Summary
Bakterielle Krankheitserreger sezernieren Proteine in den Wirt, die auf entscheidende biologische Prozesse abzielen. Die Identifizierung der Wirtswege, auf die bakterielle Effektorproteine abzielen, ist der Schlüssel zur Bekämpfung der molekularen Pathogenese. Hier wird eine Methode beschrieben, bei der ein modifizierter Hefesuppressor und ein Toxizitäts-Bildschirm verwendet werden, um Wirtswege aufzuklären, die von toxischen bakteriellen Effektorproteinen angegriffen werden.
Abstract
Intrazelluläre Bakterien sezernieren Virulenzfaktoren, sogenannte Effektorproteine, in das Wirtszytosol, die wirtsproteine und/oder die damit verbundenen biologischen Bahnen zum Nutzen des Bakteriums untergraben. Die Identifizierung von vermeintlichen bakteriellen Effektorproteinen ist aufgrund der Fortschritte bei der Sequenzierung des bakteriellen Genoms und des Aufkommens von Algorithmen, die die Silico-Identifizierung von Genen ermöglichen, die Sekretionskandidaten und/oder eukaryotisch-ähnliche Domänen. Die Identifizierung dieser wichtigen Virulenzfaktoren ist jedoch nur ein erster Schritt. Natürlich ist das Ziel, die molekulare Funktion von Effektorproteinen zu bestimmen und zu klären, wie sie mit dem Wirt interagieren. In den letzten Jahren haben Techniken wie der Hefe-Zwei-Hybrid-Bildschirm und großflächige Immunpräzipitationen in Verbindung mit Massenspektrometrie bei der Identifizierung von Protein-Protein-Wechselwirkungen unterstützt. Obwohl die Identifizierung eines Wirtsbindungspartners der entscheidende erste Schritt zur Aufklärung der molekularen Funktion eines bakteriellen Effektorproteins ist, hat das Wirtsprotein manchmal mehrere biologische Funktionen (z. B. Actin, Clathrin, Tubulin) oder Das bakterielle Protein kann Wirtsproteine nicht physisch binden, was dem Forscher wichtige Informationen über den genauen Wirtsweg, der manipuliert wird, vorenthält. Ein modifizierter Hefetoxizitätssieb in Verbindung mit einem Suppressor-Bildschirm wurde angepasst, um Wirtswege zu identifizieren, die von bakteriellen Effektorproteinen beeinflusst werden. Der Toxizitäts-Bildschirm beruht auf einer toxischen Wirkung in Hefe, die durch das Effektorprotein verursacht wird, das die biologischen Wirtswege stört, was sich oft als Wachstumsfehler manifestiert. Expression einer Hefegenombibliothek wird verwendet, um Wirtsfaktoren zu identifizieren, die die Toxizität des bakteriellen Effektorproteins unterdrücken, und so Proteine in dem Weg zu identifizieren, auf den das Effektorprotein abzielt. Dieses Protokoll enthält detaillierte Anweisungen sowohl für die Toxizitäts- als auch für die Unterdrückerbildschirme. Diese Techniken können in jedem Labor durchgeführt werden, das in der Lage ist, molekulares Klonen und Kultivieren von Hefe und Escherichia coli.
Introduction
Der erste Bericht über Verfahren ähnlich denen, die hier vorgestellt wurden, charakterisierte die Legionella pneumophila Typ IV Effektor SidD, eine DeAMPylase, die Rab11ändert. Vergleichbare Techniken wurden für die Charakterisierung mehrerer L. pneumophila Effektoren1,2,3verwendet. Der Assay wurde angepasst, um ein Coxiella burnetii Typ IV Effektorprotein4zu charakterisieren, und vor kurzem wurde der Nutzen dieser Technik für die Charakterisierung von Chlamydia trachomatis Inklusionsmembranproteinen erweitert5 .
