Summary
Bu protokol, bir insülin bağlantılı gaussia Lusiferaz ile Beta hücrelerinden insülin salgılanması için bir vekil olarak orta verim ile hızlı düşük maliyetli Lusiferaz nasıl gerçekleştirileceğini açıklar. Tahlil en lüminesans plaka okuyucular ve çok kanallı pipetler ile gerçekleştirilebilir.
Abstract
Salgılanmış insülin sonrası numune toplama için antikor tabanlı asder gerçekleştirme genellikle test süresi bir gün için birkaç saat gerektirir ve özel tahlil bağlı olarak, pahalı olabilir. Salgılanan Lusiferaz sonuçları hızlandırmak ve örnek başına tahlil maliyeti önemli ölçüde düşük sağlar. Burada, pankreas β hücrelerinden insülin salgıya aktivitesini ölçmek için nispeten az kullanılan bir yaklaşım sunuyoruz, gaussia Lusiferaz kullanarak genetik olarak C-peptid içinde eklenmiştir. Proinsüline proteolitik işleme sırasında, C-peptid insülin salgılayan vezikül içinde Lusiferaz serbest bırakılıyor nerede birlikte-insülin ile salgılanmış. Sonuçlar, Lusiferaz aşının hızı nedeniyle örnek toplamanın ardından dakikalar içinde elde edilebilir. Tahlil bir sınırlama insülin salgılanması ve mutlak bir Nicek değil göreceli bir ölçüm olmasıdır. Ancak, bu protokol, ekonomik, ölçeklenebilir ve en standart lüminesans plaka okuyucular kullanılarak gerçekleştirilebilir. Analog ve dijital çok kanallı pipetler, testin birden fazla adımını kolaylaştırır. Birçok farklı deneysel varyasyonlar aynı anda test edilebilir. Bir kez koşullar odaklı bir dizi üzerine karar verildi, insülin konsantrasyonları doğrudan standart eğrileri ile antikor tabanlı deneyleri kullanılarak ölçülmelidir Lusiferaz tahlil sonuçlarını onaylamak için.
Introduction
Burada sunulan yöntem, genetik olarak değiştirilmiş bir beta hücre hattından insülin salgılanmasını, 96-Well-Plate formatında hızla ve uygun maliyetli bir şekilde tespit edilmesine olanak tanır. Bu protokol için anahtar doğal olarak salgılanan gaussia Lusiferaz (gluc, ~ 18 kDa) eklenmiş olan insülin değiştirilmiş bir sürümüdür (bkz. Şekil 1) C-peptid içine insülin-gaussia (insgluc)1,2oluşturmak için. GFP (~ 25 kDa) gibi diğer büyük proteinler, başarılı bir şekilde C-peptid insülin içine yerleştirilen ve proinsüline-Gfp gelen beklenen post-translational işleme insülin ve Gfp-C-peptid3,4sergilenmiştir. Bu protokolde tahlil için, gluc-memeliler ifade için optimize edilmiş ve iki mutasyonlar Glow benzeri kinetik5,6geliştirmek için tanıtıldı. Çoklu kombinasyonları ve tedavi koşullarının çoğaltır kolayca 96-Well-Plate formatında test edilebilir ve salgılanması sonuçları hemen deney sonrasında elde edilebilir.
Büyük bir avantaj, daha önce de belirtildiği gibi2, bu luciferase tabanlı salgılanması ölçümü düşük maliyetidir (< $0.01/Well) nispeten daha yüksek maliyetler ve enzim bağlı İmmünosorbent teknik yönlerini ayırt (Elisas) ( > $2/Well) ve homojen zaman çözülmemiş Floresan (HTRF) veya diğer Förster rezonans enerji transferi (FRET) tabanlı antikor (> $1/Well) sağlar. Bu antikor tabanlı testlere kıyasla, hangi standart bir eğri başvuran tarafından insülin konsantrasyonu ölçmek, InsGLuc tahlil plaka üzerinde kontrol kuyuları göreli bir karşılaştırma olarak salgılayan aktivite ölçer. Bu nedenle, her deney uygun kontroller eklenmesi gerekir. Bu ayrım hızlı ve ucuz ölçümlere izin vermek için bir ticaret-off olduğunu. Bununla birlikte, insgluc salgısı, ELISA1,2ile ölçülen insülin salgılanması ile son derece ilişkilidir. Bu teknoloji yüksek verimlilik taraması için ölçeklendirilmiştir1,2,7 ve bir voltaj-Gated Potasyum kanal inhibitörü dahil olmak üzere insülin salgılanması yeni modülatörlerin tanımlanması için yol açmıştır7 β hücreli fonksiyonun doğal ürün inhibitörü yanı sıra, chromomicin a28. InsGLuc kullanımı, sürekli olarak insülin salgılanması üzerindeki etkileri için birçok farklı tedavi koşullarını test etmeyi planlayan araştırmacılar için uygundur. Takip deneylerinde, ebeveyn β hücre hattında anahtar bulguları tekrar etmek ve duvar veya insan izletlerinde optimum şekilde tekrarlamak ve antikor bazlı bir tahlil kullanarak insülin salgılanmasını ölçmek gereklidir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. reaktiflerin, medyanın ve tamponların hazırlanması (Tablo 1)
- 500 mL yüksek glikoz (4,5 g/L) Dulbecco modifiye kartal Orta (DMEM) aşağıdaki katkı maddeleri ile MIN6 komple medya hazırlayın: 15% fetal Sığır serum (FBS), 100 birimleri/mL penisilin, 100 μg/mL streptomisin, 292 μg/mL L-glutamin, ve 50 μM β-mercaptoetanol.
