정자 지도 및 운동 성 아닌 간 남녀 양성 생식 기관에서 측정

정자 (정자가 라고도 함)가 난 모 세포를 향한 여성 생식 기관을 통해 이동 하는 분자 메커니즘은 잘 이해 되지 않지만 성적 생식에 기본입니다. 정자의 운동 성이 매우 역동적 이며 정자 속도와 방향성 운동 성을 변경 하는 강력한 통신 신호에 달려 있습니다.^1,2,³,^{5 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12}. c. 엘 레 강 스는 남녀 양성의 투명 한 표 피는 단일 세포 해상도^2,3에서 살아있는 정자의 추적을 허용 하기 때문에 생체 내 정자의 움직임을 연구 하기 위한 강력한 모델이 되고있다 ^8,10. 이 백서의 목적은 C. 엘 더 스 틴 태 자 궁 내에서 정자의 움직임을 평가 하는 방법을 제공 하는 것입니다.

정자와 난 모 세포가 외부 환경에서 만나는 동물 종 (즉, 액 틱 환경)에서 정자는 난 모 세포가 분 비 하는 화학 전술 신호에 반응 합니다. 이 신호는 정자 운동의 방향을 안내 하 여 신호 소스^4,6,11에 더 가깝게 합니다. 그러나, 훨씬 덜 내부적으로 비료 종에서 정자 운동에 대 한 알려져 있다. 주요 도전은 대부분의 종에 있는 현미경 검사 법에 접근 할 수 없는 여성 생식 기관의 건축입니다. 인간에서 시험관 내 연구, 생쥐, 돼지, 예를 들어 정자의 하위 인구가 chemoattractants, 유체 흐름 및 열 그라데이션^1,5,⁹에 대응할 수 있다는 증거를 제공 하 고, ¹². 이러한 시스템을 통해, 생체 내 정자의 움직임을 시각화 하 고 추적 하는 무 능력은 이러한 기능을 규제 하는 핵심 메커니즘을 발견 하기 위한 전략에 심각한 제한을 두고 있습니다.

이러한 한계를 극복 하기 위해, 우리는 인공 수정 후 정자를 직접 시각화 하 고, 생체 내 개별 정자 이동 매개 변수를 측정 하 고, 대상에 정자 인구의 능력을 측정 하기 위해 선 충 c. 엘 레 강 스를 사용 하는 방법을 개발 했습니다 . 시비 사이트. 이러한 방법, 함께 c. 엘 더 스 분자 및 유전 도구 세트, 정자 운동 성 행동을 조절 하는 화학 신호 분자와 분자 기계의 발견을 촉진. 예를 들어, 유전 스크린은 생체 내에서 효율적인 정자 운동에 필수적인 유전자를 식별 하기 위해 양성 또는 남성에서 실시 될 수 있다¹³. 분자는 정자 활성화, 이동 속도 및 방향 운동 성³에 대 한 효과를 테스트 하기 위해 양성 태 고 광고에 주입 될 수 있다. 추가적으로, 설명 된 방법은 자 궁 외 신체 위치로 악성 정자 이동을 모니터링 하 고 정자 경쟁을 평가 하기 위해 사용 될 수 있다^10,14.

