Summary
Detta protokoll beskriver hur man utför snabb låg kostnad luciferas analyser på medel lång genom strömning med hjälp av en insulin-länkade Gaussia luciferas som en proxy för insulinsekretion från beta-celler. Analysen kan utföras med de flesta luminiscens plattan läsare och Multichannel pipetter.
Abstract
Utföra anti kropp-baserade analyser för utsöndras insulin efter provtagning samling vanligt vis kräver ett par timmar till en dag av analys tid och kan vara dyrt, beroende på den specifika analysen. Utsöndras luciferas analyser påskynda resultat och sänka analysen kostnad per prov väsentligen. Här presenterar vi en relativt underutnyttjade strategi för att mäta insulin sekretorisk aktivitet från bukspottskörteln β celler med hjälp av Gaussia luciferas genetiskt införas i C-peptid. Under proteolytisk behandling av proinsulin, är C-peptid censurerade släppa luciferas inom insulinsekretoriska vesikeln där det är co-utsöndras med insulin. Resultaten kan erhållas inom några minuter efter prov insamling på grund av hastigheten på luciferas analyser. En begränsning av analysen är att det är en relativ mätning av insulinsekretion och inte en absolut kvantitation. Detta protokoll är dock ekonomiskt, skalbart och kan utföras med de flesta standard läsare för Luminescens plattor. Analoga och digitala flerkanaliga pipetter underlättar flera steg i analysen. Många olika experimentella variationer kan testas samtidigt. När en fokuserad uppsättning villkor beslutas, bör insulinkoncentrationer mätas direkt med hjälp av anti kroppar-baserade analyser med standard kurvor för att bekräfta luciferas analysen resultat.
Introduction
Den metod som presenteras här tillåter insulinsekretion från en genetiskt modifierad beta cell linje att analyseras snabbt och kostnads effektivt i 96-well-plattan format. Nyckeln till detta protokoll är en modifierad version av insulin med den naturligt utsöndras Gaussia luciferas (gluc, ~ 18 kDa) införas (se figur 1) i C-peptid för att generera insulin-Gaussia (insgluc)1,2. Andra större proteiner, såsom GFP (~ 25 kDa), har framgångs rikt satts in i C-peptid insulin och uppvisade den förväntade post-translationell behandling från proinsulin-GFP till insulin och GFP-C-peptid3,4. För analysen i detta protokoll har gluc varit Codon-optimerad för däggdjurs uttryck och två mutationer har införts för att förbättra glödliknande kinetik5,6. Flera kombinationer och replikat av behandlings villkor kan lätt testas i 96-well-Plate-format och utsöndringen resultaten kan erhållas omedelbart efter försöket.
En stor fördel, som tidigare nämnts2, är den låga kostnaden för denna luciferase-baserade sekretion mätning (< $0,01/well) som skiljer den från de relativt högre kostnader och tekniska aspekter av enzymlänkade immunosorbent analyser (Elisas) ( > $2/well) och homogent Time-lösta fluorescens (htrf) eller annan Förster resonans energi överföring (fret)-baserad anti kropp (> $1/well) analyser. I jämförelse med dessa antikroppsbaserade analyser, som mäter koncentrationen av insulin genom att referera till en standard kurva, mäter InsGLuc-analysen sekretorisk aktivitet som en relativ jämförelse med kontrollbrunnar på plattan. Därför kräver varje experiment att det införs ordentliga kontroller. Denna distinktion är en handels-off för att möjliggöra snabba och billiga mätningar. Emellertid, insgluc sekretion har visat sig vara starkt korrelerad med insulinsekretion mätt med Elisa1,2. Denna teknik har skalas upp för hög genom strömning screening1,2,7 och har lett till identifiering av nya modulatorer av insulinsekretion inklusive en spännings-gated kalium kanal hämmare7 samt en naturlig produkt hämmare av β cell funktion, kromomycin a28. Användningen av InsGLuc är mest lämplig för forskare som planerar att kontinuerligt testa många olika behandlings villkor för deras inverkan på insulinsekretion. I uppföljnings experiment är det nödvändigt att upprepa viktiga fynd i en överordnad β cell linje, och optimalt i murina eller mänskliga öar, och mäta insulinsekretion med hjälp av en antikroppsbaserad analys.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. beredning av reagenser, media och buffertar (tabell 1)
- Förbered MIN6 kompletta medier i 500 mL hög glukos (4,5 g/L) Dulbecco modifierade Eagle medium (DMEM) med följande tillsatser: 15% fostrets bovint serum (FBS), 100 enheter/mL penicillin, 100 μg/mL streptomycin, 292 μg/mL L-glutamin, och 50 μM β-merkaptoetanol.
