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Developmental Biology

मापने शुक्राणु मार्गदर्शन और गतिशीलता के भीतर caदुष्टता hermaphrodite प्रजनन क्षेत्र एलिगेंस

Published: June 6, 2019 doi: 10.3791/59783
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Cell, Developmental and Integrative Biology, University of Alabama at Birmingham

Summary

शुक्राणु सफलतापूर्वक अंडवाहिनी के माध्यम से नेविगेट करने के लिए एक oocyte खाद चाहिए । यहां, हम सी एलिगेंस उभयलिंगी गर्भाशय के भीतर शुक्राणु प्रवास को मापने के लिए एक परख का वर्णन । यह परख संभोग के बाद गर्भाशय के भीतर शुक्राणु वितरण पर मात्रात्मक डेटा प्रदान कर सकते हैं, के रूप में अच्छी तरह के रूप में गति पर, दिशात्मक वेग, और उलटा आवृत्ति ।

Abstract

सफल निषेचन यौन प्रजनन के लिए मौलिक है, अभी तक थोड़ा तंत्र है कि महिला प्रजनन पथ के भीतर oocytes के लिए शुक्राणु गाइड के बारे में जाना जाता है । जबकि इन विट्रो अध्ययनों का सुझाव है कि आंतरिक निषेचन जानवरों के शुक्राणु अपने आसपास से विभिंन संकेतों का जवाब कर सकते हैं, महिला प्रजनन पथ के अंदर उनके व्यवहार कल्पना असमर्थता शुक्राणु प्रवास को समझने के लिए एक चुनौती पैदा करता है और अपने मूल वातावरण में गतिशीलता । यहां, हम सी एलिगेंस कि इस सीमा से अधिक है और उनके पारदर्शी epidermis का लाभ लेता है का उपयोग कर एक विधि का वर्णन । C. एलिगेंस एक माइटोकॉन्ड्रियल डाई के साथ दाग पुरुषों वयस्क उभयलिंगी के साथ mated कर रहे हैं, जो संशोधित महिलाओं के रूप में काम करते हैं, और जमा fluorescently शुक्राणु के उभयलिंगी गर्भाशय में लेबल । प्रवास और लेबल शुक्राणु की गतिशीलता तो सीधे एक जीवित hermaphrodite में एक epi-प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप का उपयोग कर ट्रैक किया जा सकता है । जंगली प्रकार के पशुओं में, गर्भाशय के माध्यम से लेबल शुक्राणु क्रॉल के लगभग ९०% और निषेचन साइट, या spermatheca तक पहुंचने । गर्भाशय के चित्र गर्भाशय के भीतर शुक्राणु के वितरण का आकलन करने के लिए सहवास के बाद 1 ज लिया जा सकता है और शुक्राणुता तक पहुंचने वाले शुक्राणु का प्रतिशत । वैकल्पिक रूप से, समय-चूक छवियों शुक्राणु गति, दिशात्मक वेग और उलटा आवृत्ति का आकलन करने के लिए संभोग के बाद तुरंत लिया जा सकता है । इस विधि के अंय आनुवंशिक और आणविक सी. elegans के लिए उपलब्ध उपकरणों के साथ संयुक्त किया जा सकता है उपंयास आनुवंशिक और आणविक तंत्र है कि महिला प्रजनन पथ के भीतर शुक्राणु मार्गदर्शन और गतिशीलता को विनियमित करने में महत्वपूर्ण है की पहचान ।

Introduction

आण्विक क्रियाविधि जिसके द्वारा शुक्राणुजीवी (शुक्राणु के रूप में संदर्भित) अंडकोशिका की ओर मादा प्रजनन पथ के माध्यम से नेविगेट करने के लिए अच्छी तरह से समझ में नहीं आ रहे हैं, अभी तक यौन प्रजनन के लिए मौलिक हैं । शुक्राणु गतिशीलता अत्यधिक गतिशील है और मजबूत संचार संकेतों पर निर्भर करता है कि शुक्राणु वेग और दिशात्मक गतिशीलता मेंपरिवर्तन 1,2,3,4,5,6 , 7 । , 8 । , 9 , 10 , 11 , 12. सी एलिगेंस विवो में शुक्राणु आंदोलन के अध्ययन के लिए एक शक्तिशाली मॉडल बन गया है क्योंकि उभयलिंगी की पारदर्शी एपिडर्मिस एकल कोशिका संकल्प2,3, पर लाइव शुक्राणु की ट्रैकिंग परमिट 8,10. इस कागज का उद्देश्य सी एलिगेंस उभयलिंगी गर्भाशय के भीतर शुक्राणु आंदोलन का आकलन करने के लिए तरीके प्रदान करना है ।

पशु प्रजातियों में जहां शुक्राणु और अंडक बाहरी वातावरण में मिलने (यानी, acquatic वातावरण), शुक्राणु chemotactic द्वारा स्रावित संकेतों को जवाब । इन संकेतों को शुक्राणु आंदोलन की दिशा गाइड, उंहें लाने के करीब संकेत स्रोत4,6,11। हालांकि, बहुत कम प्रजातियों में शुक्राणु आंदोलन है कि आंतरिक खाद के बारे में जाना जाता है । एक बड़ी चुनौती मादा प्रजनन पथ की वास्तुकला है, जो अधिकांश प्रजातियों में माइक्रोस्कोपी के लिए दुर्गम है । मनुष्यों में इन विट्रो अध्ययन, चूहों, और सूअरों, उदाहरण के लिए, सबूत है कि शुक्राणु की subpopulations chemoattractants, द्रव प्रवाह, और थर्मल gradients1,5,7,9के लिए प्रतिक्रिया कर सकते है प्रदान करते हैं, १२। इन पद्धतियों के साथ, के लिए कल्पना और vivo में शुक्राणु आंदोलन ट्रैक करने में असमर्थता रणनीतियों पर गंभीर सीमाओं इन कार्यों को विनियमित करने के लिए महत्वपूर्ण तंत्र की खोज ।

इन सीमाओं से उबरने के लिए, हम सूत्रकृमि C. एलिगेंस का उपयोग करने के तरीकों का विकास किया है सीधे गर्भाधान के बाद शुक्राणु कल्पना, vivo में व्यक्तिगत शुक्राणु प्रवास मापदंडों को मापने के लिए, और एक शुक्राणु जनसंख्या की क्षमता को मापने के लिए लक्ष्य उर्वरीकरण स्थल । इन तरीकों, एक साथ सी एलिगेंस आणविक और आनुवंशिक toolset के साथ, रासायनिक संकेतन अणुओं और आणविक मशीनरी है कि शुक्राणु गतिशीलता व्यवहार को विनियमित की खोज की सुविधा । मसलन, वीवो13में दक्ष स्पर्म मूवमेंट के लिए जरूरी जीन की पहचान करने के लिए हर्मारोडिटीज या पुरुषों में जेनेटिक स्क्रीन का आयोजन किया जा सकता है । अणुओं में शुक्राणु सक्रियण, प्रवास वेग, और दिशात्मक गतिशीलता पर प्रभाव के लिए परीक्षण करने के लिए उभयलिंगी गोंड़ में इंजेक्ट किया जा सकताहै । साथ ही, वर्णित विधियों में अस्थानिक बॉडी स्थान rogue स्पर्म माइग्रेशन की निगरानी करने के लिए और शुक्राणु प्रतियोगिता10,14का मूल्यांकन करने के लिए उपयोग किया जा सकता है ।

