Summary
تقدم هذه المقالة أساليب إعداد العينة لطريقة تحليلية فريدة في الوقت الحقيقي استنادًا إلى قياس الطيف الكتلي المحيط. هذه الطريقة تتيح لنا إجراء تحليل في الوقت الحقيقي للجزيئات البيولوجية في الجسم الحي دون أي علاجات مسبقة خاصة.
Abstract
قياس الطيف الكتلي (MS) هو أداة قوية في الكيمياء التحليلية لأنه يوفر معلومات دقيقة للغاية حول الجزيئات ، مثل نسب الكتلة إلى الشحن(m /z)، والتي هي مفيدة لاستقراء الأوزان والهياكل الجزيئية. في حين أنه هو في الأساس طريقة تحليلية مدمرة ، فإن التطورات الأخيرة في تقنية التأين المحيطمكنتنا من الحصول على البيانات مع ترك الأنسجة في حالة سليمة نسبيًا من حيث النزاهة. تأين الرذاذ الكهربائي (PESI) هو ما يسمى طريقة مباشرة لأنها لا تتطلب معالجة معقدة وتستغرق وقتا طويلا من العينات. إبرة غرامة بمثابة منتقي العينة، فضلا عن باعث التأيين. استنادا إلى خاصية حادة جدا وغرامة من تلميح التحقيق، وتدمير العينات هو الحد الأدنى، مما يسمح لنا للحصول على المعلومات الجزيئية في الوقت الحقيقي من الكائنات الحية في الموقع. هنا ، نقدم ثلاثة تطبيقات لتقنية PESI-MS التي ستكون مفيدة للبحث والتطوير في مجال الطب الحيوي. واحد ينطوي على تطبيق على الأنسجة الصلبة، وهو التطبيق الأساسي لهذه التقنية للتشخيص الطبي. وبما أن هذه التقنية تتطلب 10 ملغ فقط من العينة ، فقد تكون مفيدة للغاية في الإعدادات السريرية الروتينية. التطبيق الثاني هو للتشخيص الطبي في المختبر حيث يتم قياس مصل الدم البشري. كما أن القدرة على قياس عينات السوائل قيِّمة في مختلف التجارب البيولوجية حيث لا يمكن توفير كمية كافية من العينات للتقنيات التحليلية التقليدية. التطبيق الثالث يميل نحو التطبيق المباشر للإبر التحقيق في الحيوانات الحية، حيث يمكننا الحصول على ديناميات في الوقت الحقيقي من الأيض أو المخدرات في أجهزة محددة. في كل تطبيق، يمكننا استنتاج الجزيئات التي تم اكتشافها من قبل مرض التصلب العصبي المتعدد أو استخدام الذكاء الاصطناعي للحصول على تشخيص طبي.
Introduction
قياس الطيف الكتلي (MS) هو تحقيق تكنولوجي للنزعة الاختزالية؛ أنه يقلل من موضوع التحليل إلى وحدة التي يمكن تفسيرها على أساس الأنواع الجزيئية أو الشلالات. ولذلك، هو أسلوب تمثيلي للكيمياء التحليلية. وهي تتكون من أربع عمليات: التأين والتحليل والكشف والاستحواذ الطيفي. لأن تأين الجزيء هو أول عملية في قياس الطيف الكتلي ، فإنه يقيد بشكل عام شكل التحاليل التي سيتم معالجتها. تتطلب معظم إجراءات التأيّن تدمير بنية العينات العضوية ومورفولوجياها وعملياتها البيولوجية في الوقت الحقيقي. على سبيل المثال، يتطلب التأيين الكهربائي (ESI) MS أن تكون العينات في حالة سائلة للتأيين الفعال1. العينات ، لذلك ، يجب أن تذهب من خلال إعداد البيوكيميائية المعقدة ، والتي تغير تكوين الجزيئات. بدلا من ذلك ، في حين أن المزازة الليزر بمساعدة مصفوفة (MALDI) MS يمكن إعادة بناء الخرائط الجزيئية للأنسجة المقطعة رقيقة2،3، كفاءتها التأين منخفضة جدا للكشف عن جميع الجزيئات في العينات ، وأنها سيئة بشكل خاص في تحليل الأحماض الدهنية. وبالنظر إلى هذه القيود، يمكن استخدام تأين الرذاذ الكهربائي (PESI)4 لرصد التغيرات في الوقت الحقيقي في النظم البيولوجية في الموقع دون تدمير السلامة الهيكلية5، في حين أن الكائن البيولوجي الذي يتم ملاحظته هو من الناحية الفنية في حالة حية. يتم استخدام إبرة دقيقة جدا في هذه الحالة التي تعمل في وقت واحد كما منتقي العينة وباعث أيون. وهذا يعني أنه يمكن تجاوز تسلسلات المعالجة المسبقة للعينة المعقدة للحصول على أطياف كتلة تعكس المكونات الجزيئية للنظام الحي في الموقع.