C. 자연에는 남녀 양성 및 남성으로 존재 합니다 ( 그림 1참조). 암수 태 고 드에는 두 개의 U 자형 팔이 있어 서로 거울로 된 이미지입니다. L4 애벌레 단계 동안, 가장 근 위부 배아 세포 (즉, spermatheca 근처의 세포)는 정자를 겪습니다. 각각의 1 차적인 정액은 감수 분열를 입력 하 고 4 개의 합 골 spermatocyte를 일으킵니다. 이 spermatids는 첫 번째 성숙한 난 모 세포와 함께 spermatids로 밀고 spermiogenesis¹⁵를 받아야 합니다. 성인 암수는 정자 생성에서 기원으로 전환 합니다. 난 모 세포는 gonad를 따라 조립 라인에서 성숙 하 고, gonad의 근 위 끝에 가장 성숙한 난 모 세포, spermatheca 옆에 있습니다. 정자의 MSP 신호는 meiotic 성숙과 배 란^16,17을 유발 하는 데 필요 합니다. 남성 c.엘 레 강 스, 반면에, 정자만 생산 하는 J 자형 gonad. 정자는 정액 소포에 저장 됩니다. 암수와 결합 하면, 남성은 꼬리 근처에 있는 스파이 시를 외 음부로 삽입 합니다. Spermatids는 정액 유체¹⁸과 접촉할 때 사정 중에 활성화 됩니다. C. 엘 레 강 스 정자는 휘 발 되지 않으므로 수영 하지 않습니다. 대신, 그들은 생식 기관을 통해 기어, 운동에 대 한 의사 포드를 사용 하 여. 그것은 잘 확립 된 남성 정자,이는 더 큰 크기, 남녀 추 니 정자에 비해 경쟁 우위를가지고¹⁴.

이 방법에서, 남성 c. 엘 레 강 스는 정자 기증자 역할을 하 고 성인 hermaprhodites에 결합 된다. 성인 남성은 형광 성 미토 콘 드리 아 염료로 염색 되어 생성 된 정자를 생산 합니다. 한 번 남녀 양성의 외 음부를 통해 증 착 되 면 정자는 자 궁의 배아 주위를 spermatheca 또는 시비 사이트를 향해 기어 해야 합니다. C. 엘 더 스 모델의 투명 한 표 피는 여성 생식 기관을 통해 탐색 하는 각 개별 정자의 직접적인 시각화를 허용 합니다. 최근 몇 년 동안, 저희 연구실은이 방법을 사용 하 여 외 음부에서 정자를 인도 하는 F-시리즈 프로 스타 글란 딘의 클래스의 중요성을 입증 했습니다. 정자에의 한 양성 및 반응에의 한 합성을 관장 하는 분자 기계 심은 여전히 조사 중에 있습니다. 그러나, 정자 운동 성 및 이주를 평가 하기 위한이 방법은 크게 내부적 시비 동물에서 정자 및 난 모 세포 통신을 제어 하는 주요 선수의 식별을 용이 하 게 한다. 다음 프로토콜은이 분석을 수행 하는 방법을 단계별로 설명 합니다.

참고:이 프로토콜의 모든 단계는 실 온 (~ 20-22 ° c) 또는 16 ° c 또는 20°c로 설정 된 항 온 인큐베이터에서 수행 됩니다. 남성 및 남녀 양성 c. 엘 레 강 스는 식품 공급원^21,22로 서 표준 배양 조건 및 NA22 또는 OP50 대장균 을 사용 하 여 재배 된다. 야생 형 N2 남녀 양성 및 안개-q71) 남성은 아래의 절차에 사용 됩니다.

1. 첫째 날: 짝짓기를 위한 L4 단계 암수

1. 일관 된 결과를 얻기 위해 모든 암수는 성인을 활발 하 게 재현 하는 것으로 동기화 되어야 합니다. 20-30 L4 단계를 선택 하 여 6 cm 시드 된 선 충 성장 배지 (ngm) 플레이트에 양성 하였다. 28-30 h에 대 한 20°c에서 양성을 배양.
   참고: 단 12-15 암수는 짝짓기에 사용 됩니다. 나머지 암수는 잉여입니다.

