Summary
Detta protokoll syftar till att beskriva steg-för-steg tekniken för extraktion och bedömning av hjärt funktion med hjälp av flådda kardiomyocyter. Denna metodik möjliggör mätning och akutmodulering av myofilamentfunktion med hjälp av små frysta tarmbiopsier som kan samlas in från olika hjärtplatser, från möss till män.
Abstract
I denna artikel beskriver vi de steg som krävs för att isolera en enda permeabilized ("flådd") kardiomyocyte och bifoga den till en kraft-mätning apparat och en motor för att utföra funktionella studier. Dessa studier kommer att möjliggöra mätning av kardiomycytstelhet (passiv kraft) och dess aktivering med olika kalcium (Ca2+)-innehållande lösningar för att bestämma, bland annat: maximal kraftutveckling, myofilament Ca2+-sensitivitet (pCa50), cooperativity (nHill) och kraftombyggnadshastigheten (ktr). Denna metod möjliggör också bestämning av effekterna av läkemedel som agerar direkt på myofilaments och av uttryck av exogena rekombinanta proteiner på både aktiva och passiva egenskaper av kardiomyocyter. Kliniskt, flådda kardiomyocyte studier belysa patofysiologi av många hjärtinfarkt sjukdomar och tillåta in vitro-bedömning av effekterna av terapeutiska interventioner som riktar sig till myofilaments. Sammantaget möjliggör denna teknik ett förtydligande av hjärt patofysiologi genom att undersöka samband mellan in vitro- och in vivo-parametrar i djurmodeller och mänsklig vävnad som erhållits under öppen hjärt- eller transplantationskirurgi.
Introduction
Traditionellt har bedömning av myokardiska mekaniska egenskaper gjorts mest i flercelliga preparat, såsom papillära muskler och trabeculae1,2. Flercelliga hjärtmuskler remsor inkluderar en heterogen population av celler, inklusive kontraktil kardiomyocyter med ett okänt mönster av orientering och kraftgenerering, elektrisk aktivitet och spänning/töjningsfördelningar samt en omgivande bindvävsmatris3,4. En beredning utan kollagen och som innehåller en enda kardiomyocyte skulle möjliggöra mätning av sarkomere längd och korsbro kontraktila egenskaper i en mycket exakt och kontrollerat sätt5,6. Därför, under de senaste fyra decennierna, flera metoder har utvecklats möjliggör undersöka mekaniska, kontraktil, och avkoppling egenskaper av en enda kardiomyocyte6,7. De kontraktila funktion av dessa celler är starkt beroende av sarkomere längd och cross-bridge cykling kinetik3. Det är således önskvärt att undersöka muskelfunktion direkt i enstaka isolerade hjärtceller, med tanke på att det tillåter att bedöma sarcomere längd och prestanda samt korsbrofunktion och kontraktila egenskaper. Att isolera och fästa funktionella kardiomyocyter med en rimlig optisk sarkomereupplösning medan kraftmätningen registreras på μN-nivå är dock fortfarande utmanandeoch utvecklas 3,6. Andra utmaningar är logistiken som behöver installeras för att isolera kardiomyocyter från nyhämtade biopsier. Oförutsägbarheten hos mänskliga biopsier insamling, till exempel, kan äventyra genomförbarheten av experimenten.
Dessutom har etiska farhågor avseende ersättning, minskning och förfining av djurförsök för vetenskapliga förfaranden (principerna för 3Rs) främjat studieförändringar på cell- och vävnadsnivå, helst i mänskliga biopsier, eller i mindre djurprover. I självaste en progressiv förfining av metoder för att bedöma hjärtfunktion in vitro på en mindre nivå av komplexitet möjliggör korrekt integration av resultaten till hela kroppen och översätta dem till det kliniskascenariot 7. Sammantaget, med hjälp av prover som lagras vid -80 °C för att extrahera kardiomyocyter kan vara ett tilltalande alternativ.
Den myokardiska vävnaden skärs i små bitar och homogeniseras med en mortel och en mortel. Resultatet av denna homogenisering är en suspension av flådda buntade och isolerade celler med varierande grad av sarcolemmal skada, vari näroplasmen utsätts för badmediet och alla de cellulära komponenterna tvättas ut. Strukturer som myofibrilerna som är längre bort från sarcolemma bevaras. Således hålls sarkomere förkortning och funktionella egenskaper i samband med den myofibrillar apparaten intakt och kan registreras8,9.
Kardiomyocytekraftens kraftmätningssystem består av en elektromagnetisk motor, som används för att justera kardiomyocytelängd, och en kraftgivare, som mäter isometrisk kardiomyocytekontraktion. En permeabiliserad, eller flådd, kardiomyocyte placeras i en experimentkammare som innehåller en avslappnande lösning ([Ca2+] < 10 nM) och kisellimmad på 2 tunna nålar: en fäst på motorn och den andra till kraftgivaren. Ett optiskt system används för att bestämma kardiomyocyte morfologi och sarcomere längd. Försöksprotokollet består ofta av en serie kraftupptagningar vid buffertlösningar som innehåller olika Ca2+-koncentrationer, bestämning av actin-myosin korsbrokinetik och mätning av den passiva spänningen hos de monterade kardiomyocyterna vid fördefinierade sarkomeriska längder (figur 1). Isolering av permeabiliserade kardiomyocyter från myokardprover frysta i flytande kväve (och därefter lagrad vid -80 °C) är en teknik som utnyttjar cellulär mekanik ochproteinbiokemi för mätning av maximal Ca2+-aktiverad (aktiv) kraft per tvärsnittsyta (T aktiv , kN∙m-2), Ca2+-oberoende (passiv) spänning (Tpassiv, kN∙m-2), myofilaments Ca2+-känslighet (pCa50), myofilaments cooperativity (nHill), hastigheten av kraft ombyggnad (ktr) samt sarcomere längd beroenden av Taktiv, Tpassiv, pCa50, nHill och ktr.
Målet med detta protokoll är att illustrera och sammanfatta potentialen i cardiomyocyte kraft mätning systemet som en tillförlitlig procedur för att bedöma funktionella mekaniska egenskaper av enstaka flådda kardiomyocyter isolerade från frysta prover från olika arter.
Protocol
Alla djurförsök överensstämmer med Handledning för vård och användning av försöksdjur (NIH Publikation nr 85-23, reviderad 2011) och den portugisiska lagen om djurskydd (DL 129/92, DL 197/96; P 1131/97). De behöriga lokala myndigheterna godkände detta försöksprotokoll (018833).