هناك العديد من أساليب التأين الأخرى التي تنافس PESI-MS. واحد هو قياس الطيف التأين يتبخر السريع (REIMS)6. تعمل هذه التقنية بشكل جيد أثناء الجراحة لأنه يتم تجميعها بسكين كهربائي وتجمع عمود الأيون المتولد أثناء الشق. في حين REIMS مفيد جدا لعملية جراحية، بل هو في الأساس طريقة مدمرة تتطلب الاستئصال الكهربائي للأنسجة. لذلك ، فإنه ليس من المفيد للتحليل التفصيلي للخلايا والأنسجة في عينة إعدادية أو في التحليلات المختبرية. وعلاوة على ذلك ، لأنه يجمع كمية كبيرة من عمود تحتوي على حطام الأنسجة ، فإنه يتطلب صيانة طويلة للأجهزة بعد كل استخدام ، وبالتالي الحد من استخدام هذا الجهاز إلى الإجراءات الجراحية الخاصة. وهناك طريقة مماثلة، تسمى قياس الطيف الكتلي الأياني بالليزر (LDI-MS)7، هي تقنية أخرى غير باضعة ومفيدة لتحليل السطح. لأن هذه التقنية جيدة في مسح سطح العينة ، فإنه يحقق تحليل شامل ثنائي الأبعاد مثل قياس الطيف الكتلي التصوير MALDI8،9. ومع ذلك، نظرًا لأن LDI-MS ينطبق فقط على التحليل السطحي، فإن PESI-MS مفيد لتحليل العينات على سبيل المثال، داخل الأنسجة. وثمة تقنية أخرى، هي MasSpec Pen10،أفيد بأنها تحقق خصوصية وحساسية عالية في تشخيص سرطان الغدة الدرقية، ولكن قطر المسبار هو في ترتيب ملم وهو محدد لتحليل السطح، مما يعني أنه لا يمكن الكشف عن عقيدات صغيرة من السرطان أو الآفات المترجمة بعمق. وعلاوة على ذلك، وبما أن هذه الطريقة تستخدم قناة تدفق ميكروالخمسينيبيلية مضمنة في قلم المسبار، يجب أن يؤخذ التلوث المتبادل في الاعتبار، على غرار LDI-MS. توجد تقنيات أخرى تم تطبيقها على الإعدادات السريرية ، مثل مسبار التدفق والمسحة نموذج التأين11، ولكنها ليست واسعة الانتشار.
PESI هو تصغير المدقع من ESI، حيث الشعيرات الدموية من النانو-electrospray يتلاقى على إبرة صلبة مع نصف قطرها انحناء تلميح من عدة مئات نانومتر. التأين يحدث في منطقة مقيدة للغاية من طرف إبرة عن طريق تشكيل مخروط تايلور، والتي تبقى عينات حتى تأين جميع السوائل على طرف اكتمال12. إذا بقي المناقّل على طرف الإبرة المعدنية، يتم توليد الشحن الزائد باستمرار في الواجهة بين الإبرة المعدنية وanalytes. لذلك ، يحدث تأيين الجزيئات بشكل متسلسل اعتمادًا على نشاطها السطحي. هذه الخاصية يجعل طرف إبرة نوع من الكروماتوغرام، وفصل المناقبين اعتمادا على نشاطها السطحي. أكثر من الناحية الفنية ، والجزيئات مع النشاط سطح أقوى تأتي إلى سطح مخروط تايلور وتأين في وقت سابق من تلك التي مع ضعف النشاط السطحي ، والتي تلتصق سطح الإبرة حتى نهاية عملية التأين. وهكذا ، يتم تحقيق تأين كامل لجميع الجزيئات التي التقطتها الإبرة13. وعلاوة على ذلك، لأن هذه التقنية لا تنطوي على إضافة المذيبات زائدة عن الحاجة إلى العينة، عدة مئات من femtoliters كافية للحصول على أطياف كتلة قوية بما يكفي لمزيد من التحليل14. هذه الخصائص مفيدة لتحليل العينات البيولوجية سليمة. ومع ذلك ، فإن العيب الرئيسي لـ PESI-MS يكمن في انقطاع التأيين بسبب حركة التردي للإبرة على طول المحور الرأسي ، على غرار آلة المنشار. التأين يحدث فقط عندما يصل طرف المسبار إلى أعلى نقطة عندما يكون ارتفاع فتحة الأيون محاذياً على المحور الأفقي. التأين يتوقف في حين أن الإبرة تلتقط العينات، وبالتالي فإن استقرار التأين لا يساوي ذلك في ESI التقليدية. لذلك، PESI-MS ليست طريقة مثالية للبروتيوميات.
وحتى الآن، طُبق نظام PESI-MS بشكل رئيسي على تحليل النظم البيولوجية، التي تغطي مجموعة واسعة من المجالات من البحوث الأساسية إلى البيئات السريرية. على سبيل المثال ، كان التحليل المباشر للأنسجة البشرية التي أعدت أثناء الجراحة قادرًا على الكشف عن تراكم ثلاثي الخلايا الثلاثية في كل من سرطان الخلايا الكلوية15 وسرطان الحركوما البلعفي16. يمكن لهذه الطريقة أيضًا قياس العينات السائلة، مثل الدم، للتركيز على الملف الشخصي للدهون. فعلى سبيل المثال، تم تحديد بعض الجزيئات أثناء التغيرات الغذائية في الأرانب؛ وأفيد أن بعض هذه الجزيئات انخفضت في المراحل المبكرة جدا من التجارب، مما يدل على حساسية عالية وفائدة هذا النظام للتشخيص السريري17. وعلاوة على ذلك، تطبيق مباشر لالحيوان الحي سمح الكشف عن التغيرات الكيميائية الحيوية للكبد بعد ليلة واحدة فقط من الصيام5. زار Zaitsu وآخرون18 هذه التجربة5 وتحليل ملامح التمثيل الغذائي للكبد بنفس الطريقة تقريبا، مع النتائج التي عززت الاستقرار واستنساخ طريقتنا الأصلية. وعلاوة على ذلك، تمكنا من التمييز بين الأنسجة السرطانية من الكبد غير السرطاني المحيط ة في الفئران باستخدام هذه التقنية19. لذلك ، هذا هو تقنية قياس الطيف الكتلي متعددة الاستخدامات المفيدة في إعدادات مختلفة ، سواء في الجسم الحي أو في المختبر. من وجهة نظر أخرى ، يمكن إجراء وحدة PESI لتناسب مطياف الكتلة المختلفة عن طريق ضبط المرفق المتصاعد. في هذه المقالة القصيرة ، نقدم أساسيات وأمثلة التطبيقات(الشكل 1)، بما في ذلك التطبيقات مع الحيوانات الحية5.
