Summary
Dieses Protokoll beschreibt einen Test für die Charakterisierung der Lipidtröpfchenbildung (LD) bei menschlichen Darmorganoiden bei Stimulation mit Fettsäuren. Wir diskutieren, wie dieser Assay für die Quantifizierung der LD-Bildung verwendet wird, und wie er für ein Hochdurchsatz-Screening für Medikamente verwendet werden kann, die die LD-Bildung beeinflussen.
Abstract
Diätetische Lipide werden vom Darmepithel als freie Fettsäuren (FAs) aufgenommen. Diese FAs werden intrazellulär in Triglyceridmoleküle (TG) umgewandelt, bevor sie in Chylomikron für den Transport zur Lymphe oder in zytosolische Lipidtröpfchen (LDs) zur intrazellulären Lagerung verpackt werden. Ein entscheidender Schritt für die Bildung von LDs ist die katalytische Aktivität von Diacylglycerol-Acyltransferasen (DGAT) im letzten Schritt der TG-Synthese. LDs sind wichtig, um toxische Lipidarten zu puffern und den Zellstoffwechsel in verschiedenen Zelltypen zu regulieren. Da das menschliche Darmepithel regelmäßig mit hohen Lipidkonzentrationen konfrontiert wird, ist die LD-Bildung von großer Bedeutung, um die Homöostase zu regulieren. Hier beschreiben wir einen einfachen Test zur Charakterisierung und Quantifizierung der LD-Bildung (LDF) bei Stimulation mit der häufigsten ungesättigten Fettsäure, Ölsäure, bei menschlichen Darmorganoiden. Der LDF-Test basiert auf dem LD-spezifischen Fluoreszenzfarbstoff LD540, der die Quantifizierung von LDs durch konfokale Mikroskopie, Fluoreszenzplattenleser oder Durchflusszytometrie ermöglicht. Der LDF-Assay kann verwendet werden, um die LD-Bildung in menschlichen Darmepithelzellen zu charakterisieren oder menschliche (genetische) Störungen zu untersuchen, die den LD-Stoffwechsel beeinflussen, wie DGAT1-Mangel. Darüber hinaus kann dieser Assay auch in einer Hochdurchsatz-Pipeline verwendet werden, um neuartige therapeutische Verbindungen zu testen, die Defekte in der LD-Bildung bei Darm- oder anderen Organoiden wiederherstellen.
Introduction
Lipide sind ein entscheidender Bestandteil der menschlichen Ernährung und spielen eine wichtige Rolle bei der systemischen Energiespeicherung und dem Stoffwechsel. Bei der Aufnahme werden diätetische Lipide durch Bauchspeicheldrüsenlipasen zu freien Fettsäuren (FFAs) und Monoglyceriden (MGs) abgebaut. Diese Substrate werden dann von den Enterozyten des Darmepithels aufgenommen, wo sie zunächst durch Monoglycerid-Acyltransferasen (MGAT)-Enzyme zu Diglyceriden (DG) und anschließend zu Triglyceriden (TG) durch Diacylglycerin reesterifiziert werden. Acyltransferase 1 (DGAT1)1. Schließlich sind diese TGs entweder in Chylomicrons für den Export in das Lymphsystem oder in zytosolische Lipidtröpfchen (LDs) für die intrazelluläre Lagerung2,3integriert. Obwohl Chylomicronen benötigt werden, um diätetische Lipide auf andere Organe zu verteilen, ist die Bedeutung der intrazellulären Fettspeicherung in LDs nicht ganz klar. Jedoch, LDs haben gezeigt, dass eine regulatorische Funktion im Darm zu erfüllen, wie sie langsam Lipide in den Kreislauf bis zu 16 h nach einer Mahlzeit4freisetzen. Darüber hinaus haben lDs gezeigt, dass sie vor toxischen Fettsäurekonzentrationen schützen, wie z. B. bei Mausadipozyten unter lipolytischen Bedingungen5.
Das DGAT1-Protein befindet sich auf der endoplasmatischen Retikulummembran (ER) und spielt eine entscheidende Rolle bei der LD-Bildung im Darmepithel. Homozygote Mutationen in DGAT1 führen zu früh auftretendem schweren Durchfall und/oder Erbrechen, Hypoalbuminämie und/oder (tödlicher) Proteinverlust-Enteropathie mit Darmversagen bei Fettaufnahme, was die Bedeutung von DGAT1 bei der Lipidhomöostase des Menschen Darmepithel6,7,8,9,10. Da das Auftreten von DGAT1-Mangel beim Menschen selten ist, ist der Zugang zu primären, vom Patienten abgeleiteten Zellen nur knapp. Darüber hinaus ist die Langzeitkultur der Darmepithelzellen seit langem auf tumorabgeleitete Zelllinien beschränkt, die die normale Physiologie nur bedingt darstellen. Daher wurde die DGAT1-vermittelte LD-Bildung meist in Fibroblasten oder tierischen Zelllinien7,10,11,12untersucht. Als solche wurde kürzlich gezeigt, dass DGAT1-defizienten Patienten-abgeleiteten Fibroblasten weniger LDs ansammeln als gesunde Kontrollzellen nach Stimulation mit Ölsäure (OA)8.
Zuvor wurden Protokolle zur Kultur epitheliale Stammzellen aus jedem Magen-Darm-Organ in Form von dreidimensionalen (3D) Organoiden13etabliert. Diese Darmorganoide können über einen längeren Zeitraum13in kulturerhalten und ermöglichen die funktionelle Untersuchung patienten- und darmortspezifischer Epithelmerkmale14. Sie sind genetisch und phänotypisch stabil und können gelagert werden, was eine langfristige Expansion und Biobanking13ermöglicht.
Wir haben vor kurzem gezeigt, dass LD-Bildung leicht in menschlichen Darmorganoiden in einem LD-Formationstest (LDF) Assay6gemessen werden kann. Wenn sie OA für 16 h ausgesetzt sind, erzeugen Organoide LDs, um die Zellen vor lipidinduzierter Toxizität zu schützen. Wenn die OA-Konzentrationen zu hoch sind, sterben die Zellen durch Caspase-vermittelte Apoptose6ab. Der LDF-Test war zuvor weitgehend von DGAT1 abhängig, wie durch Organoide von DGAT1-mutierten Patienten und durch die Verwendung von DGAT1-spezifischen Inhibitoren6angezeigt wurde.
