Summary
Las proteínas de dominio J de Cognate cooperan con el acompañante Hsp70 para ayudar en una miríada de procesos biológicos que van desde el plegado de proteínas hasta la degradación. Aquí, describimos un ensayo de ligadura de proximidad in situ, que permite el seguimiento de estas máquinas de chaperone formadas transitoriamente en células bacterianas, levaduras y humanas.
Abstract
Las proteínas de dominio J (JD) forman la familia de co-chaperona más grande y diversa en las células eucariotas. Los hallazgos recientes muestran que miembros específicos de la familia JDP podrían formar heterocomplejos transitorios en eucariotas para ajustar la selección de sustratos para los disaggregases de proteína a base de chaperone de 70 kDa (Hsp70). Los complejos JDP apuntan a proteínas agregadas inducidas por estrés agudo/crónico y presumiblemente ayudan a ensamblar los desaggregases mediante la contratación de múltiples Hsp70 a la superficie de los agregados proteicos. El alcance de la red de control de calidad de proteínas (PQC) formada por estos JDP que interactúan físicamente sigue sin caracterizarse in vivo. Aquí, describimos un ensayo de interacción de proteína in situ basado en microscopía denominado ensayo de ligadura de proximidad (PLA), que es capaz de capturar de forma robusta estos complejos de chaperona formados transitoriamente en distintos compartimentos celulares de células eucariotas. Nuestro trabajo amplía el empleo de PLA de células humanas a levaduras (Saccharomyces cerevisiae) y bacterias (Escherichiacoli), lo que convierte en una herramienta importante para monitorear la dinámica de los conjuntos de proteínas formadas transitoriamente en ambos células procariotas y eucariotas.
Introduction
Una gran cantidad de información genómica sigue siendo ininterpretable debido a nuestra comprensión incompleta de los interactomes celulares. Las metodologías convencionales de detección de interacciones proteína-proteína, como la coinmunoprecipitación proteína con/sin reticulación química y la colocalización proteica, aunque ampliamente utilizadas, plantean una serie de desventajas. Algunas de las principales desventajas incluyen la cuantificación deficiente de las interacciones y la posible introducción de eventos de enlace no nativos. En comparación, las técnicas emergentes basadas en proximidad proporcionan una alternativa y un enfoque potente para capturar interacciones proteicas en las células. El ensayo de ligadura de proximidad (PLA)1, ahora disponible como un kit patentado, emplea anticuerpos para apuntar específicamente a los complejos proteicos en función de la proximidad de las subunidades que interactúan.
El PLA se inicia mediante la formación de un andamio que consiste en anticuerpos primarios y secundarios conpequeñas etiquetas de ADN (sondas PLA) en la superficie del complejo proteico objetivo (Figura 1, pasos 1-3). A continuación, determinada por la proximidad de las etiquetas de ADN, se genera una moléculade ADN circular a través de la hibridación con oligonucleótidos conectores (Figura 1, paso 4). La formación del ADN circular se completa con un paso de ligadura de ADN. La pieza circular de ADN (PCR) recién formada sirve como plantilla para la posterior reacción en cadena de la polimerasa (PCR) basada en amplificación de círculo rodante (RCA) cebada por una de las etiquetas de oligonucleótidos conjugadas. Esto genera una molécula de ADN concatemérica de una sola cadena unidaal complejo proteico a través del andamio de anticuerpos (Figura 1, paso 6). La molécula de ADN concatemérico se visualiza utilizando oligonucleótidos etiquetados fluorescentemente que hibridan en múltiples secuencias únicas dispersas a través del ADN amplificado (Figura1,paso 7)2. La señal PLA generada, que aparececomo un punto fluorescente (Figura 1, paso 7), corresponde a la ubicación del complejo proteico objetivo en la célula. Como resultado, el ensayo podría detectar complejos proteicos con alta precisión espacial. La técnica no se limita a simplemente capturar interacciones proteicas, sino que también podría utilizarse para detectar moléculas individuales o modificaciones de proteínas en proteínas con alta sensibilidad1,2.
Hsp70 forma un sistema de chaperona altamente versátil fundamentalmente importante para mantener la homeostasis de proteínas celulares participando en una serie de funciones domésticas y asociadas al estrés. Las actividades de limpieza del sistema de chaperone Hsp70 incluyen plegado de proteína sin novo, translocación de proteínas a través de membranas celulares, montaje y desmontaje de complejos proteicos, regulación de la actividad proteica y vinculación de diferentes plegados proteicos/ máquinas de control de calidad3. El mismo sistema de chaperone también vuelve a doblar las proteínas mal dobladas/desplegadas, previene la agregación de proteínas, promueve la desagregación de proteínas y coopera con las proteasas celulares para degradar las proteínas terminales mal dobladas/dañadas para facilitar la reparación celular después de estrés proteotóxico4,5. Para lograr esta diversidad funcional, el acompañante Hsp70 se basa en cochaperones asociados de la familia JDP y factores de intercambio de nucleótidos (NEF) que ajustan el control alostérico dependiente del ATP del Hsp70 de la unión y liberacióndesustratos3, 6. Además, los cochaperones JDP desempeñan un papel vital en la selección de sustratos para este versátil sistema de chaperón. Los miembros de esta familia se subdividen en tres clases (A, B y C) basadas en su homología estructural al prototipo JDP, el E. coli DnaJ. Los JDP de clase A contienen un dominio J de N-terminal, que interactúa con Hsp70, una región rica en glicina-fenilalanina, una región de unión de sustrato que consta de una región similar a un dedo de zinc (ZFLR) y dos dominios de barril, y un dominio de dimerización de terminal C. Los JDP con un dominio J n-terminal y una región rica en glicina-fenilalanina, pero que carecen de ZFLR, entran en la clase B. En general, los miembros de estas dos clases están involucrados en funciones de chaperoning. Los miembros comprendidos en la clase catchall C, que contiene JDP que solo comparten el dominio J4, reclutan Hsp70s para realizar una variedad de funciones no acompañantes. El importante papel de los JDP como "adaptadores" intercambiables de reconocimiento de sustratos del sistema Hsp70 se refleja en una expansión de los miembros de la familia durante la evolución. Por ejemplo, los seres humanos tienen más de 42 miembros distintos de JDP4. Estos JDP funcionan como monómeros, homodímeros y/o homo/hetero oligomeros4,5. Recientemente, una cooperación funcional a través de la formación compleja transitoria entre la clase A (por ejemplo, H. sapiens DNAJA2; S. cerevisiae Ydj1) y clase B (por ejemplo, H. sapiens DNAJB1; S. cerevisiae Sis1) JDPs eucariotas se informó para promover el reconocimiento eficiente de los agregados de proteína amorfo in vitro7,8. Estos complejos JDP de clase mixta se ensamblan presumiblemente en la superficie de las proteínas agregadas para facilitar la formación de desgas de proteínas a base de Hsp70- y Hsp70+Hsp1007,8,9, 10. La evidencia crítica para apoyar la existencia de estos complejos JDP de clasemixta formados transitoriamente en células eucariotas fue proporcionada con PLA 8.