Dieses Protokoll kann in zwei Hauptteile unterteilt werden: 1) der Hefetoxizitätssieb, in dem das bakterielle Effektorprotein von Interesse in Hefe exprimiert wird und Klone auf einen toxischen Phänotyp untersucht werden, wie ein Wachstumsdefekt belegt ist, und 2) der Hefesuppressor-Bildschirm , bei dem der toxische Phänotyp durch Expression einer Hefe-Genombibliothek im toxischen Stamm unterdrückt wird. So ist der Toxizitätsbildschirm ein Bildschirm für toxische Phänotypen, die sich als Wachstumsdefekte manifestieren, wenn der bakterielle Effektor von Interesse überexprimiert wird. Toxische Klone, die erfolgreich mit dem bakteriellen Effektor transformiert und exemittiert werden, werden ausgewählt und für den nächsten Schritt gespeichert. Der zweite große Schritt besteht darin, eine teilweise verdaute Hefe-Genombibliothek im toxischen Hefeklon zu exexzessither zu exexzessiert. Plasmide, die die hefegenomische Bibliothek ausmachen, die für die Verwendung in diesem Protokoll vorgeschlagen wird, tragen 5-20 kb Einsätze, die in der Regel 3-13 Hefe-Open-Leserahmen (ORF) mit einer durchschnittlichen Gengröße von 1,5 kb über alle Plasmide entsprechen, die das gesamte abgedeckte Hefegenom darstellen. ca. 10x. Dieser Teil des Assays wird als Suppressor-Bildschirm bezeichnet, da das Ziel darin besteht, die Toxizität des bakteriellen Effektorproteins zu unterdrücken. Potenzielle Suppressorplasmide werden aus Hefe isoliert, sequenziert und die unterdrückenden ORFs identifiziert. Die dem Suppressor-Bildschirm zugrunde liegende Begründung ist, dass das Effektorprotein Komponenten des Wirtswegs bindet, mit ihm verbindet und/oder überwältigt, und dass die Bereitstellung dieser Wirtsproteine im Überschuss die toxische Wirkung auf den Pfad retten und somit, Wachstumsfehler. So stellen identifizierte ORFs, die Toxizität unterdrücken, oft mehrere Teilnehmer eines Wirtswegs dar. Orthogonale Experimente werden dann durchgeführt, um zu überprüfen, ob der bakterielle Effektor tatsächlich mit dem implizierten Weg interagiert. Dies ist insbesondere dann notwendig, wenn ein Bindungspartner wie Clathrin oder Actin identifiziert wurde, da diese Proteine an einer Vielzahl von Wirtsprozessen beteiligt sind. Weitere Experimente können dann die physiologische Funktion des Effektorproteins während der Infektion aufklären. Die Toxizitäts- und Unterdrückersiebe sind auch leistungsfähige Werkzeuge zur Entschlüsselung der physiologischen Funktion von bakteriellen Effektorproteinen, die Wirtsproteine nicht physisch mit Affinitäten binden, die ausreichen, um durch Immunpräzipitation zu erkennen, oder die mit dem in enzymatischen Hit-and-Run-Interaktionen, die möglicherweise nicht von einem Hefe-zwei-Hybrid-Bildschirm erkannt werden.
Obwohl der Suppressor-Bildschirm eine leistungsfähige Methode sein kann, um potenzielle physiologische Wechselwirkungen zwischen bakteriellen Effektorproteinen und Wirtswegen aufzudecken, muss das bakterielle Effektorprotein einen Wachstumsfehler in Hefe induzieren, andernfalls Suppressor-Bildschirm wird wenig nutzen. Darüber hinaus muss der toxische Phänotyp zu mindestens einem Wachstumsdefizit von 2 bis 3 Log10 führen, oder es wird schwierig sein, Unterdrücker zu identifizieren. Wenn ein Labor für die Zellkultur eingerichtet ist, kann das Screening von Effektorproteinen auf Toxizität in gängigen Zelllinien wie HeLa oft einen Einblick geben, ob es sich lohnt, mit dem Hefetoxizitätsbildschirm fortzufahren. Die ektopische Expression des Effektorproteins in HeLa-Zellen führt manchmal zu toxizitätsbegierig, die sehr stark mit der Toxizität des Hefestamms korreliert, der für diese Bildschirme verwendet wird4. Beobachtbare Merkmale der Belastung in HeLa-Zellen sind der Verlust von Stressfasern, die Zellablösung von der Platte und die kerntechnische Kondensation, die auf Apoptose hindeutet. Jede visuelle Indikation von Stress in HeLa-Zellen macht das Protein von Interesse zu einem guten Kandidaten für die Induktion eines Wachstumsfehlers in Hefe, die sich viel schneller replizieren und somit besser auf Störungen wesentlicher Wege reagieren.
Es sollte beachtet werden, dass der Suppressor-Bildschirm nicht immer Host-Bindungspartner als Unterdrücker identifiziert, aber es kann immer noch kritische Komponenten des(n) Ziels des Wirtswegs mit einimplizieren, was zu einer ganzheitlichen Sicht auf die biologischen Prozesse führt, die von der bakterielles Effektorprotein. Oberflächlich betrachtet scheint dies kontraintuitiv, da die Bereitstellung des Bindungspartners des Effektorproteins im Überschuss den Wachstumsdefekt zu retten erwarten wäre. Bei den Bemühungen, die vom C. trachomatis Effector Protein CT229 (CpoS), das während derInfektionan mindestens 10 verschiedene Rab GTPases bindet, zu identifizieren, unterdrückte keiner der Rab-Bindenden die Toxizität von CT229. Es wurden jedoch zahlreiche Unterdrücker identifiziert, die am Handel mit Klathrin-beschichteten Vesikel (CCV) beteiligt waren, was zu weiteren Arbeiten führte, die belegen, dass CT229 den Von Rab abhängigen CCV-Handel gezielt untergräbt. In ähnlicher Weise wurden bei der Untersuchung des C. burnetii Effektorproteins Cbu0041 (CirA) mehrere Rho GTPases identifiziert, die den Hefewachstumsdefekt retteten, und es wurde später festgestellt, dass CirA als GTPase-aktivierendes Protein (GAP) für RhoA4fungiert.
