Summary
정자는 성공적으로 난 모 세포를 비료를 통해 이동 해야 합니다. 여기에서, 우리는 C에서 정자 이동 측정에 대 한 분석을 설명 합니다 . 이 분석은 결합 후 자 궁 내 정자 분포에 대 한 정량적 데이터 뿐만 아니라 속도, 방향 속도 및 반전 주파수를 제공 할 수 있습니다.
Abstract
성공적인 수정은 성적인 재생산에 근본적인, 아직 거의 여성 생식 기관 내의 난 모 세포에 정액을 안내 하는 기계 장치에 관하여 알려집니다. 체 외 연구에서 내부적으로 비 옥 동물의 정자는 그들의 주변에서 다양 한 단서에 응답할 수 있습니다 제안 하는 동안, 여성 생식 기관 내부 그들의 행동을 시각화 하는 무 능력 정자 마이그레이션 이해에 대 한 도전을 만듭니다. 및 이동성을 기본 환경에서 제공 합니다. 여기서는이 한계를 극복 하 고 투명 한 표 피를 활용 하는 c. 엘 더 스를 사용 하는 방법을 설명 합니다. C. 미토 콘 드리 아 염료로 염색 한 남성은 변성 여성 역할을 하는 성인 암수와 결합 되며, 형광으로 표시 된 정자를 남녀 양성 자 궁으로 침전 시킵니다. 표시 된 정자의 이주와 운동 성을 라이브 암수에서에 피 형광 현미경을 사용 하 여 직접 추적할 수 있습니다. 야생 형 동물에서는, 표지 된 정자의 약 90%가 자 궁을 통해 크롤링 하 고 수정 사이트, 또는 spermatheca에 도달 합니다. 자 궁의 심상은 자 궁 내의 정자의 배급 및 spermatheca에 도달 한 정액의 백분율을 평가 하기 위하여 짝짓기 후에 1 시간을 취할 수 있습니다. 대안적으로, 타임 랩 스 이미지는 정자 속도, 방향 속도 및 역전 주파수를 평가 하기 위해 짝짓기 직후에 촬영 될 수 있다. 이 방법은 여성 생식 관 내의 정자 지도와 운동 성을 조절 하는 데 중요 한 새로운 유전 및 분자 메커니즘을 식별 하는 c. 엘 레 강 스에 사용할 수 있는 다른 유전 및 분자 도구와 결합 될 수 있다.
Introduction
정자 (정자가 라고도 함)가 난 모 세포를 향한 여성 생식 기관을 통해 이동 하는 분자 메커니즘은 잘 이해 되지 않지만 성적 생식에 기본입니다. 정자의 운동 성이 매우 역동적 이며 정자 속도와 방향성 운동 성을 변경 하는 강력한 통신 신호에 달려 있습니다.1,2,3,5 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12. c. 엘 레 강 스는 남녀 양성의 투명 한 표 피는 단일 세포 해상도2,3에서 살아있는 정자의 추적을 허용 하기 때문에 생체 내 정자의 움직임을 연구 하기 위한 강력한 모델이 되고있다 8,10. 이 백서의 목적은 C. 엘 더 스 틴 태 자 궁 내에서 정자의 움직임을 평가 하는 방법을 제공 하는 것입니다.
정자와 난 모 세포가 외부 환경에서 만나는 동물 종 (즉, 액 틱 환경)에서 정자는 난 모 세포가 분 비 하는 화학 전술 신호에 반응 합니다. 이 신호는 정자 운동의 방향을 안내 하 여 신호 소스4,6,11에 더 가깝게 합니다. 그러나, 훨씬 덜 내부적으로 비료 종에서 정자 운동에 대 한 알려져 있다. 주요 도전은 대부분의 종에 있는 현미경 검사 법에 접근 할 수 없는 여성 생식 기관의 건축입니다. 인간에서 시험관 내 연구, 생쥐, 돼지, 예를 들어 정자의 하위 인구가 chemoattractants, 유체 흐름 및 열 그라데이션1,5,9에 대응할 수 있다는 증거를 제공 하 고, 12. 이러한 시스템을 통해, 생체 내 정자의 움직임을 시각화 하 고 추적 하는 무 능력은 이러한 기능을 규제 하는 핵심 메커니즘을 발견 하기 위한 전략에 심각한 제한을 두고 있습니다.
이러한 한계를 극복 하기 위해, 우리는 인공 수정 후 정자를 직접 시각화 하 고, 생체 내 개별 정자 이동 매개 변수를 측정 하 고, 대상에 정자 인구의 능력을 측정 하기 위해 선 충 c. 엘 레 강 스를 사용 하는 방법을 개발 했습니다 . 시비 사이트. 이러한 방법, 함께 c. 엘 더 스 분자 및 유전 도구 세트, 정자 운동 성 행동을 조절 하는 화학 신호 분자와 분자 기계의 발견을 촉진. 예를 들어, 유전 스크린은 생체 내에서 효율적인 정자 운동에 필수적인 유전자를 식별 하기 위해 양성 또는 남성에서 실시 될 수 있다13. 분자는 정자 활성화, 이동 속도 및 방향 운동 성3에 대 한 효과를 테스트 하기 위해 양성 태 고 광고에 주입 될 수 있다. 추가적으로, 설명 된 방법은 자 궁 외 신체 위치로 악성 정자 이동을 모니터링 하 고 정자 경쟁을 평가 하기 위해 사용 될 수 있다10,14.
