Summary
Ce protocole vise à décrire étape par étape la technique d’extraction et d’évaluation de la fonction cardiaque à l’aide de cardiomyocytes écorchés. Cette méthodologie permet la mesure et la modulation aiguë de la fonction myofilament à l’aide de petites biopsies congelées qui peuvent être recueillies à différents endroits cardiaques, des souris aux hommes.
Abstract
Dans cet article, nous décrivons les étapes nécessaires pour isoler un seul cardiomyocyte permeabilisé (« écorché ») et l’attacher à un appareil de mesure de la force et un moteur pour effectuer des études fonctionnelles. Ces études permettront de mesurer la rigidité cardiomyocyte (force passive) et son activation avec différentes solutions contenant du calcium (Ca2+) pour déterminer, entre autres: le développement maximal de la force, le myofilament Ca2+-sensibilité (pCa50),la cooperativité (nHill) et le taux de réaménagement de la force (ktr). Cette méthode permet également de déterminer les effets des médicaments agissant directement sur les myofilaments et de l’expression de protéines recombinantes exogènes sur les propriétés actives et passives des cardiomyocytes. Cliniquement, les études écorchées de cardiomyocyte mettent en évidence la pathophysiologie de beaucoup de maladies myocardiques et permettent l’évaluation in vitro de l’impact des interventions thérapeutiques ciblant les myofilaments. Au total, cette technique permet de clarifier la pathophysiologie cardiaque en étudiant les corrélations entre les paramètres in vitro et in vivo dans les modèles animaux et les tissus humains obtenus lors d’une chirurgie à cœur ouvert ou d’une greffe.
Introduction
Traditionnellement, l’évaluation des propriétés mécaniques myocardiques a été essayée la plupart du temps dans les préparations multicellulaires, telles que les muscles papillaires et le trabeculae1,2. Les bandes multicellulaires de muscles cardiaques incluent une population hétérogène de cellules, y compris les cardiomyocytes contractiles avec un modèle inconnu d’orientation et de génération de force, l’activité électrique et les distributions de stress/tension aussi bien qu’une matrice environnante de tissu conjonctif3,4. Une préparation sans collagène et contenant un seul cardiomyocyte permettrait de mesurer la longueur du sarcomère et les propriétés contractiles croisées d’une manière très précise etcontrôlée 5,6. Par conséquent, au cours des quatre dernières décennies, plusieurs méthodologies ont été développées permettant d’étudier les propriétés mécaniques, contractiles et de relaxation d’un seul cardiomyocyte6,7. La fonction contractile de ces cellules dépend fortement de la longueur du sarcomère et de la cinétique du cycle transmanie3. Ainsi, il est souhaitable d’étudier la fonction musculaire directement dans les cellules cardiaques isolées simples, considérant qu’il permet d’évaluer la longueur et la performance du sarcome ainsi que la fonction transversale et les propriétés contractiles. Cependant, isoler et attacher des cardiomyocytes fonctionnels avec une résolution optique raisonnable de sarcomere tout en enregistrant la mesure de force au niveau de μN est toujoursprovocant et évoluant 3,6. D’autres défis sont la logistique qui doit être installée pour isoler les cardiomyocytes des biopsies fraîchement recueillies. L’imprévisibilité de la collecte de biopsies humaines, par exemple, peut compromettre la faisabilité des expériences.
En outre, les préoccupations éthiques concernant le remplacement, la réduction et le raffinement de l’expérimentation animale pour les procédures scientifiques (principes des 3R) ont favorisé les changements d’étude au niveau cellulaire et tissulaire, de préférence dans les biopsies humaines, ou dans les échantillons d’animaux plus petits. En effet, un raffinement progressif des méthodologies d’évaluation in vitro de la fonction cardiaque à un plus petit niveau de complexité permet une bonne intégration des résultats à l’ensemble du corps et de les traduire au scénario clinique7. Au total, l’utilisation d’échantillons stockés à -80 °C pour extraire les cardiomyocytes peut être une alternative attrayante.
Le tissu myocardique est coupé en petits morceaux et homogénéisé avec un mortier et un pilon. Le résultat de cette homogénéisation est une suspension des cellules empaquetées et isolées écorchées avec des degrés variables de dommages sarcolemmal, dans lequel le myoplasme est exposé au milieu de bain et tous les composants cellulaires sont lavés. Des structures telles que les myofibriles qui sont plus loin de la sarcolemma sont préservées. Ainsi, le raccourcissement sarcomere et les propriétés fonctionnelles associées à l’appareil myofibrillar sont maintenus intacts et peuvent êtreenregistrés 8,9.
Le système de mesure de la force cardiomyocyte se compose d’un moteur électromagnétique, utilisé pour ajuster la longueur des cardiomyocytes, et d’un transducteur de force, qui mesure la contraction cardiomyocyte isométrique. Un cardiomyocyte perméabilisé ou écorché est placé dans une chambre expérimentale contenant une solution relaxante ([Ca2+] < 10 nM) et collée au silicium à 2 aiguilles minces : l’une attachée au moteur et l’autre au transducteur de force. Un système optique est utilisé pour déterminer la morphologie des cardiomyocytes et la longueur du sarcome. Le protocole expérimental consiste souvent en une série d’enregistrements de force sur des solutions tampons contenant différentes concentrations de Ca2+, la détermination de la cinétique entre actine et myosine et la mesure de la tension passive des cardiomyocytes montés à des longueurs de sarcomere prédéfinies (figure 1). L’isolement des cardiomyocytes perméabilisés des échantillons myocardiques congelés dans de l’azote liquide (et ensuite stockés à -80 °C) est une technique qui utilise la mécanique cellulaire et la biochimie protéique pour mesurer la force maximale ca2+activée (active) par zone transversale (Tactive,kN◊m-2),Ca2+-indépendante tension (passive) (Tpassive,kN◊m-2),myofilaments Ca2+-sensibilité (pCa50),monofilaments cooperativity (nHill), taux de réaménagement de la force (ktr) ainsi que dépendances de longueur sarcomere de Tactive,Tpassive, pCa50, nHill et ktr.
Le but de ce protocole est d’illustrer et de résumer le potentiel du système de mesure de la force cardiomyocyte comme une procédure fiable pour évaluer les propriétés mécaniques fonctionnelles des cardiomyocytes à peau unique isolés d’échantillons congelés de différentes espèces.