C. एलिगेंस प्रकृति में hermaphrodites और पुरुषों के रूप में मौजूद ( चित्रा 1देखें). उभयलिंगी गोनाद में दो U-आकार के हथियार हैं, जो एक-दूसरे की दर्पण छवियां हैं । L4 लार्वा अवस्था के दौरान, सबसे समीपस्थ जनन कोशिकाएं (अर्थात शुक्रप्रावरक के निकट की कोशिकाएं) शुक्राणुजनन से गुजरती हैं । प्रत्येक प्राथमिक शुक्राणुकोशिका अर्धसूत्रण में प्रवेश करती है और चार अगुणित शुक्राणुकोशिकाओं का उत्पादन करता है । इन शुक्राणुता को पहले परिपक्व अंडकोशिका के साथ-साथ शुक्रमैथीका में धकेल दिया जाता है और इसकी स्पर्मिजनन15से गुजरना होता है । वयस्क उभयलिंगी, शुक्राणुजनन से अंडजनन में परिवर्तित हो जाते हैं । Oocytes गोंड़ के साथ एक विधानसभा लाइन फैशन में परिपक्व, gonad के समीपस्थ अंत में सबसे परिपक्व oocytes के साथ, spermatheca के बगल में । शुक्राणु से एमएसपी संकेतों अर्धसूत्री परिपक्वता और ovulation16,17ट्रिगर करने के लिए की जरूरत है । दूसरी ओर नर सी एलिगेंसके पास एक जे के आकार का गोंड़ होता है जो केवल शुक्राणु का उत्पादन करता है । शुक्राशय को लाभदायक पुटिका में भंडारित किया जाता है । उभयलिंगी या मादा के साथ संभोग करने पर, पुरुष पूंछ के पास के कंटिका को योनी में प्रविष्ट करता है । Spermatids स्खलन के दौरान सक्रिय कर रहे हैं, जब वे लाभदायक द्रव के साथ संपर्क में आते हैं18. C. एलिगेंस शुक्राणु तैरना नहीं है क्योंकि वे नहीं कर रहे है कशाभ । इसके बजाय, वे गति के लिए स्यूडोपॉड का उपयोग कर, प्रजनन पथ के माध्यम से क्रॉल । यह अच्छी तरह से स्थापित है कि पुरुष शुक्राणु, जो आकार में बड़ा कर रहे हैं, उभयलिंगी शुक्राणु14से अधिक प्रतिस्पर्धी लाभ है ।

इस विधि में, पुरुष सी एलिगेंस शुक्राणु दाता के रूप में कार्य और वयस्क hermaprhodites करने के लिए mated कर रहे हैं. वयस्क पुरुषों एक फ्लोरोसेंट माइटोकॉन्ड्रियल डाई लेबल शुक्राणु का उत्पादन करने के साथ दाग रहे हैं । एक बार उभयलिंगी योनी के माध्यम से जमा, शुक्राणु गर्भाशय में शुक्राणुप्रावरक, या निषेचन साइट के लिए भ्रूण के आसपास क्रॉल करना होगा । सी एलिगेंस मॉडल के पारदर्शी एपिडर्मिस प्रत्येक व्यक्ति के शुक्राणु के प्रत्यक्ष दृश्य के लिए अनुमति देता है के रूप में यह महिला प्रजनन पथ के माध्यम से पर नेविगेट करता । हाल के वर्षों में, हमारे प्रयोगशाला सफलतापूर्वक इस विधि का इस्तेमाल किया है के लिए एक वर्ग के महत्व को प्रदर्शित करने के एफ श्रृंखला prostaglandins योनी से शुक्राणु के मार्गदर्शक में शुक्राणुका19,20। उभयलिंगी और शुक्राणु की प्रतिक्रिया द्वारा इसके संश्लेषण को नियंत्रित करने वाले आणविक यंत्राशय अभी भी जांच के घेरे में हैं । हालांकि, शुक्राणु गतिशीलता और प्रवास का आकलन करने के लिए इस विधि बहुत महत्वपूर्ण खिलाड़ियों की पहचान है कि नियंत्रण शुक्राणु और अंडक संचार आंतरिक रूप से उपजाऊ जानवरों में सुविधा । निंनलिखित प्रोटोकॉल कैसे इस परख प्रदर्शन करने के लिए कदम से कदम का वर्णन ।

Protocol

नोट: इस प्रोटोकॉल में सभी कदम कमरे के तापमान (~ 20-22 डिग्री सेल्सियस) या लगातार तापमान पर 16 डिग्री सेल्सियस या 20 डिग्री सेल्सियस के लिए सेट में प्रदर्शन कर रहे हैं । पुरुष और उभयलिंगी सी एलिगेंस मानक संस्कृति की स्थिति और NA22 या OP50 ई. कोलाई के रूप में एक खाद्य स्रोत21,22का उपयोग कर बड़े हो रहे हैं । जंगली-प्रकार द2 hermaphrodites और कोहरा-दो (q71) पुरुषों के नीचे की प्रक्रिया में उपयोग किया जाता है ।

1. दिन 1: उठा L4 स्टेज उभयलिंगी संभोग के लिए Hermaphrodites

  1. लगातार परिणाम प्राप्त करने के लिए, सभी hermaphrodites सक्रिय रूप से वयस्कों reproducing के रूप में सिंक्रनाइज़ किया जाना चाहिए । 20-30 L4 चरण चुनें एक 6 सेमी वरीयता प्राप्त सूत्रकृमि वृद्धि माध्यम (NGM) प्लेट के लिए hermaphrodites । 28-30 ज के लिए 20 डिग्री सेल्सियस पर hermaphrodites सेते ।
    नोट: केवल 12-15 उभयलिंगी संभोग के लिए इस्तेमाल किया जाएगा । शेष उभयलिंगी, अधिशेष हैं ।

2. दिन 1: फ्लोरोसेंट Mitochondrial डाई (Mito-डाई) के साथ पुरुषों का धुंधला

  1. एक गैर वरीय NGM प्लेट के केंद्र में ई. कोलाई (भोजन डॉट) की एक बिंदी रखकर एक पुरुष धुंधला थाली बनाओ । भोजन डॉट बनाने के लिए, एक गिलास सरगर्मी रॉड के अंत का उपयोग करने के लिए एक वरीयता प्राप्त थाली के बैक्टीरिया लॉन से ई. कोलाई परिमार्जन और यह गैर वरीयता प्राप्त थाली पर जमा । डॉट ~ व्यास में 5-7 मिमी होना चाहिए ।
  2. एक साथ मिक्स 1 मिमी mito-डाई के 2 μL ( सामग्री की तालिकादेखें) dmso में और एम९ बफर के 10 μl (3 ग्राम की KH2 autoclaving) । Pipette आहार पर mito-डाई समाधान के सभी पुरुष धुंधला थाली पर डॉट । प्लेट को अंधेरे में सूखने दें (~ 30 मिनट) ।
    नोट: Mito-डाई प्रकाश संवेदनशील है । शील्ड सभी समाधान, प्लेटें, और mito-प्रकाश से डाई युक्त कीड़े. -20 ° c पर 1 मिमी स्टॉक स्टोर ।
  3. पिक ~ १०० 1-3 दिन पुराने वयस्क पुरुषों23 mito-रंजक दाग खाना डॉट पर पुरुष धुंधला थाली । एल्यूमीनियम पंनी में थाली लपेटें और 16 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात सेते । संभोग के लिए, उपयोग ~ 12-15 hermaphrodites प्रति 50-60 पुरुषों । यदि अधिक से अधिक ~ १०० पुरुषों की जरूरत है, पुरुषों की भीड़ को रोकने के लिए और अधिक धुंधला प्लेटें बनाओ ।
    नोट: नर भी एक घड़ी ग्लास पर 3 ज के लिए एम९ बफर में 10 μM mito-डाई समाधान में इंक्यूबैटिंग द्वारा दाग जा सकता है । वाष्पीकरण और प्रकाश जोखिम को रोकने के लिए कवर कीड़े रखो । 3 ज के बाद, एक पाश्र पिपेट का उपयोग करने के लिए एक 10 सेमी वरीयता प्राप्त ngm थाली पर पुरुषों के हस्तांतरण । संभव के रूप में mito-डाई समाधान के छोटे रूप में स्थानांतरण. एल्यूमीनियम पंनी में थाली लपेटें और 16 डिग्री सेल्सियस में रातोंरात सेते ।