Anmärkning: den stabila cellinjen i detta fall bibehålls i 250 μg/mL G418 antibiotikum. - Förbered Krebs-ringer bikarbonatbuffert (KRBH) genom att göra en lösning som innehåller 5 mM KCl, 120 mM NaCl, 15 mM HEPES (pH 7,4), 24 mM NaHCO3, 1 mm mgcl2, 2 mm CaCl2och 1 mg/ml radioimmunoassay-grade nötkreatur SERUMALBUMIN (BSA). Glukos skall tillsättas om detta anges från ett 2 M-lager.
Anmärkning: krbh används för att Inkubera cellerna med och utan stimulering för att bedöma insulin och/eller Gaussia luciferas sekretion. - Bered stam lösningen för coelenterazin (CTZ) enligt följande. Förbered syrad metanol genom att tillsätta 106 μl koncentrerad HCl till 10 ml metanol. Lös därefter upp frystorkad ctz i syrad metanol vid 1 mg/ml och förvara vid-80 ° c i skruv kork rör.
Obs: dessa bestånd behåller tillräcklig aktivitet i rutinmässiga luciferas analyser, även efter 1 år av korrekt förvaring. - Förbered Gaussia luciferas (gluc) assay buffert baserad på litteraturen9 samt patent information10 till stöd i halverings tiden för Gaussia luciferas analysen i 96 väl plattan format. Använd formeln: 25 mM tris pH 8, 1 mM EDTA, 5% glycerol, 1 mg/mL na2Po4, 300 mm natriumaskorbat, 200 mm na2so3 i vatten. Frys lagren vid-20 ° c. Förvara bufferten vid 4 ° c efter upptinningen.
- För att förbereda Gaussia luciferas arbets lösning, tillsätt 4,2 μl/ml av 1 mg/ml (2,36 mm) ctz stam lösning till gluc assay buffert. Detta resulterar i en 2x arbets lösning av 10 μM CTZ som kommer att ha en 5 μM koncentration i analysen.
2. kultur av InsGLuc MIN6 celler och seedning för sekretion analyser
- Till kultur MIN6 celler, trypsinize och frö cellerna en gång per vecka med hjälp av standard cell odlings tekniker. Ändra media på cellerna varannan till var tredje dag. Inkludera lämpligt urval antibiotikum, såsom 250 μg/mL G418 i mediet.
- För att ge ett tillräckligt antal celler varje vecka för experiment, underhålla cellerna i T75 kolvar. Seedning 6 x 106 celler per T75 i 10 ml av media kommer normalt att ge 30 x 106 till 40 x 106 celler totalt per T75 efter 7 dagar av kultur.
- Att förbereda celler för plätering i 96-well tallrikar, tvätta en konfluenta T75 av insgluc MIN6 celler två gånger med PBS och tillsätt 2 ml av trypsin. Inkubera vid 37 ° c i ~ 5 min eller tills cellerna separeras från kolven. Bestäm cell koncentrationen per milliliter.
- Späd cellerna i kompletta medier till 1 x 106 celler/ml för att resultera i 1 x 105 celler i 100 μl per brunn i en 96-brunn tallrik. Cellerna ska vara tillräckligt konflytande för analysen efter 3 – 4 dagar.
Anm: för att förlänga odlings perioden kan halva cell koncentrationen förläggas. Medie förändringar krävs inte före dagen för analysen om inte cellerna ska utsättas för experimentella behandlingar.
- Späd cellerna i kompletta medier till 1 x 106 celler/ml för att resultera i 1 x 105 celler i 100 μl per brunn i en 96-brunn tallrik. Cellerna ska vara tillräckligt konflytande för analysen efter 3 – 4 dagar.