Protocol
Toutes les expériences sur les animaux sont conformes au Guide pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire (publication n° 85-23 des NIH, révisée en 2011) et à la loi portugaise sur le bien-être animal (DL 129/92, DL 197/96; P 1131/97). Les autorités locales compétentes ont approuvé ce protocole expérimental (018833).
1. Préparation des solutions de stock( Tableau 1)
- Préparez 1 000 mL de solution relaxante pour l’isolement des cardiomyocytes (RELAX-ISO) en suivant les instructions du tableau 2. Dissoudre le reagent ci-dessus ≈500 mL et ajuster le pH à 7,0 avec KOH. Réglez le volume final à 1000 mL.
- Distribuez RELAX-ISO dans des tubes de 50 mL. Conserver à -20 °C.
- Préparez 250 mL de solution d’activation en suivant les instructions du tableau 3. Dissoudre les reagents ci-dessus ≈ 100 mL d’eau ultra-pure. Réglez le pH à 7,1 avec 5 M KOH à 15 °C.
REMARQUE : Habituellement, il est nécessaire d’ajouter une quantité significative de KOH pour atteindre le pH désiré. Mettez le ballon volumétrique dans une boîte avec de la glace pour refroidir la solution à 15 °C.- Réglez le volume final à 250 mL. Agitez cette solution en continu avec un agitateur magnétique jusqu’au moment de la mélanger avec la solution relaxante.
- Préparez 100 mL de solution relaxante en suivant les instructions du tableau 4. Dissoudre les reagents ci-dessus ≈50 mL d’eau ultra-pure. Réglez le pH à 7,1 avec KOH 5 M à 15 °C.
REMARQUE: Habituellement, il est nécessaire d’ajouter une quantité importante de KOH pour atteindre un pH de 7,1. Placez le ballon volumétrique dans une boîte remplie de glace pour refroidir la solution à 15 °C. La résistance ionique des solutions utilisées pendant les mesures s’est élevé à 180 mM.- Réglez le volume final à 100 mL. Agiter cette solution en continu avec un agitateur magnétique jusqu’au moment de la mélanger avec la solution d’activation.
- Mélangez des solutions d’activation et de détente dans les proportions présentées dans le tableau 5 pour obtenir des solutions pCa entre 5,0 et 6,0.
- Continuez toujours à détendre et à activer des solutions agitantes tout en mélangeant les deux.
- Aliquot chaque mélange à 2 mL microtubes. Conserver tous les microtubes à -20 °C.
- Préparez un lot différent de solution pCa (4,5 à 6,0) pour chaque protocole.
2. Étalonnage du transducteur de force
REMARQUE : L’étalonnage du transducteur de force est une procédure de routine qui doit être effectuée tous les deux mois ou chaque fois qu’elle est soupçonnée d’être non calibrée. Le transducteur de force est très sensible et est facilement cassé. Il doit être manipulé en douceur à chaque étape de son utilisation, y compris l’étalonnage, le collage du cardiomyocyte et le nettoyage.
- Détachez le transducteur de force du reste de l’appareil.
- À l’aide d’une pince, placez le transducteur de force horizontalement de telle sorte que l’aiguille pointe vers le bas dans la même orientation que le cardiomyocyte développera la force. Cela facilitera la pendaison d’une série de masses avec des poids connus (bande élastique, suture ou broche).
REMARQUE : Vérifiez les caractéristiques du transducteur de force avant de passer à cette étape pour vérifier le facteur d’échelle [mg/volt] et éviter un poids excessif sur le transducteur. Pour le modèle transducteur de force, le facteur d’échelle est de 50 (50 mg correspondent à 1 volt) et nous utilisons 5 poids entre 12,5 et 250 mg. - Allumez le transducteur de force et laissez-le chauffer pendant 30 min.
- Commencez par accrocher la masse plus légère sur le transducteur de force et en enregistrant la tension correspondante mesurée à FORCE OUT.
- Répétez cette procédure pour un maximum de cinq poids.
- Force de parcelle appliquée au transducteur de force (charge) par rapport à la tension et vérifiez la linéarité.
- S’il n’y a pas de linéarité, ajustez le zéro et gagnez des potentiomètres dans le circuit imprimé du transducteur. Consultez ses instructions spécifiques pour plus d’informations.
- Tournez le potentiomètre zéro jusqu’à ce que la tension de sortie se lit 0,0 V.
- Mainz un poids moyen sur l’aiguille du transducteur et ajustez le potentiomètre de gain pour lire la tension correspondante (par exemple, 50 mg correspondent à 1 V). Retirez le poids et réajustez le potentiomètre zéro à 0,0.
- Répétez l’étape 2.6.2 jusqu’à ce que la sortie avec et sans le poids soit correcte.
- Remontez le transducteur de force dans l’appareil.
3. Réglage de l’appareil expérimental
- Décongeler une fiole de chacune des solutions d’activation, 4,5, 5,0, 5,2, 5,4, 5,6, 5,8, 6,0 et relaxantes et les maintenir sur la glace.
REMARQUE : L’ATP et le PCr sont des composés labiles qui doivent être maintenus à des températures froides. - Préparer le microscope, l’appareil d’essai et l’ordinateur associé pour l’utiliser( Figure 1).
- Ajustez la température de sorte que le thermomètre de chambre indique 15 °C. Effectuez toutes les expériences à cette température à l’exception des incubations de kinase et de phosphatase (20 °C).
- Allumez le transducteur de force et le moteur.
4. Extraction et perméabilisation des cardiomyocytes écorchés
- Décongeler 50 mL de solution RELAX-ISO.
- Allumez la centrifugeuse et refroidissez-la rapidement jusqu’à 4 °C.
- Décongeler 3-5 μg d’un échantillon myocardique dans une boîte de Pétri contenant 2,5 mL de solution RELAX-ISO.
- Couper le tissu en petits morceaux à l’avec une lame de scalpel( Figure 2). Coupez l’échantillon d’une manière précise pour éviter les dommages inutiles aux cellules.
- Transférer les 2,5 mL de solution RELAX-ISO avec le tissu dans un verre Potter-Elvehjem à l’aide d’une pointe de pipette coupée.