PLA se emplea cada vez más para evaluar las interacciones proteicas en metazoa, principalmente en células de mamíferos. Aquí, informamos de la expansión exitosa de esta técnica para monitorear complejos de chaperone formados transitoriamente en organismos unicelulares eucariotas y procariotas como la levadura en ciernes S. cerevisiae y la bacteria E. coli. Es importante destacar que esta expansión pone de relieve el uso potencial del PLA en la detección y análisis de microbios que infectan células humanas y animales.
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Protocol
1. Preparación de células HeLa
- Preparar los siguientes materiales: PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1,8 mM KH2PO4), pH 7,4; DMEM, complementado con 10% FCS y 1% Pen-Strep; 4% paraformaldehyde en PBS; 0.5% Tritón-X100 en PBS; TBS-T (150 mM NaCl, Tris de 20 mM, 0,05% Tween), pH 7,4; 0.0001% solución estéril de poli-L-lisina; Diapositivas de diagnóstico de 10 pozos; una cámara húmeda; papel tisú; y tarros de manchas deslizantes de Coplin.
NOTA: Para garantizar una eficiencia óptima de fijación, las soluciones de paraformaldehído deben prepararse frescas antes de cada experimento. - Prepare una cámara húmeda cubriendo la parte inferior de una caja cerrada con tejidos húmedos. Colocar la cámara húmeda a 37oC antes de iniciar el experimento, para asegurarqueque que la temperatura de la cámara esté a 37oC mientras incuba las reacciones enzimáticas.
- Células HeLa de cultivo en matraces T25, en 5 mL de DMEM (alta glucosa, glutamato y piruvato sódico suplementado) suplementadas con 10% FCS y 1% Pen-Strep, en una incubadora de CO2 de 37oC que contiene 5% CO2. Disociar las células adherentes usando 0.05% Trippsin-EDTA. Después de la adición de DMEM fresco a las células disociadas, contar las células usando una cámara de conteo celular y crecer en diapositivas de diagnóstico dentro de una cámara húmeda.
- Esterilice las diapositivas de diagnóstico por irradiación UV en una campana de cultivo celular estéril durante 30 minutos.
- Añadir 100 l de estéril filtrado 0.0001% poli-L-lisina a cada pocedés necesario para el experimento. Incubar durante 30 min. Lavar el exceso de poli-L-lisina lavando cada pozo 3x con 50 s de agua ultrapura.
- Intenta tapizar las células de HeLa y agrega aproximadamente 15.000 células a cada pocal. Si es necesario, diluir las células a por lo menos 30-50 l de DMEM por poca.
- Cultivar células en una cámara húmeda dentro de una incubadora de CO2 de 37oC al 5% durante aproximadamente 24 h. Las células deben ser de entre 60% y 80% de confluente antes de iniciar el PLA.
NOTA: Una confluencia demasiado alta disminuye la absorción de los reactivos, disminuyendo la señal obtenida al final del protocolo. - Retire el medio colocando un papel tisú en el borde del pozo. Lavar los pozos 3 veces con 50 oL de PBS.
NOTA: Las células están sujetas a desprendimiento cuando los líquidos se añaden con dureza. Esto se puede prevenir al no dejar que los pozos se sequen por completo antes de añadir nuevo líquido y añadiendo el nuevo líquido suavemente al borde del pozo. - Arreglar las células agregando 50 sL de paraformaldehído del 4% recién preparado en PBS a cada poca. Incubar durante 10 min a temperatura ambiente.
- Lave los portaobjetos 3x en PBS. Realice lavados en un frasco de manchas deslizantes de Coplín que contenga 100 ml de PBS. Para cada lavado, incubar durante 5 minutos a temperatura ambiente sin agitar.
- Permeabilizar la membrana celular sumergiendo las diapositivas en 100 ml de 0.5% Triton-X100 en PBS en un frasco de tinción deslizante Coplin. Incubar durante 10 min a temperatura ambiente sin agitar.
- Lave los portaobjetos 3 veces en TBS-T. Realice lavados en un frasco de manchas deslizantes de Coplin que contenga 100 ml de TBS-T. Para cada lavado, incubar durante 5 minutos a temperatura ambiente sin agitar.