3. glukos-stimulerad Gaussia luciferas sekretion analys
- På dagen för analysen förbereda tillräckligt KRBH för experimentet (steg 1,2). Minst 50 mL KRBH per 96-brunn krävs, därför bereds minst 75 mL för att säkerställa tillräcklig buffert för experimentet. Förbered extra buffert om olika kombinationer av villkor för behandling av läkemedel kommer att kräva KRBH för spädning.
- Förbered en reservoar med glukos fri KRBH. Decant mediet från 96-well plattan (s) genom att snabbt vända plattan över ett laboratorium sjunka och sedan blot stadigt på en bunt pappers hand dukar för att ta bort överflödigt medium.
- Använd antingen en elektronisk eller manuell 8-kanalspipett, Pipettera 100 μL/brunn KRBH från reservoaren över 96-brunn plattan (s). Upprepa för totalt två tvättar.
- (Valfritt steg av akuta sammansatta behandlingar) Om du inte utför läkemedels behandlingar, Fortsätt med steg 3,5 och 3,6 utan modifiering. För att testa effekterna av små molekyler på insulinsekretion, föreningar kan läggas till cellerna under preinkubations perioden, stimuleringsperiod, eller båda.
- En teknik är att lägga till föreningar i parti till KRBH i 1,5 mL rör och använda en justerbar 8-kanals Digital pipett för att överföra drogen-KRBH från rören till cellerna i 96-well plattor.
Obs: om en justerbar pipett inte är tillgänglig kan en replika 96-brunn platta av Drug-KRBH göras och en standard 8-kanals pipett kan användas för att överföra buffert. Ytterligare modifieringar av behandlings paradigmet kan göras för att behandla celler i 24 timmar i media före analysen, som tidigare beskrivits1,8.
- En teknik är att lägga till föreningar i parti till KRBH i 1,5 mL rör och använda en justerbar 8-kanals Digital pipett för att överföra drogen-KRBH från rören till cellerna i 96-well plattor.
- Tillsätt 100 μL av KRBH som innehåller den önskade koncentrationen av glukos eller föreningar och placera skålen i 37 ° c-inkubator för 1 h.
Obs: beroende på experimentell layout, är det mycket bra att ha en elektronisk Multichannel pipett som tillåter över gången kanal avstånd från en kolonn av åtta 1,5-mL rör till 8 rader av en 96-well plattan. - Efter 1 h preinkubation, Dekantera bufferten i diskhon och blot stadigt på pappers hand duk. Tillsätt 100 μL glukos fritt KRBH per brunn för att tvätta bort den ackumulerade bakgrunden av Gaussia luciferase. Häll av plattan igen och tillsätt kontroll och stimulerande tillstånd till plattan på 100 μL per brunn. Placera skålen i 37 ° c inkubator för 1 h.
- Samla försiktigt in 50 μL supernatanten med hjälp av en flerkanalspipett, ändra tips mellan behandlings förhållandena vid behov och överför supernatanten till en ren ogenomskinlig vit 96-brunn-analysplattan.
Obs: vita väggar klar botten plattor kan användas om det behövs, även om en betydande mängd luciferas signal kommer att förloras. - Efter uppsamling av 50 μL av KRBH-supernatanten kan provet analyseras omedelbart. Vid behov, täta och förvara prover vid 4 ° c i några dagar (gluc aktivitet halverings tid ~ 6 dagar) eller-20 ° c i upp till en månad11,12.
4. utsöndras Gaussia luciferas-analys
- För att bereda GLuc-analysens arbets lösning, Pipettera den erforderliga mängden CTZ-lagerlösning (4,2 μL/mL) till GLuc-analysbuffert. För att förhindra uppvärmningen av CTZ, Pipettera CTZ snabbt vid-80 ° c frys eller hålla röret på torris.
- Använd en elektronisk multikanalpipett och tillsätt snabbt 50 μL av GLuc-analysens arbets lösning per brunn över den 96-väl skålen som innehåller de insamlade KRBH-supernatanterna. Om det finns några droppar på sidorna av några brunnar, kort snurra plattan i en tabell-top Swing-hink centrifug.
