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방법 논문

입양 면역 요법을 위한 키메라 항원 수용체 (CAR) T 세포 제조

13.9K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/59949

⸱

2019년 12월 17일

 , 
1Center for Cellular Immunotherapies, Perelman School of Medicine at the University of Pennsylvania

이 논문에서

요약

우리는 안정적으로 키메라 항원 수용체 (CAR) T 세포를 생성하고 시험관 내 및 생체 내에서 그들의 분화 및 기능을 테스트하는 접근 방식을 설명합니다.

초록

입양 면역 요법은 암과 전염병의 치료에 대한 약속을 보유하고 있습니다. 우리는 키메라 항원 수용체 (CAR)를 가진 1 차적인 인간 T 세포를 변환하고 그들의 자손 ex vivo를 확장하는 간단한 접근을 기술합니다. 우리는 CAR 발현뿐만 아니라 분화, 증식 능력 및 세포 분석 활성을 측정하는 분석방법을 포함한다. 우리는 CAR T 세포에서 이펙터 사이토카인 생산 및 염증성 사이토카인 분비를 측정하는 방법을 설명합니다. 우리의 접근은 입양 면역 요법의 전임상 모형을 위한 CAR T 세포를 배양하기 위하여 믿을 수 있고 포괄적인 방법을 제공합니다.

서론

키메라 항원 수용체 (CA)는 명백한 종양 항원에 대하여 T 세포를 리디렉션하는 유망한 접근을 제공합니다. CAR은 항원 표적을 결합하는 합성 수용체입니다. 정확한 컴포지션은 가변이지만 CA는 일반적으로 3개의 고유한 도메인을 포함합니다. 세포외 도메인은 표적 항원과 결합하는 것을 지시하며 전형적으로 세포외 힌지를 통해 CAR에 연결된 단일 사슬 항체 단편으로 구성된다. 제2 도메인은, 일반적으로 T 세포 수용체(TCR) 복합체의 CD3θ 사슬로부터 유래되고, CAR 결합 후 T 세포 활성화를 촉진한다. 세 번째 costimultory 도메인 T 세포 기능을 향상 시키기 위해 포함, 생착, 물질 대사, 그리고 지 속성. B세포 급성 림프구성 백혈병(ALL), 만성 림프구성 백혈병(CLL) 및 다발성 골수종을 포함한 다양한 조혈 악성종양에서 CAR T 세포 치료의 성공은 이 접근법의 치료 적 약속을강조한다 1,2,3,4,5,6. 최근 식품의약국(FDA)은 2개의 CD19 특이적 CAR T 세포 치료제, 소아 및 젊은 성인을 위한 티사겐클레우셀 및 확산대형 B세포 림프종에 대한 액시카브타진 실롤루셀에 대한 승인을 통해 CAR T 세포 치료의 번역 장점을 강화합니다.

CAR T-기반 접근법은 말초 혈액으로부터 T 세포의 분리, 활성화, 유전자 변형, 및 확장 ex vivo를 포함한다. 분화는 CAR T 세포 효능을 조절하는 중요한 파라미터이다. 이에 따라, 생체 배양 시 T 세포 분화를 제한하면 주입된 생성물이 이식, 팽창 및 지속하는 능력을 향상시키고, 입양 전달2,7,8,9에이어 장기적인 면역감시를 제공한다. T 세포는 순진한 T 세포 (Tn), 중앙 기억 (Tcm), 이펙터 메모리 (Tem), 이펙터 분화 (Tte) 및 줄기 세포 메모리 (Tscm)를 포함하는 몇몇 명백한 부체로 이루어져 있습니다. 이펙터 분화 T 세포는 강력한 세포 용해 능력을 갖는다; 그러나, 그들은 짧은 수명과 제대로생착10,11,12. 대조적으로, 순진한 T 세포 및 Tcm을 포함하는 덜 분화된 표현형을 가진 T 세포는 입양세포 전이13,14,15,16,17, 18에이어 우수한 생착 및 증식능력을 나타낸다. 미리 제조된 제품에서 수집된 T 세포의 조성은 환자에 따라 달라질 수 있으며 CAR T 세포의 치료 전위와 상관관계가 있다. 시작 apheresis 생성물에서 순진한 유사 면역 표현형을 가진 T 세포의 비율은 생착 및 임상 반응 둘 다와 높게 상관관계가 있습니다19.