1. Beredning av stamlösning (tabell 1)
- Förbered 1 000 mL avslappnande lösning för kardiomyocyternas isolering (RELAX-ISO) genom att följa anvisningar i tabell 2. Lös upp reagensen ovan i ≈500 mL och justera pH-värdet till 7,0 med KOH. Justera den slutliga volymen till 1000 mL.
- Fördela RELAX-ISO i 50 mL rör. Förvaras vid -20 °C.
- Bered 250 mL aktiverande lösning genom att följa instruktionerna i tabell 3. Lös upp reagenserna ovan i ≈100 mL av ultrarent vatten. Justera pH-värdet till 7,1 med 5 M KOH vid 15 °C.
OBS: Vanligtvis är det nödvändigt att lägga till en betydande mängd KOH för att nå önskat pH. Lägg den volymetriska ballongen i en låda med is för att kyla ner lösningen till 15 °C.- Justera den slutliga volymen till 250 mL. Agitera denna lösning kontinuerligt med en magnetisk omrörare tills ögonblicket för att blanda den med den avslappnande lösningen.
- Bered 100 mL avslappnande lösning genom att följa instruktionerna i tabell 4. Lös upp reagenserna ovan i ≈50 mL av ultrarent vatten. Justera pH-värdet till 7,1 med KOH 5 M vid 15 °C.
OBS: Vanligtvis är det nödvändigt att lägga till en betydande mängd KOH för att nå ett pH-värde på 7,1. Placera den volymetriska ballongen i en låda fylld med is för att kyla ner lösningen till 15 °C. Jonstyrkan hos de lösningar som användes under mätningarna uppgick till 180 mM.- Justera den slutliga volymen till 100 mL. Agitera denna lösning kontinuerligt med en magnetisk omrörare tills det ögonblick då den blandas med aktiverande lösning.
- Blanda aktiverande och avslappnande lösningar i de proportioner som presenteras i tabell 5 för att erhålla pCa-lösningar mellan 5.0 och 6.0.
- Alltid hålla avkopplande och aktivera lösningar agiterar medan blandning båda.
- Aliquot varje blandning till 2 mL mikrorör. Förvara alla mikrorören vid -20 °C.
- Förbered en annan sats pCa-lösning (4.5 till 6.0) för varje protokoll.
2. Kalibrering av kraftgivaren
OBS: Kraftgivarens kalibrering är en rutinprocedur som bör utföras varannan månad eller närhelst den misstänks vara okalibrerad. Kraftgivaren är mycket känslig och bryts lätt. Det bör försiktigt hanteras i varje steg av dess användning, inklusive kalibrering, limning av kardiomyocyte och rengöring.
- Lösgör kraftgivaren från resten av apparaten.
- Med hjälp av en klämma, placera kraftgivaren horisontellt på ett sådant sätt att nålen pekar nedåt i samma orientering att kardiomyocyten kommer att utveckla kraft. Detta kommer att underlätta hängande en serie av massor med kända vikter (elastiskt band, sutur eller stift).
OBS: Kontrollera kraftgivarens egenskaper innan du fortsätter till detta steg för att kontrollera skalfaktorn [mg/volt] och för att undvika för stor vikt på givaren. För kraftgivaren modellen är skalfaktorn 50 (50 mg motsvarar 1 volt) och vi använder 5 vikter mellan 12,5 och 250 mg. - Slå på kraftgivaren och låt den värmas upp i 30 min.
- Börja med att hänga upp tändmassan på kraftgivaren och registrera motsvarande spänning uppmätt vid FORCE OUT.
- Upprepa denna procedur för upp till fem vikter.
- Tomtkraft som anbringas på kraftgivaren (last) kontra spänning och kontrollera om det finns linjäritet.
- Om det inte finns någon linjäritet, justera nollan och få potentiometrar i givarens kretskort. Kontrollera dess specifika instruktion för ytterligare information.
- Vrid nollpotentiometern tills utspänningen avläser 0,0 V.
- Räcka ett medelvikt på transduceren visare och justera förs till förser med potentiometer för att avläsa den motsvarande spänningen (för anföra som exempel, 50 mg motsvarar till 1 V). Ta bort vikten och justera nollpotentiometern på ny tid till 0,0.
- Upprepa steg 2.6.2 tills utgången med och utan vikten är korrekt.
- Montera kraftgivaren tillbaka in i apparaten.
3. Inställning av försöksapparaten
- Tina en injektionsflaska av var och en av de aktiverande, 4,5, 5,0, 5,2, 5,4, 5,6, 5,8, 6,0 och avslappnande lösningar och underhålla dem på is.
OBS: ATP och PCr är labila föreningar som bör bibehållas vid kalla temperaturer. - Bered mikroskopet, testapparaturen och tillhörande dator för användning (Figur 1).
- Justera temperaturen så att i-kammartermometern avläser 15 °C. Utför alla experiment vid denna temperatur förutom för kinas- och fosfatasinkubationer (20 °C).
- Slå på kraft-givaren och motorn.
4. Extraktion och permeabilisering av flådda kardiomyocyter
- Avfrostning 50 mL av RELAX-ISO-lösning.
- Sätt på centrifugen och snabbt kyla upp den till 4 °C.
- Tina 3-5 μg av ett myokardprov i en Petri-rätt som innehåller 2,5 mL RELAX-ISO-lösning.
- Skär vävnaden i små bitar med ett skalpellblad (Bild 2). Skär provet på ett exakt sätt för att undvika onödiga celler skador.
- Överför 2,5 mL av RELAX-ISO-lösning med vävnaden till ett Potter-Elvehjem-glas med hjälp av en avskuren pipettspets.
- Störa vävnaden mekaniskt med en kvarn vid en rotationshastighet på 30-40 rpm. Tryck på vävnaden 3 gånger för 2 s vardera för att få en bra cell suspension.
- Förbered 10% Triton i RELAX-ISO-lösning (250 μL triton med 2,25 mL RELAX-ISO) i ett 15 mL-rör och tillsätt denna lösning till cellupphängningen.
- Blanda försiktigt genom att vända röret 3 gånger.
- Inkubera i rumstemperatur i 1 min och 4 min på is.
- Tvätta ur Triton genom att lägga till RELAX-ISO upp till toppen av 15 mL-röret; blandas försiktigt (inverterar 3 gånger tuben) och slutligen snurrar ner cellerna i en vinklad centrifug (1 min vid 348 x g). Ta bort supernatanten upp till 3 mL ovanför cellpelletsen.
OBS: Ta bort supernatanten försiktigt för att undvika att cellpelleten störs. Ändå kommer vissa celler i supernatant oundvikligen att gå förlorade. - Upprepa steg 4.10 minst 4 gånger eller tills inga fler bubblor som produceras av Triton-rester observeras.