Für den hier ausführlich beschriebenen LDF-Assay werden 3D-Organoide aus Darmbiopsien kultiviert und wöchentlich durch Unterbrechung in einzelne Zellen geleitet, die leicht neue Organoide bilden. Für den LDF-Assay werden in jedem Brunnen einer 24-Well-Platte 7.500 organoidabgeleitete Einzelzellen plattiert. Organoide werden über mehrere Tage gebildet, über Nacht mit 1 mM OA inkubiert und mit LD540, einem fluoreszierenden zelldurchlässigen LD-spezifischen Farbstoff, der die Bildgebung erleichtert, gebeizt. Die LD-Bildung wird dann durch konfokale Mikroskopie, Fluoreszenzplattenleser oder Durchflusszytometrie quantifiziert.
Durch die Skalierung dieses LD-Formationstests auf ein 96-Well-Format kann der Assay auch für die Hochdurchsatzanalyse der LD-Bildung verwendet werden, um neuartige Medikamente zu untersuchen, die die LD-Bildung in menschlichen Darmorganoidkulturen beeinflussen, oder um (menschliche genetische) Störungen zu untersuchen, die LD-Stoffwechsel.
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Protocol
Alle Hierbeschriebenen mit menschlichen Geweben wurden von der Ethikkommission des Universitätsklinikums Utrecht (UMCU) genehmigt. Die informierte Zustimmung zur Gewebeentnahme, -erzeugung, -speicherung und -verwendung der Organoide wurde von Patienten der Wilhelmina-Kinderklinik (WKZ)-UMCU eingeholt.
1. Vorbereitung von Kulturmedien
HINWEIS: Dieses Protokoll sollte in einem Biosicherheitsschrank durchgeführt werden. Die Organoide sollten nach Standard-Zellkulturrichtlinien behandelt werden.
- Bereiten Sie Basalkultur Medium.
HINWEIS: Kulturmedium ohne Wachstumsfaktoren wird als Basalmedium (BM) bezeichnet.- Fügen Sie 5 ml HEPES (1 M), 5 ml L L-Glutamin (100x) und 5 ml Penicillin-Streptomycin (5.000 U/ml) zu 500 ml des modifizierten Dulbecco-modifizierten Eagle-Mediums mit Hams Nährstoffmischung F-12 hinzu, um BM-Medium vorzubereiten.
- Das vorbereitete BM-Medium bei 4 °C aufbewahren und maximal 2 Monate verwenden.
- Bereiten Sie R-Spondin und Noggin konditioniertes Medium (CM) nach dem Herstellerprotokoll vor.
- Kurz gesagt, wachsen die Zellen auf die gewünschte Menge in Hyperflasken mit 5 x 107 Zellen in 555 ml Medium ohne selektives Antibiotikum pro Kolben.
- Wachsen Sie die Zellen für 4 Tage, bis sie konfluent sind.
- Ersetzen Sie das Medium durch BM und Kultur für 8 weitere Tage.
- Nach 8 Tagen Kultur bei 37 °C das Kulturmedium und die Zentrifuge für 5 min bei 450 x g sammeln, um die verbleibenden Zellen zu pellet.
- Filter sterilisieren Sie den Überstand und lagern Sie Aliquots des R-Spondin oder Noggin CM bei -20 °C für maximal 6 Monate.
- Bereiten Sie Wnt3A-CM nach Boj et al.15vor.
- Kurz gesagt, wachsen die Zellen auf die gewünschte Menge in 145 mm Schalen mit 2 x 106 Zellen in 20 ml Medium ohne selektives Antibiotikum pro Schale. Wickeln Sie jede Schale mit Plastikfolie, um eine Verdunstung des Kulturmediums zu vermeiden.
- Nach 8 Tagen Kultur bei 37 °C das Kulturmedium und die Zentrifuge für 5 min bei 450 x g sammeln, um die verbleibenden Zellen zu pellet.
- Filter sterilisieren Sie den Überstand und lagern Sie Aliquots des Wnt3A-CM bei 4 °C für maximal 2 Monate.
- Bereiten Sie organoide Expansionsmedium.
HINWEIS: Menschliches kleines Darmorganoid-Expansionsmedium (siehe Rezept in Ergänzender Tabelle 1) wird als hSI-EM bezeichnet. Die folgenden Schritte erzeugen ein Endvolumen von 1 L hSI-EM und können bei Bedarf nach oben oder unten skaliert werden.- 1,46 g Nicotinamid in 12 ml zellkulturtauglicher Phosphat-gepufferter Kochchen (PBS) auflösen, um eine endgültige Verdünnung von 1 M zu erzeugen.
- Lösen Sie 245 mg n-Acetyl-Cystein in 3 ml Zellkultur-PBS auf, um eine endgültige Verdünnung von 500 mM zu erzeugen.
HINWEIS: Um die Bildung einer Lösung zu beschleunigen, können Nicotinamid und n-Acetyl-Cystein in einem Wasserbad bei 37 °C inkubiert werden. Beide Lösungen können in Chargen, Aliquoted nmöglich und bei -20 °C für die zukünftige Verwendung gelagert werden. - Filter sterilisieren beide Lösungen durch einen 0,22 m Filter in ein steriles 15 ml-Rohr.
- 167 ml BM zu einem sterilen 500 ml Kulturmittelkolben geben. Fügen Sie 200 ml R-Spondin-CM, 100 ml Noggin-CM und 100 l rekombinantem mEGF (500 g/ml) zu einer Endkonzentration von 50 ng/ml hinzu.
- 10 ml der sterilisierten Nicotinamidlösung und 2,5 ml der sterilisierten n-Acetyl-Cystein-Lösung hinzufügen. Fügen Sie 20 ml B27 Ergänzung (50x).
HINWEIS: In diesem Stadium wird das Medium als hSI-EM ohne WAS (Wnt3A-CM, A83-01 und SB202190) bezeichnet und kann bei -20 °C gespeichert werden. Wenn das Medium in kleinere Volumina eingegliedert ist, passen Sie die Konzentrationen der folgenden Schritte entsprechend an. - Auf 500 ml hSI-EM ohne WAS 10 ml Wnt3A-CM der letzten frisch zubereiteten Charge und 10 ml Wnt3A-CM der vorletzten Charge hinzufügen, um Variabilitätsänderungen in den Wnt3A-CM-Bedingungen zu minimieren.