Die Nützlichkeit des Hefesuppressor-Bildschirms zur Aufklärung von Wirtswegen, die von bakteriellen Effektorproteinen ins Visier genommen werden, kann nicht überbewertet werden, und andere Forscher, die versuchen, intrazelluläre bakterielle Effektorproteine zu charakterisieren, können diese Techniken. Diese Assays sind von Wert, wenn Immunpräzipitiermitteln und/oder Hefe-zwei Hybrid-Screens keinen Bindungspartner gefunden haben und klären können, welche Wege durch das bakterielle Effektorprotein ins Visier genommen werden. Hier werden detaillierte Protokolle für die Toxizitäts- und Unterdrücker-Screens zur Identifizierung von wirtlichen biologischen Pfaden bereitgestellt, die von intrazellulären bakteriellen Effektorproteinen ins Visier genommen werden, sowie einige der häufigsten Hindernisse, die bei der Verwendung dieser Assays und ihrer entsprechenden Lösungen.
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Protocol
1. Herstellung von Medien und Reagenzien
HINWEIS: Die Platten sollten vor dem Tag des Assays vorbereitet werden und sind gut für 1 Monat. Medien und Reagenzien können jederzeit hergestellt werden und sind gut für 1 Monat.
- 1 L der Glukoselösung (10% w/v) vorbereiten, indem 100 g D-(+)-Glucose in 800 ml destilliertem Wasser in einem 1 000 ml Becher gelöst werden. Stellen Sie die Lautstärke mit destilliertem Wasser auf 1 L ein. Filtern Sie durch einen 0,2 m sterilen Filter in eine sterile 1 L Medienspeicherflasche.
- 1 L der Galaktoselösung (10% w/v) vorbereiten, indem 100 g D-(+)- Galaktose in 800 ml destilliertem Wasser in einem 1 L Becher gelöst werden. Stellen Sie das Volumen mit destilliertem Wasser auf 1 ml ein und filtern Sie es durch einen 0,2 m sterilen Filter in eine sterile 1.000 ml Medienspeicherflasche.
- Bereiten Sie 1 L Hefeextrakt Peptondextrose (YPD) Agar durch Auflösen von 10 g Hefeextrakt, 20 g Pepton, 20 g Glukose und 20 g Agar in 1.000 ml destilliertem Wasser vor. Autoklav für 20 min und abkühlen in 56 °C Wasserbad bis zum Abkühlen. Gießen Sie in 100 mm Platten mit 20 ml Medien pro Platte.
- Bereiten Sie 1 L YPD-Brühe vor, indem Sie 10 g Hefeextrakt, 20 g Pepton und 20 g Glukose in 1.000 ml destilliertem Wasser auflösen. Autoklav für 20 min.
- Bereiten Sie den synthetischen Aussetzer (SD) Uracil (Ura-) Glucose-Agar vor. Für 1 L 6,7 g Hefestickstoffbasis ohne Aminosäuren, 1,9 g Aussetzerzusatz ohne Uracil und 15 g Agar in 800 ml destilliertem Wasser auflösen. Autoklav für 20 min und abkühlen in einem 56 °C Wasserbad, bis die Temperatur 50 bis 60 °C beträgt. Mit einer 50 ml serologischen Pipette oder einem sterilen abgestuften Zylinder 200 ml der in Schritt 1.1 zubereiteten Glukoselösung hinzufügen. Gut mischen, indem Sie sanft wirbeln oder auf Rührplatte platzieren. Gießen Sie in 100 mm Platten mit 20 ml Medien pro Platte.
- Bereiten Sie den synthetischen Aussetzer (SD) uracil (Ura-) galactose agar vor. Für 1 L 6,7 g Hefestickstoffbasis ohne Aminosäuren, 1,9 g Aussetzerzusatz ohne Uracil und 15 g Agar in 800 ml destilliertem Wasser auflösen. Autoklav für 20 min und abkühlen in einem 56 °C Wasserbad, bis die Temperatur 50 bis 60 °C beträgt. Mit einer 50 ml serologischen Pipette oder einem sterilen abgestuften Zylinder 200 ml der in Schritt 1.2 vorbereiteten Galaktoselösung hinzufügen. Gut mischen, indem Sie sanft wirbeln oder auf die Rührplatte legen. Gießen Sie in 100 mm Platten mit 20 ml Medien pro Platte.
- Bereiten Sie den synthetischen Aussetzer (SD) Uracil (Ura-) Glukosebrühe vor. Für 1 L 6,7 g Hefestickstoffbasis ohne Aminosäuren und 1,9 g Aussetzerzusatz ohne Uracil in 800 ml destilliertem Wasser auflösen. Autoklav für 20 min und abkühlen in einem 56 °C Wasserbad, bis die Temperatur 50 bis 60 °C beträgt. Mit einer 50 ml serologischen Pipette oder einem sterilen abgestuften Zylinder 200 ml der in Schritt 1.1 zubereiteten Glukoselösung hinzufügen.
- Bereiten Sie den synthetischen Aussetzer (SD) uracil (Ura-) Leucin (Leu-) Glucose-Agar vor. Für 1 L 6,7 g der Hefestickstoffbasis ohne Aminosäuren auflösen; 1,9 g Aussteigerzulage ohne Uracil, Leucin und Tryptophan; 15 g Agar; und 0,076 g Tryptophan in 800 ml destilliertem Wasser. Autoklav für 20 min und abkühlen in einem 56 °C Wasserbad, bis die Temperatur 50 bis 60 °C beträgt. Mit einer 50 ml serologischen Pipette oder einem sterilen abgestuften Zylinder 200 ml der in Schritt 1.1 zubereiteten Glukoselösung hinzufügen. Gießen Sie in 100 mm Platten mit 20 ml Medien pro Platte.