- Läs luminiscens i en passande Plattläsare inom några minuter och Läs varje brunn med en 0,1 integrations tid.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
För att mäta analysens prestanda under kontroll förhållanden kan en enkel glukos dos-responskurva eller en stimulering med diazoxidparadigmet slutföras. När det gäller den förstnämnda, pre-inkuberar cellerna för 1 h i glukos-fria förhållanden följt av behandling för 1 h med ökande glukos koncentrationer bör resultera i mycket lite sekretorisk aktivitet vid och under 5 mM, medan ökad utsöndring observeras över 8 mM glukos (figur 2). Stimulering med 35 mM KCl fungerar också som en positiv kontroll för stimulerad sekretion. Inkluderingen av utsöndringen-modulerande läkemedel under stimuleringsperioden bör ge förväntad hämning eller potentiering av utsöndras GLuc aktivitet (figur 3). Till exempel, diazoxid binder KATP -kanalen och förhindrar den från att stänga på ökad [ATP/ADP] ratio, blockering membran depolarisation och förhindra utsöndring13. Phorbol estrar som para-methoxyamphetamine (PMA) aktivera protein Kinas C (PKC) och är kända förstärkare av insulinsekretion14. Slutligen, stimulering med 1 μM adrenalin aktiverar α2a-Adrenerga receptorer som i sin tur aktiverar heterotrimeric G-proteinkomplex GI, hämmande membran depolarisation och insulinsekretion15. Det är viktigt att inse att medan MIN6 celler är en odödlig cellinjen, de börjar förlora ordentlig glukos-inducerad insulinsekretion svar (såsom vänster-förskjutning av responskurvan) efter förlängd passaging16. Av denna anledning, det är god praxis att rutinmässigt kultur alla MIN6 cellinjer i upp till åtta veckor (uppdelning en gång per vecka) innan du börjar över från flytande kväve lager.
Figur 1: Beskrivning av InsGLuc reporter. (A) först, en stabil β cellinjen (i detta fall MIN6 celler) genererades uttrycker insulin-Gaussia transgenen från råtta insulinpromotorn. (B) hela proteinet syntetiseras och förpackas i insulingranulat tillsammans med endogent insulin. Prohormon konvertaser klyva peptiden, indikeras av asterisker. Cdet bearbetade insulinet och Gaussia samutsöndras och luciferasaktiviteten detekteras genom tillsats av ctz i en syre beroende reaktion som är oberoende av ATP. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: den InsGLuc reporter är en trogen proxy av insulinsekretion från MIN6 beta-celler. (A) svar av MIN6 insgluc celler att öka glukos koncentrationer och KCl (35 mm) med Gaussia luciferas sekretion. Data är genomsnittlig Fold luciferas aktivitet ± se jämfört med 0 mm glukos villkor för tre oberoende experiment. *, P < 0,05. Figuren har modifierats med tillstånd från Kalwat et al. ACS sensorer 20161. © 2016 amerikanska Kemisksamfundet. (B) den InsGLuc reporter i MIN6 celler uppvisar den förväntade sekretoriska svar på diazoxid (DZ) paradigm där 250 μM dz behandling innehar KATP kanalen öppen, blockerar membran depolarisation om inte extracellulär KCl (35 mm) tillhandahålls att framkalla den "Utlös ande" kalcium tillströmningen. Ytterligare tillsats av glukos (20 mM) under dz + KCl villkoret avslöjar metabolisk amplifiering av sekretion som sker utan ytterligare ökningar i kalcium tillströmningen. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: inkluderande av sekretionssänkande substanser under glukos-stimulerar InsGLuc-sekretion. InsGLuc MIN6 celler pläterade i 96-well format som beskrivits var förinkuberas i glukos-fri KRBH för 1 h. cellerna behandlades sedan med eller utan 20 mM glukos i närvaro av dimetylsulfoxid (DMSO) (0,1%), KCl (35 mM), diazoxid (250 μM), PMA (100 nM), eller Epinefrin (1 μM) för 1 h. stapeldiagrammet representerar medelvärdet ± SE för minst 3 oberoende experiment. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Krebs-ringer bikarbonat buffert (KRBH) | |||
