어야 합니다. 또한 NADPH는 유통 기한이 짧기 때문에 반응에 추가하기 전에 분광광도계로 농도를 확인해야 합니다. 이것은 NADPH의 1 동등한 항상 반응 혼합물에 추가되는 것을 보장한다.
에폭시증 반응 가이드라인
반응 혼합물로 풍선에서 공기 흐름은 산소가 에폭시에 필요한 반응 산소를 유지하기 위해 유지되어야한다. PUFA는 물에 매우 용해되지 않기 때문에 혼합물도 빠르게 교반해야합니다 (DHA의 용해도는 반응 버퍼에서 ≤125 μM임). 반응은 단백질을 변성하기 위해 옥살산으로 담금질되고 (금속을 킬레이트하고 보조 인자를 제거하기 때문에) 산은 DHA를 중성 형태로 유지하며 디에틸 에테르 추출에 필요합니다. 반응 혼합물의 담금질은 EDP의 산 촉매 가수 분해를 피하기 위해 천천히 수행되어야합니다.
EDP 추출 및 정제 지침
에테르는 여러 가지 이유로 추출 용매로서 구체적으로 선택되었다. 디클로로메탄은 용액에서 단백질을 침전시킬 수 있으며, 이는 추출을 복잡하게 합니다. EtOAc는 글리세롤을 추출합니다 (효소 스톡 용액과 함께 첨가됨)은 제거하기 어렵고 플래시 크로마토그래피를 방해합니다.
그들의 자유 산 상태에 있는 EDP regioisomers는 쉽게 분리되지 않으며, 이것이 왜 regioisomers는 첫번째 플래시 열 크로마토그래피에서 단 하나 피크로 혼합됩니다. 일단 그(것)들이 메틸 에스테르로 변환되면, regioisomers는 쉽게 분리할 수 있습니다. 추가적으로, 에스테르는 일반적으로 산 형태가 즉시 필요하지 않은 경우에 장기 저장을 위한 상응하는 산 보다는 더 안정합니다.
기존/대체 방법에 대한 방법의 중요성
우리의 방법은 기존 및 대체 방법에 비해 많은 장점을 가지고 enantiopure EDP를 얻기위한 간단하고 효과적인 방법을 제공합니다. 첫째, DHA 및 다른 PUFA 및 이들의 유도체의 화학적 에폭시화는 재지오선택적 또는 상적도 선택적이지 않으며, 복잡한 혼합물은 종종 수득된다. 다중 플래시 크로마토그래피 컬럼 및 치랄 준비 HPLC를 포함한 예비 HPLC는 노동 집약적이며 원하는 매우 적은 양만 생산할 수 있는 이러한 혼합물에서 상적 화질 에폭시 지방산을 정화하는 데 필요합니다. 대사 산물. 총 합성은 또한 에폭시 지방산을 생산하기 위해 사용될 수 있지만, 그것은 엄격, 시간이 많이 소요, 여러 단계를 필요로하고, 낮은 전체 수율을 제공, BM3 효소는 발현과 정화하기 쉬운 반면, 에폭시화는 짧은 기간 내에 완료 시간. 우리의 방법은 또한 비용 효율적인: 상업 소스20 현재 제공 16,17- 그리고 19,20-EDP (그들의 racemates로) 대 한 528 USD /0.5 mg. 1 g의 NADPH또한 ~500-800 USD에 대 한 구입하실 수 있습니다., 그리고 19,20-의 200 배 금액이상 생산하는 데 사용할 수 있습니다. EDP(및 16,17-EDP의 약 50배)는 유사한 가격으로 상업적으로 제공되었으며, 현재 상업적으로 사용할 수 없는 enantiopure 형태로 제공된다.
