Summary
نحن وصف نهج لتوليد موثوق مستقبلات مستضد الشمبانزي (CAR) T الخلايا واختبار تمايزها ووظيفتها في المختبر والجسم الخارجي.
Abstract
العلاج المناعي بالتبني يبشر بمعالجه السرطان والامراض المعدية. نحن وصف نهج بسيط لنقل الخلايا الاساسيه الإنسان T مع مستقبلات مستضد تشيريك (CAR) وتوسيع ذريه السابقين الجسم البشري. ونحن تشمل المقايسات لقياس التعبير سيارة ، فضلا عن التمايز ، والقدرة التكاثري والنشاط لحل. ونحن وصف الاختبارات لقياس إنتاج السايسيسين المستجيب وإفراز خلوية التهابيه في خلايا السيارات T. نهجنا يوفر طريقه موثوقه وشامله للثقافة الخلايا السيارات T للنماذج السريرية للعلاج المناعي بالتبني.
Introduction
مستقبلات مستضد تشيريك (السيارات) توفير نهج واعده لأعاده توجيه الخلايا T ضد مستضدات الأورام متميزة. السيارات هي المستقبلات الاصطناعية التي تربط هدف مستضد. وفي حين ان تكوينها الدقيق متغير ، فان السيارات تحتوي عموما علي 3 مجالات متميزة. المجال خارج الخلية يوجه ملزمه لمستضد الهدف ويتكون عاده من قطعه واحده الجسم المضاد سلسله مرتبطة بالسيارة عن طريق المفصلي خارج الخلية. المجال الثاني ، المستمدة عاده من سلسله CD3ζ من مستقبلات الخلية T (TCR) المعقدة ، ويعزز التنشيط الخلية T بعد مشاركه السيارة. يتم تضمين مجال كوستيمولاتوري الثالث لتعزيز وظيفة الخلية T, التجهيز, الأيض, والمثابرة. نجاح العلاج بالخلايا T السيارة في مختلف الأورام الخبيثة التي تكون الدم بما في ذلك خلايا الدم الليمفاوية الحاده (ALL) ، سرطان الدم اللمفاوي المزمن (cll) والورم النخاعي المتعدد يسلط الضوء علي وعد العلاجية لهذا النهج1،2،3،4،5،6. الاخيره أداره الاغذيه والعقاقير (FDA) الموافقات لاثنين من العلاجات الخلوية CD19 الخاصة بالسيارة t, تيساجنليكلوسيل للأطفال والشباب البالغين ALL و axicabtagene ciloleucel لانتشار الأورام اللمفاوية ب الخلية الكبيرة, يعزز الجدارة الانتقالية من العلاج بالخلايا
وتشمل النهج المستندة إلى T السيارات عزل الخلايا T من الدم المحيطي ، والتنشيط ، والتعديل الجيني ، والتوسع الجسم السابق. التمايز هو معلمه هامه تنظم فعاليه الخلية تي السيارة. وفقا لذلك ، وتقييد التمايز الخلية T خلال الثقافة السابقة فيفو يعزز قدره المنتج غرست لكسب الطعم ، وتوسيع ، وتستمر ، وتوفير المناعة علي المدى الطويل بعد نقل التبني2،7،8،9. تتكون الخلايا t من عده مجموعات فرعيه متميزة بما في ذلك: الخلايا الساذجة T (Tn) ، والذاكرة المركزية (الطب الأساسي) ، والذاكرة المستجيب (تيم) ، والمنحرف متمايزة (Tte) وذاكره الخلايا الجذعية (Tscm). المستجيب المتمايزة الخلايا T لديها قدره لحل قويه. ومع ذلك ، فهي قصيرة الأمد والطعم سيئه10،11،12. وعلي النقيض من ذلك ، t الخلايا مع النمط الظاهري اقل تمايزا بما في ذلك الخلايا الساذجة t والطب العام معرض متفوقة التجهيز والقدرات التكاثري بعد نقل الخلية بالتبني13،14،15،16،17،18. تكوين الخلايا T التي تم جمعها في المنتجات المصنعة مسبقا يمكن ان تختلف عبر المرضي ويرتبط مع الإمكانات العلاجية للخلايا السيارات T. ترتبط نسبه الخلايا التائية ذات الτ الشبيهة بالسذاجة في منتج البدايات الاوليه بالاستجابة السريرية والعلاجية19.
مده الثقافة هي معلمه هامه تؤثر علي التمايز في خلايا السيارات T المعدة لنقل التبني. وضعنا مؤخرا نهجا لتوليد اعلي جوده الخلايا السيارات T باستخدام نموذج الثقافة مختصر20. وباستخدام نهجنا ، أظهرنا ان الثقافة المحدودة تؤدي إلى ظهور خلايا السيارات T مع وظيفة المستجيب المتفوقة والمثابرة بعد نقل التبني في نماذج الكسب غير المزروع من ابيضاض الدم. هنا ، نقدم النهج لتوليد موثوق بها خلايا CART19 (الخلايا الذاتية T هندستها للتعبير عن المضادة لCD19 scFv تعلق علي CD3ζ والمجالات الإشارات 4-1BB) وتشمل وصفا مفصلا لمقايسات التي توفر نظره ثاقبه في النشاط الحيوي للسيارة وفعالية قبل نقل التبني.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تمت الموافقة علي جميع الدراسات الحيوانية من قبل لجنه الرعاية الحيوانية المؤسسية والاستخدام من جامعه بنسلفانيا.
