Summary
I den här artikeln införs provberedningsmetoder för en unik analysmetod i realtid baserad på den omgivande masspektrometrimen. Denna metod gör att vi kan utföra realtidsanalys av de biologiska molekylerna in vivo utan några speciella förbehandlingar.
Abstract
Masspektrometri (MS) är ett kraftfullt verktyg i analytisk kemi eftersom det ger mycket exakt information om molekyler, såsom mass-till-charge nyckeltal (m / z), som är användbara för att härleda molekylvikter och strukturer. Även om det är i huvudsak en destruktiv analytisk metod, senaste framsteg i den omgivande jonisering teknik har gjort det möjligt för oss att förvärva data samtidigt som vävnad i ett relativt intakt tillstånd när det gäller integritet. Sond elektrosprayjonisering (PESI) är en så kallad direkt metod eftersom det inte kräver komplex och tidskrävande förbehandling av prover. En fin nål fungerar som ett prov plockare, samt en jonisering utsläppare. Baserat på den mycket skarpa och fina egenskapen hos sonden spets, förstörelse av proverna är minimal, så att vi kan förvärva realtid molekylär information från levande ting på plats. Häri introducerar vi tre tillämpningar av PESI-MS-teknik som kommer att vara användbara för biomedicinsk forskning och utveckling. Man innebär tillämpningen på fast vävnad, vilket är den grundläggande tillämpningen av denna teknik för medicinsk diagnos. Eftersom denna teknik kräver endast 10 mg av provet, Det kan vara mycket användbart i rutinkliniska inställningar. Den andra ansökan är för in vitro medicinsk diagnostik där humant blod serum mäts. Förmågan att mäta vätskeprover är också värdefull i olika biologiska experiment där en tillräcklig provvolym för konventionella analystekniker inte kan tillhandahållas. Den tredje applikationen lutar mot direkt applicering av sondnålar hos levande djur, där vi kan få realtidsdynamik av metaboliter eller läkemedel i specifika organ. I varje ansökan kan vi dra slutsatsen de molekyler som har upptäckts av MS eller använda artificiell intelligens för att få en medicinsk diagnos.
Introduction
Masspektrometri (MS) är en teknisk förverkligande av reduktionism; Det minskar föremålet för analys till en enhet som kan tolkas på grundval av molekylära arter eller kaskader. Därför är det en representativ metod för analytisk kemi. Den består av fyra processer: jonisering, analys, detektion och spektralförvärv. Eftersom jonisering av molekylen är den första processen i masspektrometri, begränsar det i allmänhet formen av analyterna som ska bearbetas. De flesta joniseringsförfaranden kräver förstörelse av strukturen, morfologi och biologiska processer i realtid av organiska prover. Till exempel kräver elektrosprayjonisering (ESI) MS att proverna är i ett flytande tillstånd för effektiv jonisering1. Prover måste därför gå igenom en komplex biokemisk beredning, som förändrar molekylernas sammansättning. Alternativt, medan matris-assisterad laser desorption jonisering (MALDI) MS kan rekonstruera molekylära kartor över tunn sektionerad vävnad2,3, dess jonisering effektivitet är för låg för att upptäcka alla molekyler i proverna, och det är särskilt dålig på att analysera fettsyror. Med tanke på dessa begränsningar kan sondelektrosprayjonisering (PESI)4 användas för att observera förändringar i realtid i biologiska system på plats utan att förstöra den strukturellaintegriteten 5, medan den biologiska organismen observeras är tekniskt i ett levande tillstånd. En mycket fin nål används i detta fall som fungerar samtidigt som ett provplockare och en jonavsändare. Detta innebär att de komplexa provförbehandlingssekvenserna kan kringgås för att erhålla massspektra som återspeglar de molekylära komponenterna i det levande systemet på plats.
Det finns flera andra joniseringsmetoder som konkurrerar med PESI-MS. En är snabb avdunstning jonisering massa pektrometri (REIMS)6. Denna teknik fungerar bra under operationen eftersom den är monterad med en elektrisk kniv och samlar jonplym genereras under snitt. Medan REIMS är mycket användbart för operationen, är det i huvudsak en destruktiv metod som kräver elektrisk ablation av vävnaden. Det är därför inte användbart för detaljerad analys av celler och vävnader i ett preparativt prov eller i laboratorieanalyser. Dessutom, eftersom det samlar en stor mängd plym som innehåller vävnad skräp, det kräver långt underhåll av enheterna efter varje användning, vilket begränsar användningen av denna maskin till särskilda kirurgiska ingrepp. En liknande metod, som kallas laser desorption jonisering massa pektrometri (LDI-MS)7, är en annan teknik som är noninvasive och användbar för ytanalysen. Eftersom denna teknik är bra på att skanna ytan av ett exemplar, uppnår den omfattande tvådimensionell analys som MALDI imaging masspektrometri8,9. Eftersom LDI-MS endast är tillämpligt på ytanalysen är PESI-MS dock fördelaktigt för att analysera proverna t.ex. En annan teknik, MasSpec Pen10, rapporterades för att uppnå hög specificitet och känslighet i diagnos sköldkörtelcancer, men diametern på sonden är i storleksordningen mm och det är specifikt för ytanalysen, vilket innebär att det inte kan upptäcka små knölar av cancer eller djupt lokaliserade skador. Eftersom denna metod använder en mikrokapillär flödeskanal inbäddad i sondpennan måste dessutom korskontaminering beaktas, liknande LDI-MS. Andra tekniker finns som har tillämpats på kliniska inställningar, såsom flödessonden och joniseringsformuläret swab11, men de är inte utbredda.