방법의 제한 사항
이 효소는 DHA의 마지막 이중 결합을 우선적으로 에폭시화하기 때문에 주요 제품은 19,20-EDP입니다 (16,17-EDP도 생산됩니다). 따라서, 원할 수 있는 다른 DHA 레지아좀제(예를 들어, 13,14-EDP, 10,11-EDP)는 야생형 BM3를 함유한 효소 에폭시에 의해 제조될 수 없다. 또한, SR-enantiomers만 BM3에 의해 생성되기 때문에, RS-enantiomers는접근할 수 없습니다, 우리의 이전에 간행된 화학 반전 방법14는 그(것)들을 합성하기 위하여 이용될 수 있더라도. 추가적으로, 반응 완충액에 있는 친유성 PUF의 낮은 용해도 때문에, 잠재적으로 추출 시간 소모하거나 금지하게 할 수 있던 EDP의 대규모 생산 (ca. 500-1,000 mg)를 위해 매우 많은 양의 완충제가 필요할 것입니다.
메서드의 다른 응용 프로그램
기쁘게도, 이 효소 에폭시화 프로토콜은 EPA 및 AA에도 적용가능하다(관련 구조는 도5에 도시되어 있다). 세 가지 지방산 모두의 에폭시증에 필요한 농도, 완충제 및 반응 시간은 동일하다. EPA의 경우, 야생형 BM3 효소도 사용되며, EPA로부터 얻어진 EEQ 분획(모노에폭시의 56% 수율), 에스테르화 후 ~14:11,18-EEQ:14,15-EEQ. EDP에 대한 관측치와 유사하게, 얻어진 17,18-EEQ는 키랄 HPLC에 의해 평가된 바와 같이 매우 에난티오퓨어(>99% 17(S), 18(R)-EEQ, 도 6참조)이다(그림 3 범례 및 재료 표참조). enantiomers의 신원은 이전에보고된 17. 그러나 AA의 경우, F87V BM3 돌연변이체는 AA21에대한 하이드록실라제인 야생형 BM3로서 대신 사용되어야 한다. 이 돌연변이체의 발현 및 정제는 또한 상기 프로토콜을 사용하며, 에폭시화는 유사한 방식으로 수행된다. 이 방법에 의해, 14,15-EET는 단독 레지아이솜제로서 수득된다. 14,15-EET 자유산은 에폭시화 후 미반응 AA와 분리할 수 없으며, 에스테르화가 필요하다. 14,15-EET 메틸 에스테르는 AA로부터 52% 수율로 수득된다. 산의 치랄 HPLC (그림 3 범례 및 재료 표참조)는 매우 에난티오퓨어 (>99%)를 나타냅니다. 14(S),15(R)-EET(이전에 보고된 바와 같이)15. 이들 EPA 및 AA 대사산물에 대한 화학적 변화는 다음과 같다:17(S),18(R)-EEQ 메틸 에스테르:1 H-NMR (500 MHz; CDCl3): δ 5.53-5.34 (m, 8 H), 3.67 (s, 3 H), 2.96 (td, J = 6.4, 4.2 Hz, 1 H), 2.90 (td, J = 6.3, 4.2 Hz, 1 H), 2.85-2.79 (m, 6 H), 2.44-2.38 (m, 1 H), 2.32 (t, J = 7.5 Hz, 2 H), 2.26-2.20 (m, 1 H) , 2.11 (q, J = 6.7 Hz, 2 H), 1.71 (quintet, J = 7.4 Hz, 2 H), 1.66-1.50 (m, 2 H), 1.05 (t, J = 7.5 Hz, 3 H); 14(S),15(R)-EET메틸 에스테르: 1개 H-NMR (500 MHz; CDCl3): δ 5.53-5.33 (m, 6 H), 3.67 (들, 3 H), 2.95-2.92 (m, 2 H), 2.81 (dt, J = 17.8, 5.8 Hz, 4 H), 2.40 (dt, J = 14.1, 6.8 Hz, 1 H), 2.32 (t, J = 7.5 Hz, 2 H), 2.23 (dt, J 14 H, H, H 14, H1. , 2.11 (q, J = 6.8 Hz, 2 H), 1.71 (quintet, J = 7.4 Hz, 2 H), 1.56-1.41 (m, 4 H), 1.38-1.30 (m, 4 H), 0.90 (t, J = 7.1 Hz, 3 H).
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Disclosures
저자는 공개할 이해상충이 없습니다.