1. T تنشيط الخلية ، والتوصيل ، والتوسع
- تنشيط الخلايا الاساسيه البشرية الاوليه الطازجة أو بالتبريد عن طريق خلط مع الخرز المغناطيسي المضادة CD3/CD28 (علي سبيل المثال ، الأذان) بنسبه 3 حبات لكل خليه T في 6-حسنا الثقافة الخلية الاطباق. الخلايا T الثقافة في X-فيفو 15 المتوسطة تستكمل مع 5 ٪ الإنسان العادي AB المصل ، 2 مم L-الجلوتامين ، 20 مم HEPES ، و IL2 (100 وحده/مل). الحفاظ علي خلايا T في تركيز 106 خلايا t/مل خلال التوسع. الخلايا T الثقافة في 37 درجه مئوية ، 20 ٪ O2، و 95 ٪ الرطوبة مع 5 ٪ CO2.
- بعد التحفيز بين عشيه وضحيها ، أضافه لينتيفيرال ماده طافي لتنشيط الخلايا T. يحسب الحجم من [سوبرننت] ضرورية ان يحقق تعدد التلوث ([موي]) من 3 − 5.
ملاحظه: CD19 bbζ لينتيفيروس البلازميد يتكون من المفصلي CD8, 4-1bb مجال كوستيمولاتوري, و CD3ζ يشير المجال21. CD19-bbζ لينتيفيرال تم إنشاء ماده طافي كما هو موضح سابقا21. - في اليوم 3 ، وجمع الأعذار ممثل من الخلايا للحجز بالتبريد. قبل الحجز بالتبريد ، قم بازاله الخرز المغناطيسي بواسطة التغليف اللطيف والفصل المغناطيسي. اعداد تجميد المتوسطة التي تحتوي علي الفوسفات-مخزنه المالحة (التلفزيونية) مع 0.5 ٪ ثنائي ميثيل سولفوكسيد (DMSO) وتخزينها في 4 درجه مئوية حتى الاستخدام.
- الخلايا الطاردة المركزية T في 300 x g لمده 5 دقائق تجاهل ماده طافي وأضافه 5 مل من تلفزيوني. خلايا الطرد المركزي في 300 x g لمده 5 دقائق وتجاهل تلفزيوني.
- أعاده تعليق بيليه الخلية في 1 مل من المتوسطة الباردة التبريد. تجميد الخلايا T في حاويه تجميد المبردة وتخزين في-80 درجه مئوية ل 48 h. نقل الخلايا المجمدة إلى النيتروجين السائل.
- غسل بقية الخلايا T مره واحده في 5 مل من تلفزيوني للقضاء علي ناقلات المتبقية. جهاز الطرد المركزي في 300 x g لمده 5 دقيقه. DECANT التلفزيونية وأعاده تعليق بيليه الخلية في المتوسطة خليه T الثقافة في تركيز 0.5 x 106 خلايا/مل.
- تقسيم الخلايا T إلى ثقافتين ، المخصصة لليوم 5 واليوم 9. العد الخلايا T عن طريق تدفق الخلوية باستخدام الخرز العد (جدول المواد) والأجسام المضادة الاحاديه إلى الإنسان CD8 ، وكذلك صبغالقدرة علي البقاء (جدول المواد).
- لقياس تركيز الخلية T ، واعداد مزيج رئيسي يحتوي علي 500 μL من تلفزيوني ، 5 μL من الخرز العد ، 10 μL من 7-امينو-اكتيميمايسين د حل الخلية البقاء علي قيد الوجود ، 4 μL من CD8 و 4 μL من الناقلات المدرعة. أضافه 40 μL من الخلايا T إلى المزيج الرئيسي وقياس تركيز الخلية عن طريق تدفق الخلوية علي أساس عدد من الخلايا الحية T/حبه التهم. أعاده تغذيه للحفاظ علي الثقافات بتركيز 0.5 × 106 خلايا/مل كل يوم.
- في اليوم 5 ، والعد والبرد اليوم 5 الثقافات كما هو موضح في الخطوات 1.3 و 1.5.
- في اليوم 7, غسل 0.5 x 106 خلايا T في التلفزيونية وأعاده التعليق في 100 μl من مضان الخلية تنشيط الفرز (facs) المخزن المؤقت. الكشف عن التعبير البروتين سطح السيارة عن طريق المناعة مع فلوريسسينتلي-مترافق المضادة لCAR19 النمط الخلوي التدفق.
- في اليوم 9 ، عد اليوم 9 الثقافات والتبريد كما هو موضح في الخطوة 1.3.