- Fügen Sie A83-01 zu einer Endkonzentration von 500 nM und SB202190 zu einer Endkonzentration von 10 m hinzu.
- Die vorbereitete hSI-EM (mit WAS) bei 4 °C aufbewahren und maximal 2 Wochen verwenden.
HINWEIS: Fügen Sie zusätzlichey-27632 zu einer Endkonzentration von 10 M (bezeichnet als hSI-EM+Y) hinzu, wenn Krypten oder einzelne Zellen kultiviert oder Organoide aus der Kryokonservierung gestartet werden.
- Vorbereiten des fluoreszierenden aktivierten Zellsortierpuffers (FACS).
- Fügen Sie 10 ml fetales Wadenserum (FCS) zu 40 ml PBS ohne Ca2+/Mg2+ für eine Endkonzentration von 10% FCS hinzu.
HINWEIS: Der FCS verhindert, dass Zellen an Labware haften.
- Fügen Sie 10 ml fetales Wadenserum (FCS) zu 40 ml PBS ohne Ca2+/Mg2+ für eine Endkonzentration von 10% FCS hinzu.
2. Kulturverfahren für menschliche kleine Darmorganoide
HINWEIS: Dieses Protokoll sollte in einem Biosicherheitsschrank durchgeführt werden. Die Organoide sollten nach Standard-Zellkulturrichtlinien behandelt werden. Beim Umgang mit Organoiden oder organoiden Zellen sollten die Zellen nach Möglichkeit auf Eis gehalten werden. Die Zellen bleiben für einige Stunden nach der Ernte lebensfähig, wenn dies sichergestellt ist. Organoide sollten in einem Standard-Zellkultur-Inkubator bei 37 °C mit 5%CO2kultiviert werden. Diese Bedingungen gelten für alle Inkubationsschritte mit Organoiden, die in die Kellermembranmatrix (BMM; d.h. Matrigel) in diesem Protokoll eingebettet sind. Die Autoren haben für diese Assays von Zwölffingerdarm abgeleitete Organoide verwendet.
- Passaging-Organoide
notiz: Jede organoide Kultur hat ihre eigene Verdoppelungszeit. Normalerweise können kleine Darmorganoide alle 7 bis 10 Tage 1:3 bis 1:5 durchführt werden. Wenn sie als einzelne Zellen durchlaufen werden, kann die Passaging-Effizienz je nach Zelldichte bis zu 1:20 betragen. Für die Einrichtung und Wartung werden Organoide in 24-Well-Platten kultiviert; für den LDF-Assay, entweder in 24- oder 96-Well-Platten.- vorbereitung
- Vorwarm ausgepackte 24-Well-Gewebekulturplatten in einem Inkubator bei 37 °C, 5 %CO2 mindestens über Nacht und vorzugsweise 5 Tage im Voraus.
HINWEIS: Die Vorerwärmung der Gewebekulturplatten im Zellkultur-Inkubator sorgt für die richtige Bildung und Anhaftung von organoidhaltigen Tröpfchen von BMM. - Um die Anzahl der Frost-Tau-Zyklen zu reduzieren, bereiten Sie 1 ml Aliquots BMM vor und lagern Sie bei -20 °C. Eine Durchstechflasche Mit BMM mindestens 30 min auf Eis auftauen, bevor Sie mit dem organoiden Passaging beginnen.
- Halten Sie ein 50 ml Rohr BM als Waschmedium auf Eis.
- Bereiten Sie hSI-EM wie in Abschnitt 1.4 beschrieben vor und bereiten Sie eine entsprechende Menge hSI-EM+Y vor, z. B. 15 ml für eine volle 24-Well-Platte.
- Vorwarm ausgepackte 24-Well-Gewebekulturplatten in einem Inkubator bei 37 °C, 5 %CO2 mindestens über Nacht und vorzugsweise 5 Tage im Voraus.
- Organoide sammeln.
- Saugen Sie vorsichtig das Kulturmedium, ohne die Tröpfchen von BMM zu stören.
- Fügen Sie 500 l kaltebm in den ersten Brunnen der Organoide, und stören Sie die BMM Tröpfchen mit Organoiden durch Pipettieren sanft nach oben und unten mit einer P1000 Pipetette.
- Wiederholen Sie diesen Vorgang mit dem gleichen Medium im nächsten Gut wie erforderlich, aber ernten Sie nicht mehr als 2 Brunnen pro 500 l BM.
- Sammeln Sie die Organoide in einem niedrigbindenden 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr und drehen Sie sich in einer Mini-Tischzentrifuge für 15 bis 20 s (max. 2.000 x g). Den Überstand vollständig aspirieren und das letzte Medium mit einer P200 Pipette entfernen.
HINWEIS: Wenn die Organoidkulturen unter dem Mikroskop sauber aussehen und keine abgestorbenen Zellen oder andere Trümmer enthalten, können die BMM-Tropfen in Schritt 2.1.2. direkt in Trypsin statt bm geerntet werden. Fahren Sie nach Schritt 2.1.2.3 in Schritt 2.1.3.1 direkt mit der Inkubation fort.
- Dissoziieren Sie die Organoide in einzelne Zellen.
- Fügen Sie den gesponnenen Organoiden 400 L Trypsin hinzu. Die Organoide bei 37 °C für 5 min in einem Wasserbad inkubieren.
- Unterbrechen Sie die verbleibenden Aggregate der Zellen, indem Sie mit einer P200-Pipette sanft nach oben und unten pfeifen. Erneut die Organoide bei 37 °C für 5 min in einem Wasserbad inkubieren.
- Überprüfen Sie den Fortschritt der Zelldissoziation unter dem Mikroskop mit 4-facher Vergrößerung. Wiederholen Sie manuelle Unterbrechung und Inkubation, wenn große Zellklumpen verbleiben.
- Wenn nur noch einzelne Zellen übrig sind, fügen Sie 1 ml BM hinzu und drehen Sie die Zellen in einer Mini-Tischzentrifuge für 15 bis 20 s herunter.