- Perturber mécaniquement le tissu à l’aide d’un broyeur à une vitesse de rotation de 30 à 40 rpm. Appuyez sur le tissu 3 fois pendant 2 s chacun pour obtenir une bonne suspension cellulaire.
- Préparez 10% triton dans la solution RELAX-ISO (250 μL de Triton avec 2,25 mL de RELAX-ISO) dans un tube de 15 mL et ajoutez cette solution à la suspension cellulaire.
- Mélanger délicatement en inversant le tube 3 fois.
- Incuber à température ambiante pendant 1 min et 4 min sur la glace.
- Laver le Triton en ajoutant RELAX-ISO jusqu’au sommet du tube de 15 mL; mélanger doucement (inverser 3 fois le tube) et finalement faire tourner les cellules dans une centrifugeuse inclinée (1 min à 348 x g). Retirer le surnatant jusqu’à 3 mL au-dessus de la pastille cellulaire.
REMARQUE : Retirez doucement le supernatant pour éviter de déranger la pastille cellulaire. Pourtant, certaines cellules en surnatant seront inévitablement perdues. - Répétez l’étape 4.10 au moins 4 fois ou jusqu’à ce qu’il n’y ait plus de bulles produites par les résidus de Triton.
REMARQUE : Plus il y a d’étapes de lavage, plus il y a de cellules perdues avec le surnatant jeté. - Lors du dernier lavage, retirer le supernatant jusqu’à un volume de 5-10 mL de suspension cellulaire.
5. Sélection et collage du cardiomyocyte écorché
- Placez une goutte de suspension cellulaire sur un coverslip sur le dessus d’une glissière en verre dans le porte-diapositives microscope( Figure 1).
- Choisissez un cardiomyocyte en forme de tige unique avec un bon modèle de striation et la taille (Figure 2).
- Trouvez les extrémités de l’aiguille du transducteur de force et du moteur à l’aide du grossissement le plus bas du microscope inversé.
- Faites pivoter le coverslip pour positionner horizontalement le cardiomyocyte sélectionné afin que ses extrémités soient alignées avec l’aiguille du transducteur de force et le moteur (figure 2).
- Placez une fine ligne de colle sur le côté du coverslip à l’aide d’une pointe d’écouvillon (Figure 2).
- Immerger les extrémités de l’aiguille du transducteur de force et le moteur dans la ligne de colle pour créer un halo de colle autour des deux extrémités.
REMARQUE : Les étapes 5.6 - 5.10 sont accomplies grâce à l’utilisation soigneuses des micropositionneuses motorisées. - Déplacez rapidement les pointes d’aiguille près du plan focal du cardiomyocyte.
- Déplacez l’extrémité de l’aiguille du transducteur de force vers le bas de sorte qu’il colle à un bord du cardiomyocyte.
- Répétez cette procédure avec la pointe du moteur et l’autre extrémité de la cellule.
REMARQUE: Cette procédure doit prendre moins de 2-3 min que la colle commence à guérir très rapidement. - Après 5-8 min, soulevez les aiguilles ≈15 μm pour éviter de coller la cellule à la couverture. Ceci est fait en déplaçant vers le haut des deux micromanipulateurs simultanément.
- Laissez la colle guérir. Cette procédure peut durer de 15 à 45 min, selon le type de colle. Dans notre cas, le cardiomyocyte est correctement collé après ≈15 min.
6. Enregistrement des mesures de force de sensibilité active, passive et Ca2+
- Remplissez le premier puits expérimental avec la solution relaxante (55-100 μL dans l’appareil expérimental) et le deuxième puits expérimental avec solution d’activation.
- À l’aide du logiciel de caméra, placez la région d’intérêt (ROI) dans une zone du cardiomyocyte avec un modèle clair de striation.
REMARQUE : Pour les myocytes cardiaques, la longueur du sarcome er fonctionnement varie entre 1,8 et 2,2 μm, et la longueur optimale du sarcome est d’environ 2,15 μm. - Mesurer la distance entre les deux extrêmes du cardiomyocyte (du moteur au halo de colle transducteur, figure 3)après l’ensemble de la longueur optimale du sarcome (2,2 μm). Enregistrez la valeur comme longueur de myocyte dans le logiciel.
- Mesurer la largeur et la profondeur des cardiomyocytes, ce dernier à l’aide d’un miroir prisme placé perpendiculairement à la cellule.
REMARQUE : Une source de lumière puissante et externe sera nécessaire pour visualiser la cellule à travers le prisme. Dans le cas où il n’y a pas de prisme, et en supposant que les cellules cardiaques ont une forme elliptique, la profondeur des cardiomyocytes peut être déduite comme 70% de la largeur des cardiomyocytes. - Calculer la zone transversale (ASC, mm2)en supposant une forme elliptique du cardiomyocyte.
- Déplacez doucement l’étape du microscope de sorte que la cellule se déplace du coverslip au puits contenant la solution relaxante sur le dos de la scène.
REMARQUE : Cette procédure peut facilement endommager la cellule. Avant de déplacer la cellule, déplacez doucement les aiguilles vers le haut un peu plus. Évitez d’enlever la cellule de la solution. - Sélectionnez le protocole dans un logiciel qui contient deux cellules de raccourcissement (80% de sa longueur initiale), qui se produira lorsque la cellule est émergée dans ca2 + solution et dans la solution de détente, respectivement (Figure 1, Fichier supplémentaire).
REMARQUE : Le premier « Slack » de la cellule sera effectué dans la solution d’activation et le second « Slack » dans la solution relaxante. Ce faisant, l’utilisateur sera en mesure de calculer la force totale (Ftotal) de la cellule à partir de la 1eret la force passive (Fpassive) de la cellule à partir de la 2nd. Utilisez la formule pour calculer la force active, Factive = Ftotal - Fpassive. La cellule est raccourcie de 80% afin de détacher toute force record de ponts croisés. - Provoquer une contraction isométrique en déplaçant le stade du microscope de sorte que le cardiomyocyte passe de la solution relaxante à la solution d’activation (pCa=4.5(1)).
REMARQUE : Si la cellule est fonctionnelle, elle se contractera immédiatement. - En atteignant le plateau de force, commencez à enregistrer les données de force.