ووفقا ً للأنظمة والقوانين في كل بلد، سيلزم تنقيح أجزاء من هذا البروتوكول للوفاء بمعايير كل مؤسسة. تطبيق على الكائن الحي هو الأكثر إثارة للاهتمام والتحدي لأنه يمكن أن توفر التغيرات الكيميائية الحيوية أو الأيضية في الأنسجة أو الأعضاء في الحيوانات الحية في الموقع. في حين تمت الموافقة على هذا الطلب من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية الحيوانات في جامعة ياماناشي، في عام 20135،جولة أخرى من الموافقة سيكون من الضروري الآن بسبب التغييرات الأخيرة في اللوائح للتجارب الحيوانية. ولذلك، من المستصوب إدخال عدة تعديلات على المخطط التجريبي. وفيما يتعلق بالأطياف الجماهيرية التي تم الحصول عليها في التجارب، مع أخذ تقلبات الأطياف الجماهيرية بين كل قياس في الاعتبار، لا يوجد نظام طيفي لتبادل المعلومات مشترك بين مجتمع تسلسل النيوكليوتيدات. يجب توخي الحذر عندما يتعامل المشغل مع الإبرة لتجنب حوادث إبرة عصا, خاصة عند إزالة الإبرة من حامل إبرة. جهاز خاص لفصل الإبرة مفيد جدا لهذا الغرض. وبما أن مقصورة وحدة PESI هي غرفة مغلقة محكمة الإغلاق ، فإن تسرب عمود الأيون لا يحدث إذا تم تشغيل مطياف الكتلة وفقًا للتعليمات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وافقت اللجنة المؤسسية لرعاية الحيوانات في جامعة ياماناشي على جميع البروتوكولات واستخدام الحيوانات التجريبية المذكورة هنا. تمت الموافقة على استخدام العينات البشرية من قبل مجلس الأخلاقيات المؤسسية في جامعة ياماناشي.
1. إعداد الأنسجة الصلبة
ملاحظة: يجب الاحتفاظ بالعينات على الجليد بعد إزالتها من جسم الحيوان أو الإنسان للحفاظ على نضارة الأنسجة. إذا كانت القياسات لا تتبع مباشرة تشريح، فمن المستحسن لتخزين الأنسجة في -80 درجة مئوية. ليس من المستحسن وضع الأنسجة في أي نوع من العازلة أو المالحة، لأنها قد استخراج محتويات معينة من الأنسجة. الأنسجة التي تم إصلاحها مع ألدهيدات أو جزءا لا يتجزأ من البارافين / الشمع أو cryogel ليست مناسبة لقياسات التصلب المتعدد.
- قطع عينة الأنسجة إلى ما يقرب من 2 × 2 × 2 ملم باستخدام مشرط أو سكين. بدلا من ذلك، لكمة من العينة مع trepan (لكمة خزعة المتاح، تتحمل حجم 3 ملم) المستخدمة لفحص الجلد. في هذه الحالة، قم بتقليم طول العمود إلى 2 مم.
ملاحظة: يمكن تحليل أي نسيج باستخدام هذه الطريقة. في هذه التجربة، الكبد15 والكلى19، وقد تم تحليلها بنجاح للحصول على أطياف الشامل. عموما، أجهزة parenchymal إعطاء أطياف كتلة جيدة، في حين أن تلك التي لديها مكونات ليفية لا. - إذا كانت الأنسجة ملوثة بالدم، اغسل لفترة وجيزة مع الجليد البارد الفوسفات العازلة المالحة.
ملاحظة: لتقليل تلف أنسجة ما بعد الوفاة، أكمل هذه الخطوة، في أقرب وقت ممكن، في درجة حرارة الغرفة. إذا لم يتم إجراء القياسات على الفور، قم بتجميد الأنسجة في النيتروجين السائل وتخزينها عند -80 درجة مئوية. - ضع عينة القطع أو اللكم (حوالي 10 ملغ) في أنبوب بلاستيكي صغير وإضافة 100 ميكرولتر من الإيثانول بنسبة 50٪.
ملاحظة: لم يتم تحديد الوزن الدقيق للعينات لأن قياس الطيف الكتلي المستخدم في هذا النظام لا يوفر بيانات كمية. ما يقرب من 10 ملغ هو الأمثل للأنسجة parenchymal. - تجانس العينة باستخدام ميكروبيستل.
- ضع 10 ميكرولتر من التجانس في بئر الخرطوشة(الشكل 2).
- ضع الخرطوشة في غرفة التأيين لمطياف الكتلة وقم بتثبيت مسبار إبرة الفولاذ المقاوم للصدأ الذي سيتم استخدامه لعينة التأيين(الشكل 2).
ملاحظة: يتم توفير إبر التحقيق من قبل الشركة المصنعة. وهي مصنوعة من الفولاذ المقاوم للصدأ ولها دائرة نصف قطرها انحناء من حوالي 400 نانومتر. - أغلق غطاء الغرفة بقوة لتنشيط جهاز الأمان تلقائيًا.
- ابدأ تشغيل الكمبيوتر على متن الطائرة بالنقر فوق رمز البدء للتحليل. باستخدام لوحات على الشاشة، وتطبيق الجهد من 2.3 كيلوفولت إلى الإبرة لتوليد electrospray وضمان أن تردد الإبرة هو 3 هرتز.
- انتظر حتى يتم إكمال القياس لمدة 30 عامًا.
ملاحظة: تتوقف جلسة العمل تلقائيًا عند اكتمال الحصول على البيانات. يتم رصد جودة التحليل من خلال إجمالي اللون يون (TIC). يتم تحديد وقت القياس للحصول على أطياف الكتلة التمثيلية ويمكن تقصيره أو تمديده. - التخلص من خرطوشة وإبرة في التخلص من المخاطر البيولوجية بعد قياس كل عينة.
ملاحظة: يمكن قياس عينة واحدة فقط في كل مرة. ليس من الضروري معايرة الجهاز قبل كل قياس. تعتمد المعايرة على الفحص المنتظم من قبل المورد مرة واحدة كل ستة أشهر. - تحليل أطياف الكتلة وتصدير بيانات النص الطيفي الجماهيري باستخدام البرامج المرتبطة بمطياف الكتلة (انظر جدول المواد)كما هو مذكور في الخطوات أدناه(الشكل 3).
- انقر على ملف LCD في نافذة متصفح ملف البيانات من البرنامج.
- اختر وانقر على ذروة واحدة على نافذة الطيف الشامل ولتصوير اللون يون المستخرج (EIC) تلقائيًا.
- تحقق من TIC و EIC وانقر على رمز الطيف المتوسط لتحديد نافذة النطاق الزمني لتوليد الطيف الكتلي.