C. 자연에는 남녀 양성 및 남성으로 존재 합니다 ( 그림 1참조). 암수 태 고 드에는 두 개의 U 자형 팔이 있어 서로 거울로 된 이미지입니다. L4 애벌레 단계 동안, 가장 근 위부 배아 세포 (즉, spermatheca 근처의 세포)는 정자를 겪습니다. 각각의 1 차적인 정액은 감수 분열를 입력 하 고 4 개의 합 골 spermatocyte를 일으킵니다. 이 spermatids는 첫 번째 성숙한 난 모 세포와 함께 spermatids로 밀고 spermiogenesis15를 받아야 합니다. 성인 암수는 정자 생성에서 기원으로 전환 합니다. 난 모 세포는 gonad를 따라 조립 라인에서 성숙 하 고, gonad의 근 위 끝에 가장 성숙한 난 모 세포, spermatheca 옆에 있습니다. 정자의 MSP 신호는 meiotic 성숙과 배 란16,17을 유발 하는 데 필요 합니다. 남성 c.엘 레 강 스, 반면에, 정자만 생산 하는 J 자형 gonad. 정자는 정액 소포에 저장 됩니다. 암수와 결합 하면, 남성은 꼬리 근처에 있는 스파이 시를 외 음부로 삽입 합니다. Spermatids는 정액 유체18과 접촉할 때 사정 중에 활성화 됩니다. C. 엘 레 강 스 정자는 휘 발 되지 않으므로 수영 하지 않습니다. 대신, 그들은 생식 기관을 통해 기어, 운동에 대 한 의사 포드를 사용 하 여. 그것은 잘 확립 된 남성 정자,이는 더 큰 크기, 남녀 추 니 정자에 비해 경쟁 우위를가지고14.
이 방법에서, 남성 c. 엘 레 강 스는 정자 기증자 역할을 하 고 성인 hermaprhodites에 결합 된다. 성인 남성은 형광 성 미토 콘 드리 아 염료로 염색 되어 생성 된 정자를 생산 합니다. 한 번 남녀 양성의 외 음부를 통해 증 착 되 면 정자는 자 궁의 배아 주위를 spermatheca 또는 시비 사이트를 향해 기어 해야 합니다. C. 엘 더 스 모델의 투명 한 표 피는 여성 생식 기관을 통해 탐색 하는 각 개별 정자의 직접적인 시각화를 허용 합니다. 최근 몇 년 동안, 저희 연구실은이 방법을 사용 하 여 외 음부에서 정자를 인도 하는 F-시리즈 프로 스타 글란 딘의 클래스의 중요성을 입증 했습니다. 정자에의 한 양성 및 반응에의 한 합성을 관장 하는 분자 기계 심은 여전히 조사 중에 있습니다. 그러나, 정자 운동 성 및 이주를 평가 하기 위한이 방법은 크게 내부적 시비 동물에서 정자 및 난 모 세포 통신을 제어 하는 주요 선수의 식별을 용이 하 게 한다. 다음 프로토콜은이 분석을 수행 하는 방법을 단계별로 설명 합니다.
Protocol
참고:이 프로토콜의 모든 단계는 실 온 (~ 20-22 ° c) 또는 16 ° c 또는 20°c로 설정 된 항 온 인큐베이터에서 수행 됩니다. 남성 및 남녀 양성 c. 엘 레 강 스는 식품 공급원21,22로 서 표준 배양 조건 및 NA22 또는 OP50 대장균 을 사용 하 여 재배 된다. 야생 형 N2 남녀 양성 및 안개-q71) 남성은 아래의 절차에 사용 됩니다.
1. 첫째 날: 짝짓기를 위한 L4 단계 암수
- 일관 된 결과를 얻기 위해 모든 암수는 성인을 활발 하 게 재현 하는 것으로 동기화 되어야 합니다. 20-30 L4 단계를 선택 하 여 6 cm 시드 된 선 충 성장 배지 (ngm) 플레이트에 양성 하였다. 28-30 h에 대 한 20°c에서 양성을 배양.
참고: 단 12-15 암수는 짝짓기에 사용 됩니다. 나머지 암수는 잉여입니다.
2. 일 1: 형광 성 미토 콘 드리 아 염료로 남성 염색 (미토 염료)
- 시 딩 된 NGM 플레이트의 중앙에 대장균 (식품 점)의 점을 배치 하 여 남성 염색 판을 만듭니다. 식품 점을 만들기 위해, 유리 교 반 로드의 끝을 사용 하 여 시드 플레이트의 박테리아 잔디밭에서 대장균 을 긁어 내 고 시드 플레이트에 입금 하십시오. 도트 직경은 ~ 5-7 mm 이어야 한다.
- 1 mM의 2 µ L을 혼합 하 고 미토 염료를 DMSO에 넣고 10 μ l의 M9 완충 액 (3 g, 5g×2hpo 4, 63G의 염화나트륨 1mmgso4, h2o의 1ml4, H2 ~ 1l를 추가합니다. 오토 클레이 빙). 미토 염료 용액을 남성 염색 판의 푸드 닷 위에 파이 펫 팅 한다. 접시를 어둠 속에서 건조 시키십시오 (~ 30 분).
참고: 미토 염료는 빛에 민감합니다. 미토 염료를 포함 한 모든 용액, 판, 벌레를 빛 으로부터 보호 합니다. 1 mM 재고를-20°c에 보관 하십시오. - 선택 ~ 100 1-3 일 늙은 성인 남성23 세에 미토 염료를 염색 한 후 남성 염색 판에 얼룩이 있다. 플레이트를 알루미늄 호 일에 싸서 16 ° c에서 밤새 배양 하십시오. 짝짓기를 위해 12-15 암수 당 ~ 50-60 남성을 사용 하십시오. 이상 ~ 100 남성이 필요한 경우, 남성의 과잉 혼잡을 방지 하기 위해 더 염색 판을 확인 합니다.