REMARQUE : Les tests peuvent être effectués individuellement. Selon le logiciel, il est possible de créer une séquence de tests qui correspondront aux différentes solutions Ca2+ dans un protocole Ca2+-sensibilité (Figure 1, Fichier Supplémentaire). - Attendez ~10 s, puis changez la cellule immergée dans la solution d’activation.
REMARQUE : Il est important d’attendre 10 s avant d’immerger la cellule dans une solution relaxante. Si la cellule est déplacée trop tôt, des données importantes pour calculer la force de réaménagement de la cellule (valeur ktr) peuvent être perdues. - Déplacez rapidement le stade de sorte que le cardiomyocyte plonge dans la solution relaxante.
- Attendez que le test s’arrête.
- Répétez les étapes 6.8 - 6.12 de sorte que la cellule soit activée deux fois dans la solution d’activation (pCa=4.5(2)).
REMARQUE : En règle générale, après la première activation, les extrémités des cardiomyocytes peuvent se détacher légèrement des extrémités de l’aiguille, en modifiant la longueur des cardiomyocytes, l’ASC et/ou la longueur du sarcome. Réajustez-vous à la longueur de sarcomere désirée et introduisez les dimensions corrigées dans le logiciel.- Continuez à marcher 6.13.2 pour ca2+ protocole de sensibilité ou enregistrer les données, si les valeurs de force passive et active de la cellule sont les seuls paramètres nécessaires et détacher la cellule des aiguilles et les nettoyer avec de l’acétone pour enlever la colle.
- Ajustez la longueur sarcomere de la cellule à 2,2 μm en l’étirant légèrement à nouveau, si nécessaire.
- Remplacez la solution d’activation par la prochaine solution Ca2+ (55-100 μL ici). Répétez les étapes 6.8 - 6.12.
- Remplacez la solution d’activation par la prochaine solution Ca2+ (55-100 μL ici) et répétez les étapes 6.8 - 6.12 jusqu’à ce que toutes les solutions aient été testées (5.0, 5.2, 5.4, 5.6, 5.8, 6.0).
- Enfin, réactivez la cellule avec la solution d’activation (pCa4.5(3)). Répétez les étapes 6.8- 6.12.
7. Incubation avec kinases et phosphatases
- Après avoir effectué le protocole de base sélectionné, diluer la kinase/phosphatase dans la solution relaxante à la concentration recommandée.
REMARQUE : Il est recommandé d’effectuer une courbe dose-réponse avant l’expérience. - Réglez la température des puits expérimentaux à 20 °C.
- Remplissez les puits expérimentaux de kinase/phosphatase, solution relaxante et solution d’activation (55-100 μL).
- Déplacez doucement le stade du microscope de sorte que la cellule soit immergée dans le puits contenant de la kinase/phosphatase.
- Incuber le cardiomyocyte avec la kinase/phosphatase pendant au moins 30 minutes ou selon les instructions des fabricants.
- Répétez le protocole de base sélectionné.
8. Finalisation de l’expérience
- Déglutifier le cardiomyocyte à partir des extrémités du transducteur de force et du moteur en étirant la cellule.
- Retirez soigneusement le halo de colle des extrémités de l’aiguille à l’aide d’un coton-tige trempé dans de l’acétone.
- Arrêtez l’équipement.
9. Analyser les données
- Recueillir tous les fichiers de chaque cardiomyocyte testé.
REMARQUE : Chaque test correspondra à un seul fichier. Cela signifie que pour chaque solution Ca2+ ou longueur sarcomere, il y aura un fichier correspondant. - Calculer les forces actives et passives d’un seul cardiomyocyte.
- Ouvrez le fichier correspondant à la première activation (pCa=4.5(1)) à l’aide d’une feuille decalcul (figure 3A, annexe A dans le fichier supplémentaire).
REMARQUE : Nous avons utilisé un programme sur mesure pour effectuer l’analyse. Veuillez consulter l’annexe A dans le dossier supplémentaire. - Moyenne ≈60 valeurs avant et moyenne ≈60 valeurs après le1er mou de la cellule (lorsque la cellule est immergée dans la solution Ca2+). Ces 2 valeurs correspondent respectivement à a et b.
- Répétez la même analyse pour le relâchement de 2nd de la cellule (lorsque la cellule est immergée dans une solution relaxante). Ces 2 valeurs correspondent respectivement à c et d.
- Calculer la différence entre a et b (force totale,F total).
- Calculer la différence entre c et d (force passive, Fpassive).
- Calculer la force active, Factive = Ftotal - Fpassive.
- Normaliser toutes les valeurs de force à CSA (voir formule ci-dessus) pour obtenir la tension totale (Ttotal),la tension passive (Tpassive)et la tension active (Tactive).
- Répétez l’étape 9.2.1 à 9.2.5 pour l’activation 2nd (pCa=4.5(2)).
- Considérez ces valeurs comme celles représentant Ttotal,Tactive et Tpassive du cardiomyocyte en cours d’analyse.
REMARQUE : La première activation de la cellule avec pCa4.5(1) est généralement associée à des altérations des dimensions cellulaires. Pour cette raison, la 2ème activation avec pCa4.5 est plus précise et est celle à utiliser. - Répétez les étapes 9.2.1 à 9.2.5 pour chaque fichier/pCa testé solutions (5.0, 5.2, 5.4, 5.6, 5.8, 6.0, 4.5(3)).
- Ouvrez le fichier correspondant à la première activation (pCa=4.5(1)) à l’aide d’une feuille decalcul (figure 3A, annexe A dans le fichier supplémentaire).
- Calculer pCa50 et nHill d’un seul cardiomyocyte.
REMARQUE : Pour cette analyse, utilisez les valeursactives F non normalisées des fichiers 4.5(2), 5.0, 5.2, 5.4, 5.6, 5.8, 6.0 et 4.5(3).- Placez dans un fichier de feuille de calcul toutes les valeurs non normalisées de Factive pour chaque solution Ca2+ testée (4,5 (2),5,0, 5,2, 5,4, 5,6, 5,8, 6,0, 4,5(3)).
- Calculer le facteur de correction = Factif [4.5(2)] - Factif [4.5(3)] / 7.