배양 기간은 입양 전달을 위해 제조된 CAR T 세포에서분화에 영향을 미치는 중요한 파라미터이다. 최근 약어 배양 패러다임20을이용하여 우수한 품질의 CAR T 세포를 생성하는 접근법을 개발하였다. 우리의 접근을 사용하여, 우리는 제한된 문화가 백혈병의 이종이식 모형에 있는 채택적인 전송 다음 우수한 이펙터 기능 및 지속성을 가진 CAR T 세포를 초래한다는 것을 보여주었습니다. 여기서, 우리는 CART19 세포(CD3θ 및 4-1BB 신호 전달 도메인에 부착된 항 CD19 scFv를 발현하도록 설계된 자가 T 세포)를 안정적으로 생성하는 접근법을 제시하고, 입양 전적 전에 CAR T 생체 활성 및 효능에 대한 통찰력을 제공하는 검소에 대한 상세한 설명을 포함한다.

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프로토콜

모든 동물 연구는 펜실베니아 대학의 기관 동물 관리 및 사용 위원회에 의해 승인됩니다.

1. T 세포 활성화, 전이 및 확장

  1. 6웰 세포 배양 요리에서 T 세포당 3개의 비드의 비율로 안티 CD3/CD28 자기 비드(예를 들어, 다이나비드)와 혼합하여 신선하거나 냉동 보존된 1차 인간 T 세포를 활성화합니다. X-VIVO 15 배지에서 배양 T 세포는 5% 정상 인간 AB 혈청, 2 mM L-글루타민, 20 mM HEPES 및 IL2 (100 단위/mL)로 보충하였다. 팽창 하는 동안 106 T 세포/mL의 농도에서 T 세포를 유지 합니다. 배양 T 세포는 37°C, 20%O2,및 95% 습도에서 5%CO2를가진.
  2. 하룻밤 자극 후, 활성화 된 T 세포에 렌티 바이러스 상류제를 추가합니다. 3−5의 감염(MOI)의 복합성을 달성하는 데 필요한 상급체의 부피를 계산합니다.
    참고: CD19-BBθ CAR 렌티바이러스 플라스미드는 CD8 힌지, 4-1BB 코스티뮬레이션 도메인 및 CD3θ 신호도메인(21)으로구성된다. CD19-BBθ 렌티바이러스 상월제는 앞서 설명한 바와 같이 생성되었다(21)
  3. 3 일째에는 동결 보존을위한 세포의 대표적인 별칭을 수집합니다. 냉동 보존에 앞서 부드러운 파이펫팅과 자기 분리로 자기 구슬을 제거하십시오. 0.5% 디메틸 설폭사이드(DMSO)로 인산완충식염수(PBS)를 함유한 동결배지를 준비하고 사용 전까지 4°C에 보관한다.
    1. 원심 분리기 T 세포를 300 x g에서 5 분 동안. 상류를 버리고 PBS 5 mL을 추가하십시오. 원심분리기 세포를 300 x g에서 5분 동안 폐기하고 PBS를 버린다.
    2. 차가운 냉동 보존 매체의 1 mL에서 세포 펠릿을 다시 중단하십시오. 냉각 된 동결 용기에 T 세포를 동결하고 -80 °C에서 48 시간 동안 저장합니다.
  4. 나머지 T 세포를 PBS 5 mL에서 한 번 세척하여 잔류 벡터를 제거합니다. 원심분리기는 300 x g에서 5분 동안 PBS를 decant하고 0.5 x 106 세포/mL의 농도로 T 세포 배양 배지에서 세포 펠릿을 재중단시켰다.
  5. T 세포를 두 개의 배양으로 분할하고, 5일째와 9일째에 지정하였다. 인간 CD4 및 CD8에 대한 계수비드(물자 표)와단일클론 항체뿐만 아니라 생존성 염료(물자표)를이용하여 유동 세포세포를 카운트한다.
    1. T 세포 농도를 측정하기 위해, PBS 500 μL, 계수 비드 5 μL, 7-아미노 액티노마이신 D 세포 생존용 액액 10 μL, CD4-FITC 4 μL 및 CD8-APC 4 μL을 함유하는 마스터 믹스를 준비한다. 마스터 믹스에 T 세포의 40 μL을 추가하고 살아있는 T 세포 / 비드 카운트의 수에 따라 유세포 측정으로 세포 농도를 측정합니다. 격일로 0.5 x 106 세포/mL의 농도로 배양을 유지하기 위해 다시 공급한다.
  6. 5일째에는 1.3단계와 1.5단계에 기재된 바와 같이 5일째 배양양을 세고 냉동보존한다.
  7. 7일째에, PBS에서 0.5 x 106 T 세포를 세척하고 형광 활성화 세포 선별(FACS) 버퍼의 100 μL에서 다시 중단한다. 유세포분석으로 형광-공액항 CAR19 관용형으로 면역염색하여 CAR 표면 단백질 발현을 검출한다.
  8. 9일째에는 1.3단계에서 기재된 바와 같이 9일째 배양및 냉동보존을 계산한다.