2-تقييم التنميط الظاهري لتمايز الخلايا التائية
- اعداد مزيج رئيسي يحتوي علي الأجسام المضادة قبل معايره لمكافحه CD3-BV605 (استنساخ OKT3) ، المضادة لCD14-المحيط الهادئ الأزرق (PB) (استنساخ HCD14) ، المضادة لCD19-PB (استنساخ HIB19) ، المضادة لل-الBV510 (استنساخ OKT4) ، المضادة لCD8-H7APC (استنساخ SK1 150503) المضادة لCD45RO-PE (استنساخ UCHL1) ، المضادة لCD27-PE-Cy7 (استنساخ 1A4CD27) ، ومكافحه الCD95-PerCP-Cy 5.5 (استنساخ DX2) ، ومكافحه الCAR19-APC.
- اعداد مضان الفردية ناقص واحد (FMO) الضوابط لمكافحه CD45RO-PE ، المضادة لCCR7-FITC ، المضادة لCD27-PE-Cy7 ومكافحه الCD95-PerCP-Cy 5.5 للتمييز بين الخلايا الملونة إيجابيا من الخلفية.
- اعداد حل تلطيخ الخلية الميتة عن طريق تمييع الحية/الميتة كاشف الأسهم (جدول المواد) 1:10000 في الاذاعه التلفزيونية.
- ذوبان اليوم 3 ، اليوم 5 ، واليوم 9 خلايا T التي كانت في السابق بالتبريد. أجهزه الطرد المركزي 1 × 106 خلايا T من كل مجموعه في 300 x g لمده 3 دقائق. تجاهل سوبرناتانت. اغسل الخلايا مره واحده مع تلفزيوني. الطرد المركزي في 300 x g لمده 3 دقائق وتجاهل تلفزيوني.
- مزيج الخلايا التائية مع حل تلطيخ الميت لمده 15 دقيقه في درجه حرارة الغرفة (RT) ، محمية من الضوء.
- أضافه 1 مل من العازلة FACS لإخماد صبغ الخلية الميتة تلطيخ. جهاز الطرد المركزي في 300 x g لمده 3 دقائق ، وتجاهل ماده طافي وأعاده تعليق بيليه الخلية في 100 μl من العازلة facs التي تحتوي علي كوكتيل الأجسام المضادة الموصوفة في الخطوة 2.1 و 2.2. احتضان لمده 1 ساعة في 4 درجه مئوية.
- أضافه 1 مل من العازلة FACS وأجهزه الطرد المركزي في 300 x g ل 3 دقيقه لغسل قباله الأجسام المضادة غير منضم. كرر ثلاث مرات مع المخزن المؤقت FACS.
- أعاده التوقف المرحلي الخلايا في 1 ٪ بارافورمالدهيد (PFA) وتخزين في 4 درجه مئوية.
- كما يقلل التعبير CD45RO بعد التثبيت ، وتحليل العينات من خلال تدفق الخلوي بعد المناعي. لتقييم التمايز ، بوابه بالترتيب التالي: singlets (FSC-H مقابل FSC-A) ، يعيشCD3 + T الخلايا (تفريغ [الحية الميتة البنفسج ، CD14 الرصاص و CD19 الرصاص مقابل CD3 BV605] ، الBV510 vs CD8-APC-H7). فيCD8 + والفرعية ، بوابه علي CD45RO vs CCR7-fitc لتعريف الخلايا الساذجة مثل T (CD45RO-CCR7 +) ، الطب العام الفرعي (CD45RO +CCR7 +) ، تيم (CD45RO +CCR7-) ، و Tte(CD45RO-CCR7-). لتحديد Tscm ، بوابه عليCD27 + t الخلايا في الخلايا الساذجة مثل t السكان. في هذه المقصورة ، Tscm هيCD95 + و TN هي CD95-.
3. التحليل الوظيفي في المختبر
- انتشار الخلايا التائية وإفراز السايسيسين
- تحقق من التعبير السيارة وكذلك سلامه الخلية كما هو موضح في الخطوات 1.5 و 1.7 ، من خلال تدفق الخلوية.
- غسل 5 × 106 خلايا T من كل مجموعه (اليوم 3 ، اليوم 5 واليوم 9) مع تلفزيوني وأعاده التعليق في محلول 1 μM من كاربوكسيفلوريسسين دياسيتات النجاح استر (cfse) في الاذاعه التلفزيونية لمده 3.5 دقيقه في RT.
- فورا أضافه 10 مل من التلفزيونية التي تحتوي علي 10 ٪ الجنين البقري المصل (الدم) لإرواء رد الفعل.
- الطرد المركزي الحل في 300 x g لمده 3 دقائق تجاهل ماده طافي وكرر هذه الخطوة يغسل ثلاث مرات. عد الخلايا في ختام التلطيخ CFSE باستخدام عداد كولتر (جدول المواد).
- حصاد الخلايا الملونة CFSE (غير محفز) ، أعاده التعليق في 1 ٪ PFA وتخزين في 4 درجه مئوية للتحليل عن طريق تدفق الخلوي.