- Después del último lavado, retire el exceso de tampón con un papel tisú. En este punto, las celdas están listas para el protocolo de ensayo de ligadura de proximidad que se discutirá en la sección 4.
2. Preparación celular de S. cerevisiae
- Preparar los siguientes materiales: 100 mM KPO4,pH 6.5, conocido como Wash Buffer; 37% de formaldehido; 4% paraformaldehyde en 100 mM KPO4, pH 6.5; 1.2 M sorbitol en 100 mM KPO4, pH 6.5; solución de liticasa (500 g/ml de liticasa, 20 mM demercaptoetanol, 100 mM de KPO 4, pH 6,5); 0.0001% solución de poli-L-lisina; 1% Tritón-X100 en 100 mM KPO4, pH 6.5; Diapositivas de diagnóstico de 10 pozos; una cámara húmeda (preparada como en el paso 1.2); papel tisú; y tarros de manchas deslizantes de Coplin.
NOTA: Para garantizar una eficiencia óptima de fijación, las soluciones de paraformaldehído deben prepararse frescas antes de cada experimento. - Cultivar un cultivo nocturno en extracto de levadura no selectivo, peptona y dextrosa (YPD) medio a 30 oC mientras se agita.
NOTA: Dependiendo de los requisitos experimentales S. cerevisiae células se pueden cultivar en sintético completo (SC) medio o selectivo sintético mínimo (SM) medio en su lugar. - Diluir el cultivo estacionario a una Do6600 de 0,1 en un medio de 20 ml. Cultivar las células a 30 oC mientras se agita hasta que el OD600 alcanza 0,5.
- Transfiera el cultivo de 20 ml a un tubo centrífugo de 50 ml. Reventar las células por centrifugación a 665 x g durante 3 min. Retire el sobrenadante. Resuspender las células en 5 ml de medio fresco.
- Corrija las celdas agregando 550 sL de 37% de formaldehído al cultivo. Incubar a temperatura ambiente durante 15 min.
- Reventar las células por centrifugación a 665 x g durante 3 min. Retire el sobrenadante. Resuspenda el pellet en 1 ml de paraformaldehído al 4% recién preparado en Wash Buffer. Incubar durante 45 min a temperatura ambiente.
- Durante la incubación, preparar las diapositivas de diagnóstico mediante la adición de 100 l de 0.01% solución de poli-L-lisina a cada pozo. Incubar los portaobjetos durante 30 min a temperatura ambiente.
- Después de 30 minutos, lavar el exceso de poli-L-lisina con agua ultrapura y dejar que los portaobjetos se sequen al aire. Los portaobjetos secos están listos para su uso.
- Lave las células dos veces con 1 ml de Wash Buffer. Realice lavados centrifugación de las células a 665 x g durante 3 min. Retire el sobrenadante y vuelva a suspender las células en Wash Buffer.
- Reventar las células por centrifugación a 665 x g durante 3 min. Retire el sobrenadante. Resuspenda las células en 1 ml de sorbitol de 1,2 M en Wash Buffer.
- Reventar las células por centrifugación a 665 x g durante 3 min. Retire el sobrenadante. Resuspenda el pellet en 250 ml de solución de litica recién preparada para digerir la pared celular. Incubar las células en la solución de Lyticase durante 15 min a 30 oC mientras agita.
- Después de la digestión, lavar las células 3 veces por centrifugación a 665 x g durante 3 min y eliminar el sobrenadante. Resuspenda las células en 250 ml de sorbitol de 1,2 M en Wash Buffer.
NOTA: Debido a que las células son frágiles después de la digestión de la pared celular, resuspenderlas con mucho cuidado para no dañar las células. - Añadir 20 l de células resuspendidas a las diapositivas recubiertas de poli-L-lisina. Permítales fijarlos a las diapositivas durante 30 minutos. Lavar las células no adherentes lavando los pozos 3x con 50 l de wash Buffer.
- Permeabilizar la membrana celular lavando 3x con 50 éL de 1% Triton-X en Wash Buffer.
NOTA: En este punto, las celdas están listas para el protocolo de ensayo de ligadura de proximidad que se discutirá en la sección 4.
3. Preparación celular de E. coli
- Preparar los siguientes materiales: PBS-T (140 mM NaCl, 2 mM KCl, 8 mM K2HPO4, 1,5 mM KH2PO4, 0,05% Tween-20), pH 7,4; solución de lisozyme (2 mg/ml de lisozima, 25 mM Tris-HCl pH 8.0, 50 mM Glucosa, 10 mM EDTA); 0.0001% solución de poli-L-lisina; 99% metanol helado; 99% metanol a temperatura ambiente; 99% acetona; Diapositivas de diagnóstico de 10 pozos; una cámara húmeda (preparada como en el paso 1.1.1); papel tisú; y tarros de manchas deslizantes de Coplin.
- Cultivar un cultivo nocturno en Luria-Bertani (LB) medio a 30 oC mientras tiembla.
- Diluir el cultivo estacionario a una OD600 de 0.02 en medio LB fresco. Cultivar las células a 30 oC mientras se agita hasta que el OD600 alcanza 0,4 para las células de fase de registro.
- Aproximadamente 15 minutos antes de que las células alcancen una DoT600 de 0.4, prepare diapositivas recubiertas de poli-L-lisina agregando 100 sL de 0.0001% poli-L-lisina a cada poca. Incubar los portaobjetos durante 30 min a temperatura ambiente.
- Después de 30 minutos lavar el exceso de poli-L-lisina con agua ultrapura y dejar que los portaobjetos se sequen al aire. Los portaobjetos secos están listos para su uso.