2. T 세포 분화의 표현형 평가

  1. 항 CD3-BV605(클론 OKT3), 안티 CD14-퍼시픽 블루(PB) (클론 HCD14), 안티 CD19-PB(클론 HIB19), 안티 CD4-BV510 (클론 OKT4), 안티 CD8-H7APC (클론 SK1), 안티 CCR7-FITC (클론 150503), 안티 CD45RO-PE (클론 UCHL1), 안티 CD27-PE-Cy7 (클론 1A4CD27), 안티 CD95-PerCP-Cy5.5 (클론 DX2), 및 안티 CAR19-APC.
  2. 안티 CD45RO-PE, 안티 CCR7-FITC, 안티 CD27-PE-Cy7 및 반대로 CD95-PerCP-Cy5.5에 대한 개별 형광 마이너스 1 (FMO) 컨트롤을 준비하여 배경에서 긍정적으로 염색된 세포를 구별합니다.
  3. PBS에서 라이브/죽은 재고 시약(재료표)1:10,000을 희석하여 죽은 세포 염색 용액을 준비합니다.
  4. 해동 3일째, 5일째, 및 9일째 T 세포는 이전에 냉동 보존되었다. 원심분리기 1 x 106 T 세포를 300 x g에서 3분 동안 300 g에서. PBS로 세포를 한 번 씻으시다. 300 x g에서 3 분 동안 원심 분리기를 하고 PBS를 폐기하십시오.
  5. 빛으로부터 보호된 실온(RT)에서 15분 동안 죽은 염색 용액과 T 세포를 섞습니다.
  6. FACS 버퍼 1mL를 추가하여 죽은 세포 염색 염료를 담금질합니다. 300 x g에서 3분 동안 원심분리기를 폐기하고, 2.1 및 2.2단계에서 기재된 항체 칵테일을 함유하는 FACS 완충액의 100 μL에서 세포 펠릿을 폐기하고 재중단한다. 4 °C에서 1 시간 동안 배양하십시오.
  7. FACS 버퍼 와 원심 분리기 1 mL을 300 x g에서 3 분 동안 추가하여 언바운드 항체를 씻어 내보소소. FACS 버퍼를 사용하면 세 번 반복합니다.
  8. 세포를 1% 파라포름알데히드(PFA)에 다시 중단하고 4°C에 보관하십시오.
  9. CD45RO 발현은 고정 후 감소함에 따라 면역 염색 후 유세포측정으로 샘플을 분석합니다. 분화를 평가하기 위해, 게이트는 다음과 같은 순서로: 싱글트 (FSC-H 대 FSC-A), 라이브 CD3+ T 셀 (덤프 [라이브 데드 바이올렛, CD14-PB 및 CD19-PB vs CD3-BV605], CD4-BV510 vs CD8-APC-H7). CD4+ 및 CD8+ 서브세트에서, 순진한 T 세포(CD45RO-CCR7+),Tcm(CD45RO+CCR7+),템(CD45RO+CCR7-), 및Tte(CD45RO-CCR7-)를 정의하는 CD45RO-PE 대 CCR7-FITC상의 게이트. Tscm을 확인하기 위해, 순진한 T 세포 집단에서 CD27+ T 세포에 대한 게이트. 이 구획에서 Tscm은 CD95+ 및 Tn은 CD95입니다.