- Bereiten Synthetische sD (SD) uracil (Ura-) Leucin (Leu-) Galactose Agar. Für 1 L 6,7 g Hefestickstoffbasis ohne Aminosäuren auflösen; 1,9 g Aussteigerzulage ohne Uracil, Leucin und Tryptophan; 15 g Agar; und 0,076 g Tryptophan in 800 ml destilliertem Wasser. Autoklav für 20 min und abkühlen in einem 56 °C Wasserbad, bis die Temperatur 50 bis 60 °C beträgt. Mit einer 50 ml serologischen Pipette oder einem sterilen abgestuften Zylinder 200 ml der in Schritt 1.2 vorbereiteten Galaktoselösung hinzufügen. Gut mischen, indem Sie sanft wirbeln oder auf eine Rührplatte legen. Gießen Sie in 100 mm Platten mit 20 ml Medien pro Platte.
- Bereiten Synthetische sD (SD) Uracil (Ura-) Leucin (Leu-) Glukosebrühe vor. Für 1 L 6,7 g Hefestickstoffbasis ohne Aminosäuren auflösen; 1,9 g Aussteigerzulage ohne Uracil, Leucin, Tryptophan; und 0,076 g Tryptophan in 800 ml destilliertem Wasser. Autoklav für 20 min und abkühlen in einem 56 x 60 °C Wasserbad, bis die Temperatur 50 °C beträgt. Mit einer 50 ml serologischen Pipette oder einem sterilen abgestuften Zylinder 200 ml der in Schritt 1.1 zubereiteten Glukoselösung hinzufügen.
- Herstellung der Polyethylenglykollösung (PEG). 50% w/v Polyethylenglykol 3350 in destilliertem Wasser hinzufügen. Sterilisieren durch Autoklavieren.
- 1 M Lithiumacetat (LiAc) vorbereiten, indem 10,2 g Lithiumacetat dehydriert in 200 ml destilliertem Wasser gelöst werden. Sterilisieren durch Autoklavieren.
- Bereiten Sie Hering Sperma DNA vor. 10 mg/ml HeringSperma-DNA mit destilliertem Wasser auf 2 mg/ml verdünnen. Bei 100 °C 5 min erhitzen und sofort 5 min auf Eis legen.
2. Klonen des Gens von Interesse in das Hefetoxizitätsplasmid pYesNTA-Kan
HINWEIS: Derzeit gibt es eine Vielzahl von Hefe Toxizität Vektoren sowohl kommerziell als auch akademisch verfügbar. Der Hefe-Suppressor-Bildschirm kann in Verbindung mit vielen dieser Vektoren verwendet werden, sofern das Plasmid, das das Effektorprotein von Interesse ausdrückt, eine andere Aussetzerauswahl als Uracil und einen anderen Antibiotikum-Marker als BlaRverwendet. Diese Arbeit verwendet einen modifizierten pYesNTA Vektor4,5, der eine Kanamycin-Widerstand-Kassette für eine einfachere Abschirmung für potenzielle Unterdrücker enthält. Das Klonschema muss es ermöglichen, dass das Effektorprotein mit dem Gal-Promoter und His-Tag im Rahmen sein kann. Das Chlamydia trachomatis Inklusionsmembranprotein CT229 wurde als Prinzipiellbeweis für diese Assays verwendet.
- Verwenden Sie PCR, um CT229 aus C. trachomatis genomischer DNA gemäß den Anweisungen des Herstellers mit CT229 +1 Kpn F (CCGGTACCAATGAGCTGTTCTAATGTTAATTCAGGT) und CT229 XhoI R (CCCTCTCTTTTTTTTACGACGGGATGCC) Primer zu verstärken. Verwenden Sie die folgenden PCR-Bedingungen: (1) 98 °C für 30 s; (2) 98 °C für 10 s, 55 °C für 30 s, 72 °C für 2 min; (3) Schritt 2 für insgesamt 25x wiederholen; (4) 72 °C für 10 min; und (5) 4 °C halten.
- Analysieren Sie 5 l des PCR-Produkts auf einem 1% Agarose-Gel (Abbildung 1).
- Reinigen Sie die restlichen 45 L DNA mit einem PCR-Reinigungskit nach den Anweisungen des Herstellers.
- Verdauen Sie die 50 l gereinigten PCR-Einsatz und pYesNTA-Kan (Abbildung 2) für 1 h bei 37 °C in einem Wasserbad mit KpnI-HF und XhoI-HF.
ANMERKUNG: Verdauen Sie für pYesNTA-Kan 5 g Plasmid mit 5 l KpnI-HF, 5 l XhoI-HF und 6 l Puffer in einem Gesamtvolumen von 60 l. Verdauen Sie für den Einsatz die gesamten 50 L des gereinigten PCR-Produkts mit 2 L KpnI-HF, 2 l XhoI-HF und 6 l Puffer. - Führen Sie den gesamten Plasmid-Digest auf einem 1% Agarose-Gel aus. Führen Sie die Reinigung des verdauten Plasmids mit einem Gelextraktionskit gemäß den Anweisungen des Herstellers durch.