2. 일 1: 형광 성 미토 콘 드리 아 염료로 남성 염색 (미토 염료)

1. 시 딩 된 NGM 플레이트의 중앙에 대장균 (식품 점)의 점을 배치 하 여 남성 염색 판을 만듭니다. 식품 점을 만들기 위해, 유리 교 반 로드의 끝을 사용 하 여 시드 플레이트의 박테리아 잔디밭에서 대장균 을 긁어 내 고 시드 플레이트에 입금 하십시오. 도트 직경은 ~ 5-7 mm 이어야 한다.
2. 1 mM의 2 µ L을 혼합 하 고 미토 염료를 DMSO에 넣고 10 μ l의 M9 완충 액 (3 g, 5g×2hpo 4, 63G의 염화나트륨 1mmgso4, h2o의 1ml4, H2 ~ 1l를 추가합니다. 오토 클레이 빙). 미토 염료 용액을 남성 염색 판의 푸드 닷 위에 파이 펫 팅 한다. 접시를 어둠 속에서 건조 시키십시오 (~ 30 분).
   참고: 미토 염료는 빛에 민감합니다. 미토 염료를 포함 한 모든 용액, 판, 벌레를 빛 으로부터 보호 합니다. 1 mM 재고를-20°c에 보관 하십시오.
3. 선택 ~ 100 1-3 일 늙은 성인 남성²³ 세에 미토 염료를 염색 한 후 남성 염색 판에 얼룩이 있다. 플레이트를 알루미늄 호 일에 싸서 16 ° c에서 밤새 배양 하십시오. 짝짓기를 위해 12-15 암수 당 ~ 50-60 남성을 사용 하십시오. 이상 ~ 100 남성이 필요한 경우, 남성의 과잉 혼잡을 방지 하기 위해 더 염색 판을 확인 합니다.
   참고: 남성은 또한 시계 유리에 3 시간 동안 M9 완충 액에 10 μ m 미토 염료 용액을 배양 하 여 염색 할 수 있습니다. 증발 및 빛 노출을 방지 하기 위해 덮여 벌레를 유지 합니다. 3 시간 후에는 파스퇴르 pipet을 사용 하 여 남성을 10cm 시드 NGM 플레이트에 전달 하십시오. 미토 염색 용액을 가능한 한 적게 옮겨 보세요. 플레이트를 알루미늄 호 일에 싸서 16 ° c에서 하룻밤 동안 배양 하십시오.