- Aspirieren Sie den Überstand vollständig. Setzen Sie die einzelnen Zellen in 200 l frischer hSI-EM mit einer P200 Pipette wieder aus. Fügen Sie weitere 800 L hSI-EM hinzu.
- Zählen Sie die Anzahl der Zellen in der Suspension.
HINWEIS: Im Labor der Autoren liefert die manuelle Zählung dissoziierter Organoidzellen zuverlässigere Ergebnisse als ein automatisierter Zellzähler. Wenn ein automatisierter Zellzähler verwendet wird, sollte die Zelldichte für nachgeschaltete Anwendungen intern getestet und angepasst werden, wenn zu wenig oder zu viele Organoide herauswachsen.
- Samenorganoide für die Wartung oder Lipid Tropfen Bildung Assay.
- Berechnen Sie das Volumen der Zellen, das für die endgültige Zelldichte benötigt wird.
HINWEIS: Ungefähr 250 Zellen/L ist eine angemessene Dichte. In einer 24-Well-Platte werden in jedem Brunnen 30 l gesät, während 5 l in jeden Brunnen einer 96-Well-Platte gesät werden. - Nehmen Sie das entsprechende Volumen der Suspension heraus und passen Sie die Dichte auf 750 Zellen/L an (oder drehen Sie sich ab und suspendieren Sie, wenn die Dichte zu niedrig ist).
- Fügen Sie BMM der Zellsuspension im Verhältnis 2:1 hinzu. Die endgültige Zelldichte in diesem Gemisch beträgt 250 Zellen/L. Mischen Sie die Suspension vorsichtig durch Pipettieren, vorsichtig vermeiden Sie Blasen.
- In einer vorgewärmten Gewebekulturplatte säen Sie drei 10 L Tröpfchen pro Brunnen in einer 24-Well-Platte oder ein einzelnes 5-L-Tröpfchen pro Brunnen in einer 96-Well-Platte aus.
- Legen Sie die Platte in einen Inkubator bei 37 °C, 5%CO2 für 10 bis 15 min, um die BMM-Tröpfchen zu erstarren. In der Zwischenzeit eine angemessene Menge hSI-EM+Y in einem Wasserbad bei 37 °C vorerwärmen.
- Jedem Brunnen einer 24-Well-Platte oder 100 l vorsichtig 500 l vorgewärmtes hSI-EM+Y zu jeder Bohrung einer 96-Well-Platte hinzufügen. Inkubieren Sie die Zellen in einem Inkubator bei 37 °C, 5%CO2 und nach 2 bis 3 Tagen ändern Sie das Medium in hSI-EM (ohne Y) und erfrischen Sie es 2-3 mal pro Woche.
HINWEIS: Nach 7 bis 10 Tagen sollte eine Pflegekultur der Organoide wieder durchgehen.
- Berechnen Sie das Volumen der Zellen, das für die endgültige Zelldichte benötigt wird.
- vorbereitung
3. Lipid Droplet Formation Assay
- Herstellung von Ölsäurekonjugat
HINWEIS: Da Ölsäure (OA) hydrophob und nicht in Wasser löslich ist, wird sie mit Rinderserumalbumin (BSA) konjugiert. BSA kann mehrere Fettsäuremoleküle binden und wird in diesem Fall im Verhältnis 1:8 verwendet, um Ölsäure für die Darmzellen zugänglich zu machen. Freie Fettsäuren und BSA können beide an Kunststoff-Laborware binden. Um eine ordnungsgemäße Endkonzentration zu gewährleisten, verwenden Sie Glasfläschchen und Glaspipetten, wann immer möglich.- Wiegen Sie 0,2 g flüssige Ölsäure bei Raumtemperatur. 1,5 ml kulturtaugliches steriles PBS hinzufügen und das Gemisch für 1 h auf 70 °C erhitzen.
- 5,89 g fettsäurefreie BSA wiegen und in 33,9 ml PBS auflösen. Erwärmen Sie das Gemisch in einem Wasserbad bei 37 °C, bis die BSA vollständig aufgelöst ist.
- Wirbeln Sie die OA-Mischung wieder, um eine Emulsion von feinen Tröpfchen zu erzeugen und fügen Sie es sofort in die BSA-Lösung mit einer Glaspipette. Halten Sie die endletzte Lösung nach dem Hinzufügen des OA in der Nähe von 37 °C. Die Endmischung besteht aus 20 mM OA in 2,5 mM BSA.
- Halten Sie die Mischung 30 min bei 37 °C, bis eine klare gelbliche Lösung verbleibt.
- Das OA-BSA-Konjugat kann mindestens 6 Monate lang bei -20 °C eingefroren werden. Beim Auftauen eines Aliquots bei 37 °C bebrüten, bis sich die Trübung auflöst und die Mischung wieder klar ist.
HINWEIS: Aufgrund des hohen Protein- und Lipidgehalts der kann die Mischung nicht gefiltert oder autoklaviert werden. Wenn die Komponenten mit Sorgfalt behandelt wurden, in einer laminaren Durchflusshaube, wenn möglich und mit sterilem PBS, die Autoren nicht mit mikrobiellen Infektionen.
- LDF konfokaler Test
- Probenvorbereitung
- Passage-Organoide, wie in Abschnitt 2.1 beschrieben. Säen Sie die organoiden Einzelzellen in einer schwarzen Klarboden-96-Well-Platte aus.
- Ersetzen Sie am 6. Tag der Kultur auf hSI-EM das Kulturmedium durch hSI-EM mit 1 mM OA-BSA Konjugat.
- Inkubieren Sie die Zellen für 16-17 h (über Nacht) bei 37 °C in Gegenwart oder Abwesenheit von 0,1 M DGAT1-Hemmer. Einschließen einer Fahrzeugsteuerung von 2,5 mM BSA.
- Nach 16-17 h das Medium ansaugen, ohne die BMM-Tröpfchen zu stören. Fixieren Sie die Organoide, indem Sie den Brunnen 30 min bei Raumtemperatur 100 l neutral gepuffertes Formaldehyd zu4 % neutral gepuffertes Formaldehyd hinzufügen.