- Cuando las células alcancen una DoT600 de 0,4, transfiera 1 ml del cultivo a un tubo de microcentrífuga estéril y a células de pellets a 2.650 x g durante 2 min.
- Resuspenda las células en un medio de 50 oL de LB.
- Fije las células añadiendo 1 ml de metanol 99% helado. Mezclar muy suavemente a mano. Incubar células durante 30 min a -20 oC.
- Después de la fijación añadir 20 l de las células a las diapositivas recubiertas de poli-L-lisina. Deje que los portaobjetos se sequen al aire durante 30 minutos.
- Añadir 50 l de solución de lisozyme recién preparada a cada pocto para digerir la pared celular. Incubar en una cámara húmeda durante 30 min a 25oC.
- Retire la solución de lisozyme de los pozos añadiendo un papel tisú al borde del pozo. Lave los portaobjetos 3x en 100 mL de PBS-T. Realice cada lavado en un frasco de manchas deslizantes de Coplin durante 30 s, sin agitar.
- Retire el tampón de lavado de las diapositivas tocando las diapositivas en un papel tisú.
- Permeabilizar las membranas celulares mediante la adición de 50 l de metanol 99% a cada poca. Incubar durante 1 min a temperatura ambiente.
- Retire el metanol colocando un papel tisú en el borde del pozo.
- Añadir 50 s l de acetona del 99% a cada poca. Incubar durante 1 min.
- Retire el exceso de acetona colocando un papel tisú en el borde del pozo. Deje que los portaobjetos se sequen al aire. En este punto, las celdas están listas para el protocolo de ensayo de ligadura de proximidad que se discutirá en la sección 4.
4. Ensayo de ligadura de proximidad
- Preparar los siguientes materiales: Zona de influencia de bloqueo; Búfer de dilución de anticuerpos; Búfer de lavado 'A' – (10 mM Tris, 150 mM NaCl, 0.05% Tween-20) pH 7.4; Búfer de lavado 'B' – (Tris de 200 mM, 100 mM NaCl) pH 7,4; Anti-Rabbit Secondary Anticuerpo PLUS; Anti-Mouse Secondary Anticuerpo MINUS; 5x Tampón de Ligación; ligasa; 5x Tampón de Amplificación (Naranja:ex 554 nm; áem 576 nm); polimerasa; agua ultrapura; y medio de montaje que contiene DAPI.
NOTA: Los reactivos de detección de PLA también están disponibles en las variantes Verde (por ejemplo, 495 nm;a em 527 nm), Rojo (ex 594 nm; áem 624 nm), FarRed (ex 644 nm;á em 669 nm) o Brightfield (peroxidasa de rábano picante (HRP) conjugado). - Bloquee las celdas agregando una gota de búfer de bloqueo a cada pozo. Incubar durante 30 min a 37oC en una cámara húmeda.
- Preparar soluciones de anticuerpos diluyendo anticuerpos en stock en El tampón de dilución de anticuerpos. Para cada pocil se requieren 40 l de solución de anticuerpos.
- Retire el tampón de bloqueo colocando un papel tisú en el borde del pozo. Añadir 40 l de anticuerpo diluido en el tampón de dilución de anticuerpos a cada poca. Incubar durante 60 minutos en una cámara húmeda a 37oC o durante la noche a 4oC.
- Retire la solución de anticuerpos de los pozos colocando un papel tisú en el borde del pozo. Lave los portaobjetos 2veces en 100 ml de Wash Buffer 'A' en un tarro de tinción deslizante de Coplin durante 5 min, sin agitar.
- Durante los pasos de lavado, diluir 5 x sondas secundarias de anticuerpos, anticonejo PLUS y anti-ratón MINUS (la especificidad de la especie de las sondas depende de los anticuerpos primarios utilizados), en Tampón de Dilución de Anticuerpos. Preparar 40 ml de solución de anticuerpos por poca.
- Añadir 40 s de solución de anticuerpos secundarios a cada poca. Incubar durante 60 min a 37oC en cámara húmeda.
- Retire la solución secundaria de anticuerpos de los pozos colocando un papel tisú en el borde del pozo. Lave los portaobjetos 2veces en 100 ml de Wash Buffer 'A' en un tarro de tinción deslizante de Coplin durante 5 min, sin agitar.
- Durante los lavados se preparan 40 ml de mezcla de ligadura por poca, mezclando 8 ml de tampón de ligadura 5x, 31 ml de agua ultrapura y 1 l de ligasa.
- Añadir 40 s de mezcla de ligadura a cada poca. Incubar durante 30 min a 37oC en una cámara húmeda.
- Retire la mezcla de ligadura de los pozos colocando un papel tisú en el borde del pozo. Lave los portaobjetos 2veces en 100 ml de Wash Buffer 'A' en un tarro de tinción deslizante de Coplin durante 2 min, sin agitar.
- Durante los lavados, preparar 40 ml de mezcla de amplificación por poca, mezclando 8 ml de solución de amplificación de 5x, 31,5 ml de agua ultrapura y 0,5 ml de polimerasa.
NOTA: La amplificación 5x contiene sondas fluorescentes. Proteja esta mezcla de la luz. Además, proteja las diapositivas de la luz durante cada uno de los siguientes pasos. Si utiliza frascos de manchas deslizantes de Coplin translúcidos y cámaras húmedas, envuélvalos en papel de aluminio. - Añadir 40 s de mezcla de amplificación por poca. Incubar durante 100 min a 37oC en una cámara húmeda.