3. 둘째 날: 짝짓기

1. 1 일째부터 새로운 시드 된 NGM 플레이트에 스테인드 남성을 선택 합니다. 결합 될 때까지 어둠 속에서 접시를 남겨 주세요. 이 단계는 과잉 미토 염료 남성 주위 염색 박테리아 제거 됩니다 보장. 과도 한 미토 염료로 염색 된 세균을 짝짓기 판에 발라 서, 암수 조직에 얼룩이 질 수 있습니다.
2. 2 μ l의 두꺼운 대장균 혼합물을 시드 된 ngm 플레이트에 떨어뜨려 결합 판을 만드십시오. 두꺼운 박테리아를 건조 시켜 짝짓기 점을 만든다. 남성과 암수는 짝짓기를 위해이 점으로 전달 됩니다. 두꺼운 대장균을 만들기 위해, 밤새 대장균의 3 ml를 회전 하 고 M9의 1 ml에 박테리아 펠 릿을 소생 시킵니다. 이 혼합물을 4°c에서 보관 하 고 최대 6 개월 동안 재사용할 수 있다.
   참고: 대장균 용액의 두께가 조절 될 수 있다. 솔루션이 너무 얇은 경우, 수 컷은 짝짓기를 위해 집계 하는 대신 짝짓기 점에서 멀리 기어 갈 수도 있습니다. E. 대장균 용 수로 만든 짝짓기 점은 너무 두 꺼 우면 결합 효율이 떨어질 수 있습니다.
3. 3.2 단계에서 결합 플레이트가 건조 되는 동안, 300 μ l의 0.1 300 트리 네이 터 (w/v)의 트 레 졸 솔 (1v/w)과, M9의 900 μ l를 혼합 하였다.
   참고: 1% (v) 트리 네이 더와 0.1%) 테 트 라미 솔은-20°c에서 aliquotes를 저장 합니다. 반복 동결 융해를 피하십시오.
4. 테 테/트라이 솔루션의 600 μ l를 시계 유리에 전달 합니다.
5. 전송 12-15 남녀 양성 시계 유리의 테 트/트라이 솔루션에 1 일째에 포착. 30 분 동안 배양 하 여 암수를 움직이지 않게 합니다. 테 터/트라이 액이 증발 하지 않도록 시계 유리를 덮어 두십시오.
   참고: 양성이 적어도 30 분 동안 마 취 되는 것이 중요 합니다. 시간이 덜 소요 되 면 이미지 수집 중에 움직이는 웜이 발생 하 여 이미징과 상호 연결 될 수 있습니다.
6. 양성이 배양 되는 동안, 3.1 단계에서 짝짓기 점 (단계 3.2)에 50-60 염색 한 남성을 선택 하십시오. 3.8 단계까지 어둠 속에 접시를 저장 합니다.
7. 테 트/트라이 용액에서 30 분 인큐베이션 후 유리 파스퇴르 pipet을 사용 하 여 고 정화 된 암수를 시계 유리에서 시 딩 되지 않은 NGM 플레이트에 옮겨 놓습니다. 가능한 한 많은 액체를 제거 하 고 과량의 액체가 건조 하 게 하십시오.
   참고: 암수가 지나치게 건조 하 게 하지 마십시오. 보이는 액체가 모두 증발 하자마자 다음 단계를 시작 하십시오.
8. 마 취 된 암수를 미 시드 된 NGM 플레이트에서 염색 된 남성을 가진 짝짓기 점 위로 전달 한다. 남성의 암수 결합을 허용 하기 위해 30 분 동안 어둠 속에서 배양 합니다.
9. 30 분 동안 결합 한 후, 타임 랩 스 이미징에 대 한 암수를 즉시 마운트하고, 또는 새로운 시드 NGM 플레이트에 암수를 옮겨 이미징 전 1 시간 동안 휴식을 취하십시오.
   참고: 남녀 양성 자 궁의 시간 경과 비디오는 정자 속도와 역전 주파수를 정량화 하는 데 사용 됩니다. 짝짓기 후 1 시간 촬영 한 자 궁의 정지 이미지는 정자 분포를 정량화 하는 데 사용 되거나, spem 지침입니다.

4. 일 2: 시각화를 위한 설치 웜

1. H2o에서 2% 아가 로스를 사용 하 여마운팅 패드 생성
   참고: 2% 아가 로스를 벌크로 만들어 유리 시험관에 넣고 4°c에서 보관할 수 있습니다. 필요할 때 각 매 취는 각 사용 전에 성분 수 있으며 열 블록에 저장 하 여 응고 되지 않도록 합니다.
   1. 장착 패드를 만들기 위해, 긴 가장자리를 만지고 나란히 3 개의 유리 현미경을 정렬 합니다. 두 외부 슬라이드 모두에 마스킹 테이프 2 개를 서로 위에 놓습니다. 테이프와이 외부 유리 슬라이드는 결과 아가 로스 패드의 두께가 "두 테이프 깊은" 될 것입니다 있도록 지원 역할을 합니다.
   2. 중앙 슬라이드에 2% 아가 로스의 ~ 75 μ l를 넣습니다 (이것은 테이프가 없는 슬라이드입니다). 즉시 아가 로스 위에 새로운 유리 현미경 슬라이드를 넣습니다. 이 상단 유리 슬라이드는 다른 슬라이드에 수직 이어야 하며, 각 끝이 두 개의 지지대 슬라이드의 테이프에 놓여 있습니다.
   3. 아가 로스를 강화 시켜 주세요 (~ 30 초). 위쪽 유리 슬라이드를 아가 로스 패드에서 밀어서 조심 스럽게 제거 합니다.
2. 테 테/트라이 용액 10-15 μ l를 2% 아가 로스 패드 위에 놓습니다. 결합 된 암수를 패드에 전달 합니다. 가능한 한 작은 박테리아로 전송 하는 주의 하십시오.
3. 아가 로스 패드의 웜 위에 커버 슬립을 놓습니다.