- احتضان العدد المطلوب من خلايا السيارات الملونة CFSE مع المشع K562-CD19 (الهدف) وكذلك K562 البرية نوع (السيطرة) الخلايا بنسبه 1:1 ل 120 h في الثقافة الحرة السايسيسين المتوسطة والظروف الثقافية كما هو موضح في الخطوة 1.1.
- بعد 24 ساعة ، الطرد المركزي السفينة الثقافة في 300 x g لمده 5 دقائق جمع 120 μl من supernatant الخلوية. تقييم إنتاج تعتمد علي التنشيط من IL2 ، IFNγ ، TNFα ، GM-السائل الدماغي الشوكي ، وغيرها من الخلوية التهابيه (IL1β ، IL4 ، IL5 ، IL6 ، IL8 ، و IL10) من قبل تحليلات لومينكس وفقا لتوصيات الشركة المصنعة.
- استبدل حجم السوبر الذي تم جمعه في الخطوة 3.1.7 بحجم مكافئ (120 μL) من الوسط الطازج.
- في اليوم 3 (اي ، بعد 96 h) ، عد وأعاده تغذيه في تركيز 0.5 x 106 خلايا/مل باستخدام حبه المستندة إلى تدفق الخلوية كما كان سابقا في الخطوة 1.5.
- في اليوم 5 ، عد الخلايا الحيةCD3 + وحساب التغيير اضعاف الخلايا t الحية نسبه إلى عدد الخلايا t الحية في اليوم 0.
- اجراء تحليل شامل لتخفيف CFSE في تقسيم خلايا السيارات T باستخدام برنامج FlowJo لتسليط الضوء علي الجولات المتعاقبة من انقسام الخلايا.
ملاحظه: يتم وصفها بشكل جيد اختبارات الانتشار في دليل FlowJo.
- فحص السمية الخلوية
ملاحظه: يتم تقييم قدره الخلايا CART19 لقتل الخلايا المستهدفة التعبير عن CD19 باستخدام 51Cr الإفراج عن الفحص.- تسميه الخلايا المستهدفة عن طريق خلط 5 × 105 K562-CD19 ، خلايا التحكم في النوع K562 البرية ، أو خلايا سرطان الدم NALM6 مع 50 Μl من Na251CRO4 و 0.5 mL من rpmi تستكمل مع 10 ٪ سلاح ل90 دقيقه في حاضنه في 37 درجه مئوية.
- خلايا الطرد المركزي في 300 x g ل 2.5 دقيقه. تجاهل ماده طافي المشعة في سلال التخلص المناسبة وغسل الخلايا المستهدفة في 5 مل من تلفزيوني. كرر خطوات الغسيل مرتين.
- أعاده تعليق الخلايا المستهدفة في وسط الفينول الخالي من اللون الأحمر الذي يحتوي علي 5%. استخدم هذه الوسيلة لبقية الاجراء لتقليل الخلفية.
- بعد تقييم التعبير السيارة والقدرة علي البقاء الخلية عن طريق التدفق الخلوي (كما هو موضح في القسم 5.1) ، مزيج الخلايا السيارات T مع الخلايا المستهدفة المسمية في المستجيب: نسب الهدف (E:T) من 10:1 ، 3:1 و 1:1 ، في ثلاث نسخ. نقل إلى لوحه أسفل U 96.
- بالتوازي ، وتشمل الخلايا المستهدفة وحدها ، والخلايا المستهدفة مع 1 ٪ كبريتات الصوديوم دوديسيل (SDS) ، لتحديد عفويه (S) والحد الأقصى (M) 51Cr الإفراج ، علي التوالي.
- خلايا الطرد المركزي في 300 x g لمده 5 دقائق واحتضان لمده 4 ساعات أو 20 ح في 37 درجه مئوية حاضنه مع 5 ٪ CO2.
- بعد الوقت المحدد ، الطرد المركزي السفينة الثقافة في 300 x g لمده 5 دقائق جمع 35 μl من ماده طافي الخلوية ونقل إلى لوحه القارئ. تجنب فقاعات. دع الصفيحة تجف بين عشيه وضحيها.
- ختم لوحه مع ختم لوحه القياسية والعد مع عداد التلالؤ السائل. وفره الكروم في ماده طافي يوفر وكيلا للقتل الخلية المستهدفة. احسب النسبة المئوية لتحلل المحددة علي النحو التالي: 100 x (عدد الإصدارات التجريبية للدقيقة الواحدة-إصدار S لكل دقيقه)/(إصدار لكل الف ظهور – إصدار النسخة الشهرية).
4. في فيفو التحليل الوظيفي
- الحصول علي الفئران التي تبلغ من العمر 6 −10 أسابيع ، والتي تفتقر إلى نظام المناعة التكيفيه ، وتعيينها لمجموعه العلاج/ التحكم بشكل عشوائي.
- حقن الحيوانية عن طريق الوريد الذيل مع 1 × 106 خلايا NALM6 في 0.1 mL العقيمة تلفزيوني.