ملاحظة: في هذا التحليل، تظهر الجزيئات المستهدفة في إطار نسبة الكتلة إلى الشحنة(m/z)(الشكل 3). وعلاوة على ذلك، لأن مدة التأين لكل ضربة واحدة من حركة إبرة قصيرة جدا، وجميع أطياف الكتلة التي تم الحصول عليها هي أساسا متوسط الأطياف أكثر من 10 s (300 بمسح). - إنشاء ملف نصي يحتوي على m/z وكثافة الأيون بالنقر على علامة التبويب التصدير لمزيد من التحليل. يمكن تخزين هذا الملف النصي في أي مجلد.
ملاحظة: أي مواد حافظة للحمض النووي الريبي ستؤثر على النمط الطيفي الأصلي للعينات. بالإضافة إلى ذلك ، من المستحسن التعامل مع الأنسجة وتخزينها دون أي سائل (مثل المالحة المخزنة على الفوسفات) لمنع إلطيال المكونات الجزيئية من الأنسجة إلى السائل أثناء التخزين. من الناحية المثالية، يتم استخدام عينات جديدة أو طازجة مجمدة دون أي علاج.
2. سوائل الجسم (مصل) إعداد
ملاحظة: هذا الإجراء كله مطابق تقريبا لتلك المستخدمة للأنسجة الصلبة. خرطوشة لعينة السوائل هو متاح من الشركة المصنعة. لأن التلوث بخلايا الدم الحمراء (RBCs) يمكن أن يقلل إلى حد كبير من كفاءة اقتناء الطيفية من العنصر المقصود (البلازما أو المصل), تأكد من القضاء على جميع RBCs عن طريق الطرد المركزي قبل القياسات.
- خذ 10 ميكرولتر من عينة المصل ووضعها في أنبوب صغير 1.5 مل.
ملاحظة: يمكن استخدام كل من المصل الطازج والمخزن. - أضف 190 ميكرولتر من الإيثانول بنسبة 50٪ إلى أنبوب 1.5 مل، ثم دوامة لمدة دقيقتين في درجة حرارة الغرفة.
- الطرد المركزي السائل في 15،000 ز لمدة 1-5 دقيقة عند 4 درجة مئوية.
- نقل 10 ميكرولتر من سوبرناستانت في بئر الخرطوشة.
- ضع الخرطوشة في غرفة التأيين للآلة وقم بتثبيت مسبار إبرة الفولاذ المقاوم للصدأ الذي سيتم استخدامه لعينات التأيين(الشكل 2).
- أغلق غطاء الغرفة بقوة لتنشيط جهاز الأمان تلقائيًا.
- بدء تشغيل الكمبيوتر على متن الطائرة بالنقر فوق رمز ابدأ لتأين.
- تخلص من خرطوشة العينة والإبرة كما هو موضح في 1.10 بمجرد أخذ القياسات.
- تحليل المجموعات التي تم الحصول عليها من EIC كما هو مذكور أدناه(الشكل 3).
- افتح ملف LCD على متصفح البيانات.
- انقر على ذروة واحدة لعرض TIC وEIC.
- حدد إطار النطاق الزمني لإنشاء أطياف الكتلة باستخدام رمز الطيف المتوسط.
- قم بتصدير الملف الذي تم إنشاؤه الذي يحتوي على كل من كثافة m/z والأيون لذروة مقابلة بالنقر فوق علامة التبويب التصدير على الشاشة.
ملاحظة: يمكن تطبيق هذا الإجراء على اللعاب والبول وسوائل الجسم الأخرى أيضًا.
3. التحضير في الجسم الحي PESI-MS في الكائن الحي
ملاحظة: في هذا القسم، يتم تقديم تطبيق لمراقبة التشكيل الجانبي الأيضي لـ 5-فلورو-2'-ديوكسيسيريدين (5-FdU) في نموذج الماوس الحي. استخدام الظروف المعقمة في جميع أنحاء.
- تغرس 100 ميكرولتر من محلول 5-FdU 100 مM في الوريد الذيل لفأر عمره شهرين (وزن 20 جم تقريبًا).
ملاحظة: لا يوجد تفضيل للجنس أو العمر أو سلالة الماوس. في حين تمت الموافقة على هذا البروتوكول في الوقت الذي قمنا فيه بالتجربة5، فإن جدوى هذه التجربة تعتمد على القيود الأخلاقية للبلد الذي سيتم إجراؤها فيه. - تَسْهَمُ الفأرَ ةَ بعد بروتوكولِ العنايةِ الحيوانيةِ المعتمدةِ. تقييم عمق التخدير من خلال عدم وجود استجابة لذيل معسر.
ملاحظة: إذا لم يسمح استخدام بنتوباربيتال الصوديوم من قبل اللجنة الأخلاقية للتجارب على الحيوانات، يمكن استخدام أساليب بديلة، مثل هيدروكلوريد الكيتامين. - حلاقة تجويف البطن باستخدام شفرة حلاقة كهربائية وتطبيق مرهم الطبيب البيطري على العينين.
- وضع الماوس بخطر في موقف supine وإصلاح الكفوف على لوحة بلاستيكية باستخدام الشريط إصلاح. فرك موقع الجراحية مع الدعك من الكحول 70٪ ثلاث مرات.
- قطع فتح تجويف البطن باستخدام مقص. أولا، قطع الجلد بشكل قطعي (10 مم) من فوق الحجاب الحاجز. قطع عاجلا عضلة جدار الجسم البطن والبريتونيوم (حوالي 7 ملم) وعقد الجرح مفتوحة باستخدام الأسلاك غير القابل للصدأ لفضح سطح الكبد.
ملاحظة: ليست هناك حاجة لسبر سطح الكبد. - تطبيق غيض من إبرة التحقيق على سطح الكبد. ضبط عمق الإبرة إلى ما يقرب من 0.5 مم عميق لتحسين كفاءة التأيين، والتحقق من TIC ونمط الطيفية في وقت واحد. تعيين الجهد العالي إلى 2.3 كيلو فولت والتردد إلى 3 هرتز على شاشة لوحة التحكم.