참고: 남성은 또한 시계 유리에 3 시간 동안 M9 완충 액에 10 μ m 미토 염료 용액을 배양 하 여 염색 할 수 있습니다. 증발 및 빛 노출을 방지 하기 위해 덮여 벌레를 유지 합니다. 3 시간 후에는 파스퇴르 pipet을 사용 하 여 남성을 10cm 시드 NGM 플레이트에 전달 하십시오. 미토 염색 용액을 가능한 한 적게 옮겨 보세요. 플레이트를 알루미늄 호 일에 싸서 16 ° c에서 하룻밤 동안 배양 하십시오.
3. 둘째 날: 짝짓기
- 1 일째부터 새로운 시드 된 NGM 플레이트에 스테인드 남성을 선택 합니다. 결합 될 때까지 어둠 속에서 접시를 남겨 주세요. 이 단계는 과잉 미토 염료 남성 주위 염색 박테리아 제거 됩니다 보장. 과도 한 미토 염료로 염색 된 세균을 짝짓기 판에 발라 서, 암수 조직에 얼룩이 질 수 있습니다.
- 2 μ l의 두꺼운 대장균 혼합물을 시드 된 ngm 플레이트에 떨어뜨려 결합 판을 만드십시오. 두꺼운 박테리아를 건조 시켜 짝짓기 점을 만든다. 남성과 암수는 짝짓기를 위해이 점으로 전달 됩니다. 두꺼운 대장균을 만들기 위해, 밤새 대장균의 3 ml를 회전 하 고 M9의 1 ml에 박테리아 펠 릿을 소생 시킵니다. 이 혼합물을 4°c에서 보관 하 고 최대 6 개월 동안 재사용할 수 있다.
참고: 대장균 용액의 두께가 조절 될 수 있다. 솔루션이 너무 얇은 경우, 수 컷은 짝짓기를 위해 집계 하는 대신 짝짓기 점에서 멀리 기어 갈 수도 있습니다. E. 대장균 용 수로 만든 짝짓기 점은 너무 두 꺼 우면 결합 효율이 떨어질 수 있습니다. - 3.2 단계에서 결합 플레이트가 건조 되는 동안, 300 μ l의 0.1 300 트리 네이 터 (w/v)의 트 레 졸 솔 (1v/w)과, M9의 900 μ l를 혼합 하였다.
참고: 1% (v) 트리 네이 더와 0.1%) 테 트 라미 솔은-20°c에서 aliquotes를 저장 합니다. 반복 동결 융해를 피하십시오. - 테 테/트라이 솔루션의 600 μ l를 시계 유리에 전달 합니다.
- 전송 12-15 남녀 양성 시계 유리의 테 트/트라이 솔루션에 1 일째에 포착. 30 분 동안 배양 하 여 암수를 움직이지 않게 합니다. 테 터/트라이 액이 증발 하지 않도록 시계 유리를 덮어 두십시오.
참고: 양성이 적어도 30 분 동안 마 취 되는 것이 중요 합니다. 시간이 덜 소요 되 면 이미지 수집 중에 움직이는 웜이 발생 하 여 이미징과 상호 연결 될 수 있습니다. - 양성이 배양 되는 동안, 3.1 단계에서 짝짓기 점 (단계 3.2)에 50-60 염색 한 남성을 선택 하십시오. 3.8 단계까지 어둠 속에 접시를 저장 합니다.
- 테 트/트라이 용액에서 30 분 인큐베이션 후 유리 파스퇴르 pipet을 사용 하 여 고 정화 된 암수를 시계 유리에서 시 딩 되지 않은 NGM 플레이트에 옮겨 놓습니다. 가능한 한 많은 액체를 제거 하 고 과량의 액체가 건조 하 게 하십시오.
참고: 암수가 지나치게 건조 하 게 하지 마십시오. 보이는 액체가 모두 증발 하자마자 다음 단계를 시작 하십시오. - 마 취 된 암수를 미 시드 된 NGM 플레이트에서 염색 된 남성을 가진 짝짓기 점 위로 전달 한다. 남성의 암수 결합을 허용 하기 위해 30 분 동안 어둠 속에서 배양 합니다.
- 30 분 동안 결합 한 후, 타임 랩 스 이미징에 대 한 암수를 즉시 마운트하고, 또는 새로운 시드 NGM 플레이트에 암수를 옮겨 이미징 전 1 시간 동안 휴식을 취하십시오.
참고: 남녀 양성 자 궁의 시간 경과 비디오는 정자 속도와 역전 주파수를 정량화 하는 데 사용 됩니다. 짝짓기 후 1 시간 촬영 한 자 궁의 정지 이미지는 정자 분포를 정량화 하는 데 사용 되거나, spem 지침입니다.
4. 일 2: 시각화를 위한 설치 웜
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H2o에서 2% 아가 로스를 사용 하 여마운팅 패드 생성
참고: 2% 아가 로스를 벌크로 만들어 유리 시험관에 넣고 4°c에서 보관할 수 있습니다. 필요할 때 각 매 취는 각 사용 전에 성분 수 있으며 열 블록에 저장 하 여 응고 되지 않도록 합니다.- 장착 패드를 만들기 위해, 긴 가장자리를 만지고 나란히 3 개의 유리 현미경을 정렬 합니다. 두 외부 슬라이드 모두에 마스킹 테이프 2 개를 서로 위에 놓습니다. 테이프와이 외부 유리 슬라이드는 결과 아가 로스 패드의 두께가 "두 테이프 깊은" 될 것입니다 있도록 지원 역할을 합니다.
- 중앙 슬라이드에 2% 아가 로스의 ~ 75 μ l를 넣습니다 (이것은 테이프가 없는 슬라이드입니다). 즉시 아가 로스 위에 새로운 유리 현미경 슬라이드를 넣습니다. 이 상단 유리 슬라이드는 다른 슬라이드에 수직 이어야 하며, 각 끝이 두 개의 지지대 슬라이드의 테이프에 놓여 있습니다.