- بعد 5 − 7 أيام ، تاكد من الأورام بواسطة التصوير الضوئي الإحيائي (BLI). حقن 150 مغ/كغ من D-luciferin إلى الفئران التي تم تخديرها مع ايزوفلونان (حجم يعتمد علي كتله الجسم).
- قياس قيم التلالؤ البيولوجي باستخدام نظام التصوير. قياس التدفق الإجمالي باستخدام البرامج المناظرة عن طريق رسم مستطيلات من منطقه مماثله حول الفئران ، والوصول من الراس إلى 50 ٪ من طول الذيل. اطرح الخلفية لكل صوره علي حده.
- بعد إنشاء ابيضاض الدم ، حقن 3 × 106 يوم 9 CART19 الخلايا ، 0.5 x 106 يوم 3 سيارة تي الخلايا ، أو المقابلة غير محوله (ntd) الإنسان الخلايا t عبر الوريد الذيل في حجم 100 μl من العقيمة تلفزيوني/Ca2 +.
ملاحظه: وبما ان النشاط الحيوي للخلايا التي يتم حصادها علي فترات مختلفه اثناء عمليه الاستزراع مختلف ، فان التركيز المختار للخلايا اليومية الثالثة اقل من اليوم التاسع. - لتحديد تطور المرض ، قياس القيم البيولوجية مرتين في الأسبوع كما هو موضح أعلاه في الخطوة 4.3.
- لتحديد الخلية السيارة T الطلاء ، وجمع 75 μL الدم عن طريق النزيف المداري الرجعية في أنبوب المغلفة أدتا. نقل 50 μL من الدم إلى أنابيب العد المطلق.
- وصمه عار الدم مع الأجسام المضادة ضد CD45 ، CD8 و CAR لمده 30 دقيقه في RT. أضافه 400 μL من 1x FACS ليسينج حل للأنابيب ودوامه جيدا. بعد تلطيخ ، وتحليل التعبير علامة السطح عن طريق تدفق الخلوي.
ملاحظه: ويمكن استخدام علامات السطح الأخرى لتقييم حاله التمايز والإرهاق للخلايا التائية في الدم. - لقياس مستويات السايتوكينات في الدم ، والدم الطارد المركزي في 1,200 x g لمده 30 دقيقه في 4 درجه مئوية لفصل المصل من الطبقة العليا من الدم.
- جمع المصل وقياس السايتوكينات مع لوحه القارئ المعين وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
باستخدام الطرق الموصوفة أعلاه ، قمنا بتحفيز وتوسيع خلايا T لمده 3 أو 9 أيام (الشكل 1ا ، ب). وحللنا أيضا ملامح التمايز الخاصة بهم ، علي النحو المبين في استراتيجية النابض المبينة في الشكل 1جيم، عن طريق قياس وفره البروتينات السكرية المميزة التي أعرب عنها علي سطح الخلية. ونحن نظهر تحولا تدريجيا نحو التمايز المنحرف مع مرور الوقت خلال الثقافة المجرية السابقة (الشكل 1د). قمنا بتقييم وظيفة المستجيب والقدرة التكاثرية لخليه السيارة T استجابه لمستضد. وتبين لنا ان الخلايا التي تم توسيعها اقل (تحصد في وقت سابق) كانت متفوقة وظيفيا مقارنه بالخلايا المزروعة علي نطاق واسع علي مدي فتره أطول. وقد عززت اليوم 3 CART19 الخلايا القدرة علي التكاثر ولحل علي أعاده التحفيز مع يجند الخاصة بهم بالنسبة إلى اليوم 9 (الشكل 2ا ، ب).
في نموذج moue الإنسان الطعم الغريب للجميع ، قارننا قوه الخلايا T السيارات التي تحصد في 3 أيام مقابل 9 أيام (الشكل 3ا). أظهرنا جرعه تعتمد علي استجابه الكريات البيضاء للخلايا CART19 المتولدة لمده 9 أيام مع استجابه كامله لجرعه عاليه من 3 × 106 وفقدان فعاليه للجرعة المنخفضة من 0.5 x 106. اليوم 3 CART19 وأظهرت الخلايا المستمرة السيطرة علي الورم في جرعات عاليه ومنخفضه من خلايا CART19 (الشكل 3ب). ارتبطت هذا استجابه كان مع الحساب مطلقه من CART19 في الدم طرفيه فيران (شكل 3[ك]) اي كان حللت يؤسس علي البروتوكول يوصف أعلاه. هذه النتائج التي تم الحصول عليها من تقييمنا الشامل لوظيفة السيارة T توفر دليلا علي ان تلك الخلايا السيارات T حصادها في وقت سابق (اليوم 3) تتفوق الخلايا السيارات T تحصد في اليوم 9.