- Reinigen Sie den verdauten PCR-Einsatz mit einem PCR-Reinigungskit gemäß den Anweisungen des Herstellers.
- Klonen Sie den Einsatz in pYesNTA-Kan mit 2 l pYesNTA-Kan (Schritt 2,5), 2 l DNA-Ligasepuffer, 1 l T4-Ligase und 15 l Einsatz (Schritt 2,6). Bei Raumtemperatur 1 h inkubieren.
- Fügen Sie die gesamte Klonreaktion zu 50 l E. coli-fähigen Zellen hinzu und führen Sie die Transformationsreaktion durch.
- Die gesamte Transformationsreaktion auf einer LB-Platte, die 100 g/ml Carbenicillin enthält, verplatten.
- Impfen Sie 10 ml der LB mit 100 g/ml Carbenicillin mit drei einzelindividuellen Kolonien. Über Nacht bei 37 °C mit Schütteln bei 150 Umdrehungen von 150 Umdrehungen/min inkubieren.
- Isolieren Sie das Plasmid mit einem Plasmid-Miniprep-Kit nach den Anweisungen des Herstellers.
- Sequenzieren Sie die isolierten Plasmide mit genspezifischen Primern (Schritt 2.1).
3. Testen Sie das Protein von Interesse auf Toxizität in Hefe
- Streak Saccharomyces cerevisiae W303 auf YPD agar (Schritt 1.3), um isolierte Kolonien zu erhalten. Bei 30 °C für 24 h inkubieren.
- Impfen Sie 10 ml YPD-Brühe (Schritt 1.4) mit einer einzigen Kolonie aus der Agarplatte (Schritt 3.1). Bei 30 °C mit Schütteln bei 150 Umdrehungen von 150 Rpm über Nacht inkubieren.
- 0,5 ml der Nachtkultur auf 10 ml YPD-Brühe (Schritt 1.4) geben und bei 30 °C mit Schütteln bei 150 U/min für 4 h brüten.
- Pellet die 10 ml Kultur bei 3.000 x g für 10 min bei 4 °C.
- Das Pellet in 1 ml sterilem Wasser wieder aufhängen, in das Mikrozentrifugenrohr geben und bei Raumtemperatur 1 min bei 3.000 x g pellet.
- Das Pellet in 1 ml mit 1 ml Lithiumacetat (LiAc) und Pellet bei 3.000 x g für 1 min bei Raumtemperatur wieder aufsetzen.
- Wiederholen Sie die LiAc-Waschanlage 2x.
- Entfernen Sie die Wäsche. Das Pellet in 2,4 ml von 50% PEG 3350 wieder aufsetzen. Fügen Sie 360 l 1M LiAc, 500 l mit 2 mg/ml Hering-Sperma-DNA und 400 l steriles Wasser hinzu.
HINWEIS: Dies ist ausreichend für 20 Transformationen. - Fügen Sie 180 l des Transformationsmixes aus Schritt 3.3.5 zu einem Mikrozentrifugenrohr hinzu, das 5 l pYesNTA-Kan CT229 Plasmid-DNA (100-500 ng) aus Schritt 2.12 enthält.
- Inkubieren Sie in einem Wasserbad bei 30 °C für 30 min.
- Inkubieren Sie in einem Wasserbad bei 42 °C für 30 min.
- Pellet bei 3.000 x g für 1 min bei Raumtemperatur.
- Entfernen Sie die Transformationsmischung mit der Pipette. Setzen Sie das Pellet in 100 l sterilem Wasser wieder auf. Platte die Umwandlung auf SD Ura- Agar mit Glukose (Schritt 1.5).
- Platten bei 30 °C für 48 h inkubieren.
- 5 ml SD Ura- Glucosehaltige Brühe (Schritt 1.7) mit einer einzigen Kolonie von der Platte impfen. Über Nacht bei 30 °C mit Schütteln bei 150 Umdrehungen von 150 Umdrehungen/min inkubieren. Beziehen Sie Hefe, die mit dem Vektor allein als Negativsteuerelement transformiert wurde, ein.
- Fügen Sie 180 l steriles Wasser in 5 Brunnen einer 96-Wellplatte (A2-A6) hinzu.
- Wirbel die Nachtkultur zu mischen.
- Fügen Sie dem ersten Brunnen (A1) 180 L Hefe hinzu. Seriell 1:10 verdünnen (insgesamt sechs Proben einschließlich unverdünnt).
- Mit einer Mehrkanalpipette, Punkt 5 l jeder Verdünnung auf SD Ura- Glukose (Schritt 1.5) und Ura- Galaktose (Schritt 1.6) Agarplatten. Bei 30 °C für 48 h inkubieren.
- Bewerten Sie die Toxizität, indem Sie das Wachstum der Hefe, die das Effektorprotein von Interesse ausdrückt, das auf den Galaktose-haltigen Medien angebaut wird, mit dem Wachstum von Hefe vergleichen, die den Vektor allein ausdrückt.