- إزالة الحيوان من لوحة بلاستيكية.
- خياطة الجرح باستخدام خياطة الأمعاء الجراحية وإعادة الماوس إلى القفص. لا تترك الماوس دون مراقبة حتى استعاد وعيه للحفاظ على الرُكَم الرُقّي. لا ترجع الماوس إلى الشركة من الحيوانات الأخرى حتى أنها قد تعافى تماما.
- تنفيذ الدورة الزمنية لكثافة الأيون في EIC وإجراءات تصوير EIC كما هو الحال في 1.11.1 إلى 1.11.4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
كما هو مبين في الشكل 3، فإن البيانات التي تم الحصول عليها بواسطة تقنية PESI-MS هي أطياف الكتلة ، التي يتراوح m/z من 10 إلى 1200 في هذا النظام. في حين يمكن للمرء الكشف عن جزيئات تصل إلى m/z 2,000, كان هناك عدد قليل من القمم التي تم الحصول عليها باستخدام هذه التقنية على مدى كتلة من m/z 1,200. لذلك، قمنا بتحليل القمم من m/z 10 إلى 1200. وكانت هناك مجموعات بارزة من القمم حول m/z 800 و 900؛ الأول يمثل مكونات غشاء الخلية، مثل أنواع الكولين فوسفاتيديل (PC)، والثاني يمثل الجلسرين ترياسيل (TAG). يوضح الشكل 4 أطياف الكتلة من الكلى البشرية الطبيعية وسرطان الخلايا الكلوية (RCC). تم الحصول على أطياف الكتلة باستخدام طريقة الأنسجة المباشرة الموضحة في البروتوكول 1. لأن نوع الخلية واضحة RCC يتراكم TAG في السيتوبلازم، مجموعة من الأطياف حول m/z 900 واضح جدا. تم الحصول على النتيجة في الشكل 4 من خلال طريقة الاستخراج التي أدخلت في الشكل 1 للعينات الصلبة.
لأن التمثيل الغذائي للدهون من سرطان الكبد الخلوي يتغير خلال تطور المرض20، فمن الممكن لرصد مراحل المرض عن طريق خزعة روتينية جنبا إلى جنب مع PESI -MS. وتصور النتيجة في الشكل 5 الاختلافات في النمط الطيفي بين أنسجة الكبد الطبيعية وHCC. خاصة، هناك العديد من أطياف رائعة من TAG في HCC. إذا كان قرار مطياف الكتلة أعلى ، فمن الممكن أن الشرح الجزيئي لكل طيف سيسمح بتوضيح الآلية الجزيئية للسرطان ، وكذلك علم وظائف الأعضاء الخلوية العادية.
يمكن إجراء مراقبة في الوقت الحقيقي لعملية التمثيل الغذائي للأدوية باستخدام PESI. في تجاربنا ، تم رصد الديناميكا الدوائية للعامل المضاد للأونية 5-FdU أكثر من 10 ق بعد حقنه من خلال الوريد الذيل من الماوس. لوحظ الكشف السريع جدا من الأطياف إلا بعد بضع ثوان من حقن المخدرات(الشكل 6)، مما يعني النقل السريع للدواء عبر مجرى الدم إلى الكبد. تضاءلت شدة قنوات الصوديوم من 5-FdU مع عيب قصير من إشارة الأيون في التسجيل في حوالي 6-7 s بعد بدء القياس. كان هذا بسبب العمق المختلف لإبرة PESI في parenchyma الكبد ، والتي كانت نتيجة لحركات الجسم للفأر ة المُسَهَمة. لذلك ، يجب توخي الحذر لضبط عمق إبرة PESI لقياس الحيوانات الحية في الوقت الحقيقي. لا توجد طريقة موصى بها للعثور على العمق الأمثل للإبرة ، ولكن ها هو واضح مع الممارسة.
تم تحليل عينات الدم من ثلاثة أفراد من قبل PESI-MS. في هذه الحالة، تم خلط 10 ميكرولتر من المصل مع 190 ميكرولتر من الإيثانول بنسبة 50٪ ثم استخدم لتحليل PESI-MS. في حين أن الأنماط الطيفية الشاملة يبدو أن تشترك في العديد من القمم المشتركة(الشكل 7)، وهناك العديد من الاختلافات الدقيقة في الأطياف من هؤلاء الأشخاص الثلاثة. فهي بصمة لكل شخص من حيث الأنشطة الأيضية. للحصول على معلومات مفصلة عن الهويات الجزيئية ، من الضروري استخدام آلة عالية المستوى. ولم يوفر مطياف الكتلة المستخدم في التجارب دقة عالية بما يكفي لتحديد الجزيئات.
إذا كان هناك تلوث بمركبات البوليمر ، فإن الأطياف الأصلية في الشكل 4 تؤدي إلى قمم دورية وواضحة متراكبة تطمس الأطياف من العينة الأصلية(الشكل 8). ولإثبات ذلك تجريبياً، أضفنا البولي بروبلين الجلسرين تريول (PPGT) إلى 2.5٪ لإعادة إنتاج حالة التلوث. تقريبا كل الأطياف المحددة التي شوهدت في الشكل 8 كانت ملثمة بإضافة PPGT.