Not: Bu durumda istikrarlı hücre hattı 250 μg/mL G418 antibiyotik korunur. - 5 mm KCL, 120 mm NaCl, 15 mm HEPES (pH 7,4), 24 mm NaHCO3, 1 mm MgCl2, 2 mm CAcl2ve 1 mg/ml radioimmunassay sınıfı Sığır serum albümin (BSA) içeren bir çözelti yaparak Krebs-Ringer bikarbonat tampon (krbh) hazırlayın. Glikoz 2 M stokta belirtilen yere eklenecektir.
Not: krbh, insülin ve/veya gaussia Lusiferaz salgılanmasını değerlendirmek için stimülasyon olmadan ve uyarılmadan hücreleri kulgermak için kullanılır. - Coelenterazine (CTZ) stok çözümünü aşağıdaki gibi hazırlayın. 10 ml metanol için 106 μL konsantre HCL ekleyerek asitlendirilmiş metanol hazırlayın. Daha sonra, 1 mg/ml 'de asitlenmiş metanol içinde liyofilize CTZ çözülür ve vida kapaklı tüplerde-80 °c ' de depolar.
Not: Bu Stoklar, uygun depolama 1 yıl sonra bile rutin Lusiferaz konusunda yeterli aktivite korur. - Hazırlamak gaussia Lusiferaz (gluc) tahlil tampon literatür üzerine dayalı9 yanı sıra patent bilgileri10 96 iyi plaka formatında gaussia Lusiferaz tahlil yarı ömrü yardım için. Formülü kullanın: 25 mM Tris pH 8, 1 mM EDTA, 5% gliserol, 1 mg/mL na2Po4, 300 mm sodyum askorbat, 200 mm na2su yani3 . -20 °C ' de stokları dondurur. Çözünme işleminden sonra tamponu 4 °C ' de saklayın.
- Gaussia Lusiferaz çalışma çözümünü hazırlamak için, gluc assay tampona 1 mg/ml (2,36 mm) CTZ stok çözeltisi 4,2 μL/ml ekleyin. Bu, 10 μM CTZ 'lik 2x çalışma çözümüyle sonuçlanır ve bu tahlil sırasında 5 μM final konsantrasyonuna sahip olacaktır.
2. InsGLuc MIN6 hücrelerinin kültürü ve salgılanması için tohumlama
- Kültür MIN6 hücreleri, tripsinize ve çekirdek hücreleri haftada bir kez standart hücre kültürü teknikleri kullanarak. Hücrelerdeki her 2-3 günde bir ortam değiştirin. Medyaya 250 μg/mL G418 gibi uygun seçim antibiyotiği ekleyin.
- Deneyler için haftalık hücre yeterli sayıda sağlamak için T75 flasks hücreleri koruyun. 10 mL medyaya T75 başına 6 x 106 hücre Seeding genellikle 30 x 10 6 için 40 x 106 hücre kültür 7 gün sonra T75 başına toplam verim olacaktır.
- 96-Well plakaları içine kaplama için hücreler hazırlamak için, PBS ile iki kez InsGLuc MIN6 hücrelerin bir confluent T75 yıkayın ve tripsin 2 mL ekleyin. 37 °C ' de ~ 5 dakika veya hücreler Flask 'dan dağılıncaya kadar kuluçat. Mililitre başına hücre konsantrasyonunu belirleyin.
- Tam medyadaki hücreleri 1 x 106 hücreye/ml 'ye 1 x 105 hücreye 100 μl 'lik bir 96-kuyu plakasına göre seyreltin. Hücreleri 3 – 4 gün sonra tahlil için yeterince konfluent olmalıdır.