PESI är extrem miniatyrisering av ESI, där nanoelektrosprayens kapillär konvergerar på en fast nål med en spetskrökningsradie på flera hundra nm. Jonisering sker i det extremt begränsade området av nålspetsen genom att bilda en Taylor kon, där prover kvar tills jonisering av all vätska på spetsen är klar12. Om analyten stannar på metallnålens spets genereras överladdningen kontinuerligt vid gränssnittet mellan metallnålen och analyterna. Därför uppstår sekventiell jonisering av molekyler beroende på deras ytaktivitet. Denna egenskap gör nålspetsen till ett slags kromatogram, som skiljer analyterna beroende på deras ytaktivitet. Mer tekniskt, molekyler med starkare ytbehandlar aktivitet kommer till ytbehandla av Taylorkonen och joniseras tidigare än de med svagare ytbehandlar aktivitet, som fäster till ytbehandla av nålen till avsluta av joniseringen. Således uppnås fullständig jonisering av alla molekyler som plockas upp av nålen13. Dessutom, eftersom denna teknik inte innebär tillsats av överflödigt lösningsmedel till provet, flera hundra femtoliter är tillräckliga för att få massa spektra tillräckligt stark för ytterligare analys14. Dessa egenskaper är fördelaktiga för analys av intakta biologiska prover. En stor nackdel med PESI-MS ligger dock i diskontinuiteten i joniseringen på grund av nålens återgående rörelse längs den vertikala axeln, liknande en sågmaskin. Jonisering sker endast när spetsen på sonden når den högsta punkten när höjden på jonöppningen är justerad på den horisontella axeln. Jonisering upphör medan nålen plockar upp prover, och så stabiliteten i jonisering är inte lika med den i konventionella ESI. Därför är PESI-MS inte en idealisk metod för proteomik.
Pesi-MS har hittills huvudsakligen tillämpats på analys av biologiska system, som omfattar ett brett spektrum av områden från grundforskning till kliniska miljöer. Till exempel, den direkta analysen av mänsklig vävnad som utarbetats under operationen kunde avslöja ansamling av triacylglycerol i både njurcellscancercarcinom 15 och faryngeal skivepitelcancer16. Denna metod kan också mäta flytande prover, såsom blod, att fokusera på lipidprofilen. Till exempel har vissa molekyler avgränsats under kostförändringar hos kaniner; det rapporterades att vissa av dessa molekyler minskade i mycket tidiga skeden av experimenten, vilket tyder på den höga känsligheten och nyttan av detta system för klinisk diagnos17. Dessutom, direkt tillämpning på ett levande djur får detektion av biokemiska förändringar i levern efter bara en natt av fasta5. Zaitsu et al.18 revisited detta experiment5 och analyserade metaboliska profiler av levern på nästan samma sätt, med resultat som förstärktstabilitet och reproducerbarhet av vår ursprungliga metod. Dessutom kunde vi diskriminera cancervävnaden från omgivande icke-cancerlever hos möss med hjälp av denna teknik19. Därför är detta en mångsidig masspektrometri teknik som är användbar i olika inställningar, både in vivo och in vitro. Ur en annan synvinkel kan PESI-modulen göras för att passa olika masspektrometrar genom att justera monteringsfästet. I denna korta artikel introducerar vi grunderna och exemplen på tillämpningar(figur 1), inklusive tillämpningar med levande djur5.
Enligt bestämmelserna och lagarna i varje land måste delar av detta protokoll ses över för att uppfylla varje institutions kriterier. Tillämpning till den levande organismen är den mest intressanta och utmanande eftersom det kan ge biokemiska eller metaboliska förändringar i vävnader eller organ hos levande djur på plats. Även om denna ansökan godkändes av den institutionella kommittén för djurvård vid universitetet i Yamanashi, 20135, kommer en annan omgång godkännande nu att vara nödvändig på grund av den senaste tidens ändringar i reglerna för djurförsöken. Flera ändringar i det experimentella systemet är därför tillrådliga. När det gäller massa spektra erhålls i experiment, med fluktuationer i massa spektra mellan varje mätning beaktas, det finns inget spektralt informationsutbyte system som är vanligt att nukleotid sekvensering samhället. Försiktighet skall iakttas när föraren hanterar nålen för att undvika nålsticksolyckor, särskilt när nålen avlägsnas från nålhållaren. En speciell anordning för att lossa nålen är mycket användbar för detta ändamål. Eftersom PESI-modulens fack är en lufttät, sluten kammare uppstår inte läckage av jonplym om masspektrometern används enligt instruktionerna.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Den institutionella kommittén för djurvård vid universitetet i Yamanashi godkände alla protokoll och användning av försöksdjur som anges häri. Användning av humanprov godkändes av den institutionella etiknämnden vid universitetet i Yamanashi.