- Calculez les valeurs corrigées de Factive pour chaque solution Ca2+ (5,0, 5,2, 5,4, 5,6, 5,8, 6,0) en soustrayant Factive - facteur de correction.
- Calculez la force relative(relativeF) pour chaque solution Ca2+ en normalisant chaque valeuractive F par la valeur corrigée correspondante.
REMARQUE : Leparent F [4.5(3)] devrait être égal à 1. Chaque protocole expérimental commence et se termine par une activation de contrôle à la concentration de Ca2+ saturante (pCa 4.5(2) et 4.5(3)). Cela permet la normalisation des forces et l’évaluation de l’aperçu des préparations par la comparaison des changements de force maximale Ca2+activée (Fmax). Si à la fin du protocole expérimental, le cardiomyocyte produit moins de 70% de la force maximale de la première contraction, cette cellule/mesure doit être exclue de l’analyse. - Utilisez leparent F et les valeurs pCa correspondantes pour s’adapter à une courbe sigmoïde avec l’équation suivante F(Ca) = CanHill/ (Ca50nHill + CanHill).
- Extrapoler les valeurs pCa et nHill de l’équation ci-dessus mentionnée.
- Calculer le taux de réaménagement des forces (ktr) d’un seul cardiomyocyte.
- Effectuez un ajustement à la courbe qui correspond aux valeurs immédiatement après le relâchement de la1er cellule.
- Calculer la pente de la courbe et cette valeur correspondra au taux de réaménagement des forces.
- Répétez l’étape 9.4.1 et 9.4.2 pour chaque solution Ca2+.
REMARQUE : Un mauvais ajustement de courbe sera obtenu pour les solutions Ca les plus basses (R au carré≤0,90).
Representative Results
Les cardiomyocytes perméabilisés fonctionnels devraient sembler uniformes et avec un modèle cohérent de striation tout au long de l’expérience. Bien qu’un certain degré de détérioration et de diminution de la force soit attendu après des expériences prolongées, les valeurs de tension active devraient être relativement stables. Les cellules montrant des signes clairs de perte de striation ou de diminution significative de la force (et 15 kN◊m-2 ou <80% de sa force active initiale) devraient être exclues. Le tableau 6 affiche les valeurs normales attendues pour les paramètres les plus importants dérivés des rongeurs, des porcs et des échantillons humains.
Les paramètres obtenus dépendent principalement du protocole choisi. La figure 5 montre des traces de force représentatives de 3 enregistrements de force sur 8 nécessaires pour effectuer un protocole de myofilaments Ca2+-sensibilité. En transférant la cellule à un puits contenant la solution d’activation, le cardiomyocyte commence à développer la force jusqu’à ce qu’elle atteigne un plateau. Après un test de mou rapide (durée de 1 ms), par lequel le cardiomyocyte raccourcit à 80% de sa longueur, nous obtenons les valeurs de base de la force zéro. Après le test de relâchement, la cellule continue de développer de la force car elle est immergée dans la solution d’activation. La force totale(totalF) est calculée en soustrayant la valeur du plateau de la valeur minimale. La pente de la dernière partie de cette courbe nous donne la valeur du taux de réaménagement de la force (ktr) (figure 6), qui est une mesure du taux apparent d’attachement et de détachement de pont croisé (fapp et gaap)10. Lorsque la valeur ktr R2 est de 0,90 ktr, la valeur ktr doit être exclue et cela se produit généralement à des concentrations inférieures de Ca2+ (pCa 5,6, 5,8 et 6,0). Après avoir transféré la cellule vers un puits contenant la solution relaxante, la cellule se détend et sa force diminue. La force passive (Fpassive)est calculée en soustrayant la valeur minimale (obtenue après un raccourcissement prolongé des cellules) à cette nouvelle valeur de force. La force active résulte de la différence entre Ftotal et Fpassif.
La force active et passive maximale qui caractérise un cardiomyocyte est celle dérivée de l’activation de la deuxième cellule avec une solution ca2+saturante (pCa = 4,5). La première activation est généralement écartée car la longueur du sarcomère doit souvent être réajustée.
Pour effectuer un protocole de sensibilité myofilament Ca2+,il est nécessaire d’effectuer au moins 9 tests d’activation (4,5; 4,5; 5,2; 5,6; 6,0; 5,0; 5,4; 5,8 et 4,5). Cette séquence est simplement ilplifiante, mais doit toujours commencer par 4,5 (deux fois) et se terminer par 4,5. La programmation du logiciel d’acquisition de données pour un protocole myofilament Ca2+-sensibilité est représentée dans la figure 1 du fichier supplémentaire.
Après avoir calculé la force active pour toutes ces solutions d’activation, vérifiez si la dernière activation a donné plus de 80% de la force maximale initiale (sinon les résultats de cette cellule devraient être jetés, comme mentionné ci-dessus). Pour corriger la baisse de Fmax pendant la série expérimentale, les valeursmax F interpolées peuvent être utilisées pour normaliser les points de données. Les données normalisées peuvent être adaptées à une courbe sigmoïde avec l’équation suivante F(Ca) = CanHill/(Ca50nHill + CanHill). Les valeurs de paramètres obtenues représentent la sensibilité au calcium (Ca50, qui peut être converti en pCa50) et la cooperativité (nHill). Toutes les valeurs de force peuvent être converties en valeurs de tension après normalisation vers la zone transversale. Outre myofilament Ca2+-sensibilité et les protocoles d’activation dépendant de la longueur, d’autres tests peuvent être effectués. C’est le cas des dépendances de longueur de sarcomere de Tactive,de Tpassive (figure 7),et de force résiduelle de cardiomyocyte. Les enregistrements de force résiduelle sont calculés à partir de la récupération initiale de la force (pCa 4.5) atteinte après le changement de longueur de la cellule (80%) et normalisé à chaque force totale à état stable atteint avant le changement de longueur11. L’augmentation de la force résiduelle est habituellement révélatrice de ponts croisés avec une cinétique lente du détachement et une rigidité plus élevée.
Enfin, il convient de souligner que cette technique peut être réalisée dans des cardiomyocytes écorchés extraits mécaniquement d’échantillons congelés ou fraîchement prélevés, ainsi que isolés enzymatiquement suivis de la perméabilisation de ses membranes. La façon dont les cardiomyocytes sont isolés a un impact significatif sur les résultats dérivés de cette technique. La figure 8 montre les différences observées entre les trois procédures d’isolement.