HINWEIS: Das Formaldehyd löst das BMM teilweise auf, während die Organoide auf den Boden sinken und an der Unterseite der Platte haften. - Entfernen Sie das Formaldehyd vorsichtig, und waschen Sie die Brunnen vorsichtig mit 150 l PBS pro Brunnen.
- Stain die Zellen für LDs mit 0,025 mg/ml LD540 und 4,6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI) in PBS für 15 min bei Raumtemperatur im Dunkeln.
- Waschen Sie die Brunnen sorgfältig mit PBS.
HINWEIS: Das Protokoll kann hier bei Bedarf angehalten werden. Halten Sie die Proben in PBS im Dunkeln bei 4 °C. Die LD540 Färbung bleibt bis zu einer Woche stabil. Dieser Assay kann auch mit lebenden Zellen durchgeführt werden, um die LD-Bildung über einen bestimmten Zeitraum zu überwachen. Dazu muss die Fixierung aus dem Protokoll weggelassen werden, und die DAPI sollte durch Hoechst-Färbung ersetzt werden. LD540 kann LDs in lebenden Zellen in der gleichen Konzentration wie beschrieben färben.
- Konfokale Bildgebung
HINWEIS: Die Bildgebung kann an vorbereiteten Organoidproben in der schwarzen Klarbodenplatte 96-Well durchgeführt werden.- Für Übersichtsbilder ganzer Organoide verwenden Sie ein 40-faches Objektiv, das für konfokale Fluoreszenzaufnahmen geeignet ist.
- Stellen Sie das Mikroskop ein, um den DAPI-Kanal bei einer Anregung von 405 nm und einer Emissionswellenlänge von ca. 410 bis 535 nm abzubilden. Für den Farbstoff LD540 wählen Sie einen Anregungslaser bei 540 nm (543 nm ist optimal) und stellen Sie die Emissionsfilter auf 545 x 700 nm ein.
HINWEIS: In diesem Protokoll wurde ein laserscannendes Konfokalsystem mit einem Weißlichtlaser, einem akusto-optischen Strahlsplitter (AOBS), einem 10x/20x Objektiv und einem Spektraldetektionssystem verwendet. Dies ermöglicht eine exakte Abstimmung auf die spezifischen Wellenlängen. Wenn kein vergleichbares System verfügbar ist, wählen Sie Laserlinien und Kurz-/Langpassfilter in der Nähe der oben genannten Spezifikationen. Für die Ganzorganoid-Bildgebung reicht eine Auflösung von 512 x 512 oder 1024 x 1024 für die nachgeschaltete Bildanalyse aus. - Stellen Sie die Lochgröße auf 1 luftige Einheit (AU) für eine ausreichende Z-Achsen-Auflösung ein.
- Um die Hälfte eines kugelförmigen Organoids abzubilden, stellen Sie einen Z-Stack auf ca. 85 m.
- Bildanalyse
HINWEIS: Für die Bildanalyse wurde Fidschi/ImageJ16,17 verwendet, um maximale Projektionen zu generieren. Die Analyse kann mit jedem Bildanalyse-Softwarepaket durchgeführt werden, das maximale Projektion, manuelle Schwellenwerte und Partikelanalyse ermöglicht.- Mit Fidschi/ImageJ wird der Z-Stack jedes Organoids in eine maximale Projektion transformiert: Bild | Stapel | Z-Projekt.
- Legen Sie den Schwellenwert für die maximale Projektion auf einen Pegel fest, in dem kein LD540-Signal in der BSA-Fahrzeugsteuerungsprobe sichtbar ist: Bild | Anpassen | Schwellenwert. Verwenden Sie diese Einstellungen, um jedes Bild zu beschumen.
- Messen Sie die Gesamtfluoreszenzfläche für jede maximale Projektion mit der Funktion Analysieren | Analysieren Sie Partikel.
HINWEIS: Obwohl die Assay-Auflösung mit einem konfokalen Mikroskop besser ist, kann dieser Test auch mit einem Fluoreszenzplattenleser mit ähnlichen Filtern analysiert werden. Um die Organoidanzahl pro Brunnen zu normalisieren, sollte das LD540-Signal durch das DAPI-Signal geteilt werden. Schließlich sollte das Signal der BSA-Fahrzeugsteuerung subtrahiert werden, um die Messungen zu normalisieren. Dieser Ansatz ermöglicht es, den Assay auf ein 96-Well-Plattenformat zu skalieren.
- Probenvorbereitung
- LDF-Flow-Zytometrischer Assay
- Probenvorbereitung
- Passage-Organoide, wie in Abschnitt 2.1 beschrieben. Säen Sie die organoiden Einzelzellen in einer 24-Well-Gewebekulturplatte aus. Zwei Brunnen pro Zustand reichen für die Durchflusszytometrie aus.
- Ersetzen Sie am 10. Tag der Kultur auf hSI-EM das Kulturmedium durch hSI-EM mit 1 mM OA-BSA Konjugat.
HINWEIS: Im Gegensatz zur konfokalen Analyse wurden 10 Tage Wachstum in EM für den Flow Cytometry Assay anstelle von 6 Tagen gewählt. Die zusätzlichen 4 Tage Expansion führen zu optisch überlappenden Organoiden, die den mikroskopischen Assay erschweren würden. Die größere Anzahl von Zellen erleichtert jedoch die Analyse der Durchflusszytometrie. - Inkubieren Sie die Zellen für 16-17 h (über Nacht) bei 37 °C in Gegenwart oder Abwesenheit von 0,1 M DGAT1-Hemmer. Einschließen einer Fahrzeugsteuerung von 2,5 mM BSA.
- Sammeln Sie die Organoide nach 16-17 h, wie in Abschnitt 2.1.2 beschrieben.
- Dissoziieren Sie die Organoide in einzelne Zellen, wie in Abschnitt 2.1.3 beschrieben.
HINWEIS: Obwohl nicht unbedingt erforderlich, wird empfohlen, die Zellenanzahl in jeder Probe zu überprüfen. Eine Gesamtanzahl von 10.000 Zellen pro Probe ist das absolute Minimum, das für eine ausreichende Auflösung erforderlich ist. Für optimale Ergebnisse verwenden Sie ca. 50.000 bis 100.000 Zellen. - Drehen Sie die Zellen in einer Mini-Tischzentrifuge für 15 bis 20 s.