1. Beredning av fast vävnad
OBS: Proverna skall förvaras på is efter avlägsnande från djuret eller människokroppen för att bevara vävnadens färskhet. Om mätningarna inte omedelbart följer dissekering rekommenderas att vävnadförvaras vid -80 °C. Det är inte tillrådligt att placera vävnaden i någon form av buffert eller saline, eftersom de kan extrahera visst innehåll från vävnaden. Vävnad som har fästs med aldehyder eller inbäddad i paraffin/vax eller kryogel är inte lämplig för MS-mätningar.
- Skär vävnadspreparatet till ca 2 x 2 x 2 mm med en skalpell eller kniv. Alternativt, stansa ut provet med en trepan (en engångsbiopsi punch, bar storlek 3 mm) som används för hudundersökningen. I detta fall trimma längden på kolonnen till 2 mm.
OBS: All vävnad kan analyseras med denna metod. I detta experiment, lever15 ochnjure 19, har framgångsrikt analyserats för att få massa spektra. Generellt, parenkymala organ ger bra massa spektra, medan de som har fibrösa komponenter inte. - Om vävnaden är förorenad med blod, tvätta kort med iskall fosfat-buffrad saltlösning.
OBS: För att minimera postmortem vävnadsskador, slutföra detta steg, så snart som möjligt, vid rumstemperatur. Om mätningarna inte görs omedelbart, snäpp fast frys vävnaden i flytande kväve och förvara vid -80 °C. - Placera det skurna eller stansade utprovet (ca 10 mg) i ett plastmikrorör och tillsätt 100 μL av 50 % etanol.
OBS: Den exakta vikten av prover bestäms inte eftersom masspektrometri som används i detta system inte ger kvantitativa data. Cirka 10 mg är optimalt för parenkymala vävnad. - Homogenisera provet med hjälp av en mikropestle.
- Placera 10 μl av homogenatet i patronens brunn (figur 2).
- Placera patronen i masspektrometerns joniseringskammare och installera den nålsond i rostfritt stål som kommer att användas för provjoniseringen(figur 2).
OBS: Sondnålar levereras av tillverkaren. De är tillverkade av rostfritt stål och har en krökning radie på cirka 400 nm. - Stäng kamlocket ordentligt för att automatiskt aktivera säkerhetsanordningen.
- Starta den inbyggda datorn genom att klicka på Start-ikonen för att analysera. Använd skärmpanelerna, applicera en spänning på 2,3 kV på nålen för att generera elektrosprayen och se till att nålfrekvensen är 3 Hz.
- Vänta tills 30 s för att mätningen ska slutföras.
Sessionen upphör automatiskt när datainsamlingen slutförs. Analysens kvalitet övervakas av ett totalt jonkromattogram (TIC). Mättiden definieras för att erhålla den representativa massspektrat och kan förkortas eller förlängas. - Kassera patronen och nålen i en biorisk disponefter efter att ha mätt varje prov.
OBS: Endast ett prov kan mätas åt gången. Det är inte nödvändigt att kalibrera maskinen före varje mätning; kalibreringen beror på leverantörens regelbundna kontroll en gång var sjätte månad. - Analysera massspektra och exportera massspektraltextdata med hjälp av programvaran som är associerad med masspektrometern (se Materialtabell)enligt stegen nedan (figur 3).
- Klicka på LCD-filen i datafilwebbläsarfönstret i programvaran.
- Välj och klicka på en enda topp på massspektrumfönstret och för att automatiskt skildra ett extraherat jonkromattogram (EIC).
- Kontrollera TIC och EIC och klicka på den genomsnittliga spektrumikonen för att välja tidsintervallet för att generera massspektrumet.
OBS: I denna analys uppträder målmolekylerna i mass-till-charge-fönstret(m/z)(figur 3). Dessutom, eftersom varaktigheten av jonisering per enda slag av nålrörelse är mycket kort, alla massa spektra erhålls är i huvudsak genomsnittliga spektra över 10 s (300 skanningar). - Generera en textfil som innehåller m/z och jonintensitet genom att klicka på fliken Exportera för vidare analys. Den här textfilen kan lagras i valfri mapp.