5. 둘째 날: 이미지 획득 설정

참고: 에 피 형광, 10 배 및 60x 대물 렌즈를 장착 한 모든 직 립 미스로 스코프는 정자 분배 용 이미지를 얻기 위해 디지털 카메라를 사용할 수 있습니다. 시간 경과 이미지를 획득할 수 있는 소프트웨어는 정자 속도, 방향 속도 및 반전 빈도를 평가 하는 데 필요 합니다.

1. 결합 후 이미지 수집 1 시간
   1. 슬라이드를 현미경 단계에 장착 합니다. 눈 조각을 살펴보고 적색 형광 방출 필터 (TRITC 필터)와 함께 10 배 대물 렌즈를 사용 하 여 아가 로스 패드에 벌레를 스캔 합니다. 웜이 발견 되 면 형광 표시등을 짧게 켜서 웜이 결합 되었는지 확인 합니다. 정자는 자 궁 내에서 볼 경우, 60x 목표로 전환.
      참고: 커버 슬립에 60x 대물 렌즈에 의해 생성 된 압력은 일부 깨지기 쉬운 벌레를 손상 시킬 수 있습니다, 내장 또는 생식 기는 동물에서 돌출을 일으키는. 10 배 목표를 사용 하 여 성공적인 결합을 검사 하면 추가 된 압력에 대 한 웜 노출을 최소화할 수 있습니다. 결합 된 벌레를 형광등의 장시간에 노출 시 키 지 마십시오.
   2. 차동 간섭 대비 현미경 (DIC)을 사용 하 여 외 음부와 하나의 spermatheca를 모두 볼 수 있도록 웜 위치를 지정 합니다. Spermatheca의 중심에 초점을 맞추고 이미지를 초점. DIC 및 TRITC 채널에 대 한 노출을 확인 합니다. DIC에서는 내부 웜 구조를 명확 하 게 볼 수 있어야 합니다. TRITC에서, 개별 정자는 별개의 puncta로 볼 수 있어야 합니다.
      참고: 각 이미지는 외 음부에서 자 궁을 spermatheca 중 하나에 캡처해야 합니다. 자 궁이 너무 길어서 한 이미지에 맞지 않으면 두 개의 개별 이미지를 촬영할 수 있습니다. 모든 이미지를 동일한 노출 수준에서 촬영할 필요는 없습니다. 그러나, 개별 정자를 형광 이미지에서 구별 하 고 정량화 할 수 있는 것이 중요 합니다.
   3. 각 자 궁에 대 한 DIC 및 형광 이미지를 획득 합니다.
   4. 모든 결합 된 암수가 이미지화 될 때까지 5.1.3 단계를 반복 합니다.
2. 타임 랩 스 동영상 캡처
   1. 아가 로스 패드를 스캔 하 고, 단계 5.1.1 및 5.1.2에 설명 된 바와 같이 자 궁 내에 표시 된 정자를 포함 하는 양성을 찾으십시오.
   2. DIC 및 TRITC 채널에서 타임 랩 스 이미지를 얻도록 소프트웨어를 구성 합니다. 일반적으로 타임 랩 스 이미지는 자 궁 당 10-20 분 동안 15-30의 간격으로 촬영 됩니다.

6. 정량화

1. 자 궁 심상에 정액 배급을 정량화 하는 것은 짝짓기 후에 1 시간을 취합니다
   1. 한쪽 끝에 있는 외 음부와 다른 쪽의 정자를 시작으로 자 궁을 삼 등분 하 여 나눕니다. 이는 세 영역을 나타냅니다. Zone 1(Z1)은 외 음부를 포함 하 고 있으며 Zone 3(Z3)에는 spermatheca가 포함 되어 있습니다.
   2. 자 궁의 각 1/3 내에서 정자의 수를 수동으로 계산 하 고 각 영역의 수를 전체 자 궁에 있는 총 정자의 백분율로 보고 합니다. 아래에 예가 나와 있습니다.
      