Figure 1 : Schéma intégré de l’appareil d’essai. L’appareil d’essai comprend le microscope, les micromanipulateurs et l’ordinateur associé. Le bas de la figure montre un cardiomyocyte écorché collé entre le moteur et le transducteur de force. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Diagramme de flux du protocole d’isolement cellulaire, de perméabilisation et de collage. L’image du coin supérieur gauche est composée de 4 images montrant des morceaux de l’échantillon cardiaque dans la solution RELAX-ISO (A) dans une boîte de Petri, (B) dans un tube utilisé pour l’homogénéisation mécanique des tissus, (C) l’homogénéisant, (D) le tissu immédiatement après l’homogénéisation et (E) quand il est dans un tube pour la perméabilisation Triton. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : Détermination de la longueur et de la longueur du sarcome d’un cardiomyocyte écorché. Détermination de la longueur et de la largeur des cellules à une longueur de sarcome de ≈2,2 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4 : Protocole d’activation dépendant de la longueur (imite le mécanisme d’élingue Frank in vitro). Traces de force représentatives et paramètres dérivés des protocoles de sensibilité Ca2+ des myofilaments effectués auparavant(A, 1,8 μm) et après avoir étiré un cardiomyocyte jusqu’à 2,2 μm (B). S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 5 : Protocole de sensibilité Myofilaments Ca2+. Traces de force représentatives et paramètres dérivés. Par souci de simplicité, seules 3 courbes de force sur 8 sont représentées. À savoir un cardiomyocyte activé avec la solution saturante, intermédiaire et la solution ca2+la plus basse (4,5, 5,6 et 6,0, respectivement). S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 6 : Traces représentatives d’une cellule cardiaque de souris activées à différentes solutions de calcium et à la courbe d’ajustement ktr respective. (A) pCa 4,5; (B) pCa 5.0; (C) pCa 5,2; (D) pCa 5,4; (E) pCa 5,6; (F) pCa 6.0 et E valeurs pour la tension totale, passive et active, ktr valeur et Rsquare pour ktr ajustement. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 7 : Protocoles de dépendances de longueur sarcome de Tpassif (A) et Tactif (B). La tension passive et la tension active ont été calculées en un seul cardiomyocyte à une longueur sarcomère de 1,8 μm à 2,3 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 8 : Résultats représentatifs pour les cardiomyocytes isolés mécaniquement des échantillons myocardiques frais (« frais ») et congelés (« congelés ») ainsi que du cœur digéré de collagène (technique modifiée de Langgendorf) avec perméabilisation postérieure avec Triton (« Collag+Triton »). Valeurs de (A) Tension totale, (B) Tension active et (C) Pasisve Tension des cardiomyocytes activés avec la solution pCa 4.5 à une longueur sarcomere de ≈2,2 μm. (D) Courbe de sensibilité au calcium et les valeurs respectives pour (E) pCa50 et (F) nHill. (G) Valeurs de force résiduelleet ( H) ktr calculées à la solution d’activation maximale (pCa 4,5). S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
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| Magasinez chez | Solutions d’actions | [M] | Volume final (mL) | Poids/volume | Notes |
| 4°C | Hydroxyde de potassium (KOH) | 1 | 100 | 5.611 g | Pour ajuster le pH |
| 4°C | Hydroxyde de potassium (KOH) | 5 | 50 | 14,03 g | Pour ajuster le pH |
| 4°C | Bes | 1 | 50 | 10,66 g | |
| 4°C | Acide propionique | 1 | 100 | 7.483 mL | Ajuster le pH à 7,0 avec 5M ou 1M KOH |
| 4°C | CaEGTA composé de: | 0.1 | 100 | Mélanger et chauffer la solution à 60°C pendant plus d’une heure. Réglez le pH à 5-6 avec 1M KOH. | |
| - CaCO3 | 0.1 | 1.001 g | |||
| - Titriplex (EGTA) | 0.1 | 3.804 |
Tableau 1 : Instructions pour la préparation des solutions de stock.
| RELAX-ISO (pour l’isolement des cardiomyocytes) | [mM] | Poids |
| Na2ATP | 5.95 | 3,28 g |
| MgCl2.6H2O | 6.04 | 1,23 g |
| Tritiplex (EGTA) | 2 | 0,76 g |
| Kcl | 139.6 | 10,41 g |
| Imidazole | 10 | 0,68 g |
Tableau 2 : Instructions pour la préparation de la solution Relax-ISO.
| Solution d’activation (pour les mesures) | [mM] | Poids / volume |
| Na2ATP | 5.97 | 0,823 g |
| MgCl 1M | 6.28 | 1,57 mL |
| Acide propionique | 40.64 | 10,16 mL |
| Bes | 100 | 25 mL |
| CaEGTA (solution stock préalablement préparée) | 7 | 17,5 mL |
| Na2PCr | 14.5 | 0,925 g |
Tableau 3 : Instructions pour activer la préparation des solutions.
| Solution relaxante (pour les mesures) | [mM] | Poids / volume |
| Na2ATP | 5.89 | 0,325 g |
| MgCl 1M | 6.48 | 0,65 mL |
| Acide propionique | 40.76 | 4,08 mL |
| Bes | 100 | 10 mL |
| Titriplex (EGTA) | 6.97 | 0,265 g |
| Na2PCr | 14.5 | 0,370 g |
Tableau 4 : Instructions pour la préparation relaxante des solutions.
| pCa = -Log [Ca2+] | Détente (pCa=9.0) Ml |
Ativating (pCa=4.5) Ml |
| 5 | 0.86 | 39.14 |
| 5.1 | 1.2 | 38.80 |
| 5.2 | 1.54 | 38.46 |
| 5.3 | 2 | 38.00 |
| 5.4 | 2.51 | 37.49 |
| 5.5 | 3.14 | 36.86 |
| 5.6 | 3.89 | 36.11 |
| 5.7 | 4.8 | 35.20 |
| 5.8 | 5.89 | 34.11 |
| 5.9 | 7.14 | 32.86 |
| 6 | 8.57 | 31.43 |
Tableau 5 : Instructions pour la préparation des solutions pCa.