3. दिन 2: संभोग

  1. एक नया, वरीयता प्राप्त NGM थाली पर 1 दिन से सना हुआ नर उठाओ । थाली को अंधेरे में सहवास तक छोड़ दें । यह कदम सुनिश्चित करता है कि पुरुषों के आसपास अतिरिक्त mito-डाई दाग बैक्टीरिया को हटा रहे हैं । संभोग की थाली पर अत्यधिक mito-डाई दाग बैक्टीरिया के carryover उभयलिंगी ऊतक दाग कर सकते हैं ।
  2. एक गैर वरीयता प्राप्त NGM प्लेट पर एक मोटी ई. कोलाई मिश्रण के 2 μl छोड़ने के द्वारा एक संभोग थाली बनाओ । संभोग डॉट को बनाने के लिए मोटे बैक्टीरिया को सूखने दें । पुरुषों और उभयलिंगी संभोग के लिए इस बिंदु पर स्थानांतरित कर दिया जाएगा । मोटी ई. कोलाईबनाने के लिए, रातोंरात ई. कोलाई के 3 मिलीलीटर नीचे स्पिन और एम९ के 1 मिलीलीटर में बैक्टीरिया की गोली को फिर से लटकाना । इस मिश्रण को 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जा सकता है और 6 महीने तक फिर से इस्तेमाल कर सकते हैं ।
    नोट: ई. कोलाई समाधान की मोटाई समायोजित किया जा सकता है । यदि समाधान बहुत पतला है, तो नर सहवास के लिए उस पर कुल के बजाय संभोग डॉट से दूर क्रॉल कर सकते हैं । एक ई. कोलाई soluton कि बहुत मोटी है से बने संभोग डॉट्स संभोग क्षमता कम हो सकती है ।
  3. जबकि चरण ३.२ से संभोग थाली सूख रहा है, एक साथ मिक्स ३०० μL का 1% (w/v) ट्राइकेन (त्रिकोणीय), ३०० μL की ०.१% (w/v) Tetramisole (Tet), और एम९ के ९०० μL ।
    नोट: 1% (w/v) Tricaine और ०.१% (w/v) Tetramisole-20 डिग्री सेल्सियस पर aliquotes के रूप में स्टोर । बारबार फ्रीज गल जाने से बचें ।
  4. एक घड़ी ग्लास के लिए टीईटी/त्रिकोणीय समाधान के ६०० μL स्थानांतरण ।
  5. स्थानांतरण 12-15 hermaphrodites घड़ी ग्लास में Tet/त्रिकोणीय समाधान के लिए 1 दिन पर उठाया । Hermaphrodites को स्थिर करने के लिए 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट । घड़ी कांच को वाष्पीकारी से टीईटी/त्रिकोणीय समाधान को रोकने के लिए कवर रखें ।
    नोट: यह महत्वपूर्ण है कि hermaphrodites कम से 30 मिनट के लिए निश्चेतक हैं । कम समय छवि अधिग्रहण, जो इमेजिंग के साथ interefere कर सकते है के दौरान एक चलती कीड़ा में परिणाम सकता है ।
  6. जबकि hermaphrodites इंक्यूबैटिंग कर रहे हैं, चरण ३.१ से संभोग डॉट (कदम ३.२) पर 50-60 दाग पुरुषों उठाओ । कदम ३.८ तक अंधेरे में थाली स्टोर ।
  7. टीईटी/ट्राई समाधान में 30 मिनट के बाद, एक गिलास पाश्र पिपेट का उपयोग करने के लिए एक गैर वरीयता प्राप्त ngm प्लेट पर घड़ी ग्लास से immobilized hermaphrodites हस्तांतरण । जितना संभव हो उतना लिक्विड निकालें और अतिरिक्त लिक्विड सूखने दें ।
    नोट: हरमैरोडिटीज को जरूरत से ज्यादा सूखने न दें । जैसे ही सभी दृश्य तरल evaporated है, अगले कदम शुरू करते हैं ।
  8. गैर वरीयता प्राप्त NGM प्लेट से संवेदनारहित उभयलिंगी को सना हुआ पुरुषों के साथ संभोग डॉट पर स्थानांतरित करें । अंधेरे में 30 मिनट के लिए सेते पुरुषों के लिए hermaphrodites के साथ दोस्त की अनुमति है ।
  9. 30 मिनट के लिए सहवास के बाद, समय-चूक इमेजिंग के लिए तुरंत hermaphrodites माउंट या एक नए पर hermaphrodites हस्तांतरण, एनजीएम प्लेट इमेजिंग से पहले 1 घंटे के लिए आराम करने के लिए ।
    नोट: उभयलिंगी गर्भाशय के समय चूक वीडियो शुक्राणु वेग और उत्क्रमण आवृत्ति की मात्रा के लिए उपयोग किया जाता है । गर्भाशय के अभी भी चित्र लिया 1 ज संभोग के बाद शुक्राणु वितरण मात्रा, या spem मार्गदर्शन करने के लिए उपयोग किया जाता है ।

4. दिवस 2: दृश्य के लिए बढ़ते कीड़े

  1. एच2ओ में 2% agarose के साथ एक बढ़ते पैड बनाना
    नोट: 2% एगरोस को थोक में बनाया जा सकता है, जिसे कांच की परखनली में रखा जाता है, और इसे 4 ° सेल्सियस पर भंडारित किया जाता है । जब जरूरत है, प्रत्येक aliquot प्रत्येक उपयोग से पहले microwaved किया जा सकता है और एक गर्मी ब्लॉक में संग्रहीत करने के लिए यह solidifying से रोकने के लिए ।
    1. बढ़ते पैड बनाने के लिए, लंबे किनारों को छूने के साथ साथ-साथ तीन ग्लास माइक्रोस्कोप स्लाइड की ओर संरेखित करें । दोनों बाहरी स्लाइड् स पर एक-दूसरे के ऊपर मास्किंग टेप के दो टुकड़े रखें । टेप के साथ इन बाहरी ग्लास स्लाइड्स समर्थन के रूप में कार्य करेंगे तो परिणामी agarose पैड की मोटाई "दो टेप गहरी" हो जाएगा ।
    2. स्थान ~ ७५ μL पिघला 2% केंद्र स्लाइड पर agarose (यह टेप के बिना स्लाइड है) । तुरंत एक नया ग्लास माइक्रोस्कोप स्लाइड agarose के शीर्ष पर जगह है । इस शीर्ष ग्लास स्लाइड अंय स्लाइड के लिए सीधा होना चाहिए, प्रत्येक अंत दो समर्थन स्लाइड के टेप पर आराम के साथ ।
    3. आगरोस कठोर चलो (~ 30 एस) । सावधानी से यह agarose पैड बंद फिसलने से शीर्ष ग्लास स्लाइड को हटा दें ।
  2. प्लेस 2% agarose पैड पर Tet/त्रिकोणीय समाधान के 10-15 μL । मेटेड hermaphrodites पैड पर स्थानांतरण । ध्यान रखना संभव के रूप में छोटे बैक्टीरिया के रूप में स्थानांतरित करने के लिए ।
  3. एगनोज़ पैड पर कीड़े के ऊपर एक कवर स्लिप रखें ।