OBS: Alla RNA konserveringsmedel kommer att påverka det inhemska spektrala mönstret av prover. Dessutom är det lämpligt att hantera och lagra vävnad utan vätska (t.ex. fosfatbuffrad saline) för att förhindra elution av molekylära komponenter från vävnaden i vätskan under lagring. Helst används färska eller färska frysta prover utan någon behandling.
2. Kroppsvätskor (serum) beredning
OBS: Hela detta förfarande är nästan identisk med den som används för fast vävnad. Patronen för vätskeprovet är tillgänglig från tillverkaren. Eftersom kontamineringen av röda blodkroppar (CFC) kraftigt kan minska effektiviteten i spektralförvärv av den avsedda komponenten (plasma eller serum), se till att eliminera alla rfc genom att centrifugera före mätningar.
- Ta 10 μL av serumprovet och lägg det i en 1,5 ml mikrotube.
OBS: Både färskt och lagrat serum kan användas. - Tillsätt 190 μl av 50% etanol till 1,5 ml röret, sedan virvel i 2 min vid rumstemperatur.
- Centrifugera vätskan vid 15 000 x g i 1-5 min vid 4 °C.
- Överför 10 μL supernatant i patronens brunn.
- Placera patronen i maskinens joniseringskammare och installera den rostfria nålsonden som kommer att användas för provjonisering(figur 2).
- Stäng kamlocket ordentligt för att automatiskt aktivera säkerhetsanordningen.
- Starta den inbyggda datorn genom att klicka på Start-ikonen för att jonisera.
- Kassera provpatronen och nålen enligt beskrivningen i 1.10 när mätningarhar gjorts.
- Analysera de erhållna uppsättningarna eIC enligt nedan(figur 3).
- Öppna LCD-filen i databläddraren.
- Klicka på en enda topp för att visa TIC och EIC.
- Välj tidsintervallet för generering av massspektra med hjälp av den genomsnittliga spektrumikonen.
- Exportera den genererade filen som innehåller både m/z- och jonintensiteten för en motsvarande topp genom att klicka på exportfliken på bildskärmen.
OBS: Detta förfarande kan tillämpas på saliv, urin och andra kroppsvätskor också.
3. Förberedelse för in vivo PESI-MS i levande organism
OBS: I detta avsnitt, ett program för att övervaka den metaboliska profilen av 5-Fluoro-2'-deoxyuridine (5-FdU) i en levande mus modell införs. Använd aseptiska förhållanden hela tiden.
- Ingjuta 100 μL av 100 mM 5-FdU lösning i svansvenen på en 2-månader gammal mus (ca 20 g vikt).
OBS: Det finns ingen preferens för kön, ålder eller mus stam. Även om detta protokoll godkändes vid den tidpunkt då vi utförde experimentet5beror genomförbarheten av detta experiment på de etiska begränsningarna i det land där det kommer att utföras. - Bedövning musen efter ditt godkända djurvårdsprotokoll. Bedöma djupet av anestesi genom bristen på svar på svans nypa.
OBS: Om användningen av natriumpentobarbital inte är tillåten av den etiska kommittén för djurförsök, kan alternativa metoder användas, såsom ketaminhydroklorid. - Raka bukhålan med hjälp av en rakkniv och applicera veterinärsalva på ögonen.
- Sätt den sethetiserade musen i en supine position och fixa tassarna på plastplattan med lagning tejp. Skrubba operationsstället med scrubs av 70% alkohol tre gånger.
- Skär upp bukhålan med sax. Skär först huden i sidled (10 mm) strax ovanför membranet. Skär senare muskeln i bukkroppsväggen och bukhinneinflammation (ca. 7 mm) och håll såret öppet med hjälp av rostfritt tråd för att exponera leverytan.
OBS: Det finns ingen anledning att perfuse ytan av levern. - Applicera sondens spets på leverns yta. Justera nålens djup till ca 0,5 mm djup för att optimera joniseringseffektiviteten, kontrollera TIC- och spektralmönstret samtidigt. Ställ in högspänningen på 2,3 kV och frekvensen till 3 Hz på kontrollpanelens skärm.
- Ta bort djuret från plastplattan.
- Sutur såret med hjälp av en kirurgisk tarmsutur och returnera musen till buren. Lämna inte musen utan uppsikt förrän den har återfått medvetandet för att upprätthålla sternal recumbency. Lämna inte musen tillbaka till andra djurs sällskap förrän den har återhämtat sig helt.