OBS: Ju mer wash-out steg görs, desto fler celler går förlorade med den kasserade supernatanten. - I den sista wash-out, ta bort supernatanten upp till en volym av 5-10 mL cell suspension.
5. Val och limning av flådd kardiomycyt
- Sätt en cellupphängningsdropp på en täckplatta ovanpå en glasrutschbana i mikroskopglashållaren (Bild 1).
- Välj en enda stavformad kardiomyocyte med ett bra striationmönster och storlek (Bild 2).
- Hitta kraft-givarens och motorns nålspetsar med hjälp av det inverterade mikroskopets lägsta förstoring.
- Rotera täckskydden för att placera den valda kardiomyocyten horisontellt så att dess ändar är i linje med kraftgivarens och motorns nål (Figur 2).
- Placera en tunn linje av lim på sidan av täcket med hjälp av en svabbspets (Bild 2).
- Sänk ner nålspetsarna på kraftgivaren och motorn i limledningen för att skapa en limgloria runt båda spetsarna.
OBS: Steg 5.6 - 5.10 åstadkoms genom noggrann användning av de motoriserade mikropositionerarna. - Flytta snabbt nålspetsarna nära hjärtmycytens fokalplan.
- Flytta nålspetsen på kraftgivaren nedåt så att den limmar sig mot kardiomyocytens ena kant.
- Upprepa denna procedur med motorns spets och cellens andra extremitet.
OBS: Detta förfarande måste ta mindre än 2-3 min som limmet börjar bota mycket snabbt. - Efter 5-8 min lyfter du nålarna ≈15 μm för att undvika att limma cellen på täcket. Detta görs genom att flytta upp båda micromanipulatorerna samtidigt.
- Låt limmet bota. Detta förfarande kan pågå från 15 till 45 min, beroende på vilken typ av lim. I vårt fall är kardiomyocyten tillräckligt limmade efter ≈15 min.
6. Registrering av kraftmätningar av aktiv, passiv och Ca2+ känslighet
- Fyll den första experimentella brunnen med avslappnande lösningen (55-100 μL i försöksapparaten) och den andra experimentella brunnen med aktiverande lösning.
- Med hjälp av kamerans programvara, placera regionen av intresse (ROI) i ett område av kardiomyocyten med ett tydligt mönster av striation.
OBS: För hjärt myocyter varierar den operativa sarkomeriska längden mellan 1,8 och 2,2 μm, och den optimala sarkomerlängden är runt 2,15 μm. - Mät avståndet mellan kardiomyocytens två ytterligheter (från motorn till transducerlim halo, figur 3) efter att den optimala sarkomerlängden har ställts in (2,2 μm). Registrera värdet som myocytelängd i programvaran.
- Mät kardiomycyt bredd och djup, den senare med hjälp av en prisma spegel placeras vinkelrätt mot cellen.
OBS: En kraftfull, extern ljuskälla kommer att krävas för att visualisera cellen genom prismat. I fall finns det ingen prisma, och förutsatt att hjärtceller har en elliptisk form, kardiomyocyte djup kan härledas som 70% av kardiomyocyte bredd. - Beräkna tvärsnittsarea (CSA, mm2) förutsatt att en elliptisk form av kardiomyocyte.
- Flytta försiktigt mikroskopet scenen så att cellen rör sig från täckskydd till brunnen som innehåller avslappnande lösning på baksidan av scenen.
OBS: Denna procedur kan lätt skada cellen. Innan du flyttar cellen, försiktigt flytta nålarna upp lite mer. Undvik att ta bort cellen ur lösningen. - Välj det protokoll i programvara som innehåller två cell förkortning (80% av dess initiala längd), som kommer att uppstå när cellen är uppträtt i Ca2 + lösning och i avslappnande lösning, respektive (Bild 1, Tilläggsfil).
OBS: Först "Slack" av cellen kommer att utföras inom aktiverande lösning och den andra "Slack" inom avslappnande lösning. Genom att göra detta kommer användaren att kunna beräkna den totala kraften (Ftotalt) av cellen från 1st och passiva kraft (Fpassiv) i cellen från 2nd. Använd formeln för att beräkna aktiv kraft, Faktiv = Ftotalt - Fpassiv. Cellen förkortas 80% för att lossa alla tvärbroar rekordkraft. - Framkalla isometrisk kontraktion genom att flytta mikroskopstadiet så att kardiomyocyten förflyttar sig från avslappnande till den aktiverande lösningen (pCa=4.5(1)).
OBS: Om cellen är funktionell, kommer den omedelbart att kontrakt. - Vid nå kraft platå, börja registrera kraftdata.
OBS: Testerna kan göras individuellt. Beroende på programvara finns möjligheten att skapa en sekvens av tester som kommer att motsvara de olika Ca2+ lösningarna inom ett Ca2+-känslighetsprotokoll (Figur 1, Tilläggsfil). - Vänta ~10 s och växla sedan cellen nedsänkt i aktiverande lösning.
OBS: Det är viktigt att vänta 10 s innan du puttrar cellen i avslappnande lösning. Om cellen flyttas för tidigt kan viktiga data för att beräkna cellens ombyggnadskraft (ktr-värde) gå förlorade. - Flytta snabbt scenen så att kardiomyocyten fördjupar sig i avslappnande lösningen.
- Vänta tills testet upphör.
- Upprepa steg 6,8 - 6,12 så att cellen aktiveras två gånger i aktiverande lösning (pCa=4.5(2)).
OBS: Typiskt, efter den första aktiveringen, cardiomyocyte slutar kan något lossna från nålen tips, ändra kardiomyocytelängd, CSA och / eller sarkomere längd. Justera till önskad sarkomerelängd och introducera de korrigerade dimensionerna i programvaran.- Fortsätt att steg 6.13.2 för Ca2 + känslighetsprotokoll eller spara data, om värden på passiv och aktiv kraft i cellen är de enda parametrar som behövs och lossa cellen från nålar och rengör dem med aceton för att ta bort limmet.
- Justera cellens sarkomlängd till 2,2 μm genom att vid behov sträcka ut den något igen.
- Byt ut den aktiverande lösningen med nästa Ca2+-lösning (55-100 μL här). Upprepa steg 6.8 - 6.12.
- Ersätt den aktiverande lösningen med nästa Ca2+-lösning (55-100 μL här) och upprepa steg 6.8 - 6.12 tills alla lösningar har testats (5.0, 5.2, 5.4, 5.6, 5.8, 6.0).