الشكل 1: الانتشار التمثيلي والتمايز الشخصي لخلايا السيارات T. (ا) توسيع خليه CART19 بعد التحفيز مع الخرز المغناطيسي المضادة لCD3/CD28. (B) تم تقييم حجم الخلية بواسطة تحليل كولتر في جميع انحاء الثقافة. (ج) استراتيجية تمثيليه لتحليل التنميط الظاهري للخلايا التائية. (د) التحليل الزمني لتمايز الخلايا التائية. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: اليوم 3 CART19 الخلايا عرض وظيفة المستجيب معززه والانتشار نسبه إلى الخلايا اليوم 9. (ا) تم حصاد الخلايا CART19 في اليومين 3 و 9 وشاركت في الاستزراع بنسبه E:T المشار اليها مع الخلايا الK562ه الCD19ه (K562-19) أو الK562 البرية (النوع الK562 البري). تم قياس السمية الخلوية المحددة بواسطة 51Cr الإفراج بعد 4 ح. (ب) كانت خلايا CART19 المسمية csfe مشتركه في الاستزراع مع K562 ، K562-البرية من نوع ، أو متوسطه فقط ل 120 h في نسبه 1:1 e:t. تم حصاد الخلايا في النقاط الزمنيه المشار اليها. تم تقييم الحسابات المطلقة من خلال قياس التدفق الخلوي. يتم عرض التغييرات النسبية اضعاف من عدد الخلايا الحية T تطبيع إلى عدد الخلايا T في اليوم 0. يتم رسم البيانات علي انها تعني ± الانحراف المعياري (SD). P < 0.001 مقارنه اليوم 3 مقابل اليوم 9. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: اليوم 3 CART19 خلايا أكثر فعاليه في الجسم المجري من اليوم 9 خلايا. (ا) التخطيط لنموذج الكسب غير المزروع والعلاج بالخلايا CART19. اليوم 3 و 9 CART19 خلايا أو السيطرة علي خلايا T (UTD) كانت IV-حقن في الفئران 5 − 7 أيام بعد حقن NALM6. (ب) القياس الكمي لعبء الورم عن طريق التصوير بالتلالؤ الإحيائي في اليوم 38 في الفئران المعالجة بالخلايا CART19 التي تحصد في اليوم 3 واليوم 9. تمثل الرموز ماوس واحد لكل منهما. خط اسود أفقي: يعني من كل مجموعه. (ج) تم قياس الدم المحيطي المطلقCD45 + T الخلايا كل أسبوعين بعد CART19 حقن الخلية وفي نهاية التجربة من خلال طريقه العد المناسب (مثل Trucount) Unpaired مان-ويتني اختبار ، وقد استخدمت اثنين من الذيل. * * P < 0.01, * * * P < 0.001, * * * * P < 0.0001. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
هنا ونحن وصف النهج لقياس وظيفة وفعالية الخلايا السيارات T تحصد علي فترات متفاوتة في جميع انحاء الثقافة المجرية السابقة. توفر أساليبنا رؤية شامله في الاختبارات المصممة لتقييم القدرة التكاثرية وكذلك وظيفة المستجيب في المختبر. ونحن وصف كيفيه قياس النشاط الخلية T السيارات بعد التحفيز من خلال السيارة ونماذج التفاصيل الطعم من ابيضاض الدم باستخدام خلايا السيارات T تحصد في اليوم 3 مقابل اليوم 9 من مرحله التوسع اللوغاريتمي.
هناك تحديات متاصله في مقارنه فعاليه الخلايا السيارات T حصادها في نقاط زمنيه مختلفه خلال التوسع الجسم الطبيعي السابق. وبما ان كميه الخلايا التائية المتولدة خلال فتره الثقافة التي تدوم 3 أيام منخفضه ، فقد لا تكون هناك اعداد كافيه لاجراء تقييم شامل للوظيفة. ويتفاقم هذا في سياق خلايا T المريض التي غالبا ما تضاءلت قدرتها التكاثري بسبب العوامل الخارجة والجوهرية20.
كم عدد الخلايا T ينبغي غرسها نظرا لان اليوم 3 الخلايا معرض تعزيز الأيض والقدرة علي التكاثر مقارنه مع نظرائهم اليوم 9 التي يتم الخروج من المرحلة التكاثرية اللوغاريتمية? وقدرنا ما أرقام اليوم 3 الخلايا السيارات T سوف تصل إلى 3 × 106 إذا تم توسيعها لمده 6 أيام أخرى في الثقافة. استخدمنا هذا التقدير لإبلاغ عدد الأيام 3 يجب ان تكون غرست الخلايا تي السيارات (0.5 x 106) لمقارنه اي ما يعادل إلى اليوم 9. ووفقا لذلك ، نطبق نهج "اختبار الإجهاد" لمقارنه النشاط الحيوي ، والفعالية ، والثبات لخلايا السيارات T المشبعة. تقليل عدد خلايا السيارات T المشبعة من 3 x 106 إلى 0.5 x 106 يكشف عن الاختلافات التي من شانها ان تكون مقنعه والا بتشبع الأرقام. ويعتمد التحكم الألى في الأورام علي تراكم الخلايا المستجيبة الكافية لتحديد الخلايا المستهدفة المناظرة لها. في اعداد عاليه من التسريب ، كل يوم 3 واليوم 9 الخلايا T السيارات تظهر الكفاءة الوظيفية.