- Bestätigen Sie die Expression des His-Tag-Fusionsproteins durch Western Blotting.
4. Transformieren Sie giftige Hefe mit der Hefe-Genombibliothek
- 100 ml SD Ura- Glukosebrühe (Schritt 1,7) mit 1 ml des Bestands ab Schritt 3.4 impfen. Für 16 bis 24 h bei 30 °C mit Schütteln bei 150 R/min inkubieren. Platz 900 ml SD Ura- Glukosebrühe bei 30 °C über Nacht, um die Medien vorzuwärmen.
- Fügen Sie die gesamten 100 ml der Übernachtungskultur zum vorgewärmten 1 L-Kolben hinzu. Bei 30 °C bei 150 R/min für 4 x 5 h inkubieren.
- Pellet die Kultur bei 6.000 x g für 10 min bei 4 °C.
- Entsorgen Sie den Überstand. Das Pellet in 250 ml sterilem Wasser wieder aufhängen. Pellet die Kultur bei 6.000 x g für 5 min bei 4 °C.
- Entsorgen Sie den Überstand. Das Pellet in 250 ml von 1 mM LiAc wieder aufhängen. Pellet die Kultur bei 6.000 x g für 5 min bei 4 °C.
- Entfernen Sie LiAc und setzen Sie das Pellet in 9,6 ml von 50% PEG 3350 wieder aus. Fügen Sie 1,44 ml 1M LiAc, 2 ml 2 mg/ml Hering-Sperma-DNA, 50 g der genomischen Bibliothek pYep13 hinzu (ATCC 37323). Stellen Sie das Volumen mit sterilem Wasser auf 15 ml ein. Mischen Sie sanft durch Inversion.
- Inkubieren Sie in einem Wasserbad bei 30 °C für 30 min.
- Fügen Sie 750 l Dimethylsulfoxid (DMSO) hinzu, um die Transformationseffizienz zu verbessern. In einem Wasserbad bei 42 °C für 30 min. Alle 10 min durch sanfte Umkehrung mischen.
- Pellet die Hefe bei 3.000 x g für 5 min bei Raumtemperatur.
- Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie das Pellet in 10 ml sterilem Wasser wieder auf. Pellet bei 3.000 x g für 5 min bei Raumtemperatur.
- Das Pellet in 8 ml sterilem Wasser wieder aufhängen.
- Um die Umwandlungseffizienz zu bestimmen, verdünnen Sie 1:10 und Platte 100 l jeder Verdünnung auf SD Ura- Leu- Glukose-Agar (Schritt 1.8).
- Platte 200 l der Probe auf SD Ura- Leu- Galactose Agar (Schritt 1.9) Platten. Verwenden Sie insgesamt 50 Platten.
- Bei 30 °C für 48 x 96 h oder bis Kolonien auftreten.
HINWEIS: Kolonien erscheinen in der Regel auf Glukose-Agar-Platten bei 48-72 h und Galaktose-Agar-Platten bei 72-96 h.
- Patch Kolonien (potenzielle Rettungen) auf SD Ura- Leu- galactose agar (Schritt 1.9) zu erweitern und Lager zu machen. Bei 30 °C für 24 bis 48 H inkubieren.
- 5 ml SD Ura- Leu- Glukosebrühe (Schritt 1.10) mit dem Teil des Pflasters impfen. Über Nacht bei 26 °C mit Schütteln bei 150 Umdrehungen von 150 Umdrehungen/min inkubieren.
- Fügen Sie 180 l des sterilen Wassers in 5 Brunnen einer 96-Wellplatte (A2-A6) hinzu.
- Wirbel die Nachtkultur zu mischen.
- Fügen Sie dem ersten Brunnen (A1) 180 L Hefe hinzu. Seriell 1:10 verdünnen (insgesamt sechs Proben einschließlich unverdünnt).
- Mit einer Mehrkanalpipette, Punkt 5 l jeder Verdünnung auf SD Ura- Glukose und SD Ura- Galactose AgarPlatten. Fügen Sie toxischeEffektor allein als Kontrolle.
- Bei 30 °C für 48 h inkubieren.
- Vergleichen Sie das Wachstum der Hefe, die den toxischen Effektor allein exzessiiert, mit Hefe, die die potentiellen Unterdrücker enthält. Gehen Sie nur mit potenziellen Unterdrückern vor, die die Toxizität im Vergleich zur Hefe, die den Effektor ausdrückt, verringert haben.
5. Identifizieren und bestätigen Sie Unterdrücker
- 5 ml SD Ura- Leu- Glukosebrühe (Schritt 1,10) mit 100 l Hefe ab Schritt 4.4 impfen und bei 30 °C mit Schütteln bei 150 U/min über Nacht inkubieren.
- Pellet die Hefe bei 3.000 x g für 2 min bei Raumtemperatur. Entsorgen Sie den Überstand vorsichtig mit einer Pipette.
- Isolieren Sie das Plasmid mit einem Hefeplasmid Miniprep-Kit nach den Anweisungen des Herstellers.