      참고: 때로는 TRITC 채널 이미지의 신호 강도를 조정 하 여 이미지에 포착 된 모든 정자를 표시 하 고 정량화 할 수 있어야 합니다.
2. 타임 랩 스 이미지에서 정자 추적
   참고: 이 백서에서는 분석을 위해 NIS-요소 소프트웨어를 사용 했습니다. 아래 섹션에서, 우리는이 소프트웨어를 사용 하 여 수동으로 정자를 추적 하기 위한 지침을 제공 합니다 (단계 6.2.1) 뿐만 아니라 오픈 소스 소프트웨어 ImageJ/피지 (단계 6.2.2).
   1. NIS-요소와 정자를 추적
      1. 추적할 타임 랩 스 시리즈가 있는 nd2 파일을 엽니다. 추적을 시작 하려면 소프트웨어에서 마우스 오른쪽 버튼을 클릭 하 고 분석 컨트롤을 선택 하 여 추적 패널을 엽니다. 추적.
      2. 추적 패널에서 새 ROI 정의를 선택 합니다. 추적 되는 각 정자를 클릭 하 여 각 관심 영역 (ROI)을 정의 합니다. 선택한 정자 위에 컬러 마크가 표시 됩니다. 모든 ROIs가 선택 된 경우 마침을 클릭 합니다.
      3. ROIs가 확인 되 면 타임 랩 스 시리즈의 다음 프레임으로 이동 합니다. ROI 마커를 이미지의 정자의 새 위치로 드래그 합니다. 정자를 더 이상 추적할 수 없을 때까지이 작업을 계속 합니다. 시간 경과 이미지의 모든 프레임을 통해 ROI 마커가 배치 된 각 위치를 연결 하는 점선이 표시 됩니다.
         참고: 영역에서 정자만 2 영역에서 정자를 추적 해야 1 그리고 3 야생 형 동물에도 원형 패턴으로 이동 하는 경향이.
      4. 추적 패널에서 내보내기를 클릭 하 여 추적 된 정자에서 모든 정량 데이터 (예: 경로 길이, 시간, XY 위치 등)를 Excel 문서로 내보냅니다.
   2. 피지와 정자를 추적
      1. 타임 랩 스 계열의 TRITC 채널 이미지를 .tif 파일로 변환 합니다. 한 시리즈의 모든 파일을 하나의 폴더에 저장 합니다.
      2. BioFormats 가져오기 기능을 사용 하 여 피지에 이미지를 가져옵니다. 하나의 타임 랩 스 시리즈에서 하나의 하이퍼 스택으로 이미지를 가져옵니다.
      3. 피지에서 트랙 메이 트 열기²⁴ 플러그인을 통해 | 추적 | 트랙 메이 트와 수동 추적. 대각선 상자가 열립니다.
      4. 피지 도구 모음에서 트랙 메이 트 도구를 선택 합니다. 추적 되는 정자를 두 번 클릭 합니다. 파선으로 그린 원이 표시 됩니다. 원 내부를 클릭 하 고 원하는 위치로 드래그 하면이 원이 재배치 될 수 있습니다. ALT 키를 동시에 누르고 마우스를 스크롤하면이 원의 크기를 변경할 수 있습니다.
      5. 추적기의 크기와 위치가 설정 되 면 원을 다시 클릭 합니다. 녹색 파선은 녹색 선으로 바뀝니다. SHIFT 와 L 키를 동시에 눌러 추적 모드를 켭니다. 이는 피지 툴바에 표시 됩니다.
      6. 타임 랩 스 시리즈의 다음 프레임으로 이동 합니다. 새 프레임에서 추적 된 정자의 새 위치를 설정 하려면 마우스를 새 지점 위에 놓고 A 키를 누릅니다. 이제 추적기가 새 위치에 나타나고 추적기가 이전 프레임에 배치 된 위치를 연결 하는 선이 표시 됩니다.
      7. 추적이 완료 되 면 트랙 메이 트 대화 상자에서 분석 을 클릭 하 여 필요한 데이터를 생성 합니다.
   3. 속도를 계산 하려면 정자의 총 경로 길이를 경과 시간으로 나눕니다.
   4. 마리오 속도를 계산 하려면 외 음부에서 시작 하 여 spermatheca 쪽을 가리키는 자 궁을 통해 선을 그립니다. 정자를 추적의 처음부터 끝까지이 줄을 따라 마이그레이션한 거리를 측정 합니다. 이 거리를 경과 시간으로 나눕니다. 음수 값은 정자가 spermatheca에서 멀리 이주 했음을 나타냅니다.
   5. 반전 빈도를 기록 하기 위해, 3 개의 연속적인 타임 랩 스 프레임 동안 정자 추적이 90 ° 미만의 각도를 생성 한 횟수를 셉니다.