- 아가 로스를 강화 시켜 주세요 (~ 30 초). 위쪽 유리 슬라이드를 아가 로스 패드에서 밀어서 조심 스럽게 제거 합니다.
- 테 테/트라이 용액 10-15 μ l를 2% 아가 로스 패드 위에 놓습니다. 결합 된 암수를 패드에 전달 합니다. 가능한 한 작은 박테리아로 전송 하는 주의 하십시오.
- 아가 로스 패드의 웜 위에 커버 슬립을 놓습니다.
5. 둘째 날: 이미지 획득 설정
참고: 에 피 형광, 10 배 및 60x 대물 렌즈를 장착 한 모든 직 립 미스로 스코프는 정자 분배 용 이미지를 얻기 위해 디지털 카메라를 사용할 수 있습니다. 시간 경과 이미지를 획득할 수 있는 소프트웨어는 정자 속도, 방향 속도 및 반전 빈도를 평가 하는 데 필요 합니다.
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결합 후 이미지 수집 1 시간
- 슬라이드를 현미경 단계에 장착 합니다. 눈 조각을 살펴보고 적색 형광 방출 필터 (TRITC 필터)와 함께 10 배 대물 렌즈를 사용 하 여 아가 로스 패드에 벌레를 스캔 합니다. 웜이 발견 되 면 형광 표시등을 짧게 켜서 웜이 결합 되었는지 확인 합니다. 정자는 자 궁 내에서 볼 경우, 60x 목표로 전환.
참고: 커버 슬립에 60x 대물 렌즈에 의해 생성 된 압력은 일부 깨지기 쉬운 벌레를 손상 시킬 수 있습니다, 내장 또는 생식 기는 동물에서 돌출을 일으키는. 10 배 목표를 사용 하 여 성공적인 결합을 검사 하면 추가 된 압력에 대 한 웜 노출을 최소화할 수 있습니다. 결합 된 벌레를 형광등의 장시간에 노출 시 키 지 마십시오. - 차동 간섭 대비 현미경 (DIC)을 사용 하 여 외 음부와 하나의 spermatheca를 모두 볼 수 있도록 웜 위치를 지정 합니다. Spermatheca의 중심에 초점을 맞추고 이미지를 초점. DIC 및 TRITC 채널에 대 한 노출을 확인 합니다. DIC에서는 내부 웜 구조를 명확 하 게 볼 수 있어야 합니다. TRITC에서, 개별 정자는 별개의 puncta로 볼 수 있어야 합니다.
참고: 각 이미지는 외 음부에서 자 궁을 spermatheca 중 하나에 캡처해야 합니다. 자 궁이 너무 길어서 한 이미지에 맞지 않으면 두 개의 개별 이미지를 촬영할 수 있습니다. 모든 이미지를 동일한 노출 수준에서 촬영할 필요는 없습니다. 그러나, 개별 정자를 형광 이미지에서 구별 하 고 정량화 할 수 있는 것이 중요 합니다. - 각 자 궁에 대 한 DIC 및 형광 이미지를 획득 합니다.
- 모든 결합 된 암수가 이미지화 될 때까지 5.1.3 단계를 반복 합니다.
- 슬라이드를 현미경 단계에 장착 합니다. 눈 조각을 살펴보고 적색 형광 방출 필터 (TRITC 필터)와 함께 10 배 대물 렌즈를 사용 하 여 아가 로스 패드에 벌레를 스캔 합니다. 웜이 발견 되 면 형광 표시등을 짧게 켜서 웜이 결합 되었는지 확인 합니다. 정자는 자 궁 내에서 볼 경우, 60x 목표로 전환.
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타임 랩 스 동영상 캡처
- 아가 로스 패드를 스캔 하 고, 단계 5.1.1 및 5.1.2에 설명 된 바와 같이 자 궁 내에 표시 된 정자를 포함 하는 양성을 찾으십시오.
- DIC 및 TRITC 채널에서 타임 랩 스 이미지를 얻도록 소프트웨어를 구성 합니다. 일반적으로 타임 랩 스 이미지는 자 궁 당 10-20 분 동안 15-30의 간격으로 촬영 됩니다.
6. 정량화
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자 궁 심상에 정액 배급을 정량화 하는 것은 짝짓기 후에 1 시간을 취합니다
- 한쪽 끝에 있는 외 음부와 다른 쪽의 정자를 시작으로 자 궁을 삼 등분 하 여 나눕니다. 이는 세 영역을 나타냅니다. Zone 1(Z1)은 외 음부를 포함 하 고 있으며 Zone 3(Z3)에는 spermatheca가 포함 되어 있습니다.
- 자 궁의 각 1/3 내에서 정자의 수를 수동으로 계산 하 고 각 영역의 수를 전체 자 궁에 있는 총 정자의 백분율로 보고 합니다. 아래에 예가 나와 있습니다.
참고: 때로는 TRITC 채널 이미지의 신호 강도를 조정 하 여 이미지에 포착 된 모든 정자를 표시 하 고 정량화 할 수 있어야 합니다.
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타임 랩 스 이미지에서 정자 추적
참고: 이 백서에서는 분석을 위해 NIS-요소 소프트웨어를 사용 했습니다. 아래 섹션에서, 우리는이 소프트웨어를 사용 하 여 수동으로 정자를 추적 하기 위한 지침을 제공 합니다 (단계 6.2.1) 뿐만 아니라 오픈 소스 소프트웨어 ImageJ/피지 (단계 6.2.2).-
NIS-요소와 정자를 추적
- 추적할 타임 랩 스 시리즈가 있는 nd2 파일을 엽니다. 추적을 시작 하려면 소프트웨어에서 마우스 오른쪽 버튼을 클릭 하 고 분석 컨트롤을 선택 하 여 추적 패널을 엽니다. 추적.