3. 시험관 내 기능 분석

  1. CAR T 세포 증식 및 사이토카인 분비
    1. 유세포측정에 의해 단계 1.5 및 1.7에 기재된 바와 같이 CAR 발현 및 세포 생존가능성을 확인한다.
    2. 각 그룹으로부터 5 x 106 T 세포를 세척(3일째, 5일째 및 9일째)에서 PBS로 세척하고, RT에서 3.5분 동안 PBS에서 카르복시플루오스테신 디아세테이트 수니미딜 에스테르(CFSE)의 1 μM 용액으로 재중단한다.
    3. 즉시 10% 태아 소 혈청 (FBS)을 포함하는 PBS의 10 mL를 추가하여 반응을 담급니다.
    4. 용액을 300 x g에서 3 분 동안 원심 분리하십시오. Coulter카운터(재료 표)를사용하여 CFSE 염색이 끝날 때 세포를 계산합니다.
    5. CFSE 염색 된 세포 (비 자극) 수확, 1 % PFA에서 다시 중단하고 유세포 분석에 의한 분석을 위해 4 °C에서 저장합니다.
    6. 1.1단계에서 설명한 바와 같이, CFSE-염색된 CAR T 세포를 조사된 K562-CD19(표적)뿐만 아니라 K562-야생형(대조군) 세포에 1:1의 비율로 1:1의 비율로 배양하여 1.1단계에 기재된 바와 같이, 사이토카인 자유 배양 배지 및 배양 조건에서 1:1의 비율로 배양한다.
    7. 24 시간 후, 배양 용기를 300 x g에서 5 분 동안 수집합니다. 제조업체의 권고에 따라 Luminex 분석에 의해 IL2, IFNγ, TNFα, GM-CSF 및 기타 염증성 사이토카인(IL1β, IL4, IL5, IL6, IL8 및 IL10)의 활성화 의존적 생산을 평가합니다.
    8. 3.1.7단계에서 수집된 상급물의 부피를 신선한 배지의 동등한 부피(120 μL)로 대체합니다.
    9. 3일째(즉, 96시간 이후)에, 1.5단계에서 이전과 같이 비드 계 유동 세포 측정을 사용하여 0.5 x 106 세포/mL의 농도로 카운트 및 재이송한다.
    10. 5일째에, 라이브CD3+ 셀을 계산하고 0일째에 살아있는 T 세포 수를 기준으로 라이브 T 셀의 배 변화를 계산한다.
    11. FlowJo 소프트웨어를 사용하여 CAR T 셀을 분할하여 연속적인 세포 분열 라운드를 강조하여 CFSE 희석에 대한 포괄적인 분석을 수행합니다.
      참고: 증식 성 어세이스는 FlowJo 설명서에 잘 설명되어 있습니다.
  2. 세포 독성 분석
    참고: CD19를 발현하는 표적 세포를 죽이는 CART19 세포의 능력은 51Cr 방출 분석기를 사용하여 평가된다.
    1. 5 x 105 K562-CD19, K562-야생 형 대조군 세포 또는 NALM6 백혈병 세포를 Na 2 51 CrO4 및 0.5 mL의NA251CrO 4 및 0.5 mL로 혼합하여 표적 세포를 37°C에서 인큐베이터에서 90분 동안 10% FBS로 보충하였다.
    2. 원심분리기 세포는 300 x g에서 2.5분 동안. 방사성 상급체를 적절한 폐기 통에 버리고 PBS의 5 mL에서 대상 세포를 세척한다. 세척 단계를 두 번 반복합니다.
    3. 5% FBS를 함유하는 페놀 적색 배지에서 표적 세포를 재중단한다. 이 미디어를 나머지 절차에 사용하셔서 배경을 줄입니다.
    4. 유세포 분석(섹션 5.1에 설명된 대로)에 의해 CAR 발현 및 세포 생존가능성을 평가한 후, CAR T 세포를 이펙터:target(E:T) 비율로 표지된 표적 세포와 혼합하여 10:1, 3:1 및 1:1, 삼중 96웰 U 바닥 판으로 옮김.
    5. 병렬로, 표적 세포를 단독으로 포함하고, 1% 나트륨 도데실 설페이트(SDS)를 가진 표적 세포를 각각 자발적(S) 및 최대(M) 51Cr 방출을 결정한다.
    6. 원심분리기 세포는 300 x g에서 5분 동안 5%의CO2를가진 37°C 인큐베이터에서 4시간 또는 20시간 동안 배양한다.
    7. 지정된 시간 후, 배양용기를 300 x g에서 5분 동안 원심분리하여 35 μL의 세포 상판을 수집하고 판독기 플레이트로 옮긴다. 거품을 피하십시오. 접시를 하룻밤 동안 건조시키십시오.
    8. 표준 플레이트 씰로 플레이트를 밀봉하고 액체 침전 카운터로 카운트하십시오. 상급에 있는 크롬 풍부는 표적 세포 살해의 프록시를 제공합니다. 다음과 같이 특정 용해의 비율을 계산합니다: 100 x (분당 카운트 [cpm] 실험 릴리스 – cpm S 릴리스)/ (cpm M 릴리스 – cpm S 릴리스).