- Slutligen återaktivera cellen med aktiverande lösning (pCa4.5(3)). Upprepa steg 6.8- 6.12.
7. Inkubation med kinaser och fosfataser
- Efter att ha utfört det valda baslinjeprotokollet späder du kinas/fosfatasen i Avslappnande lösning vid den rekommenderade koncentrationen.
OBS: Det rekommenderas att genomföra en dos-responskurva före försöket. - Ställ in temperaturen på de experimentella brunnarna till 20 °C.
- Fyll de experimentella brunnarna med kinas/fosfatas, avslappnande lösning och aktiverande lösning (55-100 μL).
- Flytta försiktigt mikroskopet scenen så att cellen blir nedsänkt i den brunn som innehåller kinas / fosfatas.
- Inkubera kardiomyocyten med kinasen/fosfatasen i minst 30 min eller enligt tillverkarnas anvisningar.
- Upprepa det valda baslinjeprotokollet.
8. Slutföra experimentet
- Unglue kardiomyocyten från spetsarna av kraftgivaren och motorn genom att sträcka cellen.
- Ta försiktigt bort limgloyan från nålspetsarna med hjälp av en bomullspinne indränkt i aceton.
- Stäng av utrustningen.
9. Analysera data
- Samla alla filer från varje kardiomyocyte testas.
OBS: Varje test kommer att motsvara en fil. Detta innebär att för varje Ca2 + lösning eller sarkomere längd, kommer det att finnas en motsvarande fil. - Beräkna aktiva och passiva krafter av en enda kardiomyocyte.
- Öppna filen som motsvarar första aktiveringen (pCa=4.5(1)) med hjälp av ett kalkylblad (Bild 3A, Tillägg A i Tilläggsfil).
OBS: Vi använde ett specialtillverkade program för att utföra analysen. Vänligen se bilaga A i tilläggsfilen. - Medelvärde ≈60-värden före och genomsnittlig ≈60-värden eftercellens 1 st-slack (när cellen är nedsänkt i Ca2+-lösning). Dessa 2 värden motsvarar a respektive b.
- Upprepa samma analys förcellens 2-nd slack (när cellen är nedsänkt i avslappnande lösning). Dessa 2 värden motsvarar c respektive d.
- Beräkna skillnaden mellan a och b (total kraft,F-summa).
- Beräkna skillnaden mellan c och d (passiv kraft, Fpassiv ).
- Beräkna aktiv kraft, Faktiv = Ftotalt - Fpassiv.
- Normalisera all kraft värderar till CSA (se formeln ovanför) att erhålla den sammanlagda spänningen(T-slutsumman), passivumspänning(T-passivum) och aktivspänning (Taktiv ).
- Upprepa steg 9.2.1 till 9.2.5 för 2nd-aktiveringen (pCa=4.5(2)).
- Betrakta dessa värden som de som representerar Ttotalt, Taktiv och Tpassiv av kardiomyocyte under analys.
OBS: Den första aktiveringen av cellen med pCa4.5(1) är vanligtvis förknippad med ombyggnader i celldimensioner. Av denna anledning är den 2: a aktiveringen med pCa4.5 mer exakt och är den som ska användas. - Upprepa stegen 9.2.1 till 9.2.5 för varje fil/pCa-testade lösningar (5.0, 5.2, 5.4, 5.6, 5.8, 6.0, 4.5(3)).
- Öppna filen som motsvarar första aktiveringen (pCa=4.5(1)) med hjälp av ett kalkylblad (Bild 3A, Tillägg A i Tilläggsfil).
- Beräkna pCa50 och nHill av en enda kardiomyocyte.
OBS: För denna analys, använd de icke-normaliserade F aktiva värdena från filerna 4.5(2), 5.0, 5.2, 5.4, 5.6, 5.8, 6.0 och 4.5(3).- Placera i en kalkylbladsfil alla icke-normaliserade värden på Faktiva för varje Ca2+-lösning som testats (4.5(2),5.0, 5.2, 5.4, 5.6, 5.8, 6.0, 4.5(3)).
- Beräkna korrektionsfaktorn = Faktiv [4,5(2)] - Faktiv [4,5(3)] / 7.
- Beräkna de korrigerade värdena för Faktiv för varje Ca2+ lösningar (5.0, 5.2, 5.4, 5.6, 5.8, 6.0) genom att subtrahera Faktiv - korrigeringsfaktor.
- Beräkna den relativa kraften(F-släkting) för varje Ca2+-lösningar genom att normalisera varjeF-aktiva värden med motsvarande korrigerade värde.
OBS:F-släktingen [4.5(3)] ska vara lika med 1. Varje försöksprotokoll börjar och slutar med en kontrollaktivering vid mättning Av Ca2+ koncentration (pCa 4.5(2) och 4.5(3)). Detta möjliggör kraft normalisering och bedömning av nedsliten av preparaten genom jämförelsen av förändringar i maximal Ca2 +-aktiverad kraft (Fmax). Om kardiomyocyten i slutet av försöksprotokollet ger mindre än minst 70% av den maximala kraften i den första sammandragningen, bör den cellen/mätningen uteslutas från analysen. - AnvändF-anhörig och motsvarande pCa-värden för att passa till en sigmoidal kurva med följande ekvation F(Ca) = CanHill/ (Ca50nHill + CanHill).
- Extrapolera pCa och nHill värden från ekvationen ovan nämnda.
- Beräkna graden av kraft ombyggnad (ktr) av en enda kardiomyocyte.
- Utför en passning till kurvan som motsvarar värdena direkt efter 1st-cellslacket.
- Beräkna lutningen på kurvan och detta värde kommer att motsvara takten i kraft ombyggnad.
- Upprepa steg 9.4.1 och 9.4.2 för varje Ca2+-lösning.
OBS: En dålig kurvpassning kommer att erhållas för de lägsta Ca-lösningarna (R i kvadrat≤0.90).
Representative Results
Funktionella permeabilized kardiomyocyter bör visas enhetlig och med en konsekvent striation mönster under hela experimentet. Även om en viss grad av försämring och kraftminskning förväntas efter långvariga experiment, bör värdena för aktiv spänning vara relativt stabila. Celler som uppvisar tydliga tecken på striationsförlust eller signifikant kraftminskning (< 15 kN∙m-2 eller <80% av dess initiala aktiva kraft) bör uteslutas. I tabell 6 visas de normalvärden som förväntas för de viktigaste parametrarna som härrör från gnagare, svin och prover från människor.