| Stam lösning eller pulver | Lager | Slutlig koncentration | 100-100 mL |
| KCl | 0,25 M | till 5 mM | med 2 ml |
| Nacl | 4 miljoner | 120 mM | med 3 ml |
| Hepes, pH 7,4 | 1 M till | till 15 mM | 1,5 ml |
| NaHCO3 | 0,5 M | till 24 mM | 4,8 ml |
| MgCl2 | 1 M till | med 1 mM | 0,1 ml |
| CaCl2 | 1 M till | 2 mM | 0,2 ml |
| Vatten | H2o | 88,4 ml | |
| RIA-grade BSA | Pulver | 1 mg/mL | 100 mg |
| Gör färska på dag av experiment. | |||
| Gaussia assay buffert * | |||
| Stam lösning eller pulver | Lager | Slutlig koncentration | 50-100 mL |
| Dinatriumfosfat | Pulver | 0,1% (1 mg/mL) | 50 mg |
| Glycerol | 40% av | 5 | 6,25-100 mL |
| Natrium-bromid | Pulver | 150 mM | 772 mg |
| EDTA pH 8 | på 0,5 m | med 1 mM | 100 μL |
| Tris-HCl pH 8 | 1M | på 25 mM | 1,25-100 mL |
| Askor bin syra * | Pulver | 300 mM | 2,64 g |
| Na2SO3** | Pulver | 200 mM | 1,26 g |
| Vatten | upp till 50mL | ||
| Förvaras i portioner vid-20 ° c, Tina en i taget och förvaras vid 4 ° c. | |||
| * Modifierad recept från luft et al. BMC biokemi 2014, 15:14. | |||
| Acidified MeOH | |||
| Stam lösning eller pulver | Lager | Slutlig koncentration | 10 mL |
| Metanol | 100% av | 10 mL | |
| Hcl | 11,65 M | 1,06% av | 0,106-100 mL |
| Coelenterazine lösning | |||
| Stam lösning eller pulver | Lager | Slutlig koncentration | med 1 mL |
| Coelenterazin | Pulver | 1 mg/mL (2,36 mM) | med 1 mg |
| Acidified metanol | med 1 mL | ||
| 4,2 μL av lagret per 1 mL Gaussia-analysbuffert resulterar i 10 μM CTZ som ska användas som en 2x arbets lösning. | |||
| Tillsätt till exempel 50 μL 2x arbets lösning till 50 μL av KRBH-provet som innehåller utsöndras Gaussia. | |||
Tabell 1: buffertlösning och lager lösnings recept som används för att utföra de presenterade analyserna.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Häri presenterar vi en metod för att snabbt bedöma glukos-stimulerad insulinsekretion svar från MIN6 β celler. För bästa svar i analysen är det viktigt att utsäde MIN6 cellerna på rätt densitet och tillåta dem att bli 85-95% konflytande. Detta förbättrar β cell svar på glukos på grund av förbättrade cell-cell-kontakter och synkronisering, som sker både i primära holsar17,18,19,20,21 samt MIN6 cellerna16,18. För att förhindra förluster i sekretoriska svar på glukos stimulering, är det viktigt att bibehålla cellerna vid så lågt av en passage som möjligt och kultur cellerna för endast 6-8 veckor före upptining av en ny injektions flaska från flytande kväve bestånd. Ändringar kan göras i pläteringsstrategin i protokoll avsnitt 2 för att anpassa den tillgängliga utrustningen efter behov. Plätering InsGLuc MIN6 celler i 96-well tallrikar för sekretion analyser ger ett stort antal brunnar för experimentella manipulationer (inklusive replikat) samt bibehålla noggrannheten av plätering i en normal Lab inställning, som plätering i rätter med högre brunn nummer kräver ofta särskild utrustning vanligt vis finns i hög genom strömning screening kärnor.