- Utför tidskursen för jonintensitet i EIC och proceduren för EIC-skildring en 1.11.1-1-11.4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Som avbildas i figur 3, de uppgifter som erhållits genom PESI-MS teknik är masspektra, vars m / z varierar från 10 till 1.200 i detta system. Medan man kan upptäcka molekyler upp till m /z 2000, det fanns få toppar erhålls med hjälp av denna teknik över massområdet m / z 1.200. Därför analyserade vi toppar från m/z 10 till 1 200. Det fanns iögonfallande grupper av toppar runt m/z 800 och 900; Den förstnämnda representerar cellmembrankomponenter, såsom fosfatidylkolin (PC), och den senare representerar triacyl glycerol (TAG). Figur 4 visar massspektra t.ex. Masspektra erhölls med hjälp av den direkta vävnadsmetoden som förklaras i protokoll 1. Eftersom den tydliga celltypen RCC ackumulerar TAG i cytoplasman är en grupp spektra runt m/z 900 mycket uttalad. Resultatet i figur 4 erhölls genom den extraktionsmetod som infördes i figur 1 för fasta prover.
Eftersom lipidmetabolismen av hepatocellulär carcinom förändringar under sjukdomsprogression20,är det möjligt att övervaka stadierna av sjukdomen genom rutinmässig biopsi i kombination med PESI-MS. Resultatet i figur 5 skildrar skillnaderna i spektralmönster mellan normal levervävnad och HCC. Speciellt finns det flera anmärkningsvärda spektra av TAG i HCC. Om upplösningen av masspektrometern är överlägsen, är det möjligt att den molekylära anteckningen av varje spektrum kommer att möjliggöra klarsyntion av den molekylära mekanismen för cancer, liksom normal cellulär fysiologi.
Realtidsövervakning av läkemedelsmetabolismen kan utföras med hjälp av PESI. I våra experiment övervakades den antionkotiska agenten5-FdU:s farmakodynamik 5-FdU efter att ha injicerats genom svansvenen på en mus. Mycket snabb upptäckt av spektra observerades bara några sekunder efter injektionsmissbruket (figur 6), vilket innebär snabb transport av läkemedlet via blodomloppet till levern. Intensiteten i natriumakdukterna i 5-FdU avtog med en kort defekt av jonsignalen i inspelningen på runt 6-7 s efter att ha startat mätningen. Detta berodde på det varierande djupet av PESI nålen i levern parenkym, vilket var resultatet av kroppen rörelser av den sethetized musen. Därför måste man vara noga med att justera pesinålens djup för realtidsmätning av levande djur. Det finns inget rekommenderat sätt att hitta det optimala djupet av nålen, men det blir uppenbart med övning.
Blodprov från tre individer analyserades av PESI-MS. I detta fall blandades 10 μl serum med 190 μL 50% etanol och användes sedan för PESI-MS-analys. Medan de övergripande spektrala mönster verkar dela flera gemensamma toppar(figur 7), det finns många minuters skillnader i spektra från dessa tre personer. De är ett fingeravtryck av varje person när det gäller metaboliska aktiviteter. För detaljerad information om molekylära identiteter är det nödvändigt att använda en avancerad maskin. Masspektrometern som användes i experimenten gav inte en tillräckligt hög upplösning för att identifiera molekylerna.
Om det finns kontaminering av polymerföreningar ger den ursprungliga spektra i figur 4 upphov till överlagrade periodiska och iögonfallande toppar som suddar ut spektra från det ursprungliga provet(figur 8). För att demonstrera detta experimentellt, tillade vi polypropylen glycerol triol (PPGT) till 2,5% för att återge ett fall av kontaminering. Nästan alla specifika spektra ses i figur 8 var maskerade av tillägg av PPGT.
Bild 1: Schematisk översikt över ett provberedningsflöde. För prover är en specialiserad provpatron idealisk för stabil datainsamling. Flytande provanalys är det enklaste sättet att utföra PESI-MS, genom att helt enkelt placera lösningen i patronen. Det finns två metoder för att tillämpa denna metod på fast vävnad. Den direkta tillämpningen av PESI på vävnaden är mycket enkel och snabb, medan extraktionsmetoden gör det möjligt att uppnå ett mycket stabilare förvärv av spektra beroende på provarterna. I detta förfarande sätts en liten del av vävnadsprovet i ett mikrorör med 100 μl 50% etanol och homogeniseras med en mikropestle. 10 μl av den resulterande homogenatanvänds sedan för masspektrometri. När det gäller att analysera ett levande djur placeras 30 μl av 50% etanol på målorganets serosalayta, följt av mätning. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Bild 2: Översikt och grundläggande komponenter i PESI-MS. En masspektrometer utrustad med en PESI-modul. Joniseringsdelen installeras i en sluten kammare där joninlopp, nålhållare och provhållare placeras. Nålen är färdig, och den engångsnålsnålen i rostfritt stål är fäst på nålhållaren. Den ställs in i masspektrometern strax efter att provpatronen placerats i kammaren. Nålens genomsnittliga krökningsvinkel är 400 nm. Patronen för placering av provet är disponibel och tillverkad av plastpolymerer. Den har en liten brunn för att placera det flytande provet (röd pil). Efter att ha satt det fasta provet i brunnen, är kassetten vikt för att nypa provet och täta brunnen. För en vätskeprovpatron används en annan som inte kräver vikning, och detta är en rekommenderad version som är överlägsen fasta prover. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Bild 3: Grafiskt användargränssnitt (GUI) för PESI-MS. Alla förfaranden för att generera massspektra från det totala jonkromattogrammet (TIC) kan utföras med tillhörande programvara. Efter att ha öppnat LCD-filen i databläddraren kan TIC visas och tidsintervallet kan väljas för att generera massspektra. Den genererade massspektra kan exporteras som textdata som innehåller både vikt-till-charge-förhållande (m/z)och jonintensitet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Human renal cell carcinom visar karakteristiska toppar av neutrala lipider. Det fanns relativt starka toppar i spektra från mänskliga njurmedicinska cell carcinom vävnad (RCC) som inte identifierades i den omgivande icke-cancerogena vävnaden. Dessa toppar representerar huvudsakligen triacylglycerol (TAG) runt mass-till-charge förhållande (m /z) 900. Spektralförvärv utfördes med hjälp av det positiva jonläget genom direkt analys. Hög spänning var inställd på 2,3 kV. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: Exempel på data som förvärvats i normala levervävnader och humanlevercancer (HCC). Den övre panelen skildrar spektra från en mänsklig levervävnad där en neoplastisk lesion inte var närvarande, men från en patient med kronisk hepatit och levercirros. Den nedre panelen visar den genomsnittliga spektra av HCC från samma patient. Vid en blick, medan dessa två har mycket liknande spektrala mönster, det finns många små skillnader i spektralmönster. Abscissa visar förhållandet mellan massa och laddning (m/z)och ordinaten skildrar den relativa intensiteten i varje spektrum. Förvärv av spektra utfördes med hjälp av det positiva jonläget efter att ha extraherat vävnaden, som avbildas i figur 2C. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6: Realtidsmätningar av läkemedelsmetabolismen. Metaboliska förändringar i 5-FdU injiceras intravenöst i svansen fartyget på en mus. Mycket snabb och känslig upptäckt av 5-FdU med natriumakdukt uppnåddes i levern på plats. På grund av instabil jonisering under mätningen kan upphörande av signalen noteras på runt 6-7 s. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 7: Exempel på data från tre individer. Humant serum från tre individer analyserades med PESI-MS. Det fanns tydliga skillnader i spektrala mönster bland individerna. Data erhölls med hjälp av det positiva jonläget. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 8: Polymerföreningar stör exakt datainsamling. På grund av den periodiska uppkomsten av spektrala toppar överlagrade på det ursprungliga exemplaret, blir det svårt att tolka data exakt. I detta fall, spektra som härrör från polypropylen triol glycerol (PPGT) visas som en bullrig overlay. Dessa föreningar, som vanligtvis används för kalibrering, maskera den ursprungliga spektra från levern. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Även pesi är ett derivat av ESI för massa pektrometri4, är det mest fördelaktigt för övervakning realtid metabolomics, samt för att analysera biokemiska reaktioner utan att utföra några komplexa eller tidskrävande förbehandlingar5,14,15,17. Det är en enkel och ögonblicklig masspektrometri teknik som kan tillämpas på det integrerade tillståndet av levande organismer. Eftersom det inte kräver komplexa kaskader av provförbehandlingar finns det en mycket större möjlighet att bedöma hela exemplarets molekylära sammansättning, eftersom vi undviker eventuell förlust av exemplar som kan förekomma i konventionella ESI, vilket kräver komplexa steg av provförbehandlingar med stora mängder organiska lösningsmedel. Därför tillåter PESI oss att få mycket mer information från exemplaret om alla villkor kontrolleras på lämpligt sätt.
Vi måste först nämna några av de tekniska aspekter som krävs för att få goda resultat när vi överväger pesi-ms-analys. Den mest kritiska faktorn i PESI är upprätthållandet av joniseringeffektivitet under analys. För att uppnå detta är det lämpligt att justera och optimera avståndet mellan nålspetsen och provytan, för att generera ett stabilt TIC genom att hänvisa till datorskärmen under analys. För att göra detta är det nödvändigt att ändra nålens djup på ett stegvis sätt för att uppnå maximal TIC. Eftersom joniseringens varaktighet är relativt kort jämfört med ESI är PESI inte idealiskt för reproducerbarhet eller kvantifiering. För det andra, eftersom formen på nålspetsen spelar en mycket viktig roll i jonisering genom att bilda en idealisk Taylor kon som fungerar som jonkälla, måste man se till att inte deformera nålspetsen. Deformation av spetsen kan leda till lägre jonisering effektivitet.