5. दिन 2: छवि अधिग्रहण सेटअप

नोट: Epi-प्रतिदीप्ति, 10x और 60x उद्देश्यों, और एक डिजिटल कैमरा शुक्राणु वितरण के लिए छवियों को प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है के साथ सुसज्जित किसी भी ईमानदार सूक्ष्मदर्शी । सॉफ्टवेयर समय व्यपगत छवियों को प्राप्त करने में सक्षम शुक्राणु गति, दिशात्मक वेग, और उलटा आवृत्ति का आकलन करने के लिए आवश्यक हैं ।

  1. छवि अधिग्रहण 1 ज के बाद संभोग
    1. स्लाइड को माइक्रोस्कोप अवस्था पर माउंट करना । आंख टुकड़े के माध्यम से देखो agarose पैड पर कीड़े के लिए स्कैन करने के लिए लाल प्रतिदीप्ति उत्सर्जन फिल्टर (TRITC फिल्टर) के साथ 10x उद्देश्य का उपयोग कर । एक बार एक कीड़ा पाया गया है, संक्षेप में अगर कीड़ा mated है देखने के लिए प्रतिदीप्ति प्रकाश पर बारी । यदि शुक्राणु गर्भाशय के भीतर दिखाई देता है, 60x उद्देश्य के लिए स्विच ।
      नोट: Coverslip पर 60x उद्देश्य के द्वारा बनाई गई दबाव कुछ नाजुक कीड़े को नुकसान हो सकता है, आंत या गोंड़ जानवर से बाहर निकालना करने के लिए कारण । सफल संभोग के लिए स्कैनिंग 10x उद्देश्य का उपयोग कर सकते है ' कीड़े जोखिम को कम करने के लिए जोड़ा गया दबाव । फ्लोरोसेंट प्रकाश की विस्तारित अवधि के लिए mated कीड़े का पर्दाफाश नहीं है ।
    2. अवकलन व्यतिकरण विपर्यास माइक्रोस्कोपी (डीआईसी) का प्रयोग करके कृमि को इस प्रकार से देखें कि भग तथा एक शुक्राणुकी दोनों ही दृष्टि में हों । शुक्राणुप्रावरक के केंद्र पर ध्यान केंद्रित करके छवि को केंद्रित करें । दोनों डीआईसी और TRITC चैनलों के लिए जोखिम की जांच करें । डीआईसी में आंतरिक कृमि संरचनाएं स्पष्ट रूप से दिखाई देनी चाहिए । TRITC में, व्यक्तिगत शुक्राणु अलग puncta के रूप में दिखाई देना चाहिए ।
      नोट: प्रत्येक चित्र को भग से एक शुक्राणुवरक में गर्भाशय को पकड़ना चाहिए । यदि गर्भाशय एक छवि पर फिट करने के लिए बहुत लंबा है, तो दो अलग चित्र लिए जा सकते हैं । यह सभी छवियों के लिए एक ही प्रदर्शन के स्तर पर लिया जा करने के लिए आवश्यक नहीं है । हालांकि, यह महत्वपूर्ण है कि व्यक्तिगत शुक्राणु प्रतिष्ठित और प्रतिदीप्ति छवियों में मात्रा निर्धारित किया जा सकता है ।
    3. प्रत्येक गर्भाशय के लिए डीआईसी और प्रतिदीप्ति छवियों को प्राप्त ।
    4. दोहराएं चरण 5.1.1-5.1.3 तक सभी mated hermaphrodites imaged किया गया है ।
  2. कैप्चर करने में समय-चूक वीडियो
    1. Agarose पैड स्कैन और गर्भाशय के भीतर लेबल शुक्राणु होते हैं कि hermaphrodites का पता लगाने, चरण में वर्णित के रूप में 5.1.1 और 5.1.2
    2. सॉफ्टवेयर को डीआईसी और TRITC चैनलों में समय चूक छवियों को प्राप्त करने के लिए कॉंफ़िगर करें । सामान्यत: समय-चूक छवियां 15-30 s अंतरालों पर 10-20 मिनट प्रति गर्भाशय के लिए ली जाती हैं ।