| Paramètre | Rongeur | Porc | Humain |
| Tension active, kN.m-2 (à 2,2 μm) | 17 – 28 | 19 – 40 | 19 – 36 |
| Tension passive, kN.m-2 (à 2,2 μm) | 3.6 – 5.5 | 1.9 – 6.8 | 1.8 – 2.3 |
| pCa50 (pCa50) | 5.58 – 5.64 | 5.40 – 5.50 | 5.43 – 5.82 |
| nHill (nHill) | 2.60 – 2.76 | 2.95 – 3.36 | 2.99 – 3.10 |
| ktr, s-1 | 4.00 – 8.00 | 1.00 – 3.00 | 0.90 – 2.00 |
Tableau 6 : Paramètres et indices typiques dérivés de cardiomyocytes perméabilisés simples provenant de rongeurs, de porcs et d’humains. Adapté à partirde 12.
| Problème | Raison possible | Solution |
| Le cardiomyocyte se détache lors de l’activation maximale | Temps de collage insuffisant; La colle est vieille et a séché | Augmenter le temps de l’étape de collage; envisager d’ouvrir un nouveau tube de colle. |
| Il y a Triton® dans la solution de suspension cellulaire, qui ne peut plus être enlevée | Répétez la procédure d’extraction avec un ou deux tritons supplémentaires® les étapes de lavage | |
| Le cardiomyocyte a une faible force dans des conditions de contrôle | L’extraction a mal tourné et a livré des cellules de mauvaise qualité | Augmentez la taille de l’échantillon et faites une nouvelle extraction. Si le problème persiste est probablement dû à une collecte d’échantillons incorrecte - jeter cet échantillon |
| La cellule se contracte visiblement, mais aucune force n’est enregistrée; La cellule a des valeurs de force inhabituelles | Le transducteur de force est éteint | Allumez-le |
| Le transducteur de force n’est pas bien calibré | Calibrer le transducteur de force à l’aide d’un ensemble de poids connus (consultez le manuel d’instructions du fabricant). | |
| L’aiguille transducteur de force est lâche | Collez l’aiguille à nouveau à l’aide de liaison en cristal 509 ou cire bijoutiers. | |
| Le modèle de striation n’est pas assez bon pour déterminer la longueur du sarcomère | Lumière insuffisante | Augmentez la lumière du microscope ou déplacez la cellule vers le coverslip et évaluez à nouveau la longueur du sarcomère (les puits ont une intensité lumineuse plus faible) |
| L’extraction a mal tourné et a livré des cellules de mauvaise qualité | Augmenter la taille de l’échantillon et faire une nouvelle extraction | |
| Les pointes des aiguilles ne sont pas dans le même plan | À l’aide de micromanipulateurs, ajustez les pointes des aiguilles vers le haut ou vers le bas jusqu’à ce qu’elles trouvent un sarcome ciblé | |
| Aucune variation de longueur et/ou de force lors de l’acquisition | Le moteur ou le transducteur de force sont éteints | Allumez-les |
| Le moteur est cassé et ne produit pas de raccourcissement cellulaire | Remplacez-le ou essayez de le calibrer à l’aide d’un générateur de fonction | |
| Trop de bruit sur les enregistrements d’acquisition | Trop d’écoulement d’air autour de l’équipement | Protéger l’équipement contre le flux d’air direct |
| Trop de vibrations autour de l’équipement | Une table de stabilisation est conseillée. Même alors, il est recommandé d’enlever tout équipement qui pourrait avoir un compresseur ou émettre des vibrations (congélateur, réfrigérateurs) | |
| Ca2+ -courbede sensibilité a des valeurs étranges et les valeurs de force n’augmentent pas avec [Ca2+]. | Le mélange de solution d’activation et de détente n’a pas été fait correctement (vérifiez 3.10 à 3.14 de la section méthodes, peut-être en raison d’un mélange insuffisant) | Décongeler les flacons avec la même concentration, recueillir tout le contenu du flacon dans le même bécher, mélanger avec un agitateur et les diviser à nouveau. Testez à nouveau ces solutions dans une nouvelle cellule. Si cela résout le problème, préparez un nouveau lot de solutions contenant ca2+ |
Tableau 7 : Table de dépannage.
Discussion
L’évaluation in vitro de la fonction cardiaque à l’aide de cardiomyocytes écorchés représente une technique importante pour clarifier les modifications qui se produisent au niveau des cardiomyocytes dans le contexte physiologique (p. ex., étirement) et pathologique (p. ex., ischémie). Cette méthodologie présente plusieurs avantages tels que l’exigence d’une quantité minimale de myocarde pour évaluer la fonction dans les cardiomyocytes obtenus à partir d’échantillons décongelés; en utilisant des cardiomyocytes d’un large éventaild’espèces (souris 13, rat1,14,15, lapin16, porc17, chien18, cobaye19 et humain20) et différents endroits cardiaques, y compris les atria, ventricules gauche et droit ou une région spécifique du cœur infarctus. De plus, cette technique permet d’offrir des concentrations spécifiques de Ca2+ et d’énergie (ATP) tout en mesurant la fonction des structures réglementaires et contractiles dans leur configuration native.