Aktuella analyser för insulinsekretion, förutom den indirekta luciferas-analysen som beskrivs här, inkluderar: Elisas som använder kolorimetriska avläsningar (direkt analys), radioimmunoassay (konkurrens analys) som använder radioaktiv avläsning, fret-baserad anti kropp konkurrens analys22 och HTRF23 som använder bandet mellan Dye-länkade anti kroppar för att mäta INSULIN direkt, och DNA-aptamers24. Var och en av dessa metoder har sina egna fördelar, men i allmänhet är de dyrare och/eller tids krävande än en luciferas assay. En viktig begränsning av insgluc-analysen är det faktum att självlysande aktivitet av co-utsöndras luciferas är bara en proxy för faktisk insulinsekretion. Dessutom, det finns ingen förväntad skillnad i luciferas aktivitet mellan Gaussia med fragment av C-peptid på dess N-och C-Termini eller Gaussia inom proinsulinproteinet, som Gaussia luciferas har framgångs rikt använts som en tagg för att mäta utsöndringen av andra proteiner25. Detta belyser kravet på bekräftelse studier med hjälp av analyser som mäter bearbetat insulin specifikt. Alternativ till direkta och indirekta mätningar av insulinsekretion kan också användas för att bedöma β-cellernas funktion. En mängd optiska reportrar finns för avläsning inklusive ATP: ADP ratio, kalcium inflöde, NAD+/NADH ratio, extracellulär signalreglerade KINASER (Erk) aktivering, eller cykliskt adenosinmonofosfat (Camp) nivåer26.
I synnerhet de framtida tillämpningarna av InsGLuc förefaller vara i screening med hög genom strömning. Denna analys har redan använts i en handfull publicerade små skärmar1,2 och opublicerade större skärmar är antingen avslutade7 eller pågår. Utveckling av andra iterationer av denna teknik kan innebära märkning av andra utsöndras ö-hormoner med luciferaser för att under lätta snabba mätningar, såsom glukagon eller somatostatin. Ändringar kan göras i alla fall där cellinjen återskapas med hjälp av alternativa metoder inklusive CRISPR/Cas9, lentivirus, eller transposase-medierad insättning i någon lämplig beta cell linje. Ytterligare möjliga ändringar av den ursprungliga reportern kan innefatta att ersätta alternativa utsöndras luciferaser för Gaussia eller kombinera flera olika utsöndras luciferaser kopplade till olika hormoner för en Multiplexed analys. Bortom cell kultur, crispr/Cas9 teknik presenterar möjligheten att generera en mus modell där en lämplig luciferas slås in i C-peptid kodning regionen Ins2 i genomet. En sådan mus skulle vara genomförbar med tanke på att transgena möss har skapats med GFP knackade in på samma C-peptid plats27 och skulle möjliggöra mätning av endogen β cell funktion med en luciferas assay in vivo eller ex vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Författarna tackar alla nuvarande och tidigare medlemmar i Cobb laboratorium för värdefulla arbete och diskussioner, och Dionne ware för administrativt stöd. Michael Kalwat stöds av en juvenil diabetes forsknings stiftelse SRA-2019-702-Q-R. Detta arbete möjliggjordes genom NIH R37 DK34128 och Welch Foundation Grant I1243 till Melanie Cobb. Tidiga delar av detta arbete stöddes också av en NIH F32 DK100113 till Michael Kalwat.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell culture materials | |||
| rIns-GLuc stable MIN6 cells | Parental MIN6 cell line stably expressing pcDNA3.1+rInsp-Ins-eGLuc and maintained in 250 ug/ml G418 | ||
| DMEM | Sigma | D6429 | 4.5 g/L glucose media |
| fetal bovine serum, heat-inactivated | Sigma | F4135 | |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo-Fisher Scientific | SV30010 | |
| beta-mercaptoethanol | Thermo-Fisher Scientific | BP 176-100 | |
| glutamine | Thermo-Fisher Scientific | BP379-100 | |
| Trypsin-EDTA | Sigma | T3924-500 | |
| G418 | Gold Biotechnology | G418-10 | Stock solution 250 mg/mL in water. Freeze aliquots at -20C. |