6. परिमाणन

  1. गर्भाशय छवियों पर मात्रात्मक शुक्राणु वितरण लिया 1 घंटे के बाद संभोग
    1. एक छोर पर योनी के साथ शुरू करने और दूसरे पर spermatheca, तिहाई में गर्भाशय विभाजित । ये तीनों जोन का प्रतिनिधित्व करेंगे । ज़ोन 1 (Z1) में भग होती है और ज़ोन 3 (जेड३) में शुक्राणुप्रावरक होता है ।
    2. मैन्युअल गर्भाशय के प्रत्येक तिहाई के भीतर शुक्राणु की संख्या की गणना, और पूरे गर्भाशय में कुल शुक्राणु के एक प्रतिशत के रूप में प्रत्येक क्षेत्र में संख्या की रिपोर्ट. एक उदाहरण के नीचे प्रदान की जाती है ।
      Equation
      नोट: कई बार, TRITC चैनल छवि के संकेत तीव्रता समायोजित करने की जरूरत है कि हर शुक्राणु है कि छवि में कब्जा कर लिया गया है दिखाई और मात्रा निर्धारित किया जा सकता है ।
  2. समय-चूक छवियों में ट्रैकिंग शुक्राणु
    नोट: इस पेपर में हमने एनालिसिस के लिए एनआईएस एलिमेंट्स सॉफ्टवेयर का इस्तेमाल किया था । नीचे दिए गए अनुभागों में, हम मैन्युअल रूप से इस सॉफ़्टवेयर का उपयोग कर शुक्राणु ट्रैकिंग के लिए निर्देश दे (चरण 6.2.1) के रूप में के रूप में अच्छी तरह से मुक्त स्रोत सॉफ़्टवेयर ImageJ/फिजी (चरण 6.2.2).
    1. NIS तत्वों के साथ शुक्राणु ट्रैकिंग
      1. ट्रैक किया जा करने के लिए समय-चूक श्रृंखला के साथ. nd2 फ़ाइल खोलें । ट्रैकिंग शुरू करने के लिए, सही सॉफ्टवेयर में क्लिक करके और विश्लेषण नियंत्रण का चयन करके ट्रैकिंग पैनल खोलो । ट्रैकिंग।
      2. ट्रैकिंग पैनल में, नया ROI निर्धारितकरें चुनें. प्रत्येक पर नज़र रखी जाएगी जो शुक्राणु पर क्लिक करके ब्याज के प्रत्येक क्षेत्र (आरओआई) को परिभाषित करें । चयनित शुक्राणु के ऊपर एक रंगीन निशान दिखाई देगा । क्लिक करें, समाप्तजब सभी rois चयनित किया गया है ।
      3. एक बार ROIs की पहचान की गई है, समय चूक श्रृंखला में अगले फ्रेम में ले जाएं । आरओआई मार्कर को चित्र में शुक्राणु की नई स्थिति में खींचें । शुक्राणु अब ट्रैक किया जा सकता है जब तक यह कर रही जारी. बिंदीदार रेखाएं प्रत्येक स्थान को कनेक्ट करते हुए दिखाई देंगी ROI मार्कर को समय-व्यतीत छवि के सभी फ़्रेम के माध्यम से रखा गया है.
        नोट: जोन 1 में शुक्राणु के रूप में केवल 2 क्षेत्र में शुक्राणु ट्रैक किया जाना चाहिए और 3 भी जंगली प्रकार के जानवरों में एक परिपत्र पैटर्न में स्थानांतरित करने के लिए करते हैं ।
      4. ट्रैकिंग पैनल में निर्यात पर क्लिक करके एक एक्सेल दस्तावेज़ को ट्रैक शुक्राणु से सभी quantifiable डेटा (जैसे, पथ लंबाई, समय, XY स्थिति, आदि) निर्यात ।
    2. ट्रैक फिजी के साथ शुक्राणु
      1. Tif फ़ाइलें करने के लिए समय-चूक श्रृंखला में TRITC चैनल छवियों को कनवर्ट करें । सभी फ़ाइलों को एक फ़ोल्डर में एक श्रृंखला से सहेजें ।
      2. BioFormats आयात समारोह का उपयोग करके फिजी के लिए छवियों को आयात करें । एक बार-चूक श्रृंखला से छवियों को एक हाइपरस्टैक के रूप में आयात करें ।
      3. ओपन24 फिजी में Trackmate Plugins के माध्यम से । ट्रैकिंग । TrackMate के साथ मैनुअल ट्रैकिंग. एक आरेख बॉक्स खुलेगा ।
      4. फिजी टूलबार में ट्रैकमेट टूल का चयन करें । स्पर्म पर डबल क्लिक करें जिसे ट्रैक किया जाएगा । डैश्ड रेखाओं वाला एक हरा वृत्त दिखाई देगा । वृत्त के अंदर क्लिक करके और इच्छित स्थान पर खींचकर इस वृत्त को पुन: अवस्थित किया जा सकता है । इस वृत्त का आकार एक साथ ALT कुंजी दबाने और माउस स्क्रॉल द्वारा परिवर्तित किया जा सकता है ।
      5. एक बार आकार और ट्रैकर की स्थिति, सर्कल पर फिर से क्लिक करें सेट किया गया है । धराशायी हरे रंग की लाइनें एक ठोस हरे रंग की लाइन में बदल जाएगी । इसके साथ ही शिफ्ट और एल कुंजी हिट करने के लिए ट्रैकिंग मोड पर बारी । यह फिजी टूलबार में दर्शाया जाएगा ।
      6. समय-व्यतीत श्रृंखला में अगले फ़्रेम पर जाएं । नए फ़्रेम में ट्रैक किए गए शुक्राणु का नया स्थान सेट करने के लिए, माउस को नए बिंदु पर घुमाएं और एक कुंजी दबाएं । ट्रैकर अब नए स्थान पर दिखाई देगा, और एक लाइन जहां tracker पिछले फ्रेम में रखा गया है स्थानों को जोड़ने दिखाई देगा ।
      7. निशान पूरा किया गया है के बाद, क्लिक करें विश्लेषण trackmate संवाद बॉक्स में डेटा की जरूरत उत्पंन करने के लिए ।
    3. गति की गणना करने के लिए, गुजरे समय से शुक्राणु की कुल पथ लंबाई विभाजित ।
    4. सदिश वेग की गणना करने के लिए, गर्भाशय के माध्यम से एक रेखा खींचना, जो भग से प्रारंभ होकर शुक्राणुप्रावरक की ओर इशारा करता है । दूरी को मापें इस रेखा के साथ-साथ स् ट्रेस के अंत तक शुक्राणु माइग्रेट हो चुके हैं । गुजरे समय तक इस दूरी को बांट लें । ऋणात्मक मान दर्शाते हैं कि शुक्राणु शुक्राणुप्रावरक से दूर चले गए हैं ।
    5. Reversal आवृत्ति रिकॉर्ड करने के लिए, जो के दौरान शुक्राणु ट्रेस लगातार तीन बार-चूक फ़्रेम के दौरान ९० ° से कम कोण जनरेट किया गया है समय की संख्या की गणना ।

Representative Results

इस कागज़ में दर्शाए गए परिणामों को उत्पन्न करने के लिए, फॉग-2 (q71) नर को मिको-डाई के साथ दाग दिया गया और यह जंगली-प्रकार, द2 उभयलिंगी के लिए mated किया गया । चित्रा 2 कृमि तैयारी, संभोग, और विश्लेषण सहित विधि के लिए एक समग्र योजना प्रदान करता है । फिल्म के रूप में 1 से पता चलता है, वयस्क उभयलिंगी प्रजनन पथ दो हथियार है कि एक दूसरे के दर्पण छवियां हैं । संभोग करने पर, लेबल शुक्राणु भग के माध्यम से उभयलिंगी गर्भाशय में जमा कर रहे हैं । शुक्राणु शुक्राणुप्रावरक, जहां वे निषेचन तक जमा हो जाती है की ओर गर्भाशय के भीतर विकासशील भ्रूण के आसपास चलते हैं । के रूप में वयस्क उभयलिंगी में रोगाणु कोशिकाओं oocytes में विकसित, समीपस्थ, सबसे परिपक्व oocytes म्यान कोशिका contrations के माध्यम से spermatheca में धकेल दिया है । निषेचन तब होता है जबकि अंडकोशिका शुक्राणुप्रावरक में होती है ।

मादा प्रजनन पथ के माध्यम से शुक्राणु वितरण और प्रवास की गणना करने के लिए, उभयलिंगी गर्भाशय तीन क्षेत्रों में विभाजित है (फिल्म 1, चित्रा 3a). क्षेत्र 1 गर्भाशय के पहले तीसरे spans, योनी से शुरू । 2 जोन गर्भाशय के मध्य तिहाई तक फैला है, और 3 जोन गर्भाशय के अंतिम तिहाई तक फैला है और शुक्राणुका भी शामिल है । उचित शुक्राणु मार्गदर्शन वाइल्ड-प्रकार का उपयोग करते हुए, N2 hermaphrodites और कोहरा-2 (q71) पुरुषों लेबल शुक्राणु के लगभग ९०% में परिणाम चाहिए spermatheca, या 3 जोन तक पहुंचने (चित्रा 3b) ।  Matings कि बहुत कम में परिणाम (चित्रा 3C, कम से 10-15 शुक्राणु) या बहुत अधिक (चित्रा 3 डी, गर्भाशय शुक्राणु से भरा) गर्भाशय में शुक्राणु की गणना नहीं की जानी चाहिए । सहचारिता में है कि परिणाम से कम 10-15 शुक्राणु, 3-4 दुष्ट शुक्राणु भारी डेटा तिरछा हो सकता है । इसी तरह, जब गर्भाशय पूरी तरह से शुक्राणु के साथ भर जाता है, शुक्राणु उचित रूप से विस्थापित नहीं कर सकते । शुक्राणु कुछ म्यूटेंट जो गरीब शुक्राणु मार्गदर्शन phenotype प्रदर्शित की यूट्रस यानी गर्भाशय भर में बिखरे हुए लग सकता है । हालांकि, इस मामले में, शुक्राणु गर्भाशय के प्रत्येक दरार नहीं भरना चाहिए, जैसा कि चित्रा 3dमें देखा । गोननाद के प्रत्येक भुजा का परिमाणीकरण एक प्रतिदर्श या एक छ माना जाता है ।