- Retire la mezcla de amplificación de los polos. Lave los portaobjetos 2veces en 100 ml de Wash Buffer 'B' en un frasco de tinción deslizante coplin durante 10 minutos sin agitar.
- Lave los portaobjetos en 100 ml de Wash Buffer 'B' diluido 1:100 en agua ultrapura en un frasco de tinción deslizante Coplin durante 30 s.
- Añadir 20 s de DAPI que contenga medio de montaje por pozo a las diapositivas. Cierre las diapositivas con un cubreobjetos y cierre las diapositivas con esmalte de uñas.
- Si toma imágenes, incubar inmediatamente DAPI que contenga medio de montaje durante 10-15 min, mientras esté protegido de la luz. Si no es así, guarde las diapositivas a -20 oC durante un máximo de 1 semana, protegidas de la luz.
5. Detección
- Utilice la microscopía confocal para adquirir imágenes de las células HeLa, S. cerevisiae y E. coli con objetivos de Apochromat de plan 20x/0.8 NA, 63x/1.4 NA y 100x/1.4 NA Plan Apochromat, respectivamente. Emocione dAPI manchado de ADN con un láser de diodo pulsado de 405 nm. Para la señal PLA (para este estudio) excitar con un láser de estado sólido de 561 nm.
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Representative Results
Nuestros estudios in vitro anteriores con proteínas purificadas revelaron que un subconjunto de JDP de clase A y Clase B forman complejos JDP de clase mixta transitoria para apuntar eficientemente a una amplia gama de proteínas agregadas y posiblemente facilitar el montaje de Hsp70-basado en desgastegas proteicas7. Empleamos PLA para determinar si los complejos JDP de clase mixta (A+B) ocurren en células de cáncer de cuello uterino humano (HeLa). Los JDP humanos DNAJA2 (clase A) y DNAJB1 (clase B) fueron atacados con anticuerpos primarios muy específicos y sondas secundarias de PLA (Figura2A-C). La aparición de punctadas fluorescentes rojas indicaba la presencia de complejos de clase mixta DNAJA2 y DNAJB1 en células HeLa (Figura 2C) confirmando nuestros hallazgos bioquímicos anteriores7. Cada punctum representa un evento de interacción proteica individual en el citosol/núcleo de la célula de HeLa.
Resultados bioquímicos anteriores obtenidos de la transferencia de energía por resonancia de Farster (FRET), que detecta las interacciones proteicas como una lectura de la cantidad de energía transferida de un fluoróforo de donante excitado unido a una proteína a un fluoróforo de aceptación adecuado unida a la segunda proteína, indicó que también podrían producirse complejos similares de clase mixta entre los JDP de levadura, in vitro8. Confirmando nuestros hallazgos bioquímicos, observamos la formación de complejos de clase mixta entre células Ydj1 (clase A) y Sis1 (clase B) en células unicelulares de eucariota S. cerevisiae (levadura de panadero) con PLA (Figura2F). En la levadura, debido a su pequeño tamaño de celda y la carbonescencia de múltiples punctadas, los puntos fluorescentes individuales generados por pLA a menudo podrían ser menos distinguibles. Se observó una disminución considerable en la formación de punctadas fluorescentes después del derribo o derribo de los JdP que interactúan en células humanas y de levadura8, lo que demuestra la alta especificidad del PLA en la captura de estos complejos de co-chaperone en diferentes tipos de células. A diferencia de sus homólogos eucariotas, los JDP procariotas (E. coli) careceden de la capacidad de formar complejos JDP de clase mixta y cooperar funcionalmente para aumentar la desagregación de proteínas, in vitro8. De acuerdo con el análisis bioquímico, no observamos la formación compleja de clase mixta JDP entre dnaj-YFP bacteriano (clase A) y CbpA-mCherry (clase B), los únicos JDP en E. coli (Figura 2I). Sin embargo, nuestra configuración de PLA pudo capturar otros conjuntos de acompañantes que involucran a los dos JDP. Por ejemplo, detectamos complejos de chaperona entre DnaJ-YFP y DnaK (bacterial Hsp70) (Figura2L)y CbpA-mCherry y DnaK8 (datos no mostrados). Estos dos complejos de chaperona bacteriana secaracterizan ampliamente tanto in vitro como in vivo 8,11,12 confirmando así nuestros resultados de PLA. Juntos, estas observaciones demuestran la capacidad del ELA para capturar de forma robusta máquinas de chaperona formadas transitoriamente en células eucariotas y procaperoticas unicelulares/multicelulares. Los controles técnicos que carecen de un anticuerpo primario contra uno de los JDP/chaperones que interactúan, pero que contienen sondas PLA secundarias derivadas del ratón y el conejo, mostraron poca o ninguna señal de fluorescencia de fondo (Figura2A, B,D,E,G,H, J,K) indicando una falta de amplificación de señal falsa positiva en nuestra configuración experimental.