- Beflecken Sie jede Probe mit 500 l 0,025 mg/ml LD540 und 1 g/ml Hoechst in PBS für 15 min bei Raumtemperatur im Dunkeln.
- Drehen Sie die Zellen in einer Mini-Tischzentrifuge für 15 bis 20 s und waschen Sie 3x mit PBS.
- Fixieren Sie die Zellen, indem Sie sie 15 min bei Raumtemperatur in 500 l neutral gepuffertem Formaldehyd in 500 l neutralgepuffertem Formaldehyd wieder aufhängen.
- Drehen Sie die Zellen herunter und waschen Sie 3x mit FACS-Puffer.
- Vorspülen von FACS-Rohren mit FACS-Puffer, um zu verhindern, dass Zellen an der Rohrwand kleben.
- Setzen Sie die Zellen in 200 L FACS-Puffer wieder aus und übertragen Sie die Zellsuspension in die vorgespülten FACS-Röhren.
- Zytometrische Durchflussanalyse
- Legen Sie die Gating-Parameter fest, um abgestorbene Zellen und Zellklumpen auszuschließen (siehe Abschnitt repräsentative Ergebnisse).
- Messen Sie in der endgültigen Gated Population mindestens 10.000 Zellen für zuverlässige Ergebnisse.
HINWEIS: Aus dieser Population liefern die mittlere Fluoreszenzintensität (MFI) von LD540 und das mittlere SSC-A-Signal zusammen ein Maß für das Gesamtvolumen der LD-Bildung pro Zelle.
- Probenvorbereitung
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Representative Results
Für eine ordnungsgemäße Analyse der LD-Bildung sollten die Organoide vor der Stimulation mit OA und anschließender Färbung nicht zu dicht gesät werden. Dies ist besonders wichtig für die Konfokal- und Plattenleser-Auslesung, da überlappende Organoide die Fluoreszenz stören könnten. Ein Beispiel für die richtige organoide Saatdichte (Abbildung 1A) und eine Kultur mit überlappenden Organoiden wird gezeigt (Abbildung 1B). Um die Variabilität der Probenstimulation mit OA zu minimieren, sollten die Organoidgröße und die Sädichte zwischen den Proben innerhalb eines Experiments vergleichbar sein. Dies wird am besten durch das Aussaat einer gleichen Anzahl von Einzelzellen gesteuert. Einige Anpassungen können jedoch notwendig sein, wenn bestimmte organoide Linien konsequent eine höhere Rekonstitutionseffizienz und damit eine konstant höhere Organoidzahl aufweisen.
Nach der Stimulation mit 1 mM OA über Nacht kann die LD-Bildung mit einem invertierten Hellfeldmikroskop visualisiert werden. Die Anhäufung von LDs streut das übertragene Licht, und daher erscheinen die Organoide dunkler, während nicht stimulierte Organoide ein transluzentes Aussehen haben (Abbildung 1C). Ein Beispiel für LD-Bildung, wie sie unter einem Hellfeldmikroskop zu sehen ist, ist in Abbildung 1Ddargestellt. Dieses Phänomen kann verwendet werden, um die experimentellen Bedingungen vor der fluoreszierenden Assay-Auslesung zu bewerten. Wenn die Positivkontrollprobe nicht visuell dunkler ist als die negative Kontrollprobe oder wenn ein umfangreicher Zelltod erkennbar ist, sollte das Experiment verworfen werden. Da FFAs für Zellen in höheren Konzentrationen toxisch sind und die tödliche Konzentration zwischen den FFA-Arten unterschiedlich ist, sollte die optimale subletale Konzentration, die die LD-Bildung induziert, für jede Anwendung titriert werden.
Sobald die OA-stimulierten Organoide protokollarisch fixiert und gebeizt sind, kann der LDF mit einem konfokalen Mikroskop visualisiert werden. Da es sich bei den Organoiden um 3D-Strukturen handelt, ist ein regelmäßiges Epifluoreszenzmikroskop aufgrund des außerfokussierten Hintergrundsignals nicht geeignet. Daher verwendeten wir eine (maximale Projektion von a) konfokalen z-Stack, um LDF in Organoiden zu charakterisieren. Abbildung 2A zeigt ein repräsentatives Ergebnis der LD-Färbung bei gesunden Kontrollorganoiden, die mit oder ohne DGAT1-Inhibitor behandelt wurden. Obwohl die Quantifizierung dieser Bilder mühsam ist, dient die konfokale Analyse hauptsächlich als Visualisierungswerkzeug, um auf abnormale LD-Bildung zu überprüfen. Die Quantifizierung der konfokalen Mikroskopieproben kann auch mit einem fluoreszierenden Plattenleser (Abbildung 2B) durchgeführt werden, der auf das fluoreszierende Hoechst-Signal normalisiert wird. Der Plattenleser-Assay zeigt eine signifikante Abnahme des LD540-Signals in Organoidzellen, die mit DGAT1-Hemmer (D1i) behandelt wurden, im Vergleich zu unbehandelten Organoiden.
Die Quantifizierung der LD-Bildung in einzelnen Zellen kann mit dem Durchflusszytometer erreicht werden. Die Gating-Strategie für dissoziierte menschliche Darmorganoide ist in Abbildung 3Adargestellt. Der erste Schritt des Gatings im FSC-A/SSC-A-Plot ist eine erste Auswahl von "live" (wenn fest) einzelnen Zellen. Um Doublets, Drillinge oder größere Zellklumpen weiter auszuschließen, haben wir zwei zusätzliche Gating-Schritte auf FSC-W/FSC-H und SSC-W/SSC-H aufgenommen. Schließlich stellt das Gating auf FSC-A/Hoechst den Ausschluss aller Zellen sicher, die vor der Fixierung tot waren oder starben. Abbildung 3B,C zeigt die Histogramme des SSC-A- und des LD540-Signals der endgültigen Lebendzellpopulation. LDF wird zu einer Zunahme von SSC-A aufgrund der Bildung von intrazellulären Lipidtröpfchen führen. Darüber hinaus LD540 Flecken für Lipide, die in den LDs gespeichert sind und dieses Signal wird auch auf LDF-Induktion erhöhen. Als solche wird die LD-Bildung als Verschiebung im MFI von SSC-A und LD540 gemessen (Abbildung 3D,E). Das MFI kann geplottet und zur statistischen Analyse verwendet werden.