본 논문에 묘사 된 결과를 생성 하기 위해, q71) 남성은 미토 염료로 염색 하 고 야생 형, N2 양성에 결합 시켰다. 도 2 는 웜 준비, 짝짓기 및 분석을 포함 하는 방법에 대 한 전체적인 체계를 제공 한다. 영화 1 이 보여줍니다, 성인 남녀 양성 생식 관은 서로의 거울 이미지 두 팔을가지고. 짝짓기 시, 표지 된 정자는 외 음부를 통해 남녀 양성 자 궁에 침착 됩니다. 정자는 자 궁 내에서 발달 하는 배아 주위로 이동 하 여 풍부 하 게 할 때까지 저장 됩니다. 성인 암수에서 배아 세포가 근 위부로 발전 함에 따라, 대부분의 성숙한 난 모는 칼 집 세포의 콘 트를 통해 spereca로 밀려 들어갑니다. 난 모 세포가 spermatheca에 있는 동안 시비는 발생 합니다.

여성 생식 기관을 통한 정자 배급 및 이동을 정량화 하기 위해, 남녀 양성 자 궁은 3 개의 영역 (영화 1, 그림 3a)으로 나뉩니다. 영역 1은 외 음부에서 시작 하 여 자 궁의 첫 번째 1/3에 걸쳐 있습니다. Zone 2는 자 궁의 중간 1/3에 걸쳐 있으며, 구역 3은 자 궁의 마지막 1/3을 확장 하 고 spermatheca를 포함 합니다. 야생 형, N2 양성 및 안개-2 (q71) 남성을 사용 하는 적절 한 정자 지도는 약 90%의 표지 된 정자를 spermatheca 또는 영역 3에 도달 하는 결과를 초래 한다 (도 3b).  너무 적은 결과 (그림 3c, 10-15 정자 미만) 또는 너무 많은 (그림 3d, 정자로채워진 자 궁) 자 궁에서 정자를 계산 해서는 안됩니다. 10-15 정자 미만에서 발생 하는 짝짓기에서, 3-4 악성 정자는 심하게 데이터를 왜곡 수 있습니다. 마찬가지로, 자 궁이 정자로 완전히 채워질 때 정자는 적절 하 게 마이그레이션할 수 없습니다. 정자는 가난한 정자 지도 표현 형을 표시 하는 일부 돌연변이의 자궁내에 걸쳐 흩어져 보일 수 있습니다. 그러나이 경우 정자는 그림 3d에서 볼 수 있듯이 자 궁의 각 틈새를 채우지 않아야 합니다. Gonad의 각 암의 정량화는 하나의 샘플 또는 하나의 n으로 간주 된다.