الشكل 1: نظرة عامة تخطيطية لتدفق إعداد العينة. بالنسبة للعينات، تعتبر خرطوشة العينات المتخصصة مثالية للحصول على بيانات مستقرة. تحليل عينة السائل هو أسهل طريقة لأداء PESI-MS، ببساطة عن طريق وضع الحل في خرطوشة. هناك طريقتان لتطبيق هذه الطريقة على الأنسجة الصلبة. التطبيق المباشر للPESI إلى الأنسجة سهل جدا وسريع، في حين أن طريقة الاستخراج تمكن من تحقيق اقتناء أكثر استقرارا من الأطياف اعتمادا على أنواع العينة. في هذا الإجراء ، يتم وضع قطعة صغيرة من عينة الأنسجة في أنبوب صغير مع 100 ميكرولتر من الإيثانول بنسبة 50٪ ومتجانسة مع micropestle. ثم يتم استخدام 10 ميكرولتر من التجانس الناتج في قياس الطيف الكتلي. في حالة تحليل الحيوان الحي ، يتم وضع 30 ميكرولتر من الإيثانول بنسبة 50٪ على السطح المصلي للجهاز المستهدف ، يليه القياس. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: نظرة عامة ومكونات أساسية لـ PESI-MS. مطياف كتلة مجهزة وحدة PESI. يتم تثبيت الجزء التأيين في غرفة مغلقة حيث يتم وضع المجانب، حامل إبرة، وحامل العينة. الإبرة جاهزة، ويتم إصلاح إبرة الفولاذ المقاوم للصدأ المتاح إلى حامل الإبرة. يتم تعيينها في مطياف الكتلة فقط بعد وضع خرطوشة العينة في الغرفة. متوسط زاوية انحناء الإبرة هو 400 نانومتر. خرطوشة لوضع العينة هو المتاح ومصنوعة من البوليمرات البلاستيكية. لديها بئر صغير لوضع عينة السائل (السهم الأحمر). بعد وضع العينة الصلبة في البئر ، يتم طي الكاسيت لقرصة العينة وختم البئر. لخرطوشة عينة السائل، يتم استخدام واحد مختلف التي لا تتطلب قابلة للطي، وهذا هو الإصدار الموصى به الذي هو متفوقة على عينات صلبة. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: واجهة المستخدم الرسومية (GUI) لPESI-MS. يمكن تنفيذ جميع إجراءات توليد أطياف الكتلة من إجمالي اللون اللوني الأيوني (TIC) مع البرامج المرتبطة بها. بعد فتح ملف LCD في متصفح البيانات ، يمكن عرض TIC ، ويمكن تحديد النطاق الزمني لتوليد أطياف الكتلة. يمكن تصدير أطياف الكتلة المولدة كبيانات نصية تحتوي على كل من نسبة الكتلة إلى الشحن(m/z)وكثافة الأيون. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: سرطان الخلايا الكلوية البشرية يظهر قمم مميزة من الدهون المحايدة. كانت هناك قمم قوية نسبيا في الأطياف من أنسجة سرطان الخلايا الكلوية البشرية (RCC) التي لم يتم تحديدها في الأنسجة غير السرطانية المحيطة. هذه القمم تمثل أساسا triacylglycerol (TAG) في جميع أنحاء نسبة كتلة إلى تهمة(م / ض)900. تم إجراء الاقتناء الطيفي باستخدام وضع الأيون الإيجابي عن طريق التحليل المباشر. تم تعيين الجهد العالي إلى 2.3 كيلو فولت. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: مثال على البيانات المكتسبة في أنسجة الكبد العادية وسرطان الخلايا الكبدية البشرية( HCC). اللوحة العلوية تصور الأطياف من أنسجة الكبد البشري حيث لم تكن هناك آفة من البلاستيك الجديد ، ولكن من مريض يعاني من التهاب الكبد المزمن وتليف الكبد. تُظهر اللوحة السفلية متوسط أطياف HCC من نفس المريض. في لمحة ، في حين أن هذين لديهما أنماط طيفية متشابهة للغاية ، هناك العديد من الاختلافات الصغيرة في النمط الطيفي. يُظهر الخراج نسبة الكتلة إلى الشحنة(m/z)ويصور التنسيق الكثافة النسبية لكل طيف. تم إجراء اكتساب الأطياف باستخدام وضع الأيون الإيجابي بعد استخراج الأنسجة ، كما هو مبين في الشكل 2C. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6: قياسات في الوقت الحقيقي لعملية التمثيل الغذائي للأدوية. التغيرات الأيضية في 5-FdU حقن عن طريق الوريد في وعاء ذيل الماوس. تم الكشف السريع جدا وحساسة من 5-FdU مع قناة الصوديوم في الكبد في الموقع. بسبب التأيين غير المستقر أثناء القياس ، يمكن ملاحظة توقف الإشارة في حوالي 6-7 s. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 7: أمثلة لبيانات من ثلاثة أفراد. تم تحليل المصل البشري من ثلاثة أفراد باستخدام PESI-MS. كانت هناك اختلافات واضحة في الأنماط الطيفية بين الأفراد. تم الحصول على البيانات باستخدام وضع الأيون الإيجابي. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 8: تتداخل مركبات البوليمر مع الحصول على البيانات الدقيقة. بسبب ظهور دوري من القمم الطيفية متراكبة على العينة الأصلية، يصبح من الصعب تفسير البيانات بدقة. في هذه الحالة، تظهر الأطياف المشتقة من البولي بروبلين ثلاثي الجليسيرول (PPGT) كتراكب صاخبة. هذه المركبات، التي تستخدم عادة للمعايرة، تخفي الأطياف الأصلية من الكبد. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
على الرغم من أن PESI هو مشتق من ESI لقياس الطيف الكتلي4، فمن الأكثر فائدة لرصد metabolomics في الوقت الحقيقي ، وكذلك لتحليل التفاعلات الكيميائية الحيوية دون إجراء أي علاجات مسبقة معقدة أو تستغرق وقتًاطويلا5،14،15،17. وهي تقنية قياس الطيف الكتلي السهلة واللحظية التي يمكن تطبيقها على الحالة المتكاملة للكائنات الحية. نظرًا لأنه لا يتطلب سلاسل معقدة من العلاجات المسبقة للعينة ، فهناك إمكانية أكبر بكثير لتقييم التكوين الجزيئي للعينة بأكملها ، لأننا نتجنب أي فقدان محتمل للعينة يمكن أن يحدث في ESI التقليدية ، والتي تتطلب خطوات معقدة من العلاجات المسبقة للعينة باستخدام كميات كبيرة من المذيبات العضوية. لذلك ، يسمح لنا PESI بالحصول على المزيد من المعلومات من العينة إذا تم التحكم في جميع الشروط بشكل مناسب.