Abbildung 1: Organoidkulturen, die durch Hellfeldmikroskopie visualisiert werden. (A,B) Für die konfokalen und fluoreszierenden Plattenleseristen ist es wichtig, dass die Organoide nicht in zu hoher Dichte im BMM-Tröpfchen ausgesät werden. (A) Organoide werden in einer angemessenen Dichte von 250 Zellen/L gesät. (B) Organoide wurden in einer zu hohen Dichte ausgesät, was zu Überlappungen von Organoiden und Zelltod führte. (C,D) Nach der nächtlichen Stimulation mit OA kann die LD-Bildung visuell beurteilt werden. (C) Organoide wurden über Nacht mit 12% BSA-Fahrzeugsteuerung inkubiert. (D) Organoide wurden über Nacht mit 1 mM OA konjugiert mit BSA inkubiert, was zu einem dunklen Aussehen führte. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Repräsentative Ergebnisse der LDF-Charakterisierung mit konfokaler Bildgebung und einem Fluoreszenzplattenleser. Gesunde Kontroll-abgeleitete-Organoide wurden über Nacht mit BSA, 1 mM OA oder 1 mM OA+D1i stimuliert. (A) Maximale Projektion von konfokalen Stapeln von 85 m, die für DAPI (Cyan) und LD540 (gelb) gebeizt sind. Diese Unterfigur ist von van Rijn et al.6adaptiert. (B) Die relative Fluoreszenzintensität von LD540 normalisierte sich mit einem Fluoreszenzplattenleser auf das nukleare DAPI-Signal, gemessen mit einem Fluoreszenzplattenleser. Die mittlere SD wird für zwei biologische Replikationen dargestellt. Die statistische Signifikanz wurde mit hilfe einer einwegigen ANOVA ohne wiederholte Messungen mit einem Tukey-Post-hoc bestimmt. *, P < 0,05. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Repräsentative Ergebnisse der LDF-Quantifizierung mittels Durchflusszytometrie. Gesunde Kontroll-abgeleitete-Organoide wurden über Nacht mit BSA, 1 mM OA oder 1 mM OA+D1i stimuliert. (A) Gating-Strategie zur Auswahl von organoidabgeleiteten Einzelzellen. Von links nach rechts, schließen Sie zuerst Trümmer durch Gating für FSC-A/SSC-A aus. Dann Tor auf FSC-W/FSC-H und SSC-W/SSC-H, um Doublets, Drillinge oder größere Zellklumpen auszuschließen. Schließlich Tor für FSC-A/Hoechst für lebende Zellen zu wählen. Sowohl der SSC-A als auch der LD540-Kanal werden zur Quantifizierung der LD-Bildung verwendet. Histogramme dieser Parameter zeigen eine Verschiebung der mittleren Fluoreszenzintensität (MFI) von (B) SSC-A und (C) LD540 bei Stimulation mit OA. (D,E) Das MFI pro Stichprobe kann in einem Diagramm dargestellt und zur durchführung statistischer Analysen verwendet werden. Die mittlere SD wird für drei biologische Replikationen dargestellt. Die statistische Signifikanz wurde mit hilfe einer einwegigen ANOVA ohne wiederholte Messungen mit einem Tukey-Post-hoc bestimmt. *, P < 0,05; **, P < 0,01; , P < 0,001. Diese Figur ist von van Rijn et al.6adaptiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| chemisch | zahlungsunfähig | Lagerkonzentration | Endgültige Konzentration |
| Wnt3a CM | - | 100% | 50% |
| R-Spondin-1 CM | - | 100% | 20% |
| Noggin CM | - | 100% | 10% |
| A83-01 (TGF-inh) | Dmso | 50 mM | 500 nM |
| B27 | - | 50x | 1x |
| mEGF | PBS/0,1% BSA | 500 g/ml | 50 ng/ml |
| N-Acetyl | wasser | 500 mM | 1,25 mM |
| Nicotinamid | Pbs | 1 M | 10 mM |
| Primocin (verwenden, bis MCB im Gefrierschrank ist) |
- | 50 mg/ml | 100 g/ml |
| SB202190 (P38 inh) | Dmso | 30 mM | 10 m |
Zusatztabelle 1: Rezept für Organoid-Expansionsmedium.
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Discussion
Hier stellen wir ein Protokoll zur Bestimmung der LD-Bildung bei menschlichen Darmorganoiden bei der Inkubation mit Ölsäure zur Verfügung. Diese Methode basiert auf dem LD-spezifischen Fluoreszenzfarbstoff LD54018, der eine Charakterisierung und Quantifizierung des Gesamtvolumens von Lipidtröpfchen innerhalb einer organoiden Kultur ermöglicht. Die Verfahren zur Etablierung und Erhaltung menschlicher Darmorganoidkulturen wurden vor13veröffentlicht, und ein visueller Leitfaden dieses Protokolls ist ebenfalls verfügbar15.
Die entscheidenden Schritte in diesem Protokoll sind die Kultur der menschlichen Darmorganoide und die richtige Konjugation von OA zu BSA. Die Kultur der Organoide erfordert eine korrekte Formulierung des Kulturmediums, da die Erhaltung einer Stammzellpopulation in hohem Maße von funktionellen Wnt3A-CM abhängt. Wenn Wnt3A-CM im eigenen Haus hergestellt wird, empfehlen wir einen hochstandardisierten Workflow und die monatliche Produktion von konditionierten Medien aufgrund der Ablaufzeit von ca. 2 Monaten. Darüber hinaus führt das 1:1-Mischen von aufeinander folgenden Wnt3A-CM-Chargen zu einer konstanteren Langzeitkultur, da sie sicherstellt, dass eine leicht suboptimale Charge keinen großen Einfluss auf das organoide Wachstum hat.
Darüber hinaus besteht unser BM aus fortschrittlichem DMEM/F12 Medium, das lipidreiche BSA enthält. Da unsere Fahrzeugkontrolle (12% BSA/BM) keine LD-Bildung bei Organoiden induziert, kommen wir zu dem Schluss, dass die Menge oder Art der FFA in BM nicht ausreicht, um den LDF-Test zu beeinflussen.