शुक्राणु वेग और उत्क्रमण आवृत्ति की गणना करने के लिए समय-चूक छवियों को लिया जाता है । केवल 2 क्षेत्र में शुक्राणु को ट्रैक किया जाना चाहिए (चित्र 4a) क्योंकि क्षेत्र 1 और 3 (फिल्म 1) में शुक्राणु जंगली प्रकार के जानवरों के भीतर भी एक परिपत्र पैटर्न में स्थानांतरित करने के लिए करते हैं । समय laspe छवियों 15-30 s अंतराल पर लिया आमतौर पर शुक्राणु ट्रैक करने के लिए उपयोग किया जाता है । केवल शुक्राणु है कि 2.5 से अधिक-3 मिनट के लिए लगातार फ्रेम में पीछा किया जा सकता है मात्रा निर्धारित कर रहे हैं । चित्र 4B-Mमें लाल और नीले रंग के बिंदुओं द्वारा चिह्नित शुक्राणु इस कसौटी को संतुष्ट करते हैं, जबकि हरे रंग की बिंदी से चिह्नित शुक्राणु नहीं । इसलिए, चित्रा 4N में परिभाषित मूल्यों लाल और नीले डॉट्स द्वारा चिह्नित शुक्राणु के लिए मात्रा निर्धारित कर रहे हैं (चित्रा 4n), जबकि शुक्राणु के लिए उन हरे डॉट द्वारा चिह्नित नहीं मात्रा का निर्धारण किया गया.

Figure 1
चित्रा 1: वयस्क के कार्टून सी एलिगेंस उभयलिंगी और पुरुष. प्रमुख प्रजनन संरचनाओं के आंकड़े में लेबल कर रहे हैं । इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: नमूना तैयार करने और डेटा अधिग्रहण के योजनाबद्ध आरेख. Mito-डाई के साथ दाग नर सिंक्रनाइज़ वयस्क hermaphrodites को mated कर रहे हैं । शुक्राणु वेग और उलटा आवृत्ति के लिए डेटा पर कब्जा करने के लिए संभोग के तुरंत बाद mated hermaphrodites की समय-चूक छवियों लिया जाता है । अभी भी mated hermaphrodites की छवियों गर्भाशय के भीतर शुक्राणु वितरण का आकलन करने के लिए संभोग के बाद 1 एच लिया जाता है । अधिक विवरण के लिए पाठ का संदर्भ लें । इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: उभयलिंगी गर्भाशय के भीतर शुक्राणु वितरण मात्रा को बढ़ाता है । (क) की योजना के अंतर्गत सी-एलिगेंस -उभयलिंगी गर्भाशय का योजनाबद्ध V = योनी, E = भ्रूण, स = शुक्राणुका, O = अंडकोशिका, Z1-जेड3 = क्षेत्र 1-3 शुक्राणु वितरण को मापने के लिए इस्तेमाल किया । (ब-घ) । डीआईसी + tritc (बाएं पैनलों) का विलय और tritc केवल (सही पैनलों) की छवियां जंगली प्रकार उभयलिंगी यूट्रस यानी गर्भाशय 1 घंटे के लिए संभोग के बाद कोहरे-2 (q71) पुरुषों mito-डाई के साथ दाग । शुक्राणु लाल दिखाई देते हैं । पीली बाह्यरेखाएं शुक्राणुप्रावरक के स्थान को दर्शाती हैं । स्केल बार: 20 μm । Z1, Z2, जेड बी में प्रत्येक जोन ± मानक विचलन में प्रतिशत शुक्राणु का प्रतिनिधित्व करते हैं । सी और डी में छवियां सहचारिता है कि बहुत कम (ग) या बहुत अधिक (डी) मात्रा के लिए शुक्राणु का परिणाम है का प्रतिनिधित्व करते हैं । इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: गर्भाशय के माध्यम से प्रवास के दौरान शुक्राणु वेग और उत्क्रमण आवृत्ति Quantifying. (क). डीआईसी + tritc फ्लोरोसेंट शुक्राणु युक्त एक उभयलिंगी गर्भाशय की छवि का विलय (लाल) । V = योनी, पीला = शुक्राणुका, Z1-जेड3 = गर्भाशय के तीन जोन, ब्लैक बॉक्स: जोन 2. (ब-उ) । समय-चूक TRITC चैनल छवियों में 2 जोन पर ज़ूम (एक में ब्लैक बॉक्स) । छवियां 20 s अंतराल पर अधिग्रहीत की गईं । 3 व्यक्तिगत शुक्राणु प्रत्येक छवि (लाल, हरे, और नीले डॉट्स) में ट्रैक किए गए थे । पैनल एम में रंगीन बिंदु बी-एलसे प्रत्येक शुक्राणु के पथ का प्रतिनिधित्व करते हैं । स्केल बार = 20μm । (N). समीकरण और शुक्राणु गति, वेक्टर वेग और उलटा आवृत्ति के लिए परिभाषाएं । (ओ). गति, वेक्टर वेग और लाल और नीले डॉट्स द्वारा पैनलों B-L में ट्रैक शुक्राणु की पलटने आवृत्ति । इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

Movie 1
फिल्म 1: शुक्राणु आंदोलन और प्रवास की फिल्म । एक wildtype उभयलिंगी धुंध के लिए mated -2 (q71) पुरुषों mito-डाई के साथ दाग था । फिल्म समय-चूक विभिंन समय अंतराल पर लिया छवियों का एक समग्र है । कृपया इस वीडियो को देखने के लिए यहां क्लिक करें । (डाउनलोड करने के लिए राइट-क्लिक करें.)