타임 랩 스 이미지는 정자 속도와 반전 주파수를 정량화 하기 위해 촬영 됩니다. 영역 2에서 정자만 추적 해야 합니다 (그림 4a) 영역 1 및 3 (영화 1)에서 정자는 야생 형 동물 내 에서도 원형 패턴으로 이동 하는 경향이 있기 때문 이다. 15-30 s 간격에서 찍은 시간 laspe 이미지는 일반적으로 정자를 추적 하는 데 사용 됩니다. 2.5-3 분 이상 연속 프레임에서 따를 수 있는 정자만 정량화 됩니다. 도 4b-M에서, 적색 및 청색 점으로 표시 된 정자는 녹색 점으로 표시 된 정자는 없지만이 기준을 만족 한다. 따라서, 도 4N 에 정의 된 값은 적색 및 청색 점 (도 4n)에 의해 표시 된 정자에 대해 정량화 되 고, 반면 녹색 점으로 표시 된 정자에 대 한 수치는 정량화 되지 않았다.

그림 1: 성인 만화 c. 엘 레 강 스 남녀 추 니와 남성. 주요 생식 구조는 그림에 표시 되어 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 2: 샘플 준비 및 데이터 수집의 개략도. 미토 염료로 얼룩진 남성은 동기화 된 성인 암수에 결합 됩니다. 결합 된 암수의 타임 랩 스 이미지는 정자 속도 및 반전 주파수에 대 한 데이터를 캡처하기 위해 짝짓기 직후에 촬영 됩니다. 결합 된 양성의 정지 화상은 자 궁 내의 정자 배급을 평가 하기 위하여 짝짓기 후에 1 시간 취합니다. 자세한 내용은 텍스트를 참조 하십시오. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 3: 남녀 양성 자 궁 내 정자 분포를 정량화. (A). c. 엘 더의 회로도 양성의 자 궁. V = 여과, E = 자 모 세포, Z1-Z3 = 영역 1-3 정자 분포를 측정 하는 데 사용 됩니다. (B-D). DIC + TRITC (왼쪽 패널)와 TRITC만 (오른쪽 패널)의 이미지는 미토 염료로 얼룩진 q71) 남성 안개에 짝짓기 한 후에 야생 형 남녀 양성의 화상 1 h를 병합 하였다. 정자는 빨간색으로 나타납니다. 노란색 윤곽선은 spermatheca의 위치를 나타냅니다. 스케일 바: 20 μ m. Z1, Z2, Z3에 대 한 B의 정량화는 각 영역에서의 정자 퍼센트 ± 표준 편차를 나타낸다. C 와 d 의 이미지는 정량화를 위해 너무 소수의 (c) 또는 너무 많은 정자를 초래 하는 매 충을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 4: 자 궁을 통해 이동 하는 동안 정자 속도와 반전 주파수를 정량화. (A). DIC + tritc는 형광 정자 (적색)를 포함 한 남녀 양성 자 궁의 이미지를 병합 했습니다. V = 외 음부, 노란색 = 슈 페로 지, Z1-Z3 = 자 궁의 세 구역, 블랙 박스: 영역 2. (B-M). 3 영역에서 확대 된 타임 랩 스 트라이 TC 채널 이미지 (검은색 상자). 이미지는 20 초 간격으로 획득 되었습니다. 3 각 이미지에서 개별 정자를 추적 했습니다 (빨간색, 녹색 및 파란색 점). 패널 M 의 컬러 도트는 B-L에서 각 정자의 경로를 나타냅니다. 축척 막대 = 20 μ m. (N). 정자 속도, 벡터 속도 및 반전 주파수에 대 한 방정식과 정의. (오). 속도, 마리오 속도 및 정자의 반전 주파수는 빨간색과 파란색 점으로 패널 B-L 에 추적. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

영화 1: 정자의 움직임 및 이동의 영화. 미토 염료로 얼룩진 q71) 남성에 게 야생 형 암수를 결합 시켰다. 동영상은 다양 한 시간 간격으로 촬영 한 타임 랩 스 이미지의 합성입니다. 이 비디오를 보려면 여기를 클릭 하십시오. (마우스 오른쪽 버튼을 클릭 하 여 다운로드 합니다.)

저자는 이해 상충이 없습니다.