De parametrar som erhålls beror huvudsakligen på det valda protokollet. Bild 5 visar representativa kraftspår av 3, av 8, kraftinspelningar som behövs för att genomföra ett protokoll av myofilaments Ca2+-känslighet. Genom att överföra cellen till en brunn som innehåller den aktiverande lösningen börjar kardiomyocyten utveckla kraft tills den når en platå. Efter ett snabbt slacktest (varaktighet på 1 ms), varvid kardiomyocyten förkortas till 80% av sin längd, erhåller vi utgångsvärdena för nollkraft. Efter slacktestet fortsätter cellen att utveckla kraft då den är nedsänkt i den aktiverande lösningen. Total kraft (Ftotalt) beräknas genom att subtrahera platåvärdet från det minimala värdet. Lutningen på den sista delen av denna kurva ger oss värdet av takten i kraft ombyggnad (ktr) (Figur 6), som är ett mått på den skenbara hastigheten på tvärbro fastsättning och avlossning (fapp och gaap)10. När ktr R2-värdet är <0,90 bör ktr-värdet uteslutas och oftast sker detta vid lägre Ca2+ koncentrationer (pCa 5,6, 5,8 och 6,0). Efter att ha överfört cellen tillbaka till en brunn som innehåller den avslappnande lösningen, slappnar cellen av och dess kraft sjunker. Passiv kraft (Fpassiv) beräknas genom att subtrahera det minimala värdet (som erhålls efter en långvarig cellförkortning) till detta nya kraftvärde. Aktiv kraft resultat från skillnaden mellan F totaltoch Fpassiv.
Den maximala aktiva och passiva kraft som kännetecknar en kardiomyocyte är den som härrör från den andra cellen aktivering med en mättande Ca2 +-lösning (pCa = 4,5). Den första aktiveringen kasseras vanligtvis eftersom sarkomerlängden ofta behöver justeras.
För att utföra ett protokoll för myofilament Ca2+-sensitivitet är det nödvändigt att utföra minst 9 aktiveringstester (4,5; 4,5; 5,2; 5,6; 6,0; 5,0; 5,4; 5,8 och 4,5). Denna sekvens är bara exemplifierande men bör alltid börja med 4,5 (två gånger) och sluta med 4,5. Programmeringen av data-förvärv programvara för en myofilament Ca2 +-känslighet protokoll skildras i figur 1 i tilläggsfilen.
Efter att ha beräknat aktiv kraft för alla dessa aktiveringslösningar, kontrollera om den senaste aktiveringen gav mer än 80% av den initiala maximala kraften (annars bör detta cellresultat kasseras, som nämnts ovan). För att korrigera för nedgången i Fmax under experimentserien kan de interpolerade Fmax-värdena användas för att normalisera datapunkterna. De normaliserade data kan passa till en sigmoidal kurva med följande ekvation F(Ca) = CanHill/(Ca50nHill + CanHill). De parametervärden som erhålls representerar kalciumkänsligheten (Ca50, som kan omvandlas till pCa50) och cooperativity (nHill). Alla kraftvärden kan konverteras till spänningsvärden efter att ha normaliserats till tvärsnittsområdet. Förutom myofilament Ca2+-känslighet och de längdberoende aktiveringsprotokollen kan andra tester utföras. Sådan är fallet med sarkomer längd beroenden av Taktiv, Tpassiv (Figur 7), och kardiomyocyter kvarvarande kraft. Resterande kraftregistreringar beräknas från den initiala kraftåtervinningen (pCa 4,5) som uppnåtts efter cellens längdbyte (80 %) och normaliseras till varje total steady-state kraft som nås innan längdbyte11. Ökning av restkraft är vanligtvis vägledande för tvärbroar med långsam lossnar kinetik och högre styvhet.
Slutligen bör vi betona att denna teknik kan utföras i flådda kardiomyocyter extraheras mekaniskt från frysta eller nyinsamlade prover, samt isolerade enzymatiskt följt av permeabilisering av dess membran. Det sätt kardiomyocyterna är isolerade effekter betydligt resultaten härrör från denna teknik. I figur 8 visas de skillnader som observerats bland de tre isoleringsförfarandena.
Figur 1: Provningsapparatens integrerade schema. Testapparaten omfattar mikroskopet, mikromanipulatorerna och tillhörande dator. Figurens botten visar en flådd kardiomycyt som limmas mellan motorn och kraftgivaren. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Bild 2: Flödesdiagram över protokollet för cellisolering, permeabilisering och limning. Den övre vänstra hörnbilden är sammansatt av 4 bilder som visar bitar av hjärtprovet i RELAX-ISO-lösningen (A) i en Petriskål, (B) i ett rör som används för mekanisk homogenisering av vävnad, (C) homogenisatorn, (D) vävnaden omedelbart efter homogenisering och (E) när den är i ett rör för Tritonpermeabilisering. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Figur 3: Bestämning av längd och sarkomerlängd av en flådd kardiomyocyte. Celllängd och breddbestämning vid en sarkomerlängd på ≈2,2 μm. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Bild 4: Längdberoende aktiveringsprotokoll (efterliknar Frank-starlingmekanismen in vitro). Representativa kraftspår och parametrar som härletts från myofilaments' Ca2+ känslighetsprotokoll utförda före (A, 1,8 μm) och efter att ha sträckt en kardiomyocyte upp till 2,2 μm (B). Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Bild 5: Myofilaments Ca2+-känslighetsprotokoll. Representativa kraftspår och härledda parametrar. För enkelhetens skull avbildas endast 3 av 8 kraftkurvor. Nämligen en kardiomyocyte aktiverad med mättningen, en mellanliggande och den lägsta Ca2+-innehållande lösningen (4.5, 5,6 respektive 6.0). Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Figur 6: Representativa spår från en hjärtcell för möss som aktiveras vid olika kalciumlösningar och respektive KTR-passformskurva. (A) pCa 4.5; (B) pCa 5.0; (C) pCa 5.2; (D) pCa 5.4; (E) pCa 5.6; (F) pCa 6.0 och E värden för total, passiv och aktiv spänning, KTR värde och Rsquare för KTR passform. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Figur 7: Protokoll av sarkomerlängdsberoenden avT-passiv (A) och Taktiv (B). Passiv spänning och aktiv spänning beräknades i en enda kardiomyocyte vid en sarkomerelängd på 1,8 μm till 2,3 μm. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Figur 8: Representativa resultat för kardiomyocyter mekaniskt isolerade från färska ("Färska") och frysta myokardiktiva prover ("Frysta") samt från kollagenassmält hjärta (modifierad Langgendorf-teknik) med bakre permeabilisering med Triton ("Collag+Triton"). Värden på (A) Total spänning, (B) Aktiv spänning och (C) Pasisve Spänning från kardiomyocyter aktiveras med pCa 4.5 lösning vid en sarkomere längd på ≈2.2 μm. (D) Kalciumkänslighetskurva och respektive värden för (E) pCa50 och (F) nHill. (G) Restkraft och (H) ktr-värden beräknade vid maximal aktiveringslösning (pCa 4.5). Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Kompletterande Fil. Vänligen klicka här för att ladda ner denna fil.