4. 생체 내 기능 분석

  1. 적응성 면역 계통이 결여된 6-10주 령 NOD-SCID γc/- (NSG) 마우스를 얻고, 무작위로 치료/대조군에 할당합니다.
  2. 0.1 mL 멸균 PBS에 1 x 106 NALM6 세포로 꼬리 정맥을 통해 동물을 정맥주사하십시오.
  3. 5-7 일 후, 생물 발광 이미징 (BLI)에 의한 종양 생착을 확인하십시오. 주입 150 이소플루란으로 마취 된 마우스에 D-luciferin의 mg/kg (볼륨은 체질량에 따라 달라집니다).
  4. 이미징 시스템을 사용하여 생물 발광 값을 측정합니다. 마우스 주위의 동일한 영역의 사각형을 그려 해당 소프트웨어를 사용하여 총 플럭스를 정량화하고 머리에서 꼬리 길이의 50 %까지 도달합니다. 각 이미지의 배경을 개별적으로 뺍니다.
  5. 백혈병을 확립한 후, 3 x 106일 9 CART19 세포, 0.5 x 106일 3 CAR T 세포 또는 꼬리 정맥을 통해 인간 T 세포를 100 μL의 멸균 PBS/Ca2+의부피로 주입한다.
    참고: 배양 과정에서 다양한 간격으로 수확된 세포의 생체활성이 다르기 때문에, 3일째 세포의 선택된 농도는 9일째보다 낮다.
  6. 질병 진행을 결정하기 위해, 4.3 단계에서 전술한 바와 같이 생물 발광 값을 일주일에 두 번 측정한다.
  7. CAR T 세포 생착을 결정하기 위해 EDTA 코팅 튜브에서 레트로 궤도 출혈을 통해 75 μL 혈액을 수집합니다. 50 μL의 혈액을 절대 계수 튜브로 옮김.
  8. RT에서 30 분 동안 CD45, CD4, CD8 및 CAR에 대한 항체로 혈액을 얼룩지게하십시오. 염색 후 유세포 분석으로 표면 마커 발현을 분석합니다.
    참고: 다른 표면 마커는 혈액에서 T 세포의 분화 및 고갈 상태를 평가하는 데 사용될 수 있다.
  9. 혈액에서 사이토 카인 수준을 측정하기 위해, 1,200 x g에서 원심 분리 혈액을 4 °C에서 30 분 동안 혈청을 혈액의 상층에서 분리하십시오.
  10. 세럼을 수집하고 제조업체의 지침에 따라 지정된 판독기 플레이트로 사이토카인을 측정합니다.

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결과

전술한 방법을 사용하여, 우리는 3 일 또는 9 일 동안 T 세포를 자극하고 확장하였다(도 1A,B). 우리는 또한 세포 표면에 표현된 명백한 당단백질의 풍부를 측정하여, 그림 1C에설명된 게이팅 전략에 의해 지시된 바와 같이 그들의 분화 단면도를 분석했습니다. 우리는 생체 배양 동안 시간이 지남에 따라 이펙터 분화를 향한 점진적인 변화를보여준다(도 1D). 우리는 항원반응으로 CAR T 세포의 이펙터 기능 및 증식 능력을 평가했습니다. 우리는 더 적은 (이전에 수확된) 확장된 세포가 더 긴 기간 동안 광범위하게 배양된 세포에 비해 기능적으로 우수했다는 것을 보여준다. 3일째 CART19 세포는 9일째에 비해 동조 리간드를 사용하여 재자극시 증식 및 세포용해 능력을 향상시켰습니다(...