- Verwandeln Sie das isolierte Plasmid in die E. coli-kompetenten Zellen und verzappen Sie die gesamte Transformation auf LB-Agar mit 100 g/ml Carbenicillin. Bei 37 °C für 24 h inkubieren.
- 10 ml LB-Brühe mit 100 g/ml Carbenicillin impfen, mit drei Kolonien von der Platte aus und bei 37 °C über Nacht mit Schütteln bei 150 U/min bebrüten.
- Pelletkulturen bei 3.000 x g für 10 min bei Raumtemperatur. Isolieren Sie Plasmid mit einem Miniprep-Kit nach den Anweisungen des Herstellers.
- Retransformieren Sie die toxische Hefe mit den isolierten Plasmiden aus Schritt 5.3.1 nach den Schritten in Teil 3 des Protokolls.
- Ungeimpfen 5 ml SD Ura- Leu- Glukosebrühe mit einer Kolonie aus der Transformationsplatte. Über Nacht bei 30 °C mit Schütteln bei 150 Umdrehungen von 150 Umdrehungen/min inkubieren.
- Spot on Ura- Leu- Glukose und Galaktose-Agar zur Bestätigung der Unterdrückung der Toxizität.
- Sequenz mit pYep13 F (ACTACGCGATCATGGCGA) und pYep13 R (TGATGCGCGCCACGATGC) Primer zur Identifizierung von Hefe-ORFs.
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Representative Results
Bevor der eigentliche Hefesuppressor-Bildschirm durchgeführt werden kann, muss das Effektorprotein von Interesse auf Toxizität in Hefe getestet werden. Dies wird erreicht, indem das Protein von Interesse an Hefe unter der Kontrolle eines Galactose-induzierbaren Promotors zum Ausdruck gebracht wird. Das Wachstum der Glukose (nicht induzierende Bedingungen) sollte zunächst verglichen werden, um sicherzustellen, dass die Toxizität speziell auf die Expression des Proteins von Interesse zurückzuführen ist und kein allgemeiner Defekt ist. Wie in Abbildung 3dargestellt, manifestiert sich die Toxizität als kleinere Kolonien und/oder reduziertes Wachstum. Eine Verringerung des Hefewachstums um 2 bis 3 Holz ist ideal für die Hefesuppressor-Bildschirme.
Wie in Abbildung 4dargestellt, kann der Toxizitäts- und Unterdrückerbildschirm in acht Schritten mit den im Protokollabschnitt beschriebenen Methoden durchgeführt werden. Das Gen von Interesse wird in einen geeigneten Vektor1geklont und die resultierenden Konstrukte werden in Hefe umgewandelt, um die Toxizität zu bewerten. Diese Studie verwendete CT229 als Gen von Interesse und pYesNTA-Kan als Vektor. Zusätzlich wurde die Expression des Mit-Tagged-Fusionsproteins durch Western Blotting bestätigt. Idealerweise sollte eine Reduzierung der Hefe, die auf Galactose-haltigen Medien angebaut wird, beobachtet werden. Wenn das Protein von Interesse toxisch für Hefe ist (Abbildung 3 und Abbildung 4), kann der Suppressor-Bildschirm durch Umwandlung des toxischen Stammes mit der Hefegenombibliothek pYep13 durchgeführt werden. Transformanten werden auf Glukose-Agar plattiert, um die Transformationseffizienz und Galaktose-Agar zu bestimmen, um potenzielle Unterdrücker zu identifizieren. Mit diesem Protokoll wurde eine minimale Transformationseffizienz von 5 x 105 mit insgesamt 10 bis 250 Kolonien auf Galactose-Agar erreicht. Patching diese Kolonien auf SD Ura- Leu- Galactose Agar (Abbildung 4) bei der Identifizierung von wahren Unterdrückern unterstützt, weil viele falsche Positive nicht wachsen, wenn geflickt. Hier wurden 50 Kolonien geflickt und acht Klone erhalten, die die Effektortoxizität unterdrückten(Abbildung 4). Die Erkennung von Unterdrückern auf SD Ura- Leu- Galactose-Agar wurde getan, um die Unterdrückung der Toxizität zu bestätigen. Wie in Abbildung 4dargestellt, unterdrückten pSup1 und pSup 2 die Toxizität des Effektorproteins, während pSup3 dies nicht tat. Daher wurde pSup3 verworfen. Plasmide wurden anschließend von den Unterdrückern isoliert und in E. coli umgewandelt, um die Plasmaausbeute zu erhöhen. Das Plasmid kann dann in die giftige Hefe umgewandelt werden, um zu bestätigen, dass das isolierte Plasmid definitiv die Effektortoxizität unterdrückt (Abbildung 4). Während die meisten isolierten Plasmide Toxizität retten sollten, wird gelegentlich ein Plasmid erhalten, das die Toxizität nicht unterdrückt, wenn es in den toxischen Hefestamm umgewandelt wird. Diese Plasmide werden verworfen, und nur diejenigen, die Toxizität nach der Retransformation unterdrücken, sollten sequenziert werden.
Das isolierte Plasmid enthält mehrere Hefe-ORFs4. Um zu ermitteln, welcher der wahre Unterdrücker ist, kann jeder ORF einzeln geklont und in dem toxischen Hefestamm wie zuvor beschrieben1,2,3,4ausgedrückt werden.