| Förvara på | Aktielösningar | [M] | Slutlig volym (mL) | Vikt/ volym | Anteckningar |
| 4°C | Kaliumhydroxid (KOH) | 1 | 100 | 5,611 g | Så här justerar du pH |
| 4°C | Kaliumhydroxid (KOH) | 5 | 50 | 14,03 g | Så här justerar du pH |
| 4°C | Bes | 1 | 50 | 10,66 g | |
| 4°C | Propionsyra | 1 | 100 | 7,483 mL | Justera pH-värdet till 7,0 med 5M eller 1M KOH |
| 4°C | CaEGTA består av: | 0.1 | 100 | Blanda och värm lösningen till 60°C i mer än 1 timme. Justera pH-värdet till 5-6 med 1M KOH. | |
| - CaCO3 | 0.1 | 1,001 g | |||
| - Titriplex (EGTA) | 0.1 | 3.804 |
Tabell 1: Instruktioner för stamlösningsberedning.
| RELAX-ISO (för kardiomyocyters isolering) | [mM] | Vikt |
| Na2ATP | 5.95 | 3,28 g |
| MgCl2.6H2O | 6.04 | 1,23 g |
| Tritiplex (EGTA) | 2 | 0,76 g |
| KCl | 139.6 | 10,41 g |
| Imidazol | 10 | 0,68 g |
Tabell 2: Instruktioner för Relax-ISO lösningsberedning.
| Aktiverande lösning (för mätningarna) | [mM] | Vikt / volym |
| Na2ATP | 5.97 | 0,823 g |
| MgCl 1M | 6.28 | 1,57 mL |
| Propionsyra | 40.64 | 10,16 mL |
| Bes | 100 | 25 mL |
| CaEGTA (stamlösning som tidigare förberetts) | 7 | 17,5 mL |
| Na2PCr | 14.5 | 0,925 g |
Tabell 3: Instruktioner för aktivering av lösningsberedning.
| Avslappnande lösning (för mätningarna) | [mM] | Vikt / volym |
| Na2ATP | 5.89 | 0,325 g |
| MgCl 1M | 6.48 | 0,65 mL |
| Propionsyra | 40.76 | 4,08 mL |
| Bes | 100 | 10 mL |
| Titriplex (EGTA) | 6.97 | 0,265 g |
| Na2PCr | 14.5 | 0,370 g |
Tabell 4: Instruktioner för avslappnande lösningsberedning.
| pCa = -Logga [Ca2+] | Avslappnande (pCa=9.0) Ml |
Ativating (pCa =4,5) Ml |
| 5 | 0.86 | 39.14 |
| 5.1 | 1.2 | 38.80 |
| 5.2 | 1.54 | 38.46 |
| 5.3 | 2 | 38.00 |
| 5.4 | 2.51 | 37.49 |
| 5.5 | 3.14 | 36.86 |
| 5.6 | 3.89 | 36.11 |
| 5.7 | 4.8 | 35.20 |
| 5.8 | 5.89 | 34.11 |
| 5.9 | 7.14 | 32.86 |
| 6 | 8.57 | 31.43 |
Tabell 5: Instruktioner för pCa-lösningar beredning.
| Parametern | Gnagare | Gris | Mänskliga |
| Aktiv spänning, kN.m-2 (vid 2,2 μm) | 17 – 28 | 19 – 40 | 19 – 36 |
| Passiv spänning, kN.m-2 (vid 2,2 μm) | 3.6 – 5.5 | 1.9 – 6.8 | 1.8 – 2.3 |
| pCa50 | 5.58 – 5.64 | 5.40 – 5.50 | 5.43 – 5.82 |
| nHill | 2.60 – 2.76 | 2.95 – 3.36 | 2.99 – 3.10 |
| ktr, s-1 | 4.00 – 8.00 | 1.00 – 3.00 | 0.90 – 2.00 |
Tabell 6: Typiska parametrar och index som härrör från enstaka permeabiliserade kardiomyocyter från gnagare, svin och människor. Anpassad från12.
| Problem | Möjlig orsak | Lösning |
| Kardiomyocyten lossnar under maximal aktivering | Otillräcklig limningstid; Limmet är gammalt och har torkat | Öka tiden för limningssteget; överväga att öppna ett nytt limrör. |
| Det finns Triton® i cellfjädringslösningen, som inte längre kan avlägsnas | Upprepa extraktionsproceduren med ytterligare en eller två Triton® tvätta ur steg | |
| Kardiomyocyten har låg kraft under kontrollförhållanden | Extraktionen gick fel och levererade lågkvaliterade celler | Öka provstorleken och gör en ny extraktion. Om problemet kvarstår beror förmodligen på felaktig provsamling - kassera detta prov |
| Cellen är synligt upphandlande men ingen kraft registreras; Cellen har ovanliga kraftvärden | Kraftgivaren är avstängd | Slå på den |
| Kraftgivaren är inte välkalibrerad | Kalibrera kraftgivaren med hjälp av en uppsättning kända vikter (kontrollera tillverkarens instruktionsmanual). | |
| Kraftgivarens nål är lös | Lim nålen igen med hjälp av kristall bond 509 eller juvelerare vax. | |
| Striationmönstret är inte tillräckligt bra för att bestämma sarkomerlängden | Otillräckligt ljus | Öka mikroskopljuset eller flytta cellen tillbaka till täcket och bedöm sarkomlängden igen (brunnarna har lägre ljusintensitet) |
| Extraktionen gick fel och levererade lågkvaliterade celler | Öka provstorleken och gör en ny extraktion | |
| Nålar tips är inte i samma plan | Justera nålarnas spetsar uppåt eller nedåt tills du hittar en fokuserad sarkomer | |
| Ingen längd och/eller kraftvariation under förvärvet | Motorn eller kraftgivaren är avstängda | Slå på dem |
| Motorn är trasig och inte producerar cell förkortning | Byt ut den eller försök att kalibrera den med hjälp av en funktionsgenerator | |
| För mycket brus på förvärvsinspelningarna | För mycket luftflöde runt utrustningen | Skydda utrustningen mot det direkta luftflödet |
| För många vibrationer runt utrustningen | En stabilisering bord är tillrådligt. Även då rekommenderas att ta bort all utrustning som kan ha en kompressor eller avge vibrationer (frys, kylskåp) | |
| Ca2+-känslighetskurva har konstiga värden och kraftvärdena ökar inte med [Ca2+]. | Blandningen av aktiverande och avslappnande lösning gjordes inte på rätt sätt (kontrollera 3.10 till 3.14 av metodavsnittet, möjligen på grund av otillräcklig blandning) | Frosta av injektionsflaskan med samma koncentration, samla upp all injektionsflaskas innehåll i samma bägare, blanda med omrörare och dela dem igen. Testa dessa lösningar igen i en ny cell. Om detta löser problemet, förbereda en ny sats av Ca2 +-innehållande lösningar |
Tabell 7: Felsökningstabell.