Figura 1: Representación esquemática de los pasos cronológicos del ensayo de ligadura de proximidad. (1) Complejo entre la proteína A y la proteína B. (2) Unión de anticuerpos primarios (1o) (verde y marrón claro) a proteínas A y B. Los dos anticuerpos primarios deben criarse en diferentes especies anfitrionas (por ejemplo, ratón, conejo o cabra). (3) Los anticuerpos primarios son reconocidos por anticuerpos secundarios específicos de la especie (2o) unidos covalentemente con oligoetiquetas de ADN (sondas PLA). (4) Cuando las proteínas A y B están en complejos, las sondas PLA enlazadas están muy cerca para facilitar que los oligos de ADN se hibridan con hebras de ADN del conector, lo que resulta en la formación de una molécula de ADN circular. Posteriormente, una ligasa de ADN facilita la unión de las hebras de ADN mediante la catalización de la formación de un enlace de fosfodiester. (5) Iniciación de la Amplificación del Círculo Rodante (RCA) de la molécula de ADN circular por una polimerasa de ADN bacteriana a 37oC. La reacción de LACR está cebada por una de las oligoetiquetas de ADN conjugadas con anticuerpos. (6) Generación de una molécula de ADN concatemérico de una sola cadena unida a uno de los anticuerpos secundarios. (7) Hibridación de sondas de oligonucleótidos complementarios con etiqueta fluorescente a una secuencia repetitiva única en la molécula de ADN concatemérico. Después del paso de hibridación, la molécula de ADN concatemérico podría visualizarse como un punto fluorescente brillante en la ubicación del complejo proteico objetivo en células fijas. La parte inferior denota los tipos de células procariotas y eucariotas en los que se aplica la técnica PLA. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. Conjuntos de acompañantes moleculares capturados por PLA en células procariotas y eucariotas. (A-C) Detección de complejos JDP de clase mixta formados entre DNAJA2 (clase A) y DNAJB1 (clase B) en la línea de células de cáncer de cuello uterino humano HeLa. PLA realizado con (A) anticuerpo anti-DNAJA2 solo (control técnico negativo); (B) anticuerpo anti-DNAJB1 solo (control técnico negativo); (C) anticuerpos anti-DNAJB1 y anti-DNAJA2 juntos. La aparición de múltiples puntos fluorescentes en el panel C (señal positiva) indica la presencia de complejos proteicos formados entre DNAJA2 y DNAJB1. Cada punto fluorescente rojo/punctum representa una sola interacción. Núcleos (ADN) teñidos con DAPI (cian). (D-F) Detección de complejos JDP de clase mixta formados entre Ydj1 (clase A) y Sis1 (clase B) en células S. cerevisiae. (D) PLA realizado solo con anticuerpo anti-Ydj1 (control técnico negativo); (E) PLA realizado solo con anticuerpos anti-Sis1 (control técnico negativo); (F) PLA realizado con anticuerpos anti-Ydj1 y anti-Sis1 juntos. La señal fluorescente positiva denota la presencia de los complejos Ydj1 y Sis1 en S. cerevisiae. Núcleos de levadura teñidos con DAPI (cian). (G-L) Detección de complejos de chaperona formados entre Hsp70 procariota (DnaK) y JDPs (DnaJ y CbpA) en células de E. coli. Debido a la falta de anticuerpos primarios específicos contra los JDP procariotas, el E. coli DnaJ (clase A) y el CbpA (clase B) fueron etiquetados con YFP y mCherry, respectivamente. (G, J) PLA realizado solo con anti-YFP (control técnico negativo); (H) PLA realizado solo con anti-mCherry (control técnico negativo). (I) PLA realizado con anticuerpoanti-YFP y anti-mCherry. La falta de formación de puntos fluorescentes indica que no hay formación compleja entre DnaJ y CbpA. (K) PLA realizado solo con anticuerpoanti-DnaK (control técnico negativo). (L) PLA realizado con anticuerpos anti-YFP y anti-DnaK juntos. La señal fluorescente positiva indica una formación compleja entre DnaK y DnaJ. ADN bacteriano teñido con DAPI (cian). Además de contener un solo anticuerpo primario, todos los controles técnicos negativos se realizaron en presencia de las respectivas sondas de PLA secundarias. Barras de escala a 10 m.
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Discussion
Los enfoques basados en la co-inmunoprecipitación y la colocalización se han utilizado como métodos de larga data para caracterizar los ensambladores de proteínas. La detección de complejos de chaperona específicos formados transitoriamente es un desafío importante con estos métodos convencionales, y como resultado, los hallazgos anteriores se limitan en gran medida a interpretaciones cualitativas. Las técnicas de coinmunoprecipitación basadas en lisis celular a menudo requieren reticulación para estabilizar las interacciones proteína-proteína. La lisis celular aumenta el riesgo de interrumpir los complejos de chaperona formados transitoriamente, mientras que la retitulación podría introducir interacciones no nativas, particularmente impulsadas por la "pegajosidad" inherente de la mayoría de los chaperones. Al analizar el sistema de chaperona Hsp70 utilizando co-inmunoprecipitación, los artefactos potenciales podrían surgir de (a) altos niveles de expresión del chaperón y (b) problemas de solubilidad relacionados con máquinas de chaperona unida a la membrana o proteína agregada. Además, las técnicas basadas en la co-inmunoprecipitación no proporcionan información sobre la localización celular de los conjuntos de proteínas capturados, lo que podría ser importante para delinear las funciones asociadas. Los inconvenientes del uso de técnicas de co-inmunoprecipitación se reducen un poco en enfoques basados en la colocalización que preservan la información de localización de proteínas. Sin embargo, la colocalización de dos o más proteínas podría indicar la asociación directa proteína-proteína o la partición de proteínas en el mismo microdominio en las células. Por lo tanto, el análisis de co-localización es, en el mejor de los casos, especulativo en la predicción de interacciones proteicas y carece de cualquier valor de proximidad. Debido a la detección a granel e indiscriminada de las proteínas dirigidas, la técnica es muy limitada en el estudio de conjuntos de proteínas específicos en las células. Esto es particularmente problemático cuando las proteínas dirigidas podrían, en paralelo, formar una amplia gama de conjuntos de proteínas distintas como en el caso del sistema de chaperone Hsp70. En comparación con estas metodologías convencionales, PLA es una técnica in situ más refinada desarrollada para detectar y cuantificar de forma robusta las asociaciones de proteínas nativas en células con información de localización de proteínas conservada. Una interacción proteica se revela mediante este ensayo basado en la proximidad (aproximadamente 10-30 nm) entre las proteínas objetivo. PLA es "ajustable" en el que el rango de la distancia de proximidad podría reducirse para obtener una lectura más estricta mediante (a) la disminución de la longitud de las etiquetas de oligonucleótidos unidas a las sondas PLA y/o (b) conjugando las etiquetas directamente a los anticuerpos primarios. Se debe tener cuidado al interpretar una señal PLA positiva. Idealmente, una interacción proteica debe confirmarse con dos o más metodologías independientes. La intensidad de la señal fluorescente en PLA no está tan determinantemente relacionada con el tamaño del racimo de proteínas o la distancia de separación entre las proteínas que interactúan como es el caso de FRET. Sin embargo, pLA tiene un alto grado de especificidad y sensibilidad, e incluso podría ser utilizado para analizar proteínas muy bajas abundantes como factores de crecimiento o citoquinas y sus interacciones en tipos de células raras o muestras clínicas13.