Discussion

शुक्राणु की क्षमता जटिल महिला प्रजनन पथ नेविगेट और oocytes खोजने के लिए यौन प्रजनन के लिए महत्वपूर्ण है । हाल ही में अध्ययन के शुक्राणु का उपयोग कर आंतरिक fertilizing पशुओं का सुझाव है कि वे सक्रिय रूप से विभिंन पर्यावरण cues का जवाब, रासायनिक संकेतों सहित, द्रव प्रवाह, और तापमान1,5,7, 9 , 12. तथापि, इन टिप्पणियों काफी हद तक इन विट्रो प्रयोगों से हुई है और थोड़ा शुक्राणु व्यवहार और प्रजनन पथ के भीतर संचार के बारे में जाना जाता है । शुक्राणु प्रवास और गतिशीलता पर vivo डेटा में प्राप्त करने के लिए मुख्य बाधाओं में से एक ज्यादातर महिला प्रजनन इलाकों के भीतर दृश्यता की कमी है । विधि हम यहां वर्णित है C. एलिगेंस का उपयोग कर इस सीमा पर काबू पा है । प्रतिनिधि के रूप में परिणाम प्रदर्शित करता है, पारदर्शी एपिडर्मिस प्रत्यक्ष दृश्य और एक जीवित, अक्षुण्ण जीव में एकल कोशिका के संकल्प पर प्रत्येक शुक्राणु की ट्रैकिंग के लिए अनुमति देता है ।

C. एलिगेंस दो लिंगों है । पुरुष, एक XO जीनोटाइप के साथ, केवल शुक्राणु का उत्पादन, और इस विधि में, शुक्राणु दाताओं के रूप में उपयोग किया जाता है । एक XX जीनोटाइप के साथ hermaphrodite, संशोधित महिलाओं रहे हैं । उनके जननग्रन्थि पहले चौथे लार्वा चरण के दौरान शुक्राणुजनन से गुजरना और वयस्कता25में अंडजनन के लिए स्विच । इस परख वयस्क hermaphrodites, जिसका प्रजनन ऊतकों महिला प्रजनन पथ के लिए एक मॉडल प्रदान का उपयोग करता है । इस परख में दोनों लिंगों के उपयोग की अनुमति देता है हम दोनों पुरुष और महिला में आनुवंशिक और आणविक रास्ते की पहचान है कि शुक्राणु मार्गदर्शन और गतिशीलता को विनियमित कर सकते हैं । सी एलिगेंसके लिए उपलब्ध आनुवंशिक और आणविक तकनीकों की पूरी मेजबानी के साथ संयुक्त, इस विधि शुक्राणु प्रवास और गतिशीलता के रूप में के रूप में अच्छी तरह से शुक्राणु और अंडक संचार में उपंयास अंतर्दृष्टि के लिए नेतृत्व कर सकते हैं ।

इस प्रोटोकॉल में कुछ महत्वपूर्ण कदम आगे विचार, प्रोटोकॉल अनुभाग में उपलब्ध कराए गए विवरण के अलावा वारंट ।

कीड़े
कोहरा-2 (q71), उसे-5 (e1490), या उसके-8 (e1489) उत्परिवर्ती नर का उपयोग द1 नर के स्थान पर किया जा सकता है । ये म्यूटेशन संस्कृतियों में पुरुषों की बारंबारता बढ़ाते हैं, लेकिन पुरुष सहवास या स्पर्म फंक्शन्स को प्रभावित नहीं करते13। महिलाओं, जैसे कोहरा-2 (q71) महिलाओं, hermaphrodites के स्थान पर इस्तेमाल किया जा सकता है । हालांकि, महिलाओं के पुरुषों के साथ पहले से mated किया जाना चाहिए करने के लिए उचित अंडक विकास की अनुमति । इस पूर्व समागम से निषेचित भ्रूण की उपस्थिति यह भी सुनिश्चित करती है कि गर्भाशय लंबे समय तक ठीक से शुक्राणु वितरण का आकलन करने के लिए पर्याप्त है । यदि उत्परिवर्ती या प्रयोगात्मक hermaphrodites का मूल्यांकन किया जा रहा है, एक नियंत्रण समूह (ओं) शामिल हैं । उदाहरण के लिए, उत्परिवर्ती hermaphrodites wildtype N2 के साथ जोड़ा जाना चाहिए, परख में अंय चर के लिए एक नियंत्रण के रूप में hermaphrodites । शाही सेना के हस्तक्षेप के लिए plasmids युक्त बैक्टीरिया के साथ खिलाया गया है कि hermaphrodites भी खाली वेक्टर नियंत्रण युक्त बैक्टीरिया के साथ खिलाया जाना चाहिए. योनी से दूरी, जहां शुक्राणु गर्भाधान कर रहे हैं, शुक्रप्रावरक, निषेचन स्थल, गर्भाशय में अंडे की संख्या के आधार पर भिंन हो सकते है (यानी गर्भाशय अंडे की संख्या में वृद्धि के साथ फैलता है) । यदि जीनोटाइप के बीच तुलना की जाए, तो उन उभयलिगों का चयन करें जिनके गर्भाशय में अंडे की समान संख्या होती है । भ्रूण के अंडे सेने या लार्वा को हिलाने वाले उभयलिंगी का चयन न करें । समय के साथ-साथ यह भी पता लगाया जा सकता है कि जिस उम्र में उभयलिंगी होना चाहिए, उसकी पहचान कैसे की जाए ।

हेम्मरोडाइटीज और नर उठा
यह महत्वपूर्ण है कि इस परख के लिए उठाया hermaphrodites ऊंचा हो गया या भूखे प्लेटों से नहीं हैं । खाद्य और फेरोमोन cues डीएएफ-7, एक tgfß homolog की अभिव्यक्ति मिलाना । DAF-7 मार्ग दिखाया गया है एफ श्रृंखला prostaglandins के संश्लेषण को विनियमित है कि शुक्राणुप्रावरक के लिए शुक्राणु मार्गदर्शक में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं20. अधिक भीड़ या भूखे प्लेटों से hermaphrodites उठा गरीब शुक्राणु मार्गदर्शन ब्याज के लक्ष्य से संबंधित नहीं में परिणाम हो सकता है । प्लेटों की सघनता से पुरुष के शुक्राणुओं पर कोई प्रभाव नहीं पड़ता । हालांकि, पुरुषों है कि बहुत युवा या बहुत पुराने है कम संभोग क्षमता में परिणाम हो सकता है (यानी, संभोग प्लेट पर hermaphrodites का प्रतिशत है कि उनके यूट्रस यानी गर्भाशय में पर्याप्त शुक्राणु है मात्रा) । 1-3 दिन पुराने वयस्क नर इस परख23के लिए इष्टतम हैं ।

हर्माचनीयकरण
हमारे हाथों में, Tetramisole और Tricaine संयोजन यह सुनिश्चित करता है कि कीड़े को स्थिर कर रहे हैं, और संभोग और छवि अधिग्रहण के दौरान जीवित रहते हैं । अन्य anesthetics, जैसे सोडियम azide, भी इस्तेमाल किया जा सकता है. हालांकि, सोडियम ऐज़ाइड अत्यधिक विषाक्त है और शर्तों को मानकीकृत करने की आवश्यकता है । Immobilization तकनीक microbeads, agarose, और microfluidics कक्षों का उपयोग कर के रूप में वे संभोग के साथ हस्तक्षेप की सिफारिश नहीं कर रहे हैं ।