| T75 tissue culture flasks | Fisher Scientific | 07-202-000 | |
| 96 well tissue culture plates | Celltreat | 229196 | |
| Reagent reservoirs (50 mL) | Corning | 4870 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Secretion assay reagents | |||
| BSA (RIA grade) | Thermo-Fisher Scientific | 50-146-952 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma | G8270-1KG | |
| KCl | Thermo-Fisher Scientific | P217-500 | |
| NaCl | Thermo-Fisher Scientific | S271-3 | |
| Hepes, pH 7.4 | Thermo-Fisher Scientific | 50-213-365 | |
| NaHCO3 | Thermo-Fisher Scientific | 15568414 | |
| MgCl2 | Thermo-Fisher Scientific | M9272-500G | |
| CaCl2 | Sigma | C-7902 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Optional drugs for stimulation experiments | |||
| Diazoxide | Sigma | D9035 | Stock solution: 50 mM in 0.1N NaOH. Add equal amount of 0.1N HCl to any buffer where diazoxide is added. |
| epinephrine (bitartrate salt) | Sigma | E4375 | Stock solution: 5 mM in water |
| PMA (phorbol 12-myristate) | Sigma | P1585 | Stock solution: 100 µM in DMSO |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Guassia assay materials | |||
| Disodium phosphate (Na2HPO4) | Thermo-Fisher Scientific | S374-500 | |
| Glycerol | Thermo-Fisher Scientific | G334 | |
| Sodium Bromide | Thermo-Fisher Scientific | AC44680-1000 | |
| EDTA | Thermo-Fisher Scientific | AC44608-5000 | Stock solution: 0.5 M pH 8 |
| Tris base | RPI | T60040-1000.0 | Stock solution: 1 M pH 8 |
| Ascorbic Acid | Fisher Scientific | AAA1775922 | US Patent US7718389 suggested ascorbate can increase coelenterazine stability. |
| Na2SO3 | Sigma | S0505-250G | US Patent US8367357 suggested sulfite may decrease background due to BSA |
| Coelenterazine (native) | Nanolight / Prolume | 3035MG | Stock solution: 1 mg/ml in acidified MeOH (2.36 mM) |
| OptiPlate-96, White Opaque 96-well Microplate | Perkin Elmer | 6005290 | Any opaque white 96 well plate should be sufficient. Clear bottom plates will also work, however some signal will be lost. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Synergy H1 Hybrid plate reader or equivalent | BioTek | 8041000 | A plate reader with luminescence detection and 96-well plate capabilities is required. |
| 8-channel VOYAGER Pipette (50-1250 µL) | Integra | 4724 | An automated multichannel pipette is extremely useful for rapid addition of luciferase reagents and plating cells in 96 well format |
| 8-channel 200 µL pipette | Transferpette S 20-200 µL | 2703710 |
References
- Kalwat, M. A., et al. Insulin promoter-driven Gaussia luciferase-based insulin secretion biosensor assay for discovery of beta-cell glucose-sensing pathways. ACS Sensors. 1 (10), 1208-1212 (2016).
- Burns, S. M., et al. High-throughput luminescent reporter of insulin secretion for discovering regulators of pancreatic Beta-cell function. Cell Metabolism. 21 (1), 126-137 (2015).
- Rajan, S., et al. In vitro processing and secretion of mutant insulin proteins that cause permanent neonatal diabetes. American Journal of Physiology - Endocrinology and Metabolism. 298 (3), E403-E410 (2010).
- Watkins, S., et al. Imaging Secretory Vesicles by Fluorescent Protein Insertion in Propeptide Rather Than Mature Secreted Peptide. Traffic. 3 (7), 461-471 (2002).
- Welsh, J. P., Patel, K. G., Manthiram, K., Swartz, J. R. Multiply mutated Gaussia luciferases provide prolonged and intense bioluminescence. Biochemical Biophysical Research Communications. 389 (4), 563-568 (2009).
- Tannous, B. A., Kim, D. E., Fernandez, J. L., Weissleder, R., Breakefield, X. O. Codon-optimized Gaussia luciferase cDNA for mammalian gene expression in culture and in vivo. Molecular Therarpy. 11 (3), 435-443 (2005).
- Compounds and methods for regulating insulin secretion. World patent. Burns, S. M., Wagner, B. K., Vetere, A. , WO2018175324A1 (2018).