Not: kültür süresini uzatmak Için hücre konsantrasyonunun yarısı kaplama yapılabilir. Hücreler deneysel tedavilere maruz kalmadıkça, test gününden önce medya değişiklikleri gerekli değildir.
- Tam medyadaki hücreleri 1 x 106 hücreye/ml 'ye 1 x 105 hücreye 100 μl 'lik bir 96-kuyu plakasına göre seyreltin. Hücreleri 3 – 4 gün sonra tahlil için yeterince konfluent olmalıdır.
3. glikoz stimüle gaussia Lusiferaz salgılanması tahlil
- Tahlil gününde deneme için yeterli KRBH hazırlamak (adım 1,2). 96-Well plaka başına 50 mL KRBH en az gereklidir, bu nedenle deneme için yeterli tampon sağlamak için en az 75 mL hazırlayın. İlaç tedavi koşulları farklı kombinasyonları seyreltme için KRBH gerektirecektir Eğer ekstra tampon hazırlayın.
- Glikoz içermeyen KRBH ile bir rezervuar hazırlayın. 96-Well plaka (ler) hızlı bir laboratuvar lavabo üzerinde plaka tersine çevirme ve daha sonra sıkıca kağıt havlu yığını üzerinde aşırı orta kaldırmak için leke tarafından orta decant.
- Elektronik veya manuel 8 kanallı pipet kullanarak, 96-Well plaka (lar) üzerinden rezervuar gelen μL/Well KRBH pipet 100. Toplam iki yıkanıyor için tekrarlayın.
- (İsteğe bağlı akut bileşik tedaviler adım) İlaç tedavileri yapılırsa, 3,5 ve 3,6 modifikasyonsuz adımlarla devam edin. Küçük moleküllerin insülin salgılanması üzerindeki etkilerini test etmek için, ön kuluçte süresi, stimülasyon süresi veya her ikisi de hücrelere bileşikler eklenebilir.
- Bir teknik 1,5 mL tüpler KRBH toplu bileşikler eklemek ve 96-Well plakaları hücrelerine tüpler ilaç KRBH aktarmak için ayarlanabilir bir 8 kanallı dijital pipet kullanın etmektir.
Not: ayarlanabilir bir pipet mevcut değilse, bir yineleme 96-iyi plaka ilaç-KRBH yapılabilir ve standart 8 kanallı pipet tampon aktarmak için kullanılabilir. Tedavi paradigması için daha fazla değişiklik, daha önce1,8açıklandığı gibi, tahlil öncesinde medyada 24 h için hücreleri tedavi etmek için yapılabilir.
- Bir teknik 1,5 mL tüpler KRBH toplu bileşikler eklemek ve 96-Well plakaları hücrelerine tüpler ilaç KRBH aktarmak için ayarlanabilir bir 8 kanallı dijital pipet kullanın etmektir.
- İstenen glikoz veya bileşikler konsantrasyonu içeren KRBH 100 μL ekleyin ve 1 saat için 37 °C küvatör içinde çanak yerleştirin.
Not: deneysel düzene bağlı olarak, sekiz 1,5 mL 'Lik tüplerin bir sütunundan kanal mesafelerini 96-kuyu plakasının 8 satırına aktarmasına olanak veren elektronik çok kanallı bir pipet olması son derece yararlıdır. - Sonra 1 ön kuluçk, tampon lavabo ve kağıt havlu sıkıca leke içine tamponu. Eklemek 100 μL glikoz ücretsiz KRBH başına iyi Gaussia luciferase birikmiş arka plan yıkamak için. Plakayı tekrar kaplama ve 100 μL 'de de plakaya kontrol ve stimülasyon koşulları ekleyin. Tabağı 37 °C ' lik kuluçte 1 saat için yerleştirin.
- Dikkatle 50 μL çok kanallı pipet kullanarak süpernatant toplamak, gerekli tedavi koşulları arasındaki ipuçlarını değiştirerek, ve temiz bir opak beyaz 96-iyi assay plaka süpernatant aktarmak.
Not: önemli miktarda Lusiferaz sinyali kaybolacak olsa da, gerektiğinde beyaz duvarlı açık-alt plakalar kullanılabilir. - Krbh supernatant 50 μL toplama sonra, örnek hemen farklı teknik kullanılarak olabilir. Gerekirse, bir kaç gün için 4 °c ' de (gluc aktivite Half-Life ~ 6 gün) veya-20 °c ' ye kadar bir ay11,12' ye kadar mühürleyin ve saklayın.