Discussion
In vitro-bedömning av hjärtfunktionen med hjälp av flådda kardiomyocyter representerar en viktig teknik för att klargöra de ändringar som sker på kardiomyocyte nivå i fysiologiska (t.ex., stretch) och patologiska sammanhang (t.ex., ischemi). Denna metod har flera fördelar såsom att kräva en minimal mängd av myokardium för att bedöma funktion i kardiomyocyter som erhållits från upptinade prover; med hjälp av kardiomyocyter från ett brett spektrum av arter (möss13, råtta1,14,15,kanin 16, gris17, hund18, marsvin19 och mänskliga20) och olika hjärt platser, inklusive atria, vänster och höger ventriklar eller en specifik region i infarcted hjärtat. Dessutom tillåter denna teknik att leverera specifika koncentrationer av Ca2 + och energi (ATP) samtidigt som man mäter funktionen av reglerande och kontraktila strukturer i deras inhemska konfiguration.
Trots enkelheten i denna teknik, det finns några kritiska steg. Det är väsentligt att garantera kvaliteten på varje steg från början, inklusive provsamling. Myofilamentproteiner är mottagliga för proteaser21. Således är det obligatoriskt att lagra prover i flytande kväve omedelbart efter dess insamling. Färska prover, som inte tidigare frystes, kommer att utveckla betydligt högre krafter, så det är inte lämpligt att blanda mätning som görs i färska och frysta prover i samma protokoll. Det näst mest kritiska steget är kardiomyocyternas extraktion. Under detta förfarande är det avgörande att behålla provet på is för det mesta. En proteashämmare cocktail kan användas för att minska risken för proteinnedbrytning under extraktionen/permeabiliseringen22. För det tredje bör prover skäras i mindre bitar med hjälp av exakta skalpell rörelser sedan vi noterade minskad kvalitet kardiomyocyter när detta steg ignorerades. Ett annat kritiskt steg är att tvätta kardiomyocyterna eftersom det är svårt att ha rätt balans mellan att tvätta ut Triton (genomsyrar cellen men främjar dess ungluing) och att hålla så många celler i supernatanten som möjligt. Det är viktigt att först prova extraktionen och antalet washouts för varje prov, art eller protokoll. Till exempel, i våra händer, noterade vi att ZSF1 feta råtta vävnad extraktioner har en "fet" aspekt, vilket gjorde dessa celler mer hala under limning men inte svårare att mäta. Det sätt vi kringgå detta problem var genom att utföra fler experiment för att ha ett rimligt antal celler per djur. Dessutom är det avgörande att välja en bra cell att limma, nämligen med god stritriation och rimlig längd. Om kardiomyocyte inte har dessa funktioner, kommer det att lossna mestadels från nålen tips eller utveckla ingen / låg kraft. Det är också viktigt att använda rätt lim för kardiomyocyte fastsättning, med tanke på tiden för limning och dess effekt att limma cellen till nålen. I våra händer botar silikonlimmet (Table of Materials) snabb (10-15 min) och tillräckligt stark. Slutligen är det sista kritiska steget relaterat med att försiktigt lyfta kardiomyocyten 5 min efter limning av cellen (för att undvika limning av cellen till täcket) och innan du flyttar den till brunnarna (för att undvika att cellen ska dras av mikroskopet skede). Tabell 7 sammanfattar felsökningen som är kopplad till den här tekniken, dess bakomliggande orsaker och möjliga lösningar för att övervinna frekventa problem.
Den stora begränsningen av denna metod är att den inte kan svara på alla frågor som rör myofilament kontraktilitet, till exempel hur snabbt myofilaments aktivera / deaktivera. I in vivo inställningen, membran depolarisation, intracellulära Ca2 + öka och dess diffusion till myofilaments måste uppstå för myocyterna att kontrakt, medan i flådda kardiomyocyter Ca2 + diffusion till myofilaments sker omedelbart när cellen är nedsänkt i Ca2 + lösning. Denna snabbare hastighet av Ca2 + diffusion kommer bias myofilaments aktivering / avaktivering analys23.
Dessa experiment påverkas av olika faktorer, inklusive temperatur, lösning pH, mekanisk perturbation (slack-re-stretch vs. slack) och cellens fästprocedurer (stiftslip vs. lim), alla dessa variabler som står för litteraturavvikelser i termer av ktr och den sarkomeriska längdberoende ökningen av kraft4,12.
Framtida framsteg av tekniken inkluderar utför funktionella studier i intakt snarare än permeabilized kardiomyocyter. Denna teknik har nackdelen att förlita sig på kardiomyocyter nyligen isolerade (inte tidigare frysta). En annan viktig fråga som inte har direkt samband med denna metod, men som kan ha en betydande inverkan på den är relaterad till den maximala perioden av provfryst lagring. Specifikt är det obligatoriskt att fastställa graden av myofilament nedbrytning under hela lagringstiden (dvs. för hur länge frysta prover kan lagras för att säkerställa god kvalitet funktionella data som härrör från de extraherade kardiomyocyter).
Disclosures
Författarna har ingen intressekonflikt.