पुरुष धुंधला
इस पांडुलिपि में इस्तेमाल mito-डाई, mitotrackercmxros, व्यापक रूप से शुक्राणु लेबलिंग के लिए इस्तेमाल किया गया है, के रूप में अच्छी तरह से अन्य mitochondria, सी एलिगेंसमें. इस mito-डाई के साथ लेबल शुक्राणु पूरी तरह कार्यात्मक है, अपनी क्षमता को बनाए रखने के लिए सक्रिय हो, प्रवास, खाद oocytes, और व्यवहार्य संतान26,27का उत्पादन । अन्य माइटोकॉन्ड्रियल रंगों, जैसे रोडैमाइन 6g और DiOC6 को सी. एलिगेंस माइटोकॉन्ड्रिया28,29को दाग लगाने के लिए इस्तेमाल किया गया है । हालांकि, इन रंगों के लिए शर्तों को इस परख में शुक्राणु लेबलिंग के लिए मानकीकृत की जरूरत है । Mitochrondrial लेबलिंग तंत्र के अलावा, इस तरह के Syto17 के रूप में डीएनए दाग, भी प्रवास के लिए शुक्राणु लेबल करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है assays हैं30. जबकि इन तकनीकों लेबलिंग अपेक्षाकृत आसान है और प्रदर्शन करने के लिए जल्दी कर रहे हैं, ट्रांसजेनिक रणनीतियों को भी शुक्राणु उत्पंन करने के लिए नियोजित किया जा सकता है कि व्यक्त शुक्राणु विशिष्ट प्रमोटरों के तहत फ्लोरोसेंट टैग31,३२।

संभोग
संभोग बिंदु है कि बहुत मोटी संभोग क्षमता कम हो सकती है । देखभाल संभव के रूप में छोटे बैक्टीरिया के रूप में हस्तांतरण करने के लिए लिया जाना चाहिए जब पुरुषों और anesthetized संभोग डॉट पर hermaphrodites स्थानांतरित ।

आगरोस पैड बनाने और कवर पर्ची रखने
एयर बुलबुले agarose पैड में उत्पन्न किया जा सकता है । वे छवि अधिग्रहण के दौरान प्रकाश refract कर सकते है या, जब काफी बड़े, कीड़े के माध्यम से गिर करने के लिए, यह छवि (ओं) प्राप्त करने के लिए असंभव बना । इसी तरह, हवा बुलबुले hermaphrodites के साथ बनाया जा सकता है जब कवर पर्ची उनके ऊपर agarose पैड पर रखा गया है । इन बुलबुले प्रकाश refract और छवि गुणवत्ता में कमी के लिए सीसा । अभ्यास हवा बुलबुले की घटना को कम करने में मदद मिलेगी ।

परिमाणन
जब मात्रा शुक्राणु वितरण, एक कीड़ा के गर्भाशय के माध्यम से विभिन्न जेड-विमानों शुक्राणु वितरण में मामूली अंतर हो सकता है । हम पाते हैं कि एक ही चित्र पर ध्यान केंद्रित spermatheca हमें प्रदान करता है कि परिणाम के समान हैं reproducible परिणाम कई z-वर्गों औसत द्वारा प्राप्त. हम अनुशंसा करते है spermatheca के केंद्र पर छवि ध्यान केंद्रित है, लेकिन फोकल विमानों थोड़ा बदल सकता है के आधार पर है experimenter की जरूरत है । यह महत्वपूर्ण है, तथापि, कि सभी छवियों को एक ही तरीके से लिया जाता है । इसके अलावा, यह महत्वपूर्ण है कि केवल शुक्राणु कि ध्यान में है गिना जाता है । यह इन-फोकस स्पर्म के लिए मापदंड निर्धारित करने में काउंटर का विवेकाधिकार है । तथापि, यह महत्वपूर्ण है कि मापदंड व्यवस्थित रूप से हर उस कृमि को लागू किया जाता है जिसका परिमाण निर्धारित है । शुक्राणु ट्रैकिंग के लिए, कई सॉफ्टवेयर स्वत: ट्रैकिंग क्षमताओं की पेशकश करते हैं । हालांकि, हम पाते है कि मैनुअल ट्रैकिंग दो मुख्य कारणों के लिए सॉफ्टवेयर के स्वत: ट्रैकिंग एल्गोरिथ्म outperforms है 1) सीमित स्थान के भीतर इसी तरह के आकार के नाभिक की बहुतायत यह मुश्किल सॉफ्टवेयर के लिए व्यक्तिगत शुक्राणु के बीच भेद करने के लिए बनाता है और प्रत्येक शुक्राणु के लिए परिभाषित ROIs बनाएं । 2) के रूप में शुक्राणु में और ध्यान से बाहर जाना है, उनकी तीव्रता बदलाव, यह मुश्किल सॉफ्टवेयर के लिए समय की विस्तारित अवधि में शुक्राणु का ट्रैक रखने के लिए कर रही है ।

Disclosures

लेखकों के हित का कोई टकराव नहीं है ।

Acknowledgments

हम ईमानदारी से अपने स्वर्गीय संरक्षक, डॉ माइकल मिलर, उनके प्रेरक और निस्वार्थ सदस्यता और एक उपकरण के लिए बेहतर शुक्राणु और अंडक संचार समझ के रूप में इस विधि के निर्माण के लिए धंयवाद । उनके अचानक निधन से उनके परिवार, उनकी प्रयोगशाला और वैज्ञानिक समुदाय को जबर्दस्त नुकसान हुआ है । इस अध्ययन को एनआईएच (R01GM085105 से एमएएम और F30HD094446 से एमएच) का समर्थन मिला । सामग्री केवल लेखकों की जिंमेदारी है और जरूरी स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों के सरकारी विचारों का प्रतिनिधित्व नहीं करता है ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents and Material
60 mm x 15 mm Petri dish Fisher FB0875713A
Agar Fisher BP1423-500
Sodium Chloride Fisher S671-3
Peptone Fisher BP1420-500
Cholesterol Sigma-Aldrich C8667
LB broth, Miller Fisher 1426-2
Escherichia coli strain NA22 Caenorhabditis Genetics Center (CGC) NA22 Either this or OP50 E. coli can be used for C. elegans maintenance and assay. Both may be purchased at the CGC
N2 CGC N2
fog-2(q71) CGC CB4108
Platinum wire 0.25 mm dia Alfa Aesar 10288
5 3/4" Disposable Pasteur pipet Fisher 13-678-20A
Watch glass Fisher 02-612A
5 mm Dia. Glass rod Fisher 50-121-5269
MitoTracker CMXRos (Mito-dye) Fisher M7512 Shield from light, store at -20 °C
Monopostassium phosphate Fisher P285-500
Disodium phosphate Fisher S374-1
Magnesium sulfate Fisher M63-500
Dimethyl sulfoxide Fisher BP231-1 DMSO
Aluminum foil Fisher 01-213-102
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate Sigma E10521-10G Tricaine is the common name. Store in aliquotes at -20 °C.
Tetramisole hydrochloride Sigma L9756-5G Store in aliquotes at -20 °C
Agarose Fisher BP1356-100
Coverslips Fisher 12-548-A 18 x 18-1
Frosted microscope slides Fisher 12-552-3
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
16 °C and 20 °C incubators Fisher 97-990E Same model, set at different temperatures.
Upright Microscope with epi-fluorescence illuminator, camera, and 10x and 60x objectives Nikon
Software with image acquisition and tracking capabilities Nikon NIS-elements AR
Stereo-microscope Nikon SMZ800N Any stereo-microscope that can be used to visualize C. elegans may be used with this protocol

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References

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मापने शुक्राणु मार्गदर्शन और गतिशीलता के भीतर caदुष्टता hermaphrodite प्रजनन क्षेत्र <em>एलिगेंस</em>
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Hu, M., Legg, S., Miller, M. A.… More

Hu, M., Legg, S., Miller, M. A. Measuring Sperm Guidance and Motility within the Caenorhabditis elegans Hermaphrodite Reproductive Tract. J. Vis. Exp. (148), e59783, doi:10.3791/59783 (2019).

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