تحدي آخر في العمل مع اليوم 3 الخلايا السيارات T هو تعلقها الثابت علي سطح تنشيطية. ويتطلب تهجيرهم من الخرز المغناطيسي التنضيد المتكرر للفصل بينهم ميكانيكيا وتعزيز تعافيهم من الثقافة. في المقابل ، اليوم 9 الخلايا لديها 1) فصل بالفعل من الخرز ، و 2) المخفف الخرز إلى حد انها يمكن ان تحصد بسهوله نسبيه.
متغير هام آخر في عمليه تصنيع الخلايا T الخلية هو اختيار ثقافة الخلية المتوسطة. ويشيع استخدام المتوسط القائم علي المؤشرات التي تم استكمالها مع الشركة لأغراض تجريبية. في المقابل, اما X-فيفو 15 أو OpTmizer, تستكمل مع المصل البشري ويفضل في التطبيقات السريرية. في حين ان هذه هي اقل تميزا ، فانها قد تحتوي علي مكونات تسهل توسيع خليه T في فتره زمنيه أقصر. وتاثيرها علي التمايز غير معروف. بالاضافه إلى ذلك ، فان أضافه السايتوكينات تؤثر علي النمو والبقاء والنمط الظاهري. في حين ان آيل-2 محركات الانتشار السريع والتمايز في الخلايا المستجيبة, آيل-7 و آيل-15, التي تنشا في العقدة الليمفاوية والأدوار المعروفة في ثبات الساكنة, يحسن التوسع في الخلايا T وتعزيز جذع الذاكرة/النمط الظاهري الذاكرة المركزية22,23,24,25.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وليس لدي المؤلفين ما يفصحون عنه.
Acknowledgments
وقد تم دعم هذا العمل جزئيا من خلال التمويل الذي قدمته شركه نوفارتس للادويه من خلال تحالف بحثي مع جامعه بنسلفانيا (مايكل c. Milone) ، فضلا عن جائزه العالم لمؤسسه سانت بالدريك (سابا غاسيمي).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti CD3/CD28 dynabeads | Thermo Fisher | 40203D | |
| APC Mouse Anti-Human CD8 | BD Biosciences | 555369 | RRID:AB_398595 |
| APC-H7 Mouse anti-Human CD8 Antibody | BD Biosciences | 560179 | RRID:AB_1645481 |
| BD FACS Lysing Solution 10X Concentrate | BD Biosciences | 349202 | |
| BD Trucount Absolute Counting Tubes | BD Biosciences | 340334 | |
| Brilliant Violet 510 anti-human CD4 Antibody | BioLegend | 317444 | RRID:AB_2561866 |
| Brilliant Violet 605 anti-human CD3 Antibody | BioLegend | 317322 | RRID:AB_2561911 |
| CellTrace CFSE Cell Proliferation Kit | Life Technolohgies | C34554 | |
| CountBright Absolute Counting Beads, | Invitrogen | C36950 | |
| FITC anti-Human CD197 (CCR7) Antibody | BD Pharmingen | 561271 | RRID:AB_10561679 |
| FITC Mouse Anti-Human CD4 | BD Biosciences | 555346 | RRID:AB_395751 |
| HEPES | Gibco | 15630-080 | |
| Human AB serum | Valley Biomedical | HP1022 | |
| Human IL-2 IS, premium grade | Miltenyi | 130-097-744 | |
| L-glutamine | Gibco | 28030-081 | |
| Liquid scintillation counter, MicroBeta trilux | Perkin Elmer | ||
| LIVE/DEAD Fixable Violet | Molecular Probes | L34964 | |
| Multisizer Coulter Counter | Beckman Coulter | ||
| Na251CrO4 | Perkin Elmer | NEZ030S001MC | |
| Pacific Blue anti-human CD14 Antibody | BioLegend | 325616 | RRID:AB_830689 |
| Pacific Blue anti-human CD19 Antibody | BioLegend | 302223 | |
| PE anti-human CD45RO Antibody | BD Biosciences | 555493 | RRID:AB_395884 |
| PE/Cy5 anti-human CD95 (Fas) Antibody | BioLegend | 305610 | RRID:AB_493652 |
| PE/Cy7 anti-human CD27 Antibody | Beckman Coulter | A54823 | |
| Phenol red-free medium | Gibco | 10373-017 | |
| UltraPure SDS Solution, 10% | Invitrogen | 15553027 | |
| Via-Probe | BD Biosciences | 555815 | |
| X-VIVO 15 | Gibco | 04-418Q | |
| XenoLight D-Luciferin - K+ Salt | Perkin Elmer | 122799 |
References
- Brentjens, R. J., et al. CD19-targeted T cells rapidly induce molecular remissions in adults with chemotherapy-refractory acute lymphoblastic leukemia. Science Translational Medicine. 5 (177), 177ra138 (2013).