- Kalwat, M. A., et al. Chromomycin A2 potently inhibits glucose-stimulated insulin secretion from pancreatic beta cells. Journal of General Physiology. , (2018).
- Luft, C., et al. Application of Gaussia luciferase in bicistronic and non-conventional secretion reporter constructs. BMC Biochemistry. 15 (1), 14 (2014).
- Ohmiya, Y., Wu, C. Stabilizing composition and stabilizing method of coelenterazine solution for high-throughput measurement of luciferase activity. U.S. Patent. , 7,718,389 B2 (2010).
- Tannous, B. A. Gaussia luciferase reporter assay for monitoring biological processes in culture and in vivo. Nature Protocols. 4 (4), 582-591 (2009).
- Wurdinger, T., et al. A secreted luciferase for ex vivo monitoring of in vivo processes. Nature Methods. 5 (2), 171-173 (2008).
- Henquin, J. C. Triggering and amplifying pathways of regulation of insulin secretion by glucose. Diabetes. 49 (11), 1751-1760 (2000).
- Mourad, N. I., Nenquin, M., Henquin, J. C. Amplification of insulin secretion by acetylcholine or phorbol ester is independent of beta-cell microfilaments and distinct from metabolic amplification. Molecular & Cellular Endocrinology. 367 (1-2), 11-20 (2013).
- Straub, S. G., Sharp, G. W. Evolving insights regarding mechanisms for the inhibition of insulin release by norepinephrine and heterotrimeric G proteins. American Journal of Physiology - Cell Physiology. 302 (12), C1687-C1698 (2012).
- Cheng, K., et al. High passage MIN6 cells have impaired insulin secretion with impaired glucose and lipid oxidation. PLoS One. 7 (7), e40868 (2012).
- Head, W. S., et al. Connexin-36 Gap Junctions Regulate In Vivo First- and Second-Phase Insulin Secretion Dynamics and Glucose Tolerance in the Conscious. Diabetes. 61 (7), 1700-1707 (2012).
- Benninger, R. K. P., Head, W. S., Zhang, M., Satin, L. S., Piston, D. W. Gap junctions and other mechanisms of cell-cell communication regulate basal insulin secretion in the pancreatic islet. The Journal of Physiology. 589 (22), 5453-5466 (2011).
- Konstantinova, I., et al. EphA-Ephrin-A-mediated beta cell communication regulates insulin secretion from pancreatic islets. Cell. 129 (2), 359-370 (2007).
- Jaques, F., et al. Dual effect of cell-cell contact disruption on cytosolic calcium and insulin secretion. Endocrinology. 149 (5), 2494-2505 (2008).
- Calabrese, A., et al. Connexin 36 Controls Synchronization of Ca2+ Oscillations and Insulin Secretion in MIN6 Cells. Diabetes. 52 (2), 417-424 (2003).
- Bielefeld-Sevigny, M. AlphaLISA immunoassay platform- the "no-wash" high-throughput alternative to ELISA. Assay and Drug Development Technologies. 7 (1), 90-92 (2009).
- Aslanoglou, D., George, E. W., Freyberg, Z. Homogeneous Time-resolved Forster Resonance Energy Transfer-based Assay for Detection of Insulin Secretion. Journal of Visualized Experiments. (135), (2018).
- Rafati, A., Zarrabi, A., Abediankenari, S., Aarabi, M., Gill, P. Sensitive colorimetric assay using insulin G-quadruplex aptamer arrays on DNA nanotubes coupled with magnetic nanoparticles. Royal Sociecy Open Science. 5 (3), 171835 (2018).
- Hulleman, J. D., Brown, S. J., Rosen, H., Kelly, J. W. A high-throughput cell-based Gaussia luciferase reporter assay for identifying modulators of fibulin-3 secretion. Journal of Biomolecular Screening. 18 (6), 647-658 (2013).
- Frank, J. A., et al. Optical tools for understanding the complexity of beta-cell signalling and insulin release. Nature Reviews Endocrinology. 14 (12), 721-737 (2018).
- Zhu, S., et al. Monitoring C-Peptide Storage and Secretion in Islet beta-Cells In Vitro and In Vivo. Diabetes. 65 (3), 699-709 (2016).