Medan PESI är fördelaktigt eftersom det kan appliceras direkt på färska prover (t.ex. lever, njure och hjärna) och levande organism utan särskild behandling, är det relativt känsligt för andra exogena föroreningar eftersom det kan jonisera nästan alla komponenter i en vätska21,22,23. Det vill sig att nackdelen med fördelen med att hoppa över provförbehandling innebär att PESI-MS missgynnas i flera situationer som ofta uppstått i biologiska experiment. Som förklaras i protokollet avsnitt, PESI är känslig för kontaminering av RNA konserveringsmedel, aldehyder och polymerföreningar såsom cryogels ofta används för histologisk beredning. Blodproppar kan hålla sig till PESI nålen och ofta maskera den avsedda spektra. Dessutom befriar hemolys av rfc-kort hemoglobin, och den separerade ferriska jonen ger upphov till mycket starkare spektra än de som härrör från de avsedda analyterna. Polymerföreningar ger också periodiska spektrala toppar som överlagrar spektra som härrör från de avsedda analyterna, vilket gör det mycket svårare att tolka de verkliga data på grund av bullret (figur 8). För att undvika problem vid förvärv av massspektra är det lämpligt att följa vårt protokoll och med särskild hänsyn till hänvisningar till kontaminationen. I detta avseende är tillämpningen av PESI begränsad i vissa fall.
En annan nackdel med PESI ligger i dess relativt instabila joniseringsprocess, vilket kräver att vi justerar djupet av sondnålen till analyserna. Dessutom kan denna teknik täcka ett mycket begränsat område i en enda analys. På grund av den mycket lilla storleken på nålspetsen som är direkt applicerad på vävnaden, PESI-MS analys är inte lika omfattande som 2D-analys som kan uppnås med en MALDI-TOF MS-baserad bildframställning massa pektrometri eller DESI-baserade imaging7,8. PESI kan dock rekonstruera en bild av hippocampus bildning, även om det tar flera timmar23 eftersom 2D-skanning av ett prov tar lång tid, främst på grund av denna teknik instabila jonisering effektivitet. Med hänsyn till detta är massspektralavbildning av PESI-MS inte ett värdefullt program.
När det gäller DE elektrokemiska egenskaperna hos PESI är volymen och koncentrationen av provet som fäster vid nålspetsen kritisk18, eftersom dämpningseffekten är något försvagad av nedskärningar av elektrospraystorleken. Med tanke på att PESI miniatyrisering av ESI, prover måste helst spädas för att undvika att bilda ett slam på spetsen. Därför är det nödvändigt att tilllägga cirka 30 μl etanol för att uppnå effektiv jonisering när direktvävnadsmetoden används(figur 2B). Detta maximerar joniseringseffektiviteten och uppnår nästan fullständig jonisering av molekylerna som är fästa vid nålspetsen.
Att välja den lämpligaste metoden för databehandling är mycket viktigt när du använder detta system24. När det gäller genomförandet av maskininlärning för alla sjukdomsdiagnos är det nödvändigt att bygga en databas för att fastställa en referens för klassificering eller kategorisering av sjukdomar7. Till exempel har vi använt stöd vektor maskin eller logistisk regression för att göra en diagnos av primära lever maligniteter25.
PESI-MS är en mångsidig och enkel teknik som har stor potential för drogscreening, dopningstester, livsmedelssäkerhetstester av jordbruksprodukter26, och vissa miljötester. Eftersom den här joniseringsenheten är kompatibel med andra spektrometrar genom att förbereda en bilaga för varje specifikt instrument kan PESI tillämpas på olika ändamål.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Motsvarande författare finansierades av Shimadzu, en tillverkare och leverantör av PESI-MS instrument.
Acknowledgments
Vi tackar Ayumi Iizuka för att driva PESI-MS och Kazuko Sawa-nobori för hennes sekreterarhjälp. Vi tackar Bronwen Gardner, Ph.D., från Edanz Group (www.edanzediting.com/ac) för att redigera ett utkast till detta manuskript.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-Fluoro-2'-deoxyuridine (5-FdU) | Sigma-Aldrich | F8791-25MG | 25mg |
| disposable biposy punch (Trepan) | kai Europa GmbH | BP-30F | bore size 3mm |
| ethanol | nacalai tesque | 14710-25 | extra pure reagent |
| LabSolutions | Shimadzu | ver. 5.96, Data analyzer | |
| micropestle | United Scientific Supplies | S13091 | |
| microtube | Treff | 982855 | 0.5 mL clear |
| PESI-MS (Direct Probe Ionization-MS) | Shimadzu | DPiMS-2020 | Mass spectrometer equipped with PESI |
| PPGT solition | Shimadzu | ND | Attached to DPiMS-2020 |
References
- Fenn, J. B., Mann, M., Meng, C. K., Wong, S. F., Whitehouse, C. M. Electrospray ionization for mass spectrometry of large biomolecules. Science. 246, 64-71 (1989).
- Karas, M., Bachman, D., Bahr, U., Hillenkamp, F. Matrix-Assisted Ultraviolet Laser Desorption of Non-Volatile Compounds. International Journal of Mass Spectrometry and Ion Processes. 78, 53-68 (1987).