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토론

여기에서 우리는 ex vivo 배양전반에 걸쳐 다양한 간격으로 수확된 CAR T 세포의 기능 및 효능을 측정하는 접근법을 기술한다. 우리의 방법은 시험관내 이펙터 기능뿐만 아니라 증식 능력을 평가하기 위해 고안된 계산에 대한 포괄적인 통찰력을 제공합니다. 우리는 CAR를 통해 자극 다음 CAR T 세포 활동을 측정하는 방법을 설명하고 그들의 로그 방출 단계의 3 대 9 일째에 수확 된 CAR T 세포를 사용하여 백혈병의 세부 이종이식 모델.

생체 내 확장 동안 다른 시점에서 수확된 CAR T 세포의 효능을 비교하는 데는 내재된 과제가 있습니다. 3일 배양 기간 동안 생성된 T 세포의 양이 낮기 때문에, 기능의 포괄적인 평가를 수행하기에 부족한 숫자가 있을 수 있다. 이것은 그의 증식 능력이 외인성 및 본질적인 요인20때문에 수시로 감소되는 참을성 있는 T 세포의 맥락에서 악화됩니다.

얼마...

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공개 사항

저자는 공개 할 것이 없다.

감사의 글

이 작품은 펜실베니아 대학과 연구 동맹을 통해 노바티스 제약에 의해 제공 된 자금을 통해 부분적으로 지원되었다 (마이클 C. 밀론) 뿐만 아니라 세인트 볼드릭의 재단 학자 상 (사바 가세미).

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
안티 CD3/CD28 다이나비드Thermo Fisher40203D
APC 마우스 안티 휴먼 CD8BD Biosciences555369RRID:AB_398595
APC-H7 마우스 안티 휴먼 CD8 항체BD Biosciences560179RRID:AB_1645481
BD FACS 용해 용액 10X 농축BD Biosciences349202
BD Trucount 절대 계수 튜브BD Biosciences340334
Brilliant Violet 510 anti-human CD4 AntibodyBioLegend317444RRID:AB_2561866
Brilliant Violet 605 anti-human CD3 AntibodyBioLegend317322RRID:AB_2561911
CellTrace CFSE 세포 증식 키트Life TechnolohgiesC34554
CountBright 절대 계수 비드,InvitrogenC36950
FITC anti-Human CD197 (CCR7) 항체BD Pharmingen561271RRID:AB_10561679
FITC Mouse Anti-Human CD4BD Biosciences555346RRID:AB_395751
HEPESGibco15630-080
Human AB serumValley BiomedicalHP1022
Human IL-2 IS, 프리미엄 등급Miltenyi130-097-744
L-글루타민Gibco28030-081
액체 섬광 계수기, MicroBeta triluxPerkin Elmer
LIVE/DEAD 고정 가능한 바이올렛분자 프로브L34964
멀티사이저 쿨터 카운터Beckman Coulter
Na251CrO4Perkin ElmerNEZ030S001MC
Pacific 블루 안티 휴먼 CD14 항체BioLegend325616RRID : AB_830689
퍼시픽 블루 안티 휴먼 CD19 항체BioLegend302223
PE 안티 휴먼 CD45RO 항체BD Biosciences555493RRID : AB_395884
PE / Cy5 안티 휴먼 CD95 (Fas) 항체BioLegend305610RRID : AB_493652
PE / Cy7 안티 휴먼 CD27 항체Beckman CoulterA54823
페놀 무함유 매체Gibco10373-017
UltraPure SDS 솔루션, 10%Invitrogen15553027
Via-ProbeBD Biosciences555815
X-VIVO 15Gibco04-418Q
XenoLight D-Luciferin - K+ SaltPerkin Elmer122799

참고문헌

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