نحن بحاجة أولا إلى ذكر بعض الجوانب التقنية المطلوبة للحصول على نتائج جيدة عند النظر في تحليل PESI-MS. العامل الأكثر أهمية في PESI هو الحفاظ على كفاءة التأين أثناء التحليل. لتحقيق ذلك ، من المستحسن ضبط وتحسين المسافة بين طرف الإبرة وسطح العينة ، لتوليد TIC مستقرة من خلال الرجوع إلى شاشة الكمبيوتر أثناء التحليل. للقيام بذلك، فمن الضروري تغيير عمق الإبرة بطريقة تدريجية لتحقيق أقصى قدر من TIC. ولأن مدة التأين قصيرة نسبياً مقارنة بـ ESI، فإن PESI ليست مثالية للاستنساخ أو القياس الكمي. ثانيا، لأن شكل تلميح إبرة يلعب دورا هاما جدا في التأيين من خلال تشكيل مخروط تايلور المثالي الذي يعمل كمصدر أيون، يجب توخي الحذر لا لتشوه تلميح إبرة. قد يؤدي تشوه الطرف إلى انخفاض كفاءة التأيين.
في حين أن PESI مفيد لأنه يمكن تطبيقه مباشرة على العينات الطازجة (مثل الكبد والكلى والدماغ) والكائن الحي دون علاج خاص ، فهو حساس نسبيًا للملوثات الخارجية الأخرى لأنه يمكن أن يأين جميع المكونات الموجودة في السائل21و22و23. وهذا يعني أن الجانب السلبي لميزة تخطي المعالجة المسبقة للعينة يعني أن PESI-MS في وضع غير مؤات في العديد من الحالات التي غالباً ما تواجه في التجارب البيولوجية. كما هو موضح في قسم البروتوكول ، فإن PESI حساس للتلوث بالمواد الحافظة للحمض النووي الريبي ، والألدهيدات ، ومركبات البوليمر مثل البوجل اتُخدمت غالبًا لإعداد النسيج. يمكن أن تلتصق جلطات الدم بإبرة PESI وغالباً ما تخفي الأطياف المقصودة. وعلاوة على ذلك، فإن انطلاق الهيموتسي من RBCs يحرر الهيموغلوبين، والأيون الفيرك المنفصم يؤدي إلى أطياف أقوى بكثير من تلك المستمدة من الأنياب المقصود. مركبات البوليمر أيضا إعطاء القمم الطيفية الدورية التي تراكب الأطياف المستمدة من الأنياب المقصود، مما يجعل من الصعب جدا لتفسير البيانات الحقيقية بسبب الضوضاء(الشكل 8). لتجنب أي مشاكل في الحصول على أطياف الكتلة ، من المستحسن اتباع بروتوكولنا ، مع ملاحظة خاصة بالإشارات إلى التلوث. وفي هذا الصدد، فإن تطبيق الـ PESI محدود في بعض الحالات.
عيب آخر من PESI يكمن في عملية التأيين غير مستقرة نسبيا، الأمر الذي يتطلب منا لضبط عمق إبرة التحقيق إلى الملخصات. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أن تغطي هذه التقنية منطقة محظورة للغاية في تحليل واحد. بسبب صغر حجم طرف الإبرة الذي يتم تطبيقه مباشرة على الأنسجة ، فإن تحليل PESI-MS ليس شاملًا مثل التحليل 2D الذي يمكن تحقيقه باستخدام قياس الطيف الكتلي التصويري المستند إلى MALDI-TOF MS أو التصوير المستند إلى DESI7،8. PESI، ومع ذلك، إعادة بناء صورة لتشكيل فرس النهر، على الرغم من أن الأمر يستغرق عدة ساعات23 لأن المسح الضوئي 2D من عينة يستغرق وقتا طويلا، وذلك أساسا بسبب كفاءة تأين هذه التقنية غير مستقرة. مع أخذ هذا في الاعتبار ، فإن التصوير الطيفي الشامل من قبل PESI-MS ليس تطبيقًا قيمًا.
فيما يتعلق بالخصائص الكهروكيميائية لـ PESI ، فإن حجم وتركيز العينة التي تلتزم بطرف الإبرة أمر بالغ الأهمية18، حيث يتم تخفيف تأثير القمع إلى حد ما عن طريق تقليص حجم الرذاذ الكهربائي. وبالنظر إلى أن PESI هو تصغير ESI ، يجب تخفيف العينات بشكل مثالي لتجنب تشكيل ملاط على الطرف. لذلك ، فإن إضافة ما يقرب من 30 ميكرولتر من الإيثانول بنسبة 50٪ ضروري لتحقيق تأين فعال عند استخدام طريقة الأنسجة المباشرة(الشكل 2B). هذا يزيد من كفاءة التأيين ويحقق تأيين كامل تقريبا من الجزيئات المرفقة إلى غيض من الإبرة.
اختيار الطريقة الأنسب لمعالجة البيانات مهم جدا عند استخدام هذا النظام24. فيما يتعلق بتنفيذ التعلم الآلي لأي تشخيص للمرض ، فإن إنشاء قاعدة بيانات ضروري لإنشاء مرجع لتصنيف أو تصنيف الأمراض7. على سبيل المثال ، استخدمنا آلة ناقلات الدعم أو الانحدار اللوجستي لإجراء تشخيص للأورام الخبيثة الكبدية الأولية25.
PESI-MS هو تقنية متعددة الاستخدامات وسهلة لديها إمكانات كبيرة لفحص المخدرات ، واختبارات المنشطات ، واختبارات سلامة الأغذية للمنتجات الزراعية26، وبعض الاختبارات البيئية. نظرًا لأن وحدة التأين هذه متوافقة مع مطياف اتّهامات أخرى من خلال إعداد مرفق لكل أداة محددة، يمكن تطبيق PESI على أغراض مختلفة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ومولت صاحب البلاغ المقابل شركة شيمادزو، وهي شركة مصنعة وموردة لصك PESI-MS.