Die Konjugation von OA zu BSA ist ein heikler Prozess, der eine gewisse Optimierung erfordern könnte. Wir haben erfahren, dass das hier beschriebene Protokoll am besten ist, wenn alle Temperaturänderungen akribisch befolgt und mit Glaslabor durchgeführt werden.
In früheren Forschungen wurden LD-Formationsassays verwendet, um LD-Größe und -Zahl mit hoher Vergrößerung8,12zu charakterisieren. Diese Assays wurden meist mit Bor-Dipyrromethen (BODIPY) 493/503 durchgeführt, was eine hervorragende Färbung für LDs mit hohem Signal-Rausch-Verhältnis bietet. Das Emissionsspektrum von BODIPY ist jedoch recht breit und überschneidet sich weitgehend mit dem fluoreszierenden Spektrum von grün fluoreszierenden Proteinen (GFP)-abgeleiteten Farbstoffen. Obwohl wir erwarten, dass die aktuelle Anwendung des LDF-Assays auch mit BODIPY funktionieren würde, ermöglicht die Wahl für LD540 eine breitere Palette von mehrfarbigen Bildern, einschließlich Co-Färbung mit GFP-Etiketten18. Wir haben diesen Test auch mit dem Lipidfleck Nile red durchgeführt (Daten nicht gezeigt). Da Nilrot jedoch dazu neigt, nicht nur LDs, sondern auch Lipid-Doppelschichten zu färben, fanden wir heraus, dass das höhere Hintergrundsignal von Nilrot die Fähigkeit unseres Assays verringert, kleine Unterschiede der LD-Bildung zu unterscheiden. Aus diesen Gründen bevorzugen wir LD540 in einem organoiden LDF-Assay.
Im Vergleich zu früheren Studien mit LDF-Assays mit hoher Vergrößerung ermöglicht der hier beschriebene Assay eine hohe Durchsatzquantitation des gesamten LD-Volumens in einer großen Population von Zellen. Daher können insbesondere die Fluoreszenzplattenleserquantitation und möglicherweise die zytometrische Durchflussanalyse skaliert werden, um die Wirkung von Medikamenten auf die LD-Bildung zu testen. Da wir gezeigt haben, dass die LD-Bildung weitgehend von der DGAT1 abhängig ist, stellen DGAT1-mangelhafte patientenabgeleitete oder D1i-behandelte Organoide eine klare Chance für die Anwendung eines solchen Screenings dar. Insbesondere bei solchen selten auftretenden Krankheiten könnte der LDF-Assay in Kombination mit patientenabgeleiteten Organoiden eine Plattform für patientenspezifische Seuchen auf neue therapeutische Medikamente bieten.
Eine Folge eines Ansatzes mit hohem Durchsatz ist jedoch, dass die Fähigkeit, einzelne LDs zu charakterisieren, verloren geht. Während die mikroskopische oder fluoreszierende Visualisierung von LDs mit hoher Vergrößerung simpere, um die Dynamik in LD-Größe und Zahl12,19zu untersuchen, unterscheidet der Ansatz mit hohem Durchsatz nicht zwischen mehreren kleinen oder weniger große LDs und können daher nicht verwendet werden, um Unterschiede im LD-Stoffwechsel zu quantifizieren, wo das Gesamtvolumen der LDs konstant bleibt. Daher sollte dies in Anwendungen, bei denen die Anzahl oder Größe der LDs als von Interesse vermutet wird, mit einer niedrigeren Durchsatz-, höheren Vergrößerungstechnik angegangen werden. Darüber hinaus erhalten die Organoide im aktuellen Assay eine basolaterale Lipidstimulation, während diätetische Lipide typischerweise an der apikalen Membran aufgenommen werden. Eine gewisse Vorsicht ist daher geboten, wenn die Ergebnisse in die physiologische Situation übersetzt werden sollen.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Wir danken B. Spee für die großzügige Bereitstellung von LD540. Diese Arbeit wurde durch ein Stipendium der niederländischen Organisation für wissenschaftliche Forschung (NWO-ZonMW; VIDI 016.146.353) an S.M.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Advanced DMEM/F12 | Gibco | 12634-028 | |
| B27 supplement | Gibco | 17504-044 | |
| Basement membrane matrix (matrigel) | BD Biosciences | 356231 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542-1MG | |
| DGAT1 inhibitor (AZD 3988) | Tocris Bioscience | 4837/10 | |
| Fatty acid free BSA | Sigma-Aldrich | A7030 | |
| Formaldehyde | Klinipath | 4078-9001 | |
| Glutamin (GlutaMAX, 100x) | Gibco | 15630-056 | |
| HEPES (1 M) | Gibco | 15630-080 | |
| Laser scanning confocal microscope | Leica | SP8X | |
| LD540 | kindly provided by Dr. B. Spee, Utrecht University | ||
| mEGF | Peprotech | 315-09_500ug | |
| N-acetyl cysteine | Sigma-Aldrich | A9165-100G | |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636-500G | |
| Noggin producing cells (HEK293-mNoggin-Fc cells) | MTA with J. den Hertog, Hubrecht Institute | ||
| Oleic acid | Sigma-Aldrich | O1008-5G | |
| p38 MAPK inhibitor (p38i) (SB202190) | Sigma-Aldrich | S7067-25MG | |
| PBS | Sigma-Aldrich | D8662-500ML | |
| PBS without Ca2+/Mg2+ | Sigma-Aldrich | D8537-500ML | |
| Penicillin-Streptomycin (5,000 U/mL) | Gibco | 15070-063 | |
| R-spondin producing cells (Cultrex HA-R-Spondin1-Fc 293T Cells) | R&D systems | 3710-001-01 | |
| TC-treated 24 well plates | Greiner-One | 662160 | |
| TC-treated black clear-bottom 96 well plates | Corning Life Sciences | 353219 | |
| TGFb type I receptor inhibitor (A83-01) | Tocris Bioscience | 2939/10 | |
| Trypsin (TrypLE Express) | Life Technologies | 12604021 | |
| WNT-3A producing cells (L-Wnt-3A cells) | MTA with J. den Hertog, Hubrecht Institute | ||
| Y-27632 dihydrochloride (Rho kinase inhibitor) | Abcam | ab120129-10 |
References
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