4. salgılanan gaussia Lusiferaz tahlil
- GLuc assay çalışma çözümünü hazırlamak için, gerekli miktarda CTZ stok çözeltisi (4,2 μL/mL) GLuc assay tampon içine pipet. CTZ ısınma önlemek için, hızlı bir şekilde CTZ pipet-80 °C dondurucu veya kuru buz üzerinde tüp tutmak.
- Bir elektronik çok kanallı pipet kullanarak, hızlı bir şekilde 96-iyi çanak toplanan KRBH süpernatants içeren başına GLuc assay çalışma çözeltisi 50 μL ekleyin. Herhangi bir kuyuların tarafında herhangi bir damlacıkları varsa, kısaca bir masa üstü salıncak-kova santrifüjte plaka spin.
- Birkaç dakika içinde uygun bir plaka okuyucuda lüminesans okuyun ve bir 0,1 s entegrasyon süresi ile her iyi okuyun.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kontrol koşullarında testin performansını ölçmek için, basit bir glikoz doz-yanıt eğrisi veya Diazoksit paradigmasını kullanarak bir stimülasyon tamamlanabilir. Önceki durumda, 1 h glikoz-ücretsiz koşullarda için hücreler ön-inküs 1 h için tedavi tarafından takip edilen glikoza konsantrasyonları ve altında çok az salgıcı aktivite neden olmalıdır 5 mM, artan salgılanması üzerinde gözlenen iken 8 mM glikoz (Şekil 2). 35 mM KCl ile stimülasyon da uyarılmış salgılanması için olumlu bir kontrol olarak hizmet vermektedir. Stimülasyon döneminde salgılaştırma-modül edilen ilaçların eklenmesi, salgılanmış GLuc aktivitesinin beklenen inhibisyonu veya potansiyeli vermelidir (Şekil 3). Örneğin, Diazoksit KATP kanalını bağlar ve ARTMıŞ [ATP/ADP] oranı üzerinde kapanmasını önler, membran depolarizasyonunu engelleme ve salgılanmasını önleme13. Para-methoxyamphetamine (PMA) gibi phorbol esterleri protein kinaz C (PKC) etkinleştirin ve insülin salgılanması bilinen amplifikatörler14. Son olarak, 1 μM epinefrin ile stimülasyon, heterotrimeric G-protein kompleksi gi 'yi aktive eden α2A-adrenergic reseptörlerini aktive eder, membran depolarizasyonunu ve insülin salgılanmasını inhibe eder15. Bu MIN6 hücreler ölümsüz bir hücre hattı iken, onlar doğru glikoz kaynaklı insülin salgılanması tepkiler kaybetmek başlar tanımak önemlidir (gibi sol-yanıt eğrisi kayması) genişletilmiş geçiş sonrası16. Bu nedenle, sıvı nitrojen stoklarından başlamadan önce sekiz haftaya kadar (haftada bir kez bölme) tüm MIN6 hücre çizgilerinin rutin olarak kültürüne iyi bir uygulamadır.
Şekil 1: InsGLuc muhabirinin açıklaması. (A) ilk olarak, istikrarlı β hücre hattı (Bu durumda MIN6 hücreler) fare insülin promotör gelen Insülin-Gaussia transgene ifade oluşturuldu. (B) tam protein sentezlenmiş ve endojen insülin ile birlikte insülin granül paketlenmiş. Prohormon convertases peptid Cleave, yıldız tarafından gösterilir. (C) işlenen insülin ve gaussia ortak salgılanır ve ATP-bağımsız, oksijeni bağımlı reaksiyonda CTZ ilavesi ile Lusiferaz aktivitesi algılanır. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 2: InsGLuc muhabiri MIN6 Beta hücrelerinden insülin salgılanmasını sadık bir vekil. (A) MIN6 insgluc hücrelerinin glikoz konsantrasyonları ve KCL (35 mm) gaussia Lusiferaz salgılanması ile artan yanıt. Veriler, üç bağımsız deney için 0 mm glikoz koşullarına kıyasla ortalama kat Lusiferaz aktivitesi ± se 'dir. *, P < 0,05. Rakam Kalwat ve Al izin ile değiştirildi. ACS sensörleri 20161. © 2016 Amerikan Kimya Derneği. (B) MIN6 hücrelerinde insgluc muhabiri Diazoksit (DZ) paradigma beklenen salgı yanıtı sergiler nerede 250 μM DZ tedavi KATP Kanal açık tutar, membran depolarizasyon engelleme sürece ekstrüler KCL (35 mm) sağlanır ' tetikleyici ' kalsiyum akını almak için. Daha fazla glikoz eklenmesi (20 mM) DZ + KCl durumu altında kalsiyum akımını daha fazla artmadan ortaya çıkan salgılaşma metabolik amplifikasyonu ortaya çıkarır. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 3: glikoz sırasında salgılanması modülasyon bileşiklerinin eklenmesi InsGLuc salgılanmasını uyarır. 96-Well formatında kaplama InsGLuc MIN6 hücreler 1 h için glikoz içermeyen KRBH preinkübe edildi. hücreler daha sonra dimetil sulfoxid (DMSO) (0,1%), KCl (35 mM), Diazoksit (250 μM), PMA (100 nM) varlığında 20 mM glikoz ile tedavi edildi veya 1 h. çubuk grafik için epinefrin (1 μM) en az 3 bağımsız deneylerin ortalama ± SE temsil eder. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
| Krebs-Ringer bikarbonat tampon (KRBH) | |||
| Stok çözeltisi veya tozu | Stok | Son konsantrasyon | 100 mL |
| Kartal | 0,25 M | 5 mM 'Lik | 2 ml 'lik |
| Nacl | 4 M | 120mm | 3 ml 'lik |
| HEPES, pH 7,4 | 1 M | 15 mM 'Lik | 1,5 ml |
| NaHCO3 | 0,5 M | 24 mM 'Lik | 4,8 ml |
| MgCl2 | 1 M | 1 mM 'Lik | 0,1 ml |
| CaCl2 | 1 M | 2 mM 'Lik | 0,2 ml |
| Su | H2O | 88,4 ml | |
| RIA-Grade BSA | Toz | 1 mg/mL | 100 mg |
| Deney gününde taze olun. | |||
| Gaussia tahlil tampon * | |||
| Stok çözeltisi veya tozu | Stok | Son konsantrasyon | 50 mL |
| Disodyum fosfat | Toz | 0,1% (1 mg/mL) | 50 mg |
| Gliserol | 40% | 5 | 6,25 mL |
| Sodyum bromür | Toz | 150 mM | 772 mg |
| EDTA pH 8 | 0,5 m | 1 mM 'Lik | 100 (μL) |
| Tris-HCl pH 8 | 1M | 25mm | 1,25 mL |
| Askorbik asit * | Toz | 300 mM | 2,64 g |
| Na2SO3** | Toz | 200 mM | 1,26 g |
| Su | 50 ml 'ye kadar | ||
| -20 °c ' de plakaya içinde saklayın, tek seferde bir çözüyor ve 4 °c ' de tutun. | |||
| * Luft ve al. BMC Biyokimya 2014, 15:14. | |||
| Acidified MeOH | |||
| Stok çözeltisi veya tozu | Stok | Son konsantrasyon | 10 mL 'Lik |
| Metan -ol | 100% | 10 mL 'Lik | |
| Hcl | 11,65 M | 1,06% | 0,106 mL |
| Coelenterazine solüsyonu | |||
| Stok çözeltisi veya tozu | Stok | Son konsantrasyon | 1 mL 'Lik |
| Coelenterazine | Toz | 1 mg/mL (2,36 mM) | 1 mg |
| Acidified metanol | 1 mL 'Lik | ||
| 4,2 1 mL Gaussia assay tampon başına μL hisse senedi, 2x çalışma çözümü olarak kullanılmak üzere 10 μM CTZ 'de sonuçlanır. | |||
| Örneğin, 50 μL 'ye, salgılanmış Gaussia içeren KRBH örneğinden 50 μL 'ye 2x çalışma çözümü ekleyin. | |||
Tablo 1: tampon ve stok çözüm tarifleri sunulan assays gerçekleştirmek için kullanılır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada, MIN6 β hücrelerinden glikoz stimüle edilen insülin salgılanması yanıtlarını hızla değerlendirmek için bir yöntem sunuyoruz. Tahlil en iyi tepkiler için uygun yoğunlukta MIN6 hücreleri tohum ve onları% 85-95 confluent haline izin önemlidir. Bu, hem primer adacıklar17, 18,19,20,21 yanı sıra oluşur Gelişmiş hücre hücre kişileri ve senkronizasyon nedeniyle glikoz β hücre yanıtlarını geliştirir MIN6 hücreler16,18. Glikoz stimülasyon için salgını yanıt kayıpları önlemek için, mümkün olduğunca bir geçit düşük olarak hücreleri korumak için önemlidir ve sadece 6-8 hafta önce sıvı nitrojen stoklarından yeni bir şişe çözme için hücre kültür. Gerekli donanıma adapte olmak için protokol Bölüm 2 ' de kaplama stratejisine değişiklikler yapılabilir. Kaplama insgluc MIN6 hücreleri 96 içine-kuyu plakaları salgılanması için deneysel manipülasyonlar (çoğaltır dahil) için kuyular çok sayıda tanıyor yanı sıra normal bir laboratuar ayarı kaplama doğruluğu korumak gibi, yüksek iyi ile yemeklerde kaplama olarak sayılar genellikle yüksek verim tarama çekirdeğinde kullanılabilir özel ekipman gerektirir.
İnsülin salgılanması için geçerli test, dolaylı Lusiferaz tahlil dışında burada açıklanan, içerir: Elisas (doğrudan assay), radyoimmunassays (rekabet assay) radyoaktif okumalar, fret tabanlı antikor kullanmak kolorimetrik okuma kullanın Yarışma assay22 ve HTRF23 hangi kullanır fret arasında boya bağlı antikorlar doğrudan insülin ölçmek için, ve DNA aptamers24. Bu yöntemlerin her biri kendi avantajları vardır, ancak genel olarak daha pahalı ve/veya bir Lusiferaz tahlil daha zaman alıcı. İnsgluc tahlil bir anahtar sınırlama, ortak salgılanan Lusiferaz Luminesans aktivite gerçek insülin salgılanması için sadece bir proxy olduğunu gerçektir. Ayrıca, gaussia arasında C-peptid parçaları ve proinsüline proteini içinde N-ve c-Termini veya gaussia arasındaki Lusiferaz aktivitesinde beklenen bir fark yoktur, gaussia Lusiferaz 'ın salgılanmasını ölçmek için bir etiket olarak başarıyla kullanıldığı diğer proteinler25. Bu, özel olarak işlenen insülin ölçmek deneyleri kullanarak onay çalışmaları gereksinimi vurgular. Aynı zamanda β hücre fonksiyonunu değerlendirmek için, insülin salgılanmasını doğrudan ve dolaylı ölçümlere alternatifler de kullanılabilir. ATP: ADP oranı, kalsiyum akımı, NAD+/NADH oranı, ekstrasellüler sinyal-düzenlenmiş KINAZLAR (erk) aktivasyonu veya döngüsel Adenozin monofosfat (Camp) seviyeleri26gibi okumalar için optik gazetecilerin çeşitli var.
Özellikle InsGLuc 'un gelecekteki uygulamaları yüksek verim taramasında görünmektedir. Bu tahlil zaten yayımlanan küçük ekranlar1,2 ve yayınlanmamış büyük ekranlar bir avuç kullanılmıştır ya7 tamamlanmış veya devam ediyor. Bu teknolojinin diğer yinelemelerinin geliştirilmesi, glukagon veya somatostatin gibi hızlı ölçümleri kolaylaştırmak için diğer salgılanan Islet hormonlarının luciferases ile etiketlenmesini içerebilir. Herhangi bir uygun Beta hücresi hattına CRISPR/Cas9, Lentivirus veya transposaz aracılı ekleme gibi alternatif yaklaşımlar kullanılarak hücre hattının yeniden oluşturulduğu her durumda değişiklikler yapılabilir. Orijinal muhabir ek olası değişiklikler Gaussia için alternatif salgılanan luciferases yerine veya Multiplexed assay için farklı hormonlar ile bağlantılı birden fazla farklı salgılanan luciferases birleştirerek içerebilir. Hücre kültürünün ötesinde, Crispr/Cas9 teknolojisi, genomda Ins2 C-peptid kodlama bölgesine uygun bir Lusiferaz 'ın çekildiği bir fare modeli oluşturma olasılığını sunar. Böyle bir fare uygulanabilir transgenik fareler Gfp ile aynı C-peptid site27 çaldı oluşturuldu ve bir Lusiferaz tahlil ile endojen β hücre fonksiyon ölçümüne izin verecek verilen olabilir içinde vivo veya ex vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların ifşa etmesi gereken hiçbir şey yok.
Acknowledgments
Yazarlar değerli iş ve tartışmalar için Cobb laboratuvarının tüm mevcut ve eski üyelerine teşekkür ve idari yardım için Dionne Ware. Michael Kalwat bir juvenil diyabet araştırma Vakfı SRA-2019-702-Q-R tarafından desteklenmektedir. Bu çalışma, NıH R37 DK34128 ve Welch Foundation Grant I1243 aracılığıyla Melanie Cobb 'a mümkün hale gelmiştir. Bu çalışmanın erken parçaları da Michael Kalwat için bir NıH F32 DK100113 tarafından destekleniyor.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell culture materials | |||
| rIns-GLuc stable MIN6 cells | Parental MIN6 cell line stably expressing pcDNA3.1+rInsp-Ins-eGLuc and maintained in 250 ug/ml G418 | ||
| DMEM | Sigma | D6429 | 4.5 g/L glucose media |
| fetal bovine serum, heat-inactivated | Sigma | F4135 | |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo-Fisher Scientific | SV30010 | |
| beta-mercaptoethanol | Thermo-Fisher Scientific | BP 176-100 | |
| glutamine | Thermo-Fisher Scientific | BP379-100 | |
| Trypsin-EDTA | Sigma | T3924-500 | |
| G418 | Gold Biotechnology | G418-10 | Stock solution 250 mg/mL in water. Freeze aliquots at -20C. |
| T75 tissue culture flasks | Fisher Scientific | 07-202-000 | |
| 96 well tissue culture plates | Celltreat | 229196 | |
| Reagent reservoirs (50 mL) | Corning | 4870 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Secretion assay reagents | |||
| BSA (RIA grade) | Thermo-Fisher Scientific | 50-146-952 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma | G8270-1KG | |
| KCl | Thermo-Fisher Scientific | P217-500 | |
| NaCl | Thermo-Fisher Scientific | S271-3 | |
| Hepes, pH 7.4 | Thermo-Fisher Scientific | 50-213-365 | |
| NaHCO3 | Thermo-Fisher Scientific | 15568414 | |
| MgCl2 | Thermo-Fisher Scientific | M9272-500G | |
| CaCl2 | Sigma | C-7902 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Optional drugs for stimulation experiments | |||
| Diazoxide | Sigma | D9035 | Stock solution: 50 mM in 0.1N NaOH. Add equal amount of 0.1N HCl to any buffer where diazoxide is added. |
| epinephrine (bitartrate salt) | Sigma | E4375 | Stock solution: 5 mM in water |
| PMA (phorbol 12-myristate) | Sigma | P1585 | Stock solution: 100 µM in DMSO |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Guassia assay materials | |||
| Disodium phosphate (Na2HPO4) | Thermo-Fisher Scientific | S374-500 | |
| Glycerol | Thermo-Fisher Scientific | G334 | |
| Sodium Bromide | Thermo-Fisher Scientific | AC44680-1000 | |
| EDTA | Thermo-Fisher Scientific | AC44608-5000 | Stock solution: 0.5 M pH 8 |
| Tris base | RPI | T60040-1000.0 | Stock solution: 1 M pH 8 |
| Ascorbic Acid | Fisher Scientific | AAA1775922 | US Patent US7718389 suggested ascorbate can increase coelenterazine stability. |
| Na2SO3 | Sigma | S0505-250G | US Patent US8367357 suggested sulfite may decrease background due to BSA |
| Coelenterazine (native) | Nanolight / Prolume | 3035MG | Stock solution: 1 mg/ml in acidified MeOH (2.36 mM) |
| OptiPlate-96, White Opaque 96-well Microplate | Perkin Elmer | 6005290 | Any opaque white 96 well plate should be sufficient. Clear bottom plates will also work, however some signal will be lost. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Synergy H1 Hybrid plate reader or equivalent | BioTek | 8041000 | A plate reader with luminescence detection and 96-well plate capabilities is required. |
| 8-channel VOYAGER Pipette (50-1250 µL) | Integra | 4724 | An automated multichannel pipette is extremely useful for rapid addition of luciferase reagents and plating cells in 96 well format |
| 8-channel 200 µL pipette | Transferpette S 20-200 µL | 2703710 |
References
- Kalwat, M. A., et al. Insulin promoter-driven Gaussia luciferase-based insulin secretion biosensor assay for discovery of beta-cell glucose-sensing pathways. ACS Sensors. 1 (10), 1208-1212 (2016).
- Burns, S. M., et al. High-throughput luminescent reporter of insulin secretion for discovering regulators of pancreatic Beta-cell function. Cell Metabolism. 21 (1), 126-137 (2015).
- Rajan, S., et al. In vitro processing and secretion of mutant insulin proteins that cause permanent neonatal diabetes. American Journal of Physiology - Endocrinology and Metabolism. 298 (3), E403-E410 (2010).
- Watkins, S., et al. Imaging Secretory Vesicles by Fluorescent Protein Insertion in Propeptide Rather Than Mature Secreted Peptide. Traffic. 3 (7), 461-471 (2002).
- Welsh, J. P., Patel, K. G., Manthiram, K., Swartz, J. R. Multiply mutated Gaussia luciferases provide prolonged and intense bioluminescence. Biochemical Biophysical Research Communications. 389 (4), 563-568 (2009).
- Tannous, B. A., Kim, D. E., Fernandez, J. L., Weissleder, R., Breakefield, X. O. Codon-optimized Gaussia luciferase cDNA for mammalian gene expression in culture and in vivo. Molecular Therarpy. 11 (3), 435-443 (2005).
- Compounds and methods for regulating insulin secretion. World patent. Burns, S. M., Wagner, B. K., Vetere, A. , WO2018175324A1 (2018).
- Kalwat, M. A., et al. Chromomycin A2 potently inhibits glucose-stimulated insulin secretion from pancreatic beta cells. Journal of General Physiology. , (2018).
- Luft, C., et al. Application of Gaussia luciferase in bicistronic and non-conventional secretion reporter constructs. BMC Biochemistry. 15 (1), 14 (2014).
- Ohmiya, Y., Wu, C. Stabilizing composition and stabilizing method of coelenterazine solution for high-throughput measurement of luciferase activity. U.S. Patent. , 7,718,389 B2 (2010).
- Tannous, B. A. Gaussia luciferase reporter assay for monitoring biological processes in culture and in vivo. Nature Protocols. 4 (4), 582-591 (2009).
- Wurdinger, T., et al. A secreted luciferase for ex vivo monitoring of in vivo processes. Nature Methods. 5 (2), 171-173 (2008).
- Henquin, J. C. Triggering and amplifying pathways of regulation of insulin secretion by glucose. Diabetes. 49 (11), 1751-1760 (2000).
- Mourad, N. I., Nenquin, M., Henquin, J. C. Amplification of insulin secretion by acetylcholine or phorbol ester is independent of beta-cell microfilaments and distinct from metabolic amplification. Molecular & Cellular Endocrinology. 367 (1-2), 11-20 (2013).
- Straub, S. G., Sharp, G. W. Evolving insights regarding mechanisms for the inhibition of insulin release by norepinephrine and heterotrimeric G proteins. American Journal of Physiology - Cell Physiology. 302 (12), C1687-C1698 (2012).
- Cheng, K., et al. High passage MIN6 cells have impaired insulin secretion with impaired glucose and lipid oxidation. PLoS One. 7 (7), e40868 (2012).
- Head, W. S., et al. Connexin-36 Gap Junctions Regulate In Vivo First- and Second-Phase Insulin Secretion Dynamics and Glucose Tolerance in the Conscious. Diabetes. 61 (7), 1700-1707 (2012).
- Benninger, R. K. P., Head, W. S., Zhang, M., Satin, L. S., Piston, D. W. Gap junctions and other mechanisms of cell-cell communication regulate basal insulin secretion in the pancreatic islet. The Journal of Physiology. 589 (22), 5453-5466 (2011).
- Konstantinova, I., et al. EphA-Ephrin-A-mediated beta cell communication regulates insulin secretion from pancreatic islets. Cell. 129 (2), 359-370 (2007).
- Jaques, F., et al. Dual effect of cell-cell contact disruption on cytosolic calcium and insulin secretion. Endocrinology. 149 (5), 2494-2505 (2008).
- Calabrese, A., et al. Connexin 36 Controls Synchronization of Ca2+ Oscillations and Insulin Secretion in MIN6 Cells. Diabetes. 52 (2), 417-424 (2003).
- Bielefeld-Sevigny, M. AlphaLISA immunoassay platform- the "no-wash" high-throughput alternative to ELISA. Assay and Drug Development Technologies. 7 (1), 90-92 (2009).
- Aslanoglou, D., George, E. W., Freyberg, Z. Homogeneous Time-resolved Forster Resonance Energy Transfer-based Assay for Detection of Insulin Secretion. Journal of Visualized Experiments. (135), (2018).
- Rafati, A., Zarrabi, A., Abediankenari, S., Aarabi, M., Gill, P. Sensitive colorimetric assay using insulin G-quadruplex aptamer arrays on DNA nanotubes coupled with magnetic nanoparticles. Royal Sociecy Open Science. 5 (3), 171835 (2018).
- Hulleman, J. D., Brown, S. J., Rosen, H., Kelly, J. W. A high-throughput cell-based Gaussia luciferase reporter assay for identifying modulators of fibulin-3 secretion. Journal of Biomolecular Screening. 18 (6), 647-658 (2013).
- Frank, J. A., et al. Optical tools for understanding the complexity of beta-cell signalling and insulin release. Nature Reviews Endocrinology. 14 (12), 721-737 (2018).
- Zhu, S., et al. Monitoring C-Peptide Storage and Secretion in Islet beta-Cells In Vitro and In Vivo. Diabetes. 65 (3), 699-709 (2016).