- 추적 패널에서 새 ROI 정의를 선택 합니다. 추적 되는 각 정자를 클릭 하 여 각 관심 영역 (ROI)을 정의 합니다. 선택한 정자 위에 컬러 마크가 표시 됩니다. 모든 ROIs가 선택 된 경우 마침을 클릭 합니다.
- ROIs가 확인 되 면 타임 랩 스 시리즈의 다음 프레임으로 이동 합니다. ROI 마커를 이미지의 정자의 새 위치로 드래그 합니다. 정자를 더 이상 추적할 수 없을 때까지이 작업을 계속 합니다. 시간 경과 이미지의 모든 프레임을 통해 ROI 마커가 배치 된 각 위치를 연결 하는 점선이 표시 됩니다.
참고: 영역에서 정자만 2 영역에서 정자를 추적 해야 1 그리고 3 야생 형 동물에도 원형 패턴으로 이동 하는 경향이. - 추적 패널에서 내보내기를 클릭 하 여 추적 된 정자에서 모든 정량 데이터 (예: 경로 길이, 시간, XY 위치 등)를 Excel 문서로 내보냅니다.
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피지와 정자를 추적
- 타임 랩 스 계열의 TRITC 채널 이미지를 .tif 파일로 변환 합니다. 한 시리즈의 모든 파일을 하나의 폴더에 저장 합니다.
- BioFormats 가져오기 기능을 사용 하 여 피지에 이미지를 가져옵니다. 하나의 타임 랩 스 시리즈에서 하나의 하이퍼 스택으로 이미지를 가져옵니다.
- 피지에서 트랙 메이 트 열기24 플러그인을 통해 | 추적 | 트랙 메이 트와 수동 추적. 대각선 상자가 열립니다.
- 피지 도구 모음에서 트랙 메이 트 도구를 선택 합니다. 추적 되는 정자를 두 번 클릭 합니다. 파선으로 그린 원이 표시 됩니다. 원 내부를 클릭 하 고 원하는 위치로 드래그 하면이 원이 재배치 될 수 있습니다. ALT 키를 동시에 누르고 마우스를 스크롤하면이 원의 크기를 변경할 수 있습니다.
- 추적기의 크기와 위치가 설정 되 면 원을 다시 클릭 합니다. 녹색 파선은 녹색 선으로 바뀝니다. SHIFT 와 L 키를 동시에 눌러 추적 모드를 켭니다. 이는 피지 툴바에 표시 됩니다.
- 타임 랩 스 시리즈의 다음 프레임으로 이동 합니다. 새 프레임에서 추적 된 정자의 새 위치를 설정 하려면 마우스를 새 지점 위에 놓고 A 키를 누릅니다. 이제 추적기가 새 위치에 나타나고 추적기가 이전 프레임에 배치 된 위치를 연결 하는 선이 표시 됩니다.
- 추적이 완료 되 면 트랙 메이 트 대화 상자에서 분석 을 클릭 하 여 필요한 데이터를 생성 합니다.
- 속도를 계산 하려면 정자의 총 경로 길이를 경과 시간으로 나눕니다.
- 마리오 속도를 계산 하려면 외 음부에서 시작 하 여 spermatheca 쪽을 가리키는 자 궁을 통해 선을 그립니다. 정자를 추적의 처음부터 끝까지이 줄을 따라 마이그레이션한 거리를 측정 합니다. 이 거리를 경과 시간으로 나눕니다. 음수 값은 정자가 spermatheca에서 멀리 이주 했음을 나타냅니다.
- 반전 빈도를 기록 하기 위해, 3 개의 연속적인 타임 랩 스 프레임 동안 정자 추적이 90 ° 미만의 각도를 생성 한 횟수를 셉니다.
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NIS-요소와 정자를 추적
Representative Results
본 논문에 묘사 된 결과를 생성 하기 위해, q71) 남성은 미토 염료로 염색 하 고 야생 형, N2 양성에 결합 시켰다. 도 2 는 웜 준비, 짝짓기 및 분석을 포함 하는 방법에 대 한 전체적인 체계를 제공 한다. 영화 1 이 보여줍니다, 성인 남녀 양성 생식 관은 서로의 거울 이미지 두 팔을가지고. 짝짓기 시, 표지 된 정자는 외 음부를 통해 남녀 양성 자 궁에 침착 됩니다. 정자는 자 궁 내에서 발달 하는 배아 주위로 이동 하 여 풍부 하 게 할 때까지 저장 됩니다. 성인 암수에서 배아 세포가 근 위부로 발전 함에 따라, 대부분의 성숙한 난 모는 칼 집 세포의 콘 트를 통해 spereca로 밀려 들어갑니다. 난 모 세포가 spermatheca에 있는 동안 시비는 발생 합니다.
여성 생식 기관을 통한 정자 배급 및 이동을 정량화 하기 위해, 남녀 양성 자 궁은 3 개의 영역 (영화 1, 그림 3a)으로 나뉩니다. 영역 1은 외 음부에서 시작 하 여 자 궁의 첫 번째 1/3에 걸쳐 있습니다. Zone 2는 자 궁의 중간 1/3에 걸쳐 있으며, 구역 3은 자 궁의 마지막 1/3을 확장 하 고 spermatheca를 포함 합니다. 야생 형, N2 양성 및 안개-2 (q71) 남성을 사용 하는 적절 한 정자 지도는 약 90%의 표지 된 정자를 spermatheca 또는 영역 3에 도달 하는 결과를 초래 한다 (도 3b). 너무 적은 결과 (그림 3c, 10-15 정자 미만) 또는 너무 많은 (그림 3d, 정자로채워진 자 궁) 자 궁에서 정자를 계산 해서는 안됩니다. 10-15 정자 미만에서 발생 하는 짝짓기에서, 3-4 악성 정자는 심하게 데이터를 왜곡 수 있습니다. 마찬가지로, 자 궁이 정자로 완전히 채워질 때 정자는 적절 하 게 마이그레이션할 수 없습니다. 정자는 가난한 정자 지도 표현 형을 표시 하는 일부 돌연변이의 자궁내에 걸쳐 흩어져 보일 수 있습니다. 그러나이 경우 정자는 그림 3d에서 볼 수 있듯이 자 궁의 각 틈새를 채우지 않아야 합니다. Gonad의 각 암의 정량화는 하나의 샘플 또는 하나의 n으로 간주 된다.
타임 랩 스 이미지는 정자 속도와 반전 주파수를 정량화 하기 위해 촬영 됩니다. 영역 2에서 정자만 추적 해야 합니다 (그림 4a) 영역 1 및 3 (영화 1)에서 정자는 야생 형 동물 내 에서도 원형 패턴으로 이동 하는 경향이 있기 때문 이다. 15-30 s 간격에서 찍은 시간 laspe 이미지는 일반적으로 정자를 추적 하는 데 사용 됩니다. 2.5-3 분 이상 연속 프레임에서 따를 수 있는 정자만 정량화 됩니다. 도 4b-M에서, 적색 및 청색 점으로 표시 된 정자는 녹색 점으로 표시 된 정자는 없지만이 기준을 만족 한다. 따라서, 도 4N 에 정의 된 값은 적색 및 청색 점 (도 4n)에 의해 표시 된 정자에 대해 정량화 되 고, 반면 녹색 점으로 표시 된 정자에 대 한 수치는 정량화 되지 않았다.
그림 1: 성인 만화 c. 엘 레 강 스 남녀 추 니와 남성. 주요 생식 구조는 그림에 표시 되어 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 샘플 준비 및 데이터 수집의 개략도. 미토 염료로 얼룩진 남성은 동기화 된 성인 암수에 결합 됩니다. 결합 된 암수의 타임 랩 스 이미지는 정자 속도 및 반전 주파수에 대 한 데이터를 캡처하기 위해 짝짓기 직후에 촬영 됩니다. 결합 된 양성의 정지 화상은 자 궁 내의 정자 배급을 평가 하기 위하여 짝짓기 후에 1 시간 취합니다. 자세한 내용은 텍스트를 참조 하십시오. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: 남녀 양성 자 궁 내 정자 분포를 정량화. (A). c. 엘 더의 회로도 양성의 자 궁. V = 여과, E = 자 모 세포, Z1-Z3 = 영역 1-3 정자 분포를 측정 하는 데 사용 됩니다. (B-D). DIC + TRITC (왼쪽 패널)와 TRITC만 (오른쪽 패널)의 이미지는 미토 염료로 얼룩진 q71) 남성 안개에 짝짓기 한 후에 야생 형 남녀 양성의 화상 1 h를 병합 하였다. 정자는 빨간색으로 나타납니다. 노란색 윤곽선은 spermatheca의 위치를 나타냅니다. 스케일 바: 20 μ m. Z1, Z2, Z3에 대 한 B의 정량화는 각 영역에서의 정자 퍼센트 ± 표준 편차를 나타낸다. C 와 d 의 이미지는 정량화를 위해 너무 소수의 (c) 또는 너무 많은 정자를 초래 하는 매 충을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4: 자 궁을 통해 이동 하는 동안 정자 속도와 반전 주파수를 정량화. (A). DIC + tritc는 형광 정자 (적색)를 포함 한 남녀 양성 자 궁의 이미지를 병합 했습니다. V = 외 음부, 노란색 = 슈 페로 지, Z1-Z3 = 자 궁의 세 구역, 블랙 박스: 영역 2. (B-M). 3 영역에서 확대 된 타임 랩 스 트라이 TC 채널 이미지 (검은색 상자). 이미지는 20 초 간격으로 획득 되었습니다. 3 각 이미지에서 개별 정자를 추적 했습니다 (빨간색, 녹색 및 파란색 점). 패널 M 의 컬러 도트는 B-L에서 각 정자의 경로를 나타냅니다. 축척 막대 = 20 μ m. (N). 정자 속도, 벡터 속도 및 반전 주파수에 대 한 방정식과 정의. (오). 속도, 마리오 속도 및 정자의 반전 주파수는 빨간색과 파란색 점으로 패널 B-L 에 추적. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
영화 1: 정자의 움직임 및 이동의 영화. 미토 염료로 얼룩진 q71) 남성에 게 야생 형 암수를 결합 시켰다. 동영상은 다양 한 시간 간격으로 촬영 한 타임 랩 스 이미지의 합성입니다. 이 비디오를 보려면 여기를 클릭 하십시오. (마우스 오른쪽 버튼을 클릭 하 여 다운로드 합니다.)
Discussion
복잡 한 여성 생식 기관을 탐색 하 고 난 모 세포를 찾는 정자의 능력은 성적 재생에 중요 합니다. 내부적으로 시비 된 동물의 정자를 사용 하는 최근의 연구에 따르면 화학 신호, 유체 흐름 및 온도 기울기를 포함 한 다양 한환경 큐에 능동적으로 대응 하는 것이 좋습니다. 9 , 12. 그러나, 이러한 관측은 크게 시험관 실험에서 결과 거의 정자 행동 및 생식 기관 내에서 통신에 대 한 알려져 있다. 정자 이동 및 운동 성에 생체 내 데이터를 획득 하는 주요 장벽 중 하나는 대부분의 여성 생식 책자 내에서 가시성의 부족. 여기에서 설명 하는 방법은 c. 엘 더 스를 사용 하 여이 제한을 극복 합니다. 대표 결과 입증으로, 투명 표 피는 직접 시각화 및 살아있는, 온전한 유기 체에서 단일 세포 해상도에서 각 정자의 추적을 허용 한다.
C. 엘 더는 두 남녀가 있다. 남성은 XO 유전자 형으로 정자를 생산 하 고이 방법에서는 정자 기증자로 사용 됩니다. XX 유전자 형이 있는 암수는 개 질 된 여성입니다. 그들의 생식 기는 첫 번째 애벌레 단계에서 정자 생성을 받아야 하 고 성년에서 기원에 전환25. 이 분석은 생식 조직이 여성 생식 기관을 위한 모형을 제공 하는 성인 암수를 사용 합니다. 이 분석에서 두 남녀의 활용은 우리가 정자의 지도와 운동 성을 조절 할 수 있는 남성과 여성 모두에서 유전 및 분자 경로를 식별 할 수 있습니다. 이 방법은 정자 이동 및 운동 성 뿐만 아니라 정자 및 난 모 세포 통신에 대 한 새로운 통찰력으로 이어질 수 있습니다 c.엘 더 스에 대 한 사용할 수 있는 유전 및 분자 기술의 전체 호스트와 결합.
이 프로토콜의 몇 가지 중요 한 단계는 프로토콜 섹션에 제공 된 세부 사항 외에 추가로 고려해 야 합니다.
웜
안개-q71( e1490)또는 그-8 (E1489) 돌연변이 남성은 N2 남성 대신에 사용 될 수 있다. 이러한 돌연변이는 문화권에서 남성의 빈도를 증가, 하지만 남성 짝짓기 또는 정자 기능에 영향을 주지 않습니다13. Q71) 암컷과 같은 여성은 양성 대신에 사용 될 수 있다. 그러나, 여성은 적절 한 난 모 세포의 개발을 허용 하기 위해 남성과 사전에 결합 해야 합니다. 이 사전 결합에서 수정 된 배아의 존재는 자 궁이 정자 분포를 제대로 평가할 수 있을 정도로 길다는 것을 보장 합니다. 돌연변이 또는 실험적 양성이 평가 되는 경우에는 대조 군 (들)을 포함 한다. 예를 들어, 돌연변이 형 암수는 분석에서 다른 변수들에 대 한 대조 군으로 서 wildtype N2 암수와 짝을 이루어야 합니다. RNA 간섭 분석을 위한 플라스 미드를 포함 하는 박테리아에 공급 된 양성은 또한 빈 벡터 조절을 포함 하는 박테리아로 공급 되어야 합니다. 정자가 수정 되는 외 음부 로부터의 거리는 정자, 수정 부위는 자 궁의 계란 수 (즉, 자 궁이 증가 하는 계란 수로 확장 됨)에 따라 다를 수 있습니다. 유전자 형 간의 비교가 이루어지는 경우, 그에 게 유사한 계란 수를 포함 하는 양성을 선택 합니다. 부 화 배아를 포함 하는 양성 또는 유 충을 선택 하지 마십시오. 남녀 양성을 해야 하는 최적의 연령을 확인 하기 위해 시간 과정이 수행 될 수 있습니다.
남녀 양성 및 남성 따기
이 분석을 위해 고른 암수는 자란 또는 굶 어 지는 판에서가 아니라는 것이 중요 합니다. 음식 및 페로몬 단서는 TGFß 상 동체의 DAF-7의 발현을 조절 한다. DAF-7 통로는 spermatheca20으로 정자를 인도 하는 데 중요 한 역할을 하는 F-시리즈 프로 스타 글란 딘의 합성을 조절 하는 것으로 나타났습니다. 혼잡 하거나 굶는 접시에서 암수를 따기 가난한 정자 지도 관심의 대상에 관련 되지 발생할 수 있습니다. 판의 밀도는 남성 정자에 영향을 미치지 않는 것 같습니다. 그러나 너무 젊은 또는 너무 오래 된 남성은 결합 효율을 감소 시킬 수 있습니다 (즉, 결합 플레이트에 양성의 퍼센트는 그들의 자궁내에 있는 충분 한 정자를 정량화 하는). 1-3 하루 오래 된 성인 남성은이 분석에 대 한 최적의23.
마 취 암수
테 트 라 미 솔과 트리 네이 저의 조합은 벌레가 움직이지 않도록 하 고, 짝짓기와 이미지 수집 중에도 살아 남습니다. 나트륨 아 지 드 같은 다른 마 취 제도 사용 될 수 있다. 그러나 나트륨 아 지 드은 독성이 높고 조건을 표준화 해야 합니다. 마이크로 비드, 아가 로스 및 미세 유체 챔버를 사용 하는 고정 기법은 결합을 방해 하므로 권장 되지 않습니다.
남성 염색
이 원고, MitoTrackerCMXRos에 사용 된 미토 염료는 c.엘 레 강 스에서 정자 뿐만 아니라 다른 미토 콘 드리 아를 라벨링 하는 데 널리 사용 되어 왔습니다. 이 미토 염료로 표지 된 정자는 완전히 기능적 이어서 활성화 되 고, 이동 하 고, 난 모 세포를 비 옥 하 고, 생존 가능한 자손26,27을 생산 하는 능력을 유지 합니다. 로 다 민 6g 및 DiOC6와 같은 다른 미토 콘 드리 아 염료는 c. 엘 더 스 미토 콘 드리 아28,29를 얼룩에 사용 되었습니다. 그러나,이 염료에 대 한 조건은이 분석에서 정액 라벨링을 위해 표준화 될 필요가 있습니다. Mitochrondrial 라벨링 메커니즘 외에도, Syto17와 같은 DNA 얼룩은 또한 마이그레이션 분석 법30에 대 한 정자 라벨에 사용 될 수 있다. 이러한 라벨링 기술은 비교적 쉽고 빠르게 수행 되는 반면, 트랜스 제 닉 전략은 또한 정자 별 프로모터 (31),32에 따라 형광 태그를 발현 하는 정자를 생성 하기 위해 채택 될 수 있다.
짝짓기
너무 두 껍 지 않은 결합 점은 결합 효율을 저하 시킬 수 있습니다. 치료는 남성을 전송 하는 경우 가능한 한 작은 박테리아로 전송 하 고 짝짓기 점 상 암수를 마 취 해야한다.
아가 로스 패드 만들기 및 커버 슬립 배치
에 어 버블은 아가 로스 패드에서 생성 될 수 있습니다. 이미지를 획득 하는 동안 빛을 굴절 시키거나, 충분히 큰 경우 웜이 통과 하 여 이미지를 획득할 수 없게 됩니다. 마찬가지로, 공기 방울은 아가 로스 패드에 커버 슬립이 배치 될 때 암수를 따라 생성 될 수 있습니다. 이러한 버블은 빛을 굴절 시켜 이미지 품질을 저하 시킵니다. 연습은 기포의 발생을 감소 도움이 될 것입니다.
정량화
정자 배급을 정량화 할 때, 웜의 자 궁을 통해 다른 z 평면은 정자 분포에 약간의 차이가 있을 수 있습니다. 우리는 spermatheca에 초점을 맞춘 단일 이미지를 복용 우리에 게 여러 z 섹션을 평균화 하 여 얻은 결과와 유사한 재현 가능한 결과를 제공 하는 것을 발견. 우리는 spermatheca의 중심에 이미지를 집중 하는 것이 좋습니다, 그러나 초점 평면은 실험 자의 필요에 따라 약간 변경 될 수 있습니다. 그러나 모든 이미지를 동일한 방식으로 촬영 하는 것이 중요 합니다. 또한, 초점이 있는 정자만 계산 하는 것이 중요 합니다. 그것은 초점 정자의 기준을 결정 하는 카운터의 재량 이다. 그러나 기준이 정량화 되는 모든 웜에 체계적으로 적용 되는 것이 중요 합니다. 정자 추적을 위해, 많은 소프트웨어는 자동 추적 기능을 제공 합니다. 그러나, 우리는 수동 추적이 두 가지 주요 이유로 소프트웨어의 자동 추적 알고리즘을 능가 하는 것을 발견: 1) 제한 된 공간 내에서 유사 하 게 크기의 핵의 풍요로 움이 어렵게 개별 정자를 구별 하는 소프트웨어 그리고 각 정자에 대해 정의 된 ROIs를 만듭니다. 2) 정자는 초점을 이동, 그들의 강도 이동, 어렵게 시간의 연장 된 기간 동안 정자를 추적 하는 소프트웨어에 대 한.
Disclosures
저자는 이해 상충이 없습니다.
Acknowledgments
우리는 진심으로 우리의 후기 멘토, 박사 마이클 밀러, 그의 영감과 사심 멘토링과 더 나은 정자 및 난 모 세포 통신을 이해 하는 도구로이 방법의 창조에 감사 합니다. 그의 갑작스런 통과는 그의 가족, 그의 실험실, 그리고 과학적인 공동체를 위한 엄청난 손실 이었습니다. 이 연구는 NIH (MAM 및 F30HD094446에 R01GM085105)에 의해 지원 되었다. 콘텐츠는 전적으로 저자의 책임이 며, 반드시 건강의 국가 학회 공식 견해를 나타내는 것은 아닙니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents and Material | |||
| 60 mm x 15 mm Petri dish | Fisher | FB0875713A | |
| Agar | Fisher | BP1423-500 | |
| Sodium Chloride | Fisher | S671-3 | |
| Peptone | Fisher | BP1420-500 | |
| Cholesterol | Sigma-Aldrich | C8667 | |
| LB broth, Miller | Fisher | 1426-2 | |
| Escherichia coli strain NA22 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | NA22 | Either this or OP50 E. coli can be used for C. elegans maintenance and assay. Both may be purchased at the CGC |
| N2 | CGC | N2 | |
| fog-2(q71) | CGC | CB4108 | |
| Platinum wire 0.25 mm dia | Alfa Aesar | 10288 | |
| 5 3/4" Disposable Pasteur pipet | Fisher | 13-678-20A | |
| Watch glass | Fisher | 02-612A | |
| 5 mm Dia. Glass rod | Fisher | 50-121-5269 | |
| MitoTracker CMXRos (Mito-dye) | Fisher | M7512 | Shield from light, store at -20 °C |
| Monopostassium phosphate | Fisher | P285-500 | |
| Disodium phosphate | Fisher | S374-1 | |
| Magnesium sulfate | Fisher | M63-500 | |
| Dimethyl sulfoxide | Fisher | BP231-1 | DMSO |
| Aluminum foil | Fisher | 01-213-102 | |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate | Sigma | E10521-10G | Tricaine is the common name. Store in aliquotes at -20 °C. |
| Tetramisole hydrochloride | Sigma | L9756-5G | Store in aliquotes at -20 °C |
| Agarose | Fisher | BP1356-100 | |
| Coverslips | Fisher | 12-548-A | 18 x 18-1 |
| Frosted microscope slides | Fisher | 12-552-3 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| 16 °C and 20 °C incubators | Fisher | 97-990E | Same model, set at different temperatures. |
| Upright Microscope with epi-fluorescence illuminator, camera, and 10x and 60x objectives | Nikon | ||
| Software with image acquisition and tracking capabilities | Nikon | NIS-elements AR | |
| Stereo-microscope | Nikon | SMZ800N | Any stereo-microscope that can be used to visualize C. elegans may be used with this protocol |
References
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