Abbildung 1: PCR-Verstärkung des Zielgens. CT229 von Chlamydia trachomatis serovar L2 wurde PCR aus genomischer DNA verstärkt. PCR-Produkte wurden auf einem 1% Agarose-Gel mit Ethidiumbromid gefärbt analysiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: pYesNTA-Kan Plasmidkarte. Das Zielgen wurde in die Multiple-Klon-Site (MCS) von pYesNTA-Kan geklont. Kanamycin wurde zur Selektion in E. coli und Uracil-Aussetzer zur Selektion in S. cerevisiae verwendet. Der Ausdruck des His-tagged-Fusionsproteins wurde durch Western Blotting überprüft. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Repräsentative Hefetoxizität s. Effektorproteine von Interesse wurden in pYesNTA-Kan geklont. Sequenzverifizierte Plasmide wurden in S. cerevisiae umgewandelt und Transformanten wurden seriell verdünnt und auf Ura- Glukose und Galaktose-Agar gesichtet, um die Toxizität zu bewerten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Übersicht über den Hefesuppressorbildschirm. Das Zielgen wurde in pYesNTA-Kan geklont und Plasmide wurden in S. cerevisiaeumgewandelt. Die Transformanten wurden seriell verdünnt und auf Ura- Glukose und Galaktose-Agar gesichtet, um die Toxizität zu bewerten. Um den Weg zu identifizieren, auf den das toxische Effektorprotein abzielt, wurde der Hefestamm, der das toxische Protein ausdrückt, mit einer Hefe-Genombibliothek transformiert. Kolonien wurden auf Ura- Leu- Galactose Agar geflickt und gesichtet, um die Toxizität zu beurteilen. Plasmide wurden von denen isoliert, die die Toxizität des Effektorproteins unterdrücken. Plasmide wurden in den toxischen Hefestamm umgewandelt, um zu bestätigen, dass das isolierte Plasmid ein Unterdrücker ist. Plasmide von Unterdrückern wurden sequenziert, um die vorhandenen Hefe-ORFs zu identifizieren. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Dieses Protokoll beschreibt schritt-für-Schritt-Verfahren zur Identifizierung von biologischen Wirtspfaden, die von bakteriellen Effektorproteinen mit einer modifizierten Hefetoxizität und einem Suppressor-Bildschirm ins Visier genommen werden. Der verwendete Hefestamm, S. cerevisiae W303, ist auxotroph für Uracil und Leucin. Uracil-Auxotrophie des Stammes wird verwendet, um Hefe auszuwählen, die das Protein von Interesse auf dem pYesNTA-Kan Vektor trägt, während Leucin-Auxotrophie verwendet wird, um für den Hefe-Genombibliotheksvektor pYep13 auszuwählen. Die Hefegenombibliothek Plasmide tragen 3-13 ORFs, so dass jeder ORF einzeln in den p415-ADH-Vektor6 oder einen ähnlichen Vektor geklont und in die giftige Hefe umgewandelt werden sollte, um zu identifizieren, welcher der wahre Unterdrücker ist. Es ist typisch, mehrere Unterdrücker zu identifizieren, die einen biologischen Wirtsweg darstellen. Unterdrücker können manchmal direkte Bindungspartner des bakteriellen Proteins von Interesse sein, aber nicht immer.
Die Erzeugung von Hefe-Klonen, die das bakterielle Protein von Interesse auf pYesNTA-Kan tragen, ist der erste große Schritt und es sollte große Vorsicht walten lassen, um die Integrität dieser Klone so schnell wie möglich zu bewahren, da es eine starke negative Selektion für Hefe gibt, die toxische Proteine, auch ohne absichtliche Galaktose-Induktion, und sie können das Plasmid verlieren. Gelegentlich gibt es Plasmidverlust, auch wenn die Hefe unter Auswahl auf Aussetzermedien gehalten wird. Eine Methode wurde zuvor berichtet, um das Auftreten von Plasmidverlust zu verringern, indem der Vektor linearisiert und in das Hefegenom1integriert wird.
Ein großer Nachteil dieser Techniken ist, dass der Unterdrückerbildschirm nur dann aussagekräftige Daten liefert, wenn die Überexpression des bakteriellen Effektorproteins einen beobachtbaren und konsistenten Wachstumsfehler in der Hefe auslöst. Die Hauptschwierigkeit bei dieser Methode besteht darin, dass keine Unterdrücker identifiziert werden. Es ist schwer festzustellen, ob ein Versäumnis, Unterdrücker zu identifizieren, auf biologische Gründe oder technische Probleme zurückzuführen ist. Aus biologischer Sicht könnte es mehrere Ursachen geben: Das Protein von Interesse könnte so toxisch sein, dass Proteine aus der Genombibliothek nicht in der Lage sind, die Toxizität signifikant zu unterdrücken, der zielgerichtete Weg möglicherweise nicht in der Lage ist, zu retten, oder zahlreiche Faktoren erforderlich sein können, um die toxische Wirkung zu überwinden. Die Annäherung an die biologische Erklärung ist eine Herausforderung, da es viele undefinierte Variablen gