Summary
本研究では、脂肪酸塩オレイン酸オレイン酸を用いた分化HepaRG細胞における肝小胞性脂肪症を誘導するための詳細なプロトコルを説明し、一貫性のある抗ストークスを含む脂質蓄積の検出と定量のための方法を採用する。ラマン散乱(CARS)顕微鏡、細胞フルオロメトリクス分析、オイルレッドO染色、およびqPCR。
Abstract
肝脂肪症は、肝細胞におけるトリグリセリド含有脂脂脂小滴の蓄積から生じた代謝機能障害を表す。過剰な脂肪の蓄積は、非アルコール性脂肪性肝疾患(NAFLD)につながり、潜在的に可逆的であり、非アルコール性脂肪性肝炎(NASH)、最終的には肝硬変および肝細胞癌(HCC)に進化する可能性がある。肝細胞の脂質蓄積とNASHへの進行、不可逆的な肝臓損傷、線維症、肝硬変、さらにはHCCを結びつける分子機構は依然として不明である。この目的のために、いくつかのインビトロおよびインビボモデルは、NAFLDを引き起こす病理学的プロセスを解明するために開発された。本研究では、脂肪酸塩オレイン酸オレイン酸で処理したDMSO分化ヒト肝肝肝細胞細胞からなる肝小胞性脂肪症の誘導に関する細胞モデルについて述べた。実際、オレイン酸ナトリウム処理HepaRG細胞は細胞質中の脂質液滴を蓄積し、脂肪症の典型的な特徴を示す。このインビトロヒトモデルは、生体内マウスモデルならびに一次ヒト肝細胞に対する貴重な代替手段を表す。また、オイルレッドO染色、細胞フルオロメトリックボディピー測定、qPCRによる代謝遺伝子発現解析、コヒーレントアンチストークなど、HepaRG細胞における脂肪蓄積の定量と評価のためのいくつかの方法の比較も提示します。ラマン散乱(CARS)顕微鏡。CARSイメージングは、材料科学アプリケーションでよく知られている化学分析技術であるラマン分光法の化学的特異性と、高速かつ高解像度の非線形光学顕微鏡の利点を組み合わせることで、正確な精度を可能にします。脂質蓄積および脂質液滴ダイナミクスの定量化。小胞性脂肪症の誘導のための効率的なインビトロモデルの確立は、脂質蓄積の定量化および特性評価のための正確な方法と共に、NAFLDの早期診断の開発につながる可能性がある。分子マーカーの同定、および新しい治療戦略の生成に。
Introduction
肝脂肪症は、肝臓体重の少なくとも5%のトリグリセリド含有脂脂脂滴内の肝内脂肪蓄積として定義される。長期の肝脂質貯蔵は、潜在的に可逆的なプロセスであるが、それは肝臓代謝機能障害、炎症および非アルコール性脂肪性肝疾患(NAFLD)の高度な形態、多くの部分で慢性肝疾患の主な原因を引き起こす可能性がある世界1、2.NAFLDは、より積極的な非アルコール性脂肪性肝炎(NASH)に進化する多因子性疾患であり、肝硬変に進行し、患者のごく一部では肝細胞癌(HCC)1、3に進行する可能性がある。NAFLDの特定の治療法として承認された治療法は現在利用でき、食事とライフスタイルの変更の組み合わせは、NAFLDおよびNASH管理4、5、6の柱のままです。
NAFLDの病因における肝性テアトーシスの発症につながる分子機構は、依然として解明されるべきである7.この文脈において、ヒトのステアトーシス病の進行を研究するためにマウスモデルが開発された。無数の異なるモデルが存在し、それぞれが異なるアプローチを組み合わせた遺伝的、栄養的および化学的に誘導されたモデルを含む、その長所と短所を持っています。遺伝子組み換え(トランスジェニックまたはノックアウト)マウスは、自発的に肝疾患を発症する。しかしながら、これらの変異はヒトでは非常にまれであり、単一遺伝子の欠失または過剰発現(例えば、ob/obマウス)は、分子レベル8、9における多因子ヒト疾患の病因を模倣しないかもしれないことに留意されたい。同様に、食事または薬理学的操作後にマウスによって獲得された疾患は、ヒト8におけるNAFLDの発症に関連するヒト食の影響を模倣しないかもしれない。しかし、動物モデルは、NAFLDの理解の開発を容易にしており、このアプローチは現在、実験室研究で最も頻繁に使用される戦略です。それにもかかわらず、動物モデルで得られた結果のヒトにおける複製は繰り返し失敗し、診療所10への翻訳が不十分である。
従って、NAFLDのインビトロモデルは、NAFLD進行の分子機構を解明する上で基本的な役割を果たし、多数の化合物をスクリーニングする貴重なツールを表す。一次細胞培養、不死細胞株および肝生検は、研究目的11のために広く使用されている。原発性ヒト肝細胞はヒトの臨床状態によく似ていますが、ドナーの数は限られており、一次細胞培養は細胞の変動性に起因する再現性が低い。これらの観察は、倫理的およびロジスティックな問題と共に、ヒト原発性肝細胞の使用が12に制限される結果となった。したがって、肝細胞株は、肝細胞株が着実に成長し、ほぼ無制限の寿命を有し、安定した表現型を有するので、一次培養に対するいくつかの本質的な利点を有する便利な代替手段を表す。さらに、細胞株は容易にアクセス可能であり、肝細胞株の培養条件は原発肝細胞の培養条件よりも単純であり、異なる実験室間で標準化されている。
ここでは、脂肪酸オレイン酸オレイン酸で処理した肝分化HepaRG細胞に代表される肝小胞性脂肪症のインビトロ細胞ベースモデルを詳細に説明する。HepaRG細胞株は、C型肝炎感染の影響を受けた女性患者およびエドモンドソングレードIよく分化した肝腫瘍14から確立された。HepaRG細胞株は、2%ジメチルスルホキシド(DMSO)に曝露した際に、胆汁様および肝細胞様細胞の2つの異なる細胞型に対して分化することができるヒトの二分性前駆細胞株である。分化HepaRG細胞(dHepaRG)は、成人肝細胞といくつかの特徴と特性を共有し、アルブミン、アルドラセB、シトクロムP450 2E1(CYP2E1)、およびシトクロムP450 3A4(CYP3A4)13などの肝臓特異的遺伝子を安定的に発現する能力を有する。(ステップ 3)を使用します。脂肪酸塩オレイン酸ナトリウム(250μM)を用いたdHepaRG細胞の治療は、細胞質脂質液滴の生成につながり、脂肪肝14、15、17、18()ステップ 4)。脂質液滴の蓄積は、オイルレッドO染色(ステップ5)、中性トリグリセリドおよび脂質赤オレンジを染色するリソクロム脂肪溶解色素によって容易に検出することができる。脂肪dHepaRGの脂質を効率的に定量するために、ここでは4,4-ジフルオロ-1,3,5,7-テトラメチル-4-ボラ-3a-3a-3a-4a-diaza-s-インダシン(Bodipy 505/515)(ステップ6)で染色した後の細胞フルオロ分析を例示します。細胞内脂質体に、脂質液滴19を標識するために使用されている。また、ここでは、dHepaRG細胞における複数の代謝遺伝子の定量ポリメラーゼ連鎖反応(qPCR)(ステップ7)によるテアトーシスの評価方法を示す。オレイン酸ナトリウム処理後の脂質液滴の蓄積をさらに特徴付け、定量化するために、一貫性のあるアンチストークス・ラマン散乱(CARS)顕微鏡検査(ステップ8)を行い、視覚化と定量化を可能にする革新的な技術を行いました。20、21を標識せずに脂質液滴。
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Protocol
1. 培養培養剤・試薬の調製
- 増殖培地:グルタマックス、10%の胎児ウシ血清(FBS)、1%ペニシリン/ストレプトマイシン、5 μg/mLインスリンおよび0.5 μMヒドロコルチゾン半球シミネチン酸を含むウィリアムのE培地を補う。
- 分化媒体:グルタマックス、10%FBS、1%ペニシリン/ストレプトマイシン、5μg/mLインスリン、50 μMヒドロコルチゾン半球シクチン酸塩および2%DMSOを含むウィリアムのE培地を補う。
- 凍結培地:10%DMSOで増殖培地を補合する。
- オレイン酸ナトリウム:100mM濃度で99%メタノールに溶解し、O/Nをかき混ぜ、-20°Cで保存する。
- オイルレッドO:ストックソリューションを準備します。オイルレッドOの0.35gの重量を量り、イソプロパノールの100 mLで溶解します。O/N、フィルター(0.2 μm)をかき混ぜ、RTで保存する作業溶液を準備する:dH2 Oの4 mLとオイルレッドOストック溶液の6 mLを混ぜます。室温(RT)に20分間座り、0.2μmフィルターで濾過します。適切なろ過は、背景を避けるために正常な染色のために強くお勧めします。
- ボディピー(505/515):100μMのストック濃度でDMSOでボディピー(505/515)染料を溶解し、暗い暗い中で-20°Cで保存し、最終的な100nM濃度で使用します。
- CARS実験用の透明なガラス底料理を取得します。
2. HepaRG細胞の解凍、増幅、凍結保存
- 窒素凍結保存HepaRG細胞を解凍するまで37°C浴に浸漬して解凍する。低パッセージ バッチ (<20) を選択します。HepaRG細胞は市販されている。
- 細胞を10mLの増殖培地と遠心分離機を含む15mLチューブに5分間(200 x g、4°C)で迅速に移入します。
- 上清を廃棄し、増殖培地の5mLで細胞を再懸濁する。
- 細胞を数え、2.5 x 104セル/cm2をプレートするために希釈します。
- 2 日または 3 日ごとにメディアを更新します。細胞は約24時間の倍増時間で増殖する。
- トリプシン溶液0.05%で3〜5分インキュベーションにより80%合流時にHepaRG細胞を剥離する。増殖培地と遠心分離機で細胞を5分間集めます(200 x g、4°C)。
- 上清を廃棄し、増殖培地の5mLで細胞を再懸濁する。
- 細胞を数え、2.5 x 104セル/cm2をプレートするために希釈します。
- この段階では、ステップ2.5〜2.8を繰り返して細胞を増幅し、適切な数の細胞に到達して実験を開始するか、ステップ2.10のように凍結保存する。
- 肝保存HepaRG細胞を凍結保存するには、トリプシン溶液0.05%で3-5分インキュベーションによりめっき後24時間細胞を剥離する。増殖培地と遠心分離機で細胞を5分間集めます(200 x g、4°C)。上清を廃棄し、凍結培地の1mL/バッチ、1.5 x 106細胞/バッチで細胞を再懸濁し、液体窒素中のバッチを凍結保存する。
3. HepaRG細胞の分化(0~21日目) (図1A)
- 0日目。低密度(2.5 x 104細胞/cm2)の種子HepaRG細胞を、適切な増殖培地を用いた培養処理食(図1B)を用いた。2つの皿は、各アッセイ(オイルレッドO染色、FACS分析、qPCR):コントロール細胞用とオレイン酸処理細胞用の1つ)にメッキする必要があります。CARS測定を行う場合(ステップ8)、透明なガラス底の皿に並列に細胞を播種する。対照として、未処理の皿を1つ収穫し(増殖細胞0日目)、分化マーカー遺伝子の遺伝子発現解析を行う(ステップ3.6参照)。
- 2日目と4日目。適切な増殖培地で培地を変更し、合流するまで細胞を増殖させる。
- 7日目。セルは 100% コンフルエントでなければなりません (図 1C)。1xリン酸緩衝生理食べ物(PBS)で細胞を一度洗います。1x PBSを取り外し、分化媒体の適切なボリュームを追加します。
- 8日目、9日目、12日目、15日目、18日目。 1x PBSで細胞を1回洗います。1x PBSを取り外し、分化媒体の適切なボリュームを追加します。
- 21日目。顕微鏡下でHepaRG細胞を観察し、細胞が結合分化培養物であることを確認する(図1D)。
- 対照として、分化マーカー遺伝子の遺伝子発現解析(ステップ7)を行う1つの対照皿(分化細胞21日目)を収穫する(図1E)。
- 21日目に、分化したHepaRG細胞を液体窒素中で凍結保存することができる。
4. ベシキュラー脂肪症の誘導(21日目~26日目)
- 21日目。250 μM(1:400)の最終濃度に完全な分化媒体の適切な容積を有するオレイン酸ナトリウム(100 mM)を希釈する。99%メタノール1:400(オレイン酸ナトリウムと同じ体積)を分化媒体の別のアリコートに加え、車両制御処理を行います。(例えば:オレイン酸ナトリウムの25 μLを培地の10mLに加え、平行に25 μLの99%メタノールを10mLの培地に加える)。1x PBSで細胞を1回洗浄し、車両またはオレイン酸ナトリウム培地を追加します。
- 23日目と25日目。ステップ 4.1 のように、作成した培地の適切な体積で培地を変更します。
- 26日目。オレイン酸ナトリウム処理細胞に脂質液滴が蓄積し、図2Aのように細胞質中の半透明の液滴として容易に見える光学顕微鏡で観察する。
5. 脂質過負荷と脂肪症誘導の評価:オイルレッドO染色
- 1x PBSで一度細胞を洗浄し、1x PBSを完全に除去します。
- 4%のパラホルムアルデヒド(1x PBSで希釈)を加え、RTで15分間インキュベートします。
注意:パラホルムアルデヒドは有毒なので、このステップは、手袋、ラボコート、マスクなどの保護具を備えたヒュームフードで行う必要があります。 - パラホルムアルデヒドを除去し、1x PBSで細胞を2回洗浄します。細胞は、染色前に数日間4°Cで1x PBSに保つことができます。パラフィルムで包み、アルミホイルで覆い、細胞の乾燥を防ぎます。
- 1x PBS を削除します。RTで5分間60%イソプロパノールで細胞をインキュベートします。
- イソプロパノールを取り除き、細胞をRTで完全に乾燥させます。
- オイルレッドO作動液を追加し、30分間RTでインキュベートします。各サンプルに必要な作業解の量は、細胞の培養に使用される培養量に対応します。
- オイルレッドO溶液を取り出し、すぐにddH2Oを加え、ddH2Oで細胞を4回洗浄する。
- 分析のために顕微鏡下で画像を取得する(図2B)。
- 油赤いO染料を溶出させる:すべての水を除去し、乾燥させるための。100%イソプロパノールの1mLを追加し、RTで穏やかな振りながら10分間インキュベートします。
- イソプロパノールを繰り出し、オイルレッドO染料を数回上下に繰り出し、すべてのオイルレッドOが溶液中であることを確認します。溶液をキュベットに移します。分光光測定でOD500nmを測定し、100%イソプロパノールをブランクとして使用する(図2C)。
6. 脂質過負荷と脂肪症誘導の評価:ボディピー染色と細胞フルオロメーション分析
- 1x PBSで細胞を1回洗います。37°Cで40分間暗闇の中で1x PBSで希釈したボディピーの100 nMでインキュベートします。染色されていないコントロールは、フローサイトメトリー測定に含める必要があります。この時点から、可能な限り光からサンプルを保護します。
注:各サンプルに必要な染色溶液の量は、細胞の培養に使用される培養物の量に対応します。 - 染色液を除去し、1x PBSで細胞を一度洗浄します。手順 6.3-6.6 に進みます。FACS(蛍光活性化細胞選別)分析または顕微鏡イメージング用ステップ6.7用。
- 1x PBSで細胞をそっと削り、15mLチューブに移します。遠心分離機 10 分 (200 x g, 4 °C)
- ペレットを乱さずに上清をそっと取り除き、1x PBSの3mLで洗浄します。遠心分離機 5分(200 x g、4 °C)。
- 上清を取り出し、1x PBSの300 μLで再中断し、FACSチューブに移します。
- 505/515 nmの励起/発光波長を用いてサイトフルオロメシス分析によりボディピの蛍光強度を直ちに測定する(図3A,B)。
- 1x PBSで細胞を1回洗浄し、完全にPBSを除去します。
- 4%のパラホルムアルデヒド(1x PBSで希釈)を加え、RTで15分間インキュベートします。
注意:パラホルムアルデヒドは有毒なので、このステップは、手袋、ラボコート、マスクなどの保護具を備えたヒュームフードで行う必要があります。 - パラホルムアルデヒドを除去し、PBSで5分間サンプルを3倍洗います。細胞は4°Cで1x PBSに保つことができるか、またはすぐに画像化することができる(図3C)。貯蔵のために、パラフィルムで包み、細胞が乾燥するのを防ぐためにアルミ箔で覆う。
7. 脂質過負荷および脂肪症誘導の評価:qPCR
- 1x PBSで細胞を1回洗います。1x PBSで細胞を掻き取り、遠心分離機を200x gで削り、上清を捨てます。この工程では、細胞を-80°Cで回収するか、ステップ7.2のように処理することができる。
- メーカーの指示に従って市販の試薬を使用して、標準的な方法で全RNA単離を行います。
- UV分光光測定によるRNA濃度を評価し、A260/A280の読み取りに基づいてRNA純度が高い(2.0に近い)ことを確認します。
- 標準的なcDNA合成キットを使用して、総RNAの1 μgからcDNAを合成します。
- CDNAをH2 Oで最終的な50μL体積に希釈します。
- qPCRによって三重に各cDNAサンプルを分析する:コントロールとして3つのハウスキーピング遺伝子に特異的なプライマーを含む各プライマーに必要な反応に十分な1つのqPCRマスターミックス(表1)を準備する:グリセラルデイド-3-fosfatoデイドロゲナシ(GAPDH)、アクチンBおよびリボソーム18S(プライマー配列については材料表を参照)
- PCRマルチウォールプレートにウェルあたり18 μLのマスターミックスを分配します。
- 各ウェルに2μLのcDNAサンプルを加えます。プレートをシールします。
- サーマルサイクラーの指示に従ってサンプルを実行します。
8. 脂質過負荷および脂肪症誘導の評価: CARS
- 手順 5.1- 5.3 で説明されているように、以前にガラス底の皿に調製したセルを修正します。
- 市販の調整可能なピコ秒パルスレーザーシステムをオンにし、異なる波長の2つの出力を得るためにそれを調整します。出力間の周波数差は、メチレン対称ストレッチに対応する強烈なCARS光信号を生成するために2,840 cm-1でなければなりません。1,064 nm(「ストークス」光)の固定波長出力の場合、他の波長は817nm(「ポンプ」光)に調整する必要があります。
- 817 nm 出力が空間的および一時的に 1,064 nm 出力と重なっていることを確認する:適切なダイクロイックミラー(すなわち、817 ~1,064 nmの間のカット)を使用して、光遅延線を使用して光遅延ラインを使用してレーザーの時間的な重なりを得るパルス。
- 2つのコプロパゲーションビームが両方コリメートされ、その直径がサンプルに焦点を当てる顕微鏡内の光学系に適した同様の値を持っていることを確認します。必要に応じて、それらを組み合わせたダイクロイックミラーの前にビームを別々にコリメートします。
- 赤外線レーザー走査ユニットとデュアルチャンネルの赤/緑エピ検出ユニットを含む必要がある市販の反転顕微鏡システムをオンにし、コプロパシングレーザービームを走査ユニットに合わせます。
- デュアルチャネルエピ検出ユニットを開き、フィルタキューブを取り外し、赤波長検出フィルタをバンドパスフィルタに置き換え、817/1,064 nmポンプ/ストークス励起の663 nmを中心とした2,840 cm-1 CARS信号を選択できます。スキーム。狭帯域(20 nm)フィルタは、高レベルの蛍光バックグラウンド信号の収集を避けるために好ましい。
- 反転CARS顕微鏡のステージに皿を置き、100倍の油浸目的を使用して、目的の垂直位置をシフトして細胞に焦点を合わせます。
- 顕微鏡ソフトウェアをセットアップして、127 μm x 127 μm の視野で高解像度(1024 x 1024 ピクセル)の画像を収集します。
- 顕微鏡ソフトウェアを設定して、127 μm x 127 μm の画写界の画像を継続的に取得して表示し、画像収集パラメータを最適化しながら表示された画像を確認します。レーザーパワーが迅速な画像収集と最小限の損傷のためにバランスを取っていることを確認し、必要に応じてビームパスに適切な中性密度フィルタを挿入し、良好な信号ツーノイズの画像の収集を可能にするピクセルのドウェル時間を選択します。選択されたレーザーの力条件の下の比率。
- 最適化された条件の下で皿内のいくつかの異なる視野の画像を取得し、保存します。必要に応じて、緑色波長放出によって生成されるマルチフォトン蛍光画像(主に817nmの2光子励起から)、他のエピ検出器を介して同時に収集してもよい。各料理に対して8.7-8.10の手順を繰り返します。
- CARS 画像解析では、ImageJ の FIJI 実装を使用してイメージを処理します。詳細を失うことなく信号対雑音比を向上させるために、さらに分析する前に、各画像にデスペックル関数(または同様のデノレーションツール)を操作します。
- FIJIを使用して手動で細胞を選択し、セグメント化された個々の細胞内の脂質液滴を自動的にカウントして、各セルの脂質液滴領域と数値、および各皿の画像データセット全体に関する統計を生成します。
9. MTT細胞生存率アッセイ
- プレートは、分化培養培地の最終100μL体積において1x105細胞/ウェルの密度を持つ96ウェルプレートにHepaRG細胞を分化した。
- 播種後24時間、99%メタノール(車両)で細胞を処理し、100μM、250μMおよび500 μMのオレイン酸ナトリウムおよびパルミ酸ナトリウムを100μLの分化培地/ウェルで三重に希釈した。
- 99%メタノールで培地を変更し、100 μM、250 μM、500 μMのオレイン酸ナトリウムとパルミテートナトリウムを100μLの分化培地/ウェル毎に24時間ごとに希釈します。
- メタノール/オレイン酸ナトリウム/パルミテートナトリウム処理後96時間、分化培地/ウェルの分化培地/ウェルを100μLで希釈した2μMドキソルビシンで細胞を対照として処理する。
- ドキソルブウシン処理後18時間、分化培養培地の100μLで培地を変化する。
- 3-(4,5-ジメチルチアゾル-2-yl)-5-(3-カルボキシキホキフェニル)-2-(4-スルホフェニル)-2H-テトラゾリウム試薬MTT(材料表)のピペ20μLを100μL培地中の細胞を含有する96ウェルブリュゼウプレートの各ウェルに.トリプリケート中の分化培養培地の100μLの細胞なしでコントロールに20 μLの試薬をピペッティングすることにより、バックグラウンドコントロールを含めます。
- 加湿、5%CO2雰囲気で37°Cでプレートをインキュベートします。
- MTTテトラゾリウム試薬で30、60、90分間インキュベートした後、96ウェルプレートリーダーを使用して490nmで吸光度を記録します。他のサンプルの吸光度値から、無細胞制御ウェルのバックグラウンド吸光度を減算します。
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Representative Results
このプロトコルは、オレイン酸ナトリウム処理によるDMSO分化HepaRG細胞における小胞性脂肪症を誘導し、特徴付ける効率的な方法を説明する(図1A)。
HepaRG細胞の分化
分化を効率的に誘導するには、増殖細胞を低密度(2.5 x 104細胞/cm2)で増殖培地に播種する必要があります。低密度で播種すると、細胞は積極的に分裂し、細長い未分化形態を獲得する(図1B)。細胞は、100%の合流に達するまで、7日間増殖培地で増殖したままにしておくべきである(図1C)。2%DMSOに曝露した後、細胞は分化し始め、胆汁性上皮様細胞に囲まれた典型的な肝細胞様コロニーを形成する(図1D)。分化したHepaRG細胞は、アルブミン、Cyp3A4およびアルドラーゼBなどの肝特異的マーカーを発現する。適切な分化を検証するために、分化細胞(21日目)および増殖細胞におけるこれらの肝マーカー遺伝子の発現レベル(0日目)をqPCR(図1E)により分析した。アルブミン、Cyp3A4およびアルドラーゼB遺伝子は増殖するHepaRG細胞と比較して分化されたHepaRG細胞でアップレギュレートされるべきであり、我々は我々の分化プロトコルの有効性を確認し、この傾向を観察した。
オレイン酸ナトリウム処理によるHepaRG細胞における小胞性脂肪症の誘導
dHepaRG細胞のオレイン酸ナトリウム処理は、脂肪蓄積を誘導し、細胞質中の脂質液滴として光学顕微鏡下で見える(図2A)。脂肪症の効率的な誘導を検証するために、オレイン酸処理および制御HepaRG細胞をオイルレッドO色素で染色した。染色後、脂質液滴は赤液滴(図2B)として容易に見ることができ、イソプロパノールでeleを通してエリゼしたオイルレッドO色素の分光光測定測定により定量することができる(図2C)。細胞からの熱光油赤Oの吸光度は、細胞質脂質液滴の蓄積に直接比例する。
オレイン酸ナトリウム濃度及び露光時間は、MTT色彩細胞生存率アッセイにより決定した(ステップ9)。オレイン酸ナトリウム処理はパルミテートナトリウム処理と比較し、アポトーチンドキソルブシン(2μM)を対照として用いった(図2D)。化合物の毒性はMTTによって評価され、MTTテトラゾリウムを含む市販化合物(材料表)を利用した。水溶性黄色MTTテトラゾリウム化合物は、代謝活性細胞によって紫色の不溶性ホルマザン産物にバイオリダリングされます。ホルマザン産物は490nmの吸光度で定量され、その量は培養中の生細胞数に直接比例する(図2D)。
オレイン酸ナトリウム処理HepaRG細胞における小胞性ステアトシスの定量化
オレイン酸ナトリウム処理後の細胞脂質含有量の増加を定量化するために、脂質液滴を標識するプローブであるBodipy色素を用いて染色を行った。細胞フルオロメトリック分析を用いて、コントロール細胞と比較してオレイン酸処理細胞において高いボディピー平均蛍光強度によりトリグリセリド含有量を定量することができる(図3A,B)、有効な脂肪を示すオレイン処理後の蓄積。実際、Bodipy染色細胞の画像は、対照細胞に見えないオレイン酸処理細胞中の明るい緑色蛍光脂質液滴を示す(図3C)。
dHepaRG細胞のオレイン酸ナトリウム処理は、脂質代謝および炎症性遺伝子発現を調節解除する。小胞性脂肪症の効率的な誘導を評価するために、コントロール細胞のそれらと比較して、オレイン酸ナトリウム処理細胞における選択された遺伝子の発現レベルをqPCRで分析した(図4)。アセチル-CoAカルボキシラーゼベータ(ACACB)、グリセロール-3-リン酸アシルトランスフェラーゼミトコンドリア(GPAM)、ペリピピン(PLIN2、PLIN4)、アポリポプロテインB(APOB)、ピルビン酸脱水素酵素キソザイム4(PDK4)、カルニチンパルムインターロイキン6(IL6)は、オレイン酸処理dHepaRG細胞で上方調節されたが、一方、溶質担体ファミリー2部2(SLC2A1)、アポリポタンパク質C-III(APOC3)、およびステアロイルCoAデサトゥラーゼ(SCD)は下方調節された(図4)。分化したHepaRG細胞にオレイン酸ナトリウムを添加した際に液滴中の脂質貯蔵をさらに特徴付け、定量化するために、革新的な顕微鏡検査技術、コヒーレントアンチストークスラマン散乱(CARS)顕微鏡を利用し、標識なしの脂質液滴の可視化と定量化(図5A)。脂質液滴は、CARS画像を用いて単細胞レベルでの数、分布、形態の観点から統計的に定量化した。オレイン酸ナトリウム(250μM)による治療は、脂質液滴数の有意な増加(図5B)を引き起こし、細胞当たりの総液滴面積(図5C)が高くなり、細胞当たりの液滴面積が高くなった(図5Dは、対照細胞と比較して、dHepaRG細胞がオレイン酸ナトリウム処理後に脂肪を効率的に蓄積したことを示す。
図 1: HepaRG細胞の分化。(A) ステップ3及び4に記載されているHepaRG細胞分化/治療プロトコルを示す代表的な図。(B-D)播種後0日目(B)に染色されていない増殖HepaRG細胞を示す画像(C)、播種後7日目(C)、播種後21日目に分化HepaRG(dHepaRG)を播種した後(D)。(E)全RNAを増殖およびdHepaRG細胞から抽出し、cDNAを、示された遺伝子に特異的なプライマーを用いてqPCRによって合成および分析した(材料の表)。試料はGAPDH、アクチンBおよびリボソーム18Sハウスキーピング遺伝子の平均に正規化した。ヒストグラムは、増殖(0日目)と分化細胞(21日目)の折りたたみ誘導を示す(バーはS.D.;p値が学生のt検定によって計算されたことを示す)。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 2: dHepaRG細胞のオレイン酸ナトリウム処理は脂質液滴蓄積を誘発した。(A) 無染色の分化HepaRG(dHepaRG)細胞を車両(対照)(左の画像)または250μMオレイン酸ナトリウムで5日間処理した画像(右画像)。(B)処理後、細胞をオイルレッドO染料で染色した。脂質液滴は赤で表示されます。(C)オイルレッドO染料をeleし、ODを570nmで測定した。結果は、3つの独立した実験の手段として表されます(バーはS.D.;学生のt検定によるp値を示します)。(D) dHepaRG細胞の細胞生存率評価(99%メタノール)を処理(Ctrl)またはオレイン酸ナトリウムおよびパルミ酸ナトリウム(100μM、250μM、または500μM)で5日間処理するか、またはドキソルブシン(2μM)で18h処理した。 細胞毒性の評価は、製造元の指示に従って、MTTアッセイキット(材料の表)を用いて490nmで吸光度を記録して行った。結果は、3つの独立した実験の手段として表されます(バーはS.D.;p値が学生のt検定を使用して決定されたことを示します:*0.01 ≤ p < 0.05;**0.001 ≤ p < 0.01; ***p < 0.001)。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 3: ボディピー染色によるオレイン酸ナトリウム処理後の脂肪蓄積の定量化分化HepaRG(dHepaRG)細胞を車両(対照)または250μMオレイン酸ナトリウムで5日間処理した。処理後、dHepaRG細胞をボディピー色素で染色し、フローサイトメトリーにより分析した。(A) 代表的なオーバーレイプロファイル(最大の割合:最大染色強度のパーセンテージ)。(B) ヒストグラムは、3つの独立した実験から対照対照細胞のパーセンテージとして平均蛍光強度(MFI)を示す(バーはS.D.;p値は学生のt検定を用いて決定された:*0.01 ≤ p < 0.05; **0.001 ≤ p < 0.01;< 0.001)。(C)細胞を4%パラホルムアルデヒドで固定した。画像は、緑色のボディピー染色脂質液滴を示しています。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 4: dHepaRG細胞のオレイン酸ナトリウム処理は、脂質代謝および炎症性遺伝子発現の調節を誘導する。分化HepaRG(dHepaRG)細胞を車両(対照)または250μMオレイン酸ナトリウムで5日間処理した。cDNは、示された遺伝子に特異的なプライマーを用いてqPCRによって分析され、結果はGAPDH、アクチンBおよびリボソーム18Sハウスキーピング遺伝子の平均に正規化された。プライマーは材料の表に与えられる。ヒストグラムは、示された遺伝子の発現レベルを対照上の処理細胞の折りたたみ誘導として示す(バーはS.D.;p値が学生のt検定によって計算されたことを示す)。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 5: CARS顕微鏡によるオレイン酸ナトリウム処理後の脂質液滴蓄積の特徴付け分化HepaRG(dHepaRG)細胞を車両(対照)または250μMオレイン酸ナトリウムで5日間処理し、CARS顕微鏡検査により分析した。(A) 脂質液滴CARSのコントラストを赤で示す代表的な画像。(B) 細胞当たりの脂質液滴数を示すヒストグラム。(C) 細胞あたりの液滴で覆われた総画像面積を示すヒストグラム。(D)細胞当たりの液滴で覆われた%液滴領域を示すヒストグラム。すべての結果は、3つの独立した実験の手段として表されます(バーはS.E.;p値が学生のt検定によって決定されたことを示します:*0.01 ≤ p < 0.05;**0.001 ≤ p < 0.01; ***p < 0.001)。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
| 試薬 | 単一反応の体積(μL) |
| 2x SYBR グリーン蛍光色素 | 10歳 |
| PCRグレードH2O | 6 |
| フォワード プライマー (μM) | 1 |
| リバースプライマー(μM) | 1 |
表 1: qPCR マスター ミックス。
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Discussion
このプロトコルは、HepaRG細胞を区別する方法と、オレイン酸ナトリウム処理による小胞性脂肪症を誘導する方法について説明する(図1A)。実際、他のヒト肝細胞癌(HCC)細胞株と比較して、HepaRG細胞株は成人ヒト肝細胞の特徴を示し、一次ヒト肝細胞を培養したex vivoに代わる貴重な代替手段を表す13,14 、15.HepaRG細胞株は、肝臓細胞毒性研究、薬物代謝、およびウイルス学研究15、16、22に広く使用されている。
HepaRG細胞と比較して、HepG2、HUH7、HUH6およびHep3Bのような他のHCC細胞株は、より低い代謝能力を示し、肝臓特異的な機能の実質的なセットを欠いている23、24、およびより高い基礎レベルを示す脂質液滴に蓄積された細胞質脂肪蓄積。したがって、これらのHCC細胞株は、HepaRG細胞株よりも脂質過負荷後の小胞性脂肪症の誘導モデルとしてあまり有用ではない。
プロトコル内の重要な手順
低密度(2.5 x 104細胞/cm2)で播種すると、HepaRG細胞は細長い未分化形態を獲得し、積極的に分裂する。100%合流に達した後、それらは2%DMSOへの曝露時に分化することができ、胆汁上皮様細胞に囲まれた典型的な肝細胞様コロニーを形成する(図1D)。この混合胆汁/肝細胞細胞培養は、他の肝細胞型(シナノイドまたはクッファー)を欠いているにもかかわらず、生理的状態に似た肝臓組織の特徴を要約する。
分化プロセスの重要なステップは、細胞の合流です。細胞は低密度(2.5 x 104細胞/cm2)(図1B)で播種し、少なくとも1週間(0〜7日目)増殖培地で積極的に増殖させなければならない。7日目に、分化プロセスを開始するために2%のDMSOを追加する前に、細胞は100%合流でなければなりません(図1C)。7日目(ステップ2.2)で完全な合流に達していない場合は、100%の合流が達成されるまで、細胞が増殖培地で数日間増殖を続けることを強くお勧めします。
プロトコルの制限事項
分化培地を添加した後、一部の細胞が罹患し、その後2〜3日の間に細胞の10%が死亡することが観察されている。この段階では、毎日の洗浄と中程度の変化(ステップ2.4)は、浮遊死細胞を廃棄し続ける必要があります。分化と増殖培地の両方を補完する特定のFBS(材料表)の使用は、7-21日目の分化効率と低い細胞死を増加させるべきである(ステップ2.4)。20経過までの細胞を維持し、分化細胞のための低い経口(<20)を選択することを強くお勧めします:最年少のHepaRG細胞では細胞死が少なくなります。さらに、HepaRGの分化は35mmと60mmの皿でより有効であると思われるが、細胞は100mmと150mmの皿に播種すると、より多くの苦しむ傾向がある。
変更とトラブルシューティング
パルミチン性脂肪酸およびオレイン酸の両方の異なる比率への曝露は、トラセトプラズマ系脂質液滴25,26の形成をもたらすことが示されている。しかし、分化HepaRG細胞のオレイン酸ナトリウム処理は、脂質蓄積および細胞生存率の効率的な誘導という点で、パルミチン酸曝露よりも優れた結果を示した(図2D)。実際、パルミチン酸処理は、分化したHepaRG細胞に対して有毒であることが判明した(図2D)。かなり細胞傷害性物質25、26、27、28、29.さらに、細胞ベースのアッセイにおけるパルミテートの利用は、溶解度が低いため困難です。それにもかかわらず、細胞株の本質的な変動性のために、オレイン酸ナトリウムの作業濃度と処理時間の長さを検証し、細胞生存率アッセイを用いた時間経過実験で異なる濃度を試験することをお勧めします。
脂質検出技術の意義と比較
細胞中の脂質量の正確な決定は、本研究において多くの異なるアプローチを用いられた。オイルレッドO染色、ボディピー染色、CARSイメージングを介して得られた結果の間に、定性的およびまたほぼ定量的な合意が認められた。細胞集団における脂質量の迅速な推定のために、ボディピー流量学またはオイルレッドOのような汚れの使用は理想的である。細胞の脂質液滴含有量のより詳細な検査のために、イメージングモダリティが好ましい。さらに、オイルレッドO20、30などの脂質汚れに対する特異性の問題が報告されており、場合によっては、Bodipy染色はCARSよりも低い容量を有し、他の細胞の中で脂質液滴を排他的に標識することが確認されています。オルガネラ(データは示さない)。したがって、CARSのようなラベルフリーの顕微鏡イメージング技術を使用することは、ステアトーシスの定量および特性化に大きな利点を提供します。大きな蛍光標識の使用を避けることで、一般的な蛍光色素と比較して脂質分子のサイズが小さいため、CARSイメージングが有利になります。したがって、脂質の検出のためには、大きなタンパク質分子を観察するよりもさらに、標識フリーの方法が望ましい。脂質CARS信号は、サンプル内で非線形相互作用が発生した場合にのみ生成される光学放出です。この相互作用は、サンプルに焦点を当てた2つの励起レーザーの周波数の差がメチレン(CH2)ストレッチ振動周波数と一致した場合にのみ検出できます。脂質中のメチレン基の豊富さは、信号対雑音比が高い非常に強い信号を生み出し、光学相互作用の非線形性はCARS顕微鏡で高い空間分解能が可能であることを意味します。CARS画像の優れた品質は、一般的に、この研究で示されるように、脂質液滴のサイズと数に関する統計の収集を可能にします。さらに、他の研究は、異なる治療18と異なる細胞内局在化と脂質液滴のサイズを相関させるCARS顕微鏡の使用を実証し、異なる波長での補足CARS測定を使用して、またはブロードバンドCARSまたは同様の刺激されたラマンアプローチは、研究者が脂質液滴31、32内の脂肪酸の異なるタイプを特徴付け可能であることを示している。さらに、CARS画像収集の急速化により、生細胞のオンサイトイメージングが可能となり、脂質液滴の増殖および凝集33の時間的進化を調べることができます。
今後のアプリケーション
ここ数十年で、細胞生物学における脂質液滴の役割と機能に関する見解が進化してきました。以前は基本的に不活性な貯蔵小胞であると考えられていたが、現在では非常に動的な細胞小器官であることが理解され、疾患におけるその役割はますます34、35、36と認識されている。肝疾患の場合、脂質蓄積(脂肪症)は重要な側面であることが長い間知られているが、疾患進行における脂質液滴の関与の正確なメカニズムは完全には明らかではない。したがって、脂質液滴の動的挙動を特徴付けることができるCARSなどの方法は、NAFLDを含む疾患の分子理解の開発にとって極めて重要である。qPCRによる代謝遺伝子発現解析は、CARSを介した脂質の分子イメージングと非常に相補的であり、以前の研究17,18で実証されているように、疾患メカニズムに関するより深い洞察を可能にする。本研究では、脂質代謝の調節や炎症性遺伝子発現の調節を伴う脂肪酸蓄積を観察し、早期疾患診断のためのバイオマーカーパネルの構築に寄与する可能性がある。
オレイン酸ナトリウム処理dHepaRG細胞ベースモデルは、発症だけでなく、NAFLDの進行に関与する分子機構の知識を高め、疾患に対するより良い治療アプローチの開発の基礎を提供する可能性があります。
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Disclosures
著者らは、彼らが競合する金銭的利益を持っていないと宣言します。
Acknowledgments