Acknowledgments
이 작품은 R00 ES024806 (건강의 국가 학회), DMS-1761320 (국립 과학 재단) 및 미시간 주립 대학에서 시작 기금에 의해 지원됩니다. 저자는 준 양 박사 (데이비스 캘리포니아 대학)와 라리타 Karchalla (미시간 주립 대학) 효소 반응의 최적화에 대한 도움을 감사하고 자, 박사 토니 쉴밀러 (MSU 질량 분광및 Metabolomics 시설) HRMS 데이터 수집에 대한 지원을 제공합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ammonium Bicarbonate | Sigma | 9830 | NA |
| Ampicillin | GoldBio | A30125 | NA |
| Anhydrous magnesium sulfate | Fisher Scientific | M65-3 | NA |
| Anhydrous methanol | Sigma-Aldrich | 322515 | NA |
| Anhydrous sodium sulfate | Fisher Scientific | S421-500 | NA |
| Anhydrous toluene | Sigma-Aldrich | 244511 | NA |
| Arachidonic Acid (AA) | Nu-Chek Prep | U-71A | Air-sensitive. |
| Diethyl Ether | Sigma | 296082 | NA |
| DMSO (molecular biology grade) | Sigma-Aldrich | D8418 | NA |
| Docosahexaenoic Acid (DHA) | Nu-Chek Prep | U-84A | Air-sensitive. |
| EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid) | Invitrogen | 15576028 | NA |
| Eicosapentaenoic Acid (EPA) | Nu-Chek Prep | U-99A | Air-sensitive. |
| Ethyl acetate | Sigma | 34858 | NA |
| Flash column cartridges 25, 40, 4, 12 g sizes | Fisher Scientific | 145170203, 145154064, 5170200 | Alternatively, conventional column chromatography can be used |
| Formic acid (HPLC Grade) | J.T. Baker | 0128-01 | NA |
| Glycerol | Sigma | G7757 | NA |
| Hexanes | VWR | BDH24575 | NA |
| LB Broth | Sigma | L3022 | NA |
| Lithium hydroxide | Sigma-Aldrich | 442410 | NA |
| Magnesium chloride | Fisher Scientific | 2444-01 | NA |
| Methanol (HPLC grade) | Sigma-Aldrich | 34860-41-R | NA |
| NADPH Tetrasodium Salt | Sigma-Aldrich | 481973 | Air-sensitive. |
| Oxalic acid | Sigma-Aldrich | 194131 | NA |
| pBS-BM3 transfected DH5α E. coli | NA | NA | NA |
| PMSF (phenylmethanesulfonyl fluoride) | Sigma | P7626 | Toxic! |
| Potassium Permanganate | Sigma-Aldrich | 223468 | For TLC staining. |
| Potassium phosphate dibasic | Sigma | 795496 | NA |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma | 795488 | NA |
| Q Sepharose Fast Flow resin (GE Healthcare life sciences) | Fisher Scientific | 17-0515-01 | For anion exchange purification of enzyme |
| Sodium Chloride | Sigma | 71376 | NA |
| Tetrahydrofuran, anhydrous | Sigma-Aldrich | 186562 | NA |
| TMS-Diazomethane (2.0 M in hexanes) | Sigma-Aldrich | 362832 | Very toxic. |
| Tris-HCl | GoldBio | T-400 | NA |
| Also necessary: | |||
| Automatic flash purification system (we used a Buchi Reveleris X2) | Buchi | ||
| C18 HPLC column (Zorbax Eclipse XDB-C18) | Agilent | ||
| Centrifuge capable of 10,000 x g | |||
| Chiral HPLC Column (Lux cellulose-3), 250 x 4.6 mm, 5 µM, 1000 Å) | Phenomenex | ||
| General chemistry supplies: a 2 L separatory funnel, beakers and Erlenmeyer flasks with 1000-2000 L capacity, 20 mL vials, HPLC vials, small round-bottomed flasks and stir-bars. | |||
| HPLC (we use a Shimadzu Prominence LC-20AT analytical pump and SPD-20A UV-vis detector | Shimadzu | ||
| Nanodrop 2000 Spectrophotometer | Thermo-Fisher Scientific | ||
| NMR | NMR: Agilent DD2 spectrometer (500 MHz) | ||
| Rotary evaporator | Buchi | ||
| Sonic dismembrator or ultrasonic homogenizer | Cole-Parmer |
References
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