Acknowledgments
Författarna tackar Portugisiska stiftelsen för vetenskap och teknik (FCT), Europeiska unionen, Quadro de Referência Estratégico Nacional (QREN), Fundo Europeu de Desenvolvimento Regional (FEDER) och Programa Operacional Factores de Competitividade (COMPETE) för finansiering unic (UID/IC/00051/2013) forskningsenhet. Detta projekt stöds av FEDER genom COMPETE 2020 - Programa Operacional Competitividade E Internacionalização (POCI), projektet DOCNET (NORTE-01-0145-FEDER-000003), med stöd av Norte Portugals regionala operativa program (NORTE 2020), inom ramen för Portugals 2020-partnerskapsavtal, genom Europeiska regionala utvecklingsfonden (ERUF), projektet NETDIAMOND (POCI-01-0145-FEDER-016385), med stöd av europeiska struktur- och investeringsfonder, Lissabons regionala operativa program 2020. Patrícia Rodrigues finansierades av FCT (SFRH/BD/96026/2013) och João Almeida-Coelho var av Universidade do Porto/FMUP och FSE-Fundo Social Europeu, NORTE 2020-Programa Operacional Regional do Norte, (NORTE-08-5369-FSE-000024-Programas Doutorais).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetone | Sigma | 34580 | |
| Adenosine 5’-triphosphate disodium salt hydrate (Na2ATP) | Sigma | A2383 | |
| Calcium carbonate (CaCO3) | Merck | 1.02067.0500 | |
| Imidazole | VWR | 24720.157 | |
| Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2.6H2O) | Merck | 1.05833.0250 | |
| Magnesium chloride solution (MgCl2 1M) | Sigma | M1028 | |
| N,N-Bis(2-hydroxyethyl)taurine (BES) | Sigma | B9879 | |
| Phosphocreatine dissodium salt hydrate (Na2PCr) | Sigma | P7936 | |
| Potassium chloride (KCl) | Merck | 1.04936.1000 | |
| Potassium hydroxide (KOH) | Merck | 8.14353.1000 | |
| Propionic acid (C3H6O2) | Merck | 8.00605.0500 | |
| Silicone Squeeze Tube | Marineland | 31003 | |
| Tritiplex (EGTA) | Merck | 1.08435.0025 | |
| Triton® X-100 10% | Merck | 648463 | |
| Tissue homogeneizer (GKH GT Motor Control) | Terre Haute Glas-col | ||
| Length Controller (Model 315C-I) | Aurora Scientific | ||
| Force Transducer (Model 403 A) | Aurora Scientific | ||
| Software ASI 600A | Aurora Scientific | ||
| Sotware VSL (Model 900B) | Aurora Scientific | ||
| Inverted Microscope (IX51) | Olympus |
References
- Leite-Moreira, A. M., et al. Stretch-induced compliance: a novel adaptive biological mechanism following acute cardiac load. Cardiovascular Research. 114 (5), 656-667 (2018).
- Falcao-Pires, I., Fontes-Sousa, A. P., Lopes-Conceicao, L., Bras-Silva, C., Leite-Moreira, A. F. Modulation of myocardial stiffness by β-adrenergic stimulation - its role in normal and failing heart. Physiological Research. 60 (4), 599-609 (2011).
- Cokkinos, D. V. Introduction to Translational Cardiovascular Research. , Springer International Publishing. 371-387 (2015).
- van der Velden, J., Stienen, G. J. M. Cardiac Disorders and Pathophysiology of Sarcomeric Proteins. Physiological Reviews. 99 (1), 381-426 (2019).
- Garnier, D. Attachment procedures for mechanical manipulation of isolated cardiac myocytes: a challenge. Cardiovascular Research. 28 (12), 1758-1764 (1994).
- Brady, A. J. Mechanical properties of isolated cardiac myocytes. Physiological Reviews. 71 (2), 413-428 (1991).
- Falcao-Pires, I., Leite-Moreira, A. F. Chapter 20. Introduction to Translational Cardiovascular Research. Cokkinos, D. V. 20, Springer, Cham. 371-387 (2015).
- Liang, W. Teaching calcium-induced calcium release in cardiomyocytes using a classic paper by Fabiato. Advances Physiology Education. 32 (1), 1-10 (2008).
- Roche, S. M., Gumucio, J. P., Brooks, S. V., Mendias, C. L., Claflin, D. R. Measurement of Maximum Isometric Force Generated by Permeabilized Skeletal Muscle Fibers. Journal of Visualized Experiments. (100), e52695 (2015).
- Huxley, A. F. Muscle structure and theories of contraction. Progress Biophysics and Biophysical Chemistry. 7, 255-318 (1957).
- Sequeira, V., et al. Synergistic role of ADP and Ca(2+) in diastolic myocardial stiffness. Journal Physiology. 593 (17), 3899-3916 (2015).
- Edes, I. F., et al. Rate of tension redevelopment is not modulated by sarcomere length in permeabilized human, murine, and porcine cardiomyocytes. American Journal Physiology Regulatory Integrative Comparative Physiology. 293 (1), R20-R29 (2007).
- King, N. M., et al. Mouse intact cardiac myocyte mechanics: cross-bridge and titin-based stress in unactivated cells. Journal General Physiology. 137 (1), 81-91 (2011).
- Hamdani, N., et al. Myocardial titin hypophosphorylation importantly contributes to heart failure with preserved ejection fraction in a rat metabolic risk model. Circulation Heart Failure. 6 (6), 1239-1249 (2013).
- Miranda-Silva, D., et al. Characterization of biventricular alterations in myocardial (reverse) remodelling in aortic banding-induced chronic pressure overload. Scientific Reports. 9 (1), 2956 (2019).
- Rodrigues, P. G., et al. Early myocardial changes induced by doxorubicin in the nonfailing dilated ventricle. American Journal Physiology Heart Circulatory Physiology. 316 (3), H459-H475 (2019).
- van der Velden, J., et al. Alterations in myofilament function contribute to left ventricular dysfunction in pigs early after myocardial infarction. Circulation Research. 95 (11), e85-e95 (2004).
- Wakili, R., et al. Multiple potential molecular contributors to atrial hypocontractility caused by atrial tachycardia remodeling in dogs. Circulation: Arrhythmia Electrophysiology. 3 (5), 530-541 (2010).
- Ait Mou, Y., le Guennec, J. Y., Mosca, E., de Tombe, P. P., Cazorla, O. Differential contribution of cardiac sarcomeric proteins in the myofibrillar force response to stretch. Pflugers Archiv. 457 (1), 25-36 (2008).
- Falcao-Pires, I., et al. Diabetes mellitus worsens diastolic left ventricular dysfunction in aortic stenosis through altered myocardial structure and cardiomyocyte stiffness. Circulation. 124 (10), 1151-1159 (2011).
- Lim, C. C., et al. Anthracyclines induce calpain-dependent titin proteolysis and necrosis in cardiomyocytes. Journal Biology Chemistry. 279 (9), 8290-8299 (2004).
- Woulfe, K. C., et al. A Novel Method of Isolating Myofibrils From Primary Cardiomyocyte Culture Suitable for Myofibril Mechanical Study. Frontiers Cardiovascular Medicine. 6, 12 (2019).
- Ait Mou, Y., Bollensdorff, C., Cazorla, O., Magdi, Y., de Tombe, P. P.