私たちは、HepaRG細胞を親切に提供してくれたクリスチャン・トレポ教授(INSERM U871、フランス、リヨン)に感謝します。私たちは、行政支援のためにリタ・アポディアに感謝しています。この研究は、MIUR-大臣デル・イストルツィオーネ、デルユニバーシタ・エ・デッラ・ライスカ(FIRB 2011-2016 RBAP10XKNC)、ローマのサピエンツァ大学(プロト)によってサポートされました。C26A13T8PS;Prot。C26A142MCH;Prot。C26A15LSXL)。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hyclone HyClone Fetal Clone II | GE Healthcare | SH30066 | |
| William’s E medium with GlutaMAX | Thermofisher | 32551087 | |
| Penicillin/streptomycin | SIGMA | P4333 | |
| Insulin | SIGMA | I9278 | |
| Hydrocortisone hemisuccinate | SIGMA | H2270 | |
| DMSO, dimethyl sulfoxide | SIGMA | D2438 | |
| Sodium Oleate | SIGMA | O7501 | |
| Methanol | SIGMA | 179337 | |
| Isopropanol | SIGMA | 278475 | |
| BODIPY 505/515 | Thermofisher | D3921 | |
| PBS | Thermofisher | 14190-250 | |
| Formaldehyde solution | SIGMA | 252549 | |
| RNAse free DNAseI | Promega | M198A | |
| Glass-bottomed dishes | Willco Wells | GWST-5040 | |
| Oil Red solution | SIGMA | O625 | |
| CellTiter 96 AQueous One Solution | Promega | G3582 | |
| q-PCR oligo name | Sequence | ||
| ACACB FOR | CAAGCCGATCACCAAGAGTAAA | ||
| ACACB REV | CCCTGAGTTATCAGAGGCTGG | ||
| β-actin FOR | GCACTCTTCCAGCCTTCCT | ||
| β-actin REV | AGGTCTTTGCGGATGTCCAC | ||
| ALBUMIN FOR | TGCTTGAATGTGCTGATGACAGG | ||
| ALBUMIN REV | AAGGCAAGTCAGCAGGCATCTCATC | ||
| ALDOB FOR | GCATCTGTCAGCAGAATGGA | ||
| ALDOB REV | TAGACAGCAGCCAGGACCTT | ||
| APOB FOR | CCTCCGTTTTGGTGGTAGAG | ||
| APOB REV | CCTAAAAGCTGGGAAGCTGA | ||
| APOC3 FOR | CTCAGCTTCATGCAGGGTTA | ||
| APOC3 REV | GGTGCTCCAGTAGTCTTTCAG | ||
| CPT1A FOR | TCATCAAGAAATGTCGCACG | ||
| CPT1A REV | GCCTCGTATGTGAGGCAAAA | ||
| CYP2E1 FOR | TTGAAGCCTCTCGTTGACCC | ||
| CYP2E1 REV | CGTGGTGGGATACAGCCAA | ||
| CYP3A4 FOR | CTTCATCCAATGGACTGCATAAAT | ||
| CYP3A4 REV | TCCCAAGTATAACACTCTACACAGACAA | ||
| GAPDH FOR | TGACAACTTTGGTATCGTGGAAGG | ||
| GAPDH REV | AGGGATGATGTTCTGGAGAGCC | ||
| GPAM FOR | TCTTTGGGTTTGCGGAATGTT | ||
| GPAM REV | ATGCACATCTCGCTCTTGAATAA | ||
| IL6 FOR | CCTGAACCTTCCAAAGATGGC | ||
| IL6 REV | ACCTCAAACTCCAAAAGACCAGTG | ||
| PDK4 FOR | ACAGACAGGAAACCCAAGCCAC | ||
| PDK4 REV | TGGAGGTGAGAAGGAACATACACG | ||
| PLIN2 FOR | TTGCAGTTGCCAATACCTATGC | ||
| PLIN2 REV | CCAGTCACAGTAGTCGTCACA | ||
| PLIN4 FOR | AATGAGTTGGAGGGGCTGGGGGACATC | ||
| PLIN4 REV | GGTCACCTAAACGAACGAAGTAGC | ||
| SCD FOR | TCTAGCTCCTATACCACCACCA | ||
| SCD REV | TCGTCTCCAACTTATCTCCTCC | ||
| SLC2A1 FOR | TGCTCATCAACCGCAACGAG | ||
| SLC2A1 REV | CCGACTCTCTTCCTTCATCTCCTG | ||
| 18S FOR | CGCCGCTAGAGGTGAAATTC | ||
| 18S REV | TTGGCAAATGCTTTCGCTC |
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