- Tanaka, K., et al. Protein and polymer analyses up to m/z 100000 by laser ionization time-of flight mass spectrometry. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 2, 151-153 (1988).
- Hiraoka, K., Nishidate, K., Mori, K., Asakawa, D., Suzuki, S. Development of probe electrospray using a solid needle. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 21, 3139-3144 (2007).
- Yoshimura, K., Chen, L. C., Yu, Z., Hiraoka, K., Takeda, S. Real time analysis of living animals by electrospray ionization mass spectrometry. Analytical Biochemistry. 417, 195-201 (2011).
- Balog, J., et al. Intraoperative tissue identification using rapid evaporative ionization mass spectrometry. Science Translational Medicine. 5, 194ra93 (2013).
- Boughton, B. A., Hamilton, B. Spatial metabolite profiling by matrix-assisted laser desorption ionization mass spectrometry imaging. Advances in Experimental Medicine and Biology. 965, 291-321 (2017).
- Shimma, S., Sugiura, Y., Hayasaka, T., Hoshikawa, Y., Noda, T., Setou, M. MALDI-based imaging mass spectrometry revealed abnormal distribution of phospholipids in colon cancer liver metastasis. Journal of Chromatography. B, Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 855, 98-103 (2017).
- Sugiyama, E., Setou, M. Visualization of brain gangliosides using MALDI imaging mass spectrometry. Methods in Molecular Biology. 1804, 223-229 (2018).
- Zhang, J., et al. Nondestructive tissue analysis for ex vivo and in vivo cancer diagnosis using a handheld mass spectrometry system. Science Translational Medicine. 9, 406 (2017).
- Pirro, V., Jarmusch, A. K., Vincenti, M., Cooks, R. G. Direct drug analysis from oral fluid using swab touch spray mass spectrometry. Analytica Chimca Acta. 861, 47-54 (2015).
- Chen, L. C., et al. Characterization of probe electrospray generated from a solid needle. Journal of Physical Chemistry. B. 112, 11164-11170 (2008).
- Mandal, M. K., Chen, L. C., Hiraoka, K. Sequential and exhaustive ionization of analytes with different surface activity by probe electrospray ionization. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 22, 1493-1500 (2011).
- Yoshimura, K., Chen, C. L., Asakawa, D., Hiraoka, K., Takeda, S. Physical properties of the probe electrospray ionization (PESI) needle applied to the biological samples. Journal of Mass Spectrometry. 44, 978-985 (2009).
- Yoshimura, K., et al. Analysis of renal cell carcinoma as a first step for mass spectrometry-based diagnostics. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 23, 1741-1749 (2012).
- Ashizawa, K., et al. Construction of mass spectra database and diagnosis algorithm for head and neck squamous cell carcinoma. Oral Oncology. 75, 111-119 (2017).
- Johno, H., et al. Detection of potential new biomarkers of atherosclerosis by probe electrospray ionization mass spectrometry. Metabolomics. 14, 38 (2018).
- Zaitsu, K., et al. Intact endogenous metabolite analysis of mice liver by probe electrospray ionization/triple quadrupole tandem mass spectrometry and its preliminary application to in vivo real-time analysis. Analytical Chemistry. 88, 3556-3561 (2016).
- Yoshimura, K., et al. Real time diagnosis of chemically induced hepatocellular carcinoma using a novel mass spectrometry-based technique. Analytical Biochemistry. 441, 32-37 (2013).
- Nakagawa, H., et al. Lipid metabolic reprogramming in hepatocellular carcinoma. Cancers. 10, 447-461 (2018).
- Mandal, M. K., Chen, L. C., Hashimoto, Y., Yu, Z., Hiraoka, K. Detection of biomolecules from solutions with high concentration of salts using probe electrospray and nano-electrospray ionization mass spectrometry. Analytical Methods. 2, 1905-1912 (2010).
- Yoshimura, K., Chen, L. C., Johno, H., Nakajima, M., Hiraoka, K., Takeda, S. Development of non-proximate probe electrospray ionization for real-time analysis of living animal. Mass Spectrometry. 3, S0048 (2014).
- Chen, L. C., et al. Ambient imaging mass spectrometry by electrospray ionization using solid needle as sampling probe. Journal of Mass Spectrometry. 44, 1469-1477 (2009).
- Yoshimura, K., Chen, C. L., Asakawa, D., Hiraoka, K., Takeda, S. Physical properties of the probe electrospray ionization (PESI) needle applied to the biological samples. Journal of Mass Spectrometry. 44, 978-985 (2009).
- Takeda, S., Yoshimura, K., Hiraoka, K. Innovations in analytical oncology - Status quo of mass spectrometry-based diagnostics for malignant tumor. Journal of Analytical Oncology. 1, 74-80 (2012).
- Hiraoka, K., et al. Component profiling in agricultural applications using an adjustable acupuncture needle for sheath-flow probe electrospray ionization/mass spectrometry. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 67, 3275-3283 (2019).