Acknowledgments
نشكر أيومي إيزوكا لتشغيلها PESI-MS وكازوكو سوا-نوبوري على مساعدتها في مجال السكرتارية. نشكر برونوين غاردنر، دكتوراه، من مجموعة إدانز (www.edanzediting.com/ac) لتحريرمسودة هذه المخطوطة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-Fluoro-2'-deoxyuridine (5-FdU) | Sigma-Aldrich | F8791-25MG | 25mg |
| disposable biposy punch (Trepan) | kai Europa GmbH | BP-30F | bore size 3mm |
| ethanol | nacalai tesque | 14710-25 | extra pure reagent |
| LabSolutions | Shimadzu | ver. 5.96, Data analyzer | |
| micropestle | United Scientific Supplies | S13091 | |
| microtube | Treff | 982855 | 0.5 mL clear |
| PESI-MS (Direct Probe Ionization-MS) | Shimadzu | DPiMS-2020 | Mass spectrometer equipped with PESI |
| PPGT solition | Shimadzu | ND | Attached to DPiMS-2020 |
References
- Fenn, J. B., Mann, M., Meng, C. K., Wong, S. F., Whitehouse, C. M. Electrospray ionization for mass spectrometry of large biomolecules. Science. 246, 64-71 (1989).
- Karas, M., Bachman, D., Bahr, U., Hillenkamp, F. Matrix-Assisted Ultraviolet Laser Desorption of Non-Volatile Compounds. International Journal of Mass Spectrometry and Ion Processes. 78, 53-68 (1987).
- Tanaka, K., et al. Protein and polymer analyses up to m/z 100000 by laser ionization time-of flight mass spectrometry. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 2, 151-153 (1988).
- Hiraoka, K., Nishidate, K., Mori, K., Asakawa, D., Suzuki, S. Development of probe electrospray using a solid needle. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 21, 3139-3144 (2007).
- Yoshimura, K., Chen, L. C., Yu, Z., Hiraoka, K., Takeda, S. Real time analysis of living animals by electrospray ionization mass spectrometry. Analytical Biochemistry. 417, 195-201 (2011).
- Balog, J., et al. Intraoperative tissue identification using rapid evaporative ionization mass spectrometry. Science Translational Medicine. 5, 194ra93 (2013).
- Boughton, B. A., Hamilton, B. Spatial metabolite profiling by matrix-assisted laser desorption ionization mass spectrometry imaging. Advances in Experimental Medicine and Biology. 965, 291-321 (2017).
- Shimma, S., Sugiura, Y., Hayasaka, T., Hoshikawa, Y., Noda, T., Setou, M. MALDI-based imaging mass spectrometry revealed abnormal distribution of phospholipids in colon cancer liver metastasis. Journal of Chromatography. B, Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 855, 98-103 (2017).
- Sugiyama, E., Setou, M. Visualization of brain gangliosides using MALDI imaging mass spectrometry. Methods in Molecular Biology. 1804, 223-229 (2018).
- Zhang, J., et al. Nondestructive tissue analysis for ex vivo and in vivo cancer diagnosis using a handheld mass spectrometry system. Science Translational Medicine. 9, 406 (2017).
- Pirro, V., Jarmusch, A. K., Vincenti, M., Cooks, R. G. Direct drug analysis from oral fluid using swab touch spray mass spectrometry. Analytica Chimca Acta. 861, 47-54 (2015).
- Chen, L. C., et al. Characterization of probe electrospray generated from a solid needle. Journal of Physical Chemistry. B. 112, 11164-11170 (2008).
- Mandal, M. K., Chen, L. C., Hiraoka, K. Sequential and exhaustive ionization of analytes with different surface activity by probe electrospray ionization. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 22, 1493-1500 (2011).
- Yoshimura, K., Chen, C. L., Asakawa, D., Hiraoka, K., Takeda, S. Physical properties of the probe electrospray ionization (PESI) needle applied to the biological samples. Journal of Mass Spectrometry. 44, 978-985 (2009).
- Yoshimura, K., et al. Analysis of renal cell carcinoma as a first step for mass spectrometry-based diagnostics. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 23, 1741-1749 (2012).
- Ashizawa, K., et al. Construction of mass spectra database and diagnosis algorithm for head and neck squamous cell carcinoma. Oral Oncology. 75, 111-119 (2017).
- Johno, H., et al. Detection of potential new biomarkers of atherosclerosis by probe electrospray ionization mass spectrometry. Metabolomics. 14, 38 (2018).
- Zaitsu, K., et al. Intact endogenous metabolite analysis of mice liver by probe electrospray ionization/triple quadrupole tandem mass spectrometry and its preliminary application to in vivo real-time analysis. Analytical Chemistry. 88, 3556-3561 (2016).
- Yoshimura, K., et al. Real time diagnosis of chemically induced hepatocellular carcinoma using a novel mass spectrometry-based technique. Analytical Biochemistry. 441, 32-37 (2013).
- Nakagawa, H., et al. Lipid metabolic reprogramming in hepatocellular carcinoma. Cancers. 10, 447-461 (2018).
- Mandal, M. K., Chen, L. C., Hashimoto, Y., Yu, Z., Hiraoka, K. Detection of biomolecules from solutions with high concentration of salts using probe electrospray and nano-electrospray ionization mass spectrometry. Analytical Methods. 2, 1905-1912 (2010).
- Yoshimura, K., Chen, L. C., Johno, H., Nakajima, M., Hiraoka, K., Takeda, S. Development of non-proximate probe electrospray ionization for real-time analysis of living animal. Mass Spectrometry. 3, S0048 (2014).
- Chen, L. C., et al. Ambient imaging mass spectrometry by electrospray ionization using solid needle as sampling probe. Journal of Mass Spectrometry. 44, 1469-1477 (2009).
- Yoshimura, K., Chen, C. L., Asakawa, D., Hiraoka, K., Takeda, S. Physical properties of the probe electrospray ionization (PESI) needle applied to the biological samples. Journal of Mass Spectrometry. 44, 978-985 (2009).
- Takeda, S., Yoshimura, K., Hiraoka, K. Innovations in analytical oncology - Status quo of mass spectrometry-based diagnostics for malignant tumor. Journal of Analytical Oncology. 1, 74-80 (2012).
- Hiraoka, K., et al. Component profiling in agricultural applications using an adjustable acupuncture needle for sheath-flow probe electrospray ionization/mass spectrometry. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 67, 3275-3283 (2019).