Malgré la simplicité de cette technique, il y a quelques étapes critiques. Il est essentiel de garantir la qualité de chaque étape dès le début, y compris la collecte d’échantillons. Les protéines de myofilament sont sensibles aux protéases21. Il est donc obligatoire de stocker les échantillons dans de l’azote liquide immédiatement après sa collecte. Les échantillons frais, qui n’étaient pas congelés auparavant, développeront des forces significativement plus élevées, de sorte qu’il n’est pas conseillé de mélanger la mesure effectuée dans des échantillons frais et congelés dans le même protocole. La deuxième étape la plus critique est l’extraction des cardiomyocytes. Au cours de cette procédure, il est crucial de maintenir l’échantillon sur la glace la plupart du temps. Un cocktail inhibiteur de la protéase peut être utilisé pour réduire le risque de dégradation des protéines pendant l’extraction/perméabilisation22. Troisièmement, les échantillons devraient être coupés en petits morceaux à l’aide de mouvements précis du scalpel puisque nous avons noté des cardiomyocytes de qualité réduite lorsque cette étape a été ignorée. Une autre étape critique est de laver les cardiomyocytes car il est difficile d’avoir le bon équilibre entre laver Triton (perméabilize la cellule, mais favorise son déglutage) et de garder autant de cellules dans le supernatant que possible. Il est important d’essayer d’abord l’extraction et le nombre de lavages pour chaque échantillon, espèce ou protocole. Par exemple, dans nos mains, nous avons noté que les extractions obèses de tissu de rat de ZSF1 ont un aspect « gras », qui a rendu ces cellules plus glissantes pendant le collage mais pas plus difficiles à mesurer. La façon dont nous contournons ce problème était d’effectuer plus d’expériences pour avoir un nombre raisonnable de cellules par animal. En outre, il est crucial de choisir une bonne cellule à coller, à savoir avec une bonne striation et une longueur raisonnable. Si le cardiomyocyte n’a pas ces dispositifs, il se détachera la plupart du temps des bouts d’aiguille ou développera aucune/basse force. Il est également important d’utiliser la colle correcte pour l’attachement cardiomyocyte, compte tenu du temps de collage et de son efficacité pour coller la cellule à l’aiguille. Dans nos mains, la colle de silicone (Table of Materials) guérit rapidement (10-15 min) et assez fort. Enfin, la dernière étape critique est liée au levage soigneusement du cardiomyocyte 5 min après collage de la cellule (pour éviter de coller la cellule à la couverture) et avant de la déplacer vers les puits (pour éviter que la cellule ne soit traînée par l’étape du microscope). Le tableau 7 résume le dépannage associé à cette technique, ses causes sous-jacentes et les solutions possibles pour surmonter les problèmes fréquents.
La principale limitation de cette méthode est qu’elle ne peut pas répondre à toutes les questions liées à la contractilité du myofilament, telles que la vitesse à laquelle les myofilaments s’activent/se désactivent. Dans le cadre in vivo, la dépolarisation membranaire, l’augmentation intracellulaire ca2+ et sa diffusion aux myofilaments doivent se produire pour que les myocytes se contractent, tandis que dans les cardiomyocytes écorchés Ca2+ diffusion aux myofilaments se produit immédiatement lorsque la cellule est submergée dans la solution Ca2+. Ce taux plus rapide de diffusion Ca2+ biaisera l’analyse d’activation/désactivation des myofilaments23.
Ces expériences sont influencées par différents facteurs, y compris la température, le pH de solution, la perturbation mécanique (slack-re-stretch vs slack) et les procédures de fixation cellulaire (attache d’épingle vs colle), toutes ces variables tenant compte des écarts de littérature en termes de ktr et de l’augmentation dépendante de la longueur du sarcomere en force4,12.
Les progrès futurs de la technique incluent l’exécution d’études fonctionnelles dans des cardiomyocytes intacts plutôt que perméabilisés. Cette technique a l’inconvénient de s’appuyer sur des cardiomyocytes fraîchement isolés (non préalablement congelés). Une autre question importante qui n’est pas directement liée à cette méthodologie, mais qui pourrait avoir une incidence importante sur celle-ci, est liée à la période maximale d’entreposage congelé de l’échantillon. Plus précisément, il est obligatoire d’établir le degré de dégradation du myofilament tout au long du temps d’entreposage (c.-à-d. pendant combien de temps les échantillons congelés peuvent être stockés afin d’assurer des données fonctionnelles de bonne qualité provenant des cardiomyocytes extraits).
Disclosures
Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts.
Acknowledgments
Les auteurs remercient la Fondation portugaise pour la science et la technologie (FCT), l’Union européenne, Quadro de Referência Estratégico Nacional (QREN), Fundo Europeu de Desenvolvimento Regional (FEDER) et Programa Operacional Factores de Competitividade (COMPETE) pour le financement de l’unité de recherche unic (UID/IC/00051/2013). Ce projet est soutenu par FEDER dans le cadre de COMPETE 2020 - Programa Operacional Competitividade E Internacionalização (POCI), le projet DOCNET (NORTE-01-0145-FEDER-000003), soutenu par le programme opérationnel régional Norte Portugal (NORTE 2020), dans le cadre de l’accord de partenariat Portugal 2020, par l’intermédiaire du Fonds européen de développement régional (FEDF), le projet NETDIAMOND (POCI-01-0145-FEDER-016385), soutenu par les Fonds structurels et d’investissement européens, programme opérationnel régional de Lisbonne 2020. Patrícia Rodrigues a été financée par fct (SFRH/BD/96026/2013) et João Almeida-Coelho a été par Universidade do Porto/FMUP et FSE-Fundo Social Europeu, NORTE 2020-Programa Operacional Regional do Norte, (NORTE-08-5369-FSE-000024-Programas Doutorais).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetone | Sigma | 34580 | |
| Adenosine 5’-triphosphate disodium salt hydrate (Na2ATP) | Sigma | A2383 | |
| Calcium carbonate (CaCO3) | Merck | 1.02067.0500 | |
| Imidazole | VWR | 24720.157 | |
| Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2.6H2O) | Merck | 1.05833.0250 | |
| Magnesium chloride solution (MgCl2 1M) | Sigma | M1028 | |
| N,N-Bis(2-hydroxyethyl)taurine (BES) | Sigma | B9879 | |
| Phosphocreatine dissodium salt hydrate (Na2PCr) | Sigma | P7936 | |
| Potassium chloride (KCl) | Merck | 1.04936.1000 | |
| Potassium hydroxide (KOH) | Merck | 8.14353.1000 | |
| Propionic acid (C3H6O2) | Merck | 8.00605.0500 | |
| Silicone Squeeze Tube | Marineland | 31003 | |
| Tritiplex (EGTA) | Merck | 1.08435.0025 | |
| Triton® X-100 10% | Merck | 648463 | |
| Tissue homogeneizer (GKH GT Motor Control) | Terre Haute Glas-col | ||
| Length Controller (Model 315C-I) | Aurora Scientific | ||
| Force Transducer (Model 403 A) | Aurora Scientific | ||
| Software ASI 600A | Aurora Scientific | ||
| Sotware VSL (Model 900B) | Aurora Scientific | ||
| Inverted Microscope (IX51) | Olympus |
References
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