El chaperón Hsp70 se asocia con múltiples cochaperones (por ejemplo, JDPs y NEFs) durante su vida útil celular14 para impulsar funciones biológicas distintas. El gran número de configuraciones probables de la máquina Hsp70-JDP-NEF y su comportamiento dinámico en las células han obstaculizado en gran medida una comprensión detallada de las funciones específicas de estas máquinas de chaperone. Por lo tanto, se requieren herramientas biológicas que permitan el rastreo selectivo de conjuntos Hsp70 distintos para diseccionar el cableado general de esta red de chaperonesen en las células. Los complejos de chaperón JDP-JDP y JDP-Hsp70 formados transitoriamente7 fueron capturados efectivamente en células con PLA, lo que indica que esta técnica es adecuada para estudiar interacciones moleculares con altas constantes de disociación (por ejemplo, >3 m Kd ). Aunque, en el trabajo actual, el ensayo se utiliza principalmente como un indicador binario tipo "sí" o "no" para la interacción de chaperón, los usuarios pueden emplear esta técnica para obtener lecturas semicuantitativas del grado de interacción contando digitalmente la fluorescencia intensidades de la señal15. Sin embargo, debido a la amplificación no lineal de la señal PLA, se debe tener precaución al interpretar los datos PLA de manera cuantitativa16. A pesar de las ventajas antes mencionadas, este método tiene ciertas limitaciones. Una de las principales desventajas del PLA es que el ensayo requiere la fijación celular, limitando en gran medida su capacidad para resolver la dinámica temporal de la complejidad proteica en células vivas. En comparación, in vivo FRET17 o Transferencia de Energía por Resonancia de Bioluminiscencia (BRET)18 permite el monitoreo de interacciones proteicas similares de una manera espacio-temporal en células vivas con valores de proximidad relativamente más pequeños (<10 nm). A diferencia de PLA, una señal FRET presenta una correlación lineal estricta con los niveles de expresión de proteínas16 haciendo de FRET el estándar de oro en el análisis cuantitativo de interacciones proteicas. Sin embargo, a diferencia de la dependencia de FRET del factor de orientación enigmático2, el PLA no se ve influenciado por la orientación de las sondas PLA, lo que aumenta la probabilidad de capturar un complejo proteico19. En términos de facilidad de uso, FRET y BRET requieren una experiencia única, lo que generalmente limita la accesibilidad de estas metodologías a la comunidad de investigación en general. Además, ambas técnicas requieren la modificación de las proteínas que interactúan mediante la unión de etiquetas de proteínaluminescentes/fluorescentes voluminosas que podrían interferir potencialmente con la función proteica y la formación compleja.
Los siguientes pasos (1-4) requieren una consideración cuidadosa para la implementación exitosa de PLA en las células. (1) Selección de anticuerpos: El kit PLA disponible comercialmente es compatible con anticuerpos primarios criados contra ratón, conejo y cabra solamente. El ELA requiere anticuerpos primarios muy específicos que no se unen a objetivos fuera de lugar. Además, es importante seleccionar anticuerpos primarios que sean compatibles con aplicaciones como la inmunohistoquímica (IHC), el ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) y/o la inmunoprecipitación (IP) para garantizar que los anticuerpos puedan reconocer secuencias de aminoácidos antigénicos expuestas en la superficie de las proteínas plegadas. Antes de su uso, se recomienda realizar pruebas de todos los anticuerpos primarios para su especificidad. Esto se puede realizar a través del análisis de manchas occidentales de lisados de células enteras. En los casos en que las proteínas objetivo tengan homólogos con pequeñas variaciones en el tamaño y la similitud de la secuencia (por ejemplo, paralogs Hsp70 y JDP), la especificidad de los anticuerpos podría probarse con enfoques de derribo/desmontaje de genes o sondeando contra homologs para descartar cualquier posible reconocimiento cruzado. Si no se dispone de anticuerpos adecuados, las proteínas dirigidas podrían etiquetarse con epítopos que tengan anticuerpos de calidad aceptable (Figura 2F). (2) Fijación y permeabilización de las células: Se podría utilizar un tratamiento de 4% de paraformaldehído y 0,1-0,5% de Tritón-X100 para fijar y permeabilizar células, respectivamente. El uso de 4% paraformaldehído es un mejor tratamiento para preservar las interacciones proteína-proteína y la ultraestructura celular en comparación con las condiciones fijativas que emplean 99% metanol20,21,22. Sin embargo, la fijación de células con 99% de metanol produce menos tinción de fondo citoplasma, y tal vez sea más adecuada para casos específicos como la detección de conjuntos de proteínas asociadas al citoesqueleto21,22. La permeabilización eficiente tanto de la membrana plasmática como de las membranas orgánulos para aumentar la accesibilidad de los anticuerpos podría lograrse con el tensioactivo no iónico Triton-X100. Sin embargo, Triton-X100 puede eliminar proteínas no específicamente de la membrana plasmática23,24. Por lo tanto, para el análisis de conjuntos de proteínas asociados con membranas celulares, se podrían aplicar detergentes alternativos como saponina o digitalina que se dirige a esteroles para permeabilizar membranas21,22,25. (3) Interrupción de la pared celular: Antes de la permeabilización de la membrana, se necesita un paso adicional que involucre enzimas líticas específicas para aumentar la penetrabilidad de los anticuerpos en los tipos celulares con paredes celulares (por ejemplo, hongos, células vegetales y bacterianas). Por ejemplo, empleamos liticase, que degrada el glucano para interrumpir la pared celular deS. cerevisiae26. Del mismo modo, elE. colipared celular fue interrumpida usando lisozyme, una enzima que se dirige a los peptidogglicanos27,28. La composición de la pared celular y la sensibilidad a la enzima lítica varían con diferentes condiciones de crecimiento26y la confluencia cultural29,30. Por lo tanto, la concentración de las enzimas líticas y los tiempos de digestión pueden variar y se debe tener cuidado para prevenir la sobredigestión o subdigestión de las células. Después de la digestión de la pared celular, las células son relativamente frágiles y requieren agentes de aglomeración como el sorbitol para que permanezcan intactas durante los pasos de lavado. (4) Amplificación del ADN: La ligadura de ADN y los pasos de reacción de PCR del círculo rodante son sensibles a las fluctuaciones de temperatura y humedad. Para garantizar una amplificación y reproducibilidad robustas del ADN del ensayo, estas reacciones deben realizarse a 37 oC en una cámara de humedad. Es importante destacar que se debe evitar que las células procecidas se sequen mientras se realiza el ensayo para evitar cualquier unión de anticuerpos no específicos y eventos de amplificación de ADN que podrían conducir a un aumento en la señal de fondo.
Teniendo en cuenta todas las cosas, la implementación de este ensayo no requiere una experiencia única e instrumentación sofisticada. El monitoreo exitoso de los complejos de chaperona JDP-JDP y JDP-Hsp70 ilustra la aplicación potencial de esta técnica para rastrear conjuntos de proteínas formados transitoriamente en todos los tipos de células. Nuestra implementación de la técnica en levaduras y bacterias aumenta significativamente la aplicabilidad del PLA para estudiar diversos procesos biológicos mediados por conjuntos de proteínas distintos en una amplia gama de organismos. Además, nuestro trabajo destaca el PLA como una nueva y prometedora herramientade interacción proteica para estudiar los cambios evolutivos que se producen a nivel molecular en todas las especies 8.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
NBN cuenta con el apoyo de una beca especial de reclutamiento de la Facultad de Enfermería de medicina y ciencias de la salud de la Universidad de Monash con financiación del Gobierno del Estado de Victoria y el Gobierno de Australia. Agradecemos a Bernd Bukau (ZMBH, Universidad de Heidelberg, Alemania) y Harm H. Kampinga (Departamento de Ciencias Biomédicas de Células y Sistemas, Universidad de Groningen, Países Bajos) por su inestimable apoyo y intercambio de reactivos, Holger Lorenz (ZMBH Imaging Facility, Universidad de Heidelberg, Alemania) por su apoyo con la microscopía confocal y el procesamiento de imágenes, y Claire Hirst (ARMI, Universidad de Monash, Australia) para la lectura crítica del manuscrito.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 37% Formaldehyde | Merck | 103999 | |
| Acetone | Sigma-Aldrich | 32201 | |
| anti-DNAJA2 antibody | Abcam | ab157216 | |
| anti-DNAJB1 Antibody | Enzo Life Sciences | ADI-SPA-450 | |
| anti-DnaK antibody | In house | ||
| anti-mCherry antibody | Abcam | ab125096 | |
| anti-Sis1 Antibody | Cosmo Bio Corp | COP-080051 | |
| anti-Ydj1 antibody | StressMarq Biosciences | SMC-150, | |
| anti-YFP antibody | In house | ||
| Coplin slide-staining jar | Sigma-Aldrich | S5516 | |
| Diagnostic slides | Marienfeld | 1216530 | |
| DMEM | Thermo-Fischer | 31966021 | |
| DuoLink In Situ Detection Reagents Orange | Sigma-Aldrich | DUO92007 | |
| DuoLink In Situ Mounting Medium + DAPI | Sigma-Aldrich | DUO82040 | |
| DuoLink In Situ PLA Probe Anti-Mouse MINUS | Sigma-Aldrich | DUO92004 | |
| DuoLink In Situ PLA Probe Anti-Rabbit PLUS | Sigma-Aldrich | DUO92002 | |
| DuoLink In Situ Wash Buffers, Fluorescence | Sigma-Aldrich | DUO82049 | |
| Fetal Calf Serum | Thermo-Fischer | 10082147 | |
| Lysozyme | Sigma-Aldrich | 62971 | |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 32213 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo-Fischer | 15070063 | |
| Poly-L-Lysine | Sigma-Aldrich | P47-07 | |
| Sorbitol | Sigma-Aldrich | S7547 | |
| Triton-X100 | Merck | 108643 | |
| Trypsin | Thermo-Fischer | 25300096 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
| Zymolase 100T / / Lyticase | United States Biological | Z1004 |
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