- Grupp, S. A., et al. Chimeric antigen receptor-modified T cells for acute lymphoid leukemia. The New England Journal of Medicine. 368 (16), 1509-1518 (2013).
- Kalos, M., et al. T Cells with Chimeric Antigen Receptors Have Potent Antitumor Effects and Can Establish Memory in Patients with Advanced Leukemia. Science Translational Medicine. 3 (95), 95ra73 (2011).
- Kochenderfer, J. N., Rosenberg, S. A. Treating B-cell cancer with T cells expressing anti-CD19 chimeric antigen receptors. Nature Reviews. Clinical Oncology. 10 (5), 267-276 (2013).
- Maude, S. L., et al. Chimeric antigen receptor T cells for sustained remissions in leukemia. The New England Journal of Medicine. 371 (16), 1507-1517 (2014).
- Porter, D. L., Levine, B. L., Kalos, M., Bagg, A., June, C. H. Chimeric antigen receptor-modified T cells in chronic lymphoid leukemia. The New England Journal of Medicine. 365 (8), 725-733 (2011).
- Porter, D. L., et al. Chimeric antigen receptor T cells persist and induce sustained remissions in relapsed refractory chronic lymphocytic leukemia. Science Translational Medicine. 7 (303), 303ra139 (2015).
- Maude, S. L., Teachey, D. T., Porter, D. L., Grupp, S. A. CD19-targeted chimeric antigen receptor T-cell therapy for acute lymphoblastic leukemia. Blood. 125 (26), 4017-4023 (2015).
- Kochenderfer, J. N., et al. Lymphoma Remissions Caused by Anti-CD19 Chimeric Antigen Receptor T Cells Are Associated With High Serum Interleukin-15 Levels. Journal of Clinical Oncology. 35 (16), 1803-1813 (2017).
- Bollard, C. M., Rooney, C. M., Heslop, H. E. T-cell therapy in the treatment of post-transplant lymphoproliferative disease. Nature Reviews. Clinical Oncology. 9 (9), 510-519 (2012).
- Brestrich, G., et al. Adoptive T-cell therapy of a lung transplanted patient with severe CMV disease and resistance to antiviral therapy. American Journal of Transplantation. 9 (7), 1679-1684 (2009).
- Savoldo, B., et al. Treatment of solid organ transplant recipients with autologous Epstein Barr virus-specific cytotoxic T lymphocytes (CTLs). Blood. 108 (9), 2942-2949 (2006).
- Berger, C., et al. Adoptive transfer of effector CD8+ T cells derived from central memory cells establishes persistent T cell memory in primates. The Journal of Clinical Investigation. 118 (1), 294-305 (2008).
- Gattinoni, L., et al. A human memory T cell subset with stem cell-like properties. Nature Methods. 17 (10), 1290-1297 (2011).
- Hinrichs, C. S., et al. Adoptively transferred effector cells derived from naive rather than central memory CD8+ T cells mediate superior antitumor immunity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (41), 17469-17474 (2009).
- Klebanoff, C. A., et al. Central memory self/tumor-reactive CD8+ T cells confer superior antitumor immunity compared with effector memory T cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (27), 9571-9576 (2005).
- Wang, X., et al. Engraftment of human central memory-derived effector CD8+ T cells in immunodeficient mice. Blood. 117 (6), 1888-1898 (2011).
- Wang, X., et al. Comparison of naive and central memory derived CD8+ effector cell engraftment fitness and function following adoptive transfer. Oncoimmunology. 5 (1), e1072671 (2016).
- Fraietta, J., et al. Determinants of response and resistance to CD19 chimeric antigen receptor (CAR) T cell therapy of chronic lymphocytic leukemia. Nature Medicine. 24 (5), 563-571 (2018).
- Ghassemi, S., et al. Reducing Ex Vivo Culture Improves the Antileukemic Activity of Chimeric Antigen Receptor (CAR) T Cells. Cancer Immunology Research. 6 (9), 1100-1109 (2018).
- Milone, M. C., et al. Chimeric receptors containing CD137 signal transduction domains mediate enhanced survival of T cells and increased antileukemic efficacy in vivo. Molecular therapy : the journal of the American Society of Gene Therapy. 17 (8), 1453-1464 (2009).
- Cieri, N., et al. IL-7 and IL-15 instruct the generation of human memory stem T cells from naive precursors. Blood. 121 (4), 573-584 (2013).
- Cui, G., et al. IL-7-Induced Glycerol Transport and TAG Synthesis Promotes Memory CD8 T Cell Longevity. Cell. 161 (4), 750-761 (2015).
- Xu, Y., et al. Closely related T-memory stem cells correlate with in vivo expansion of CAR.CD19-T cells and are preserved by IL-7 and IL-15. Blood. 123 (24), 3750-3759 (2014).
- Singh, N., Perazzelli, J., Grupp, S. A., Barrett, D. M. Early memory phenotypes drive T cell proliferation in patients with pediatric malignancies. Science Translational Medicine. 8 (320), 320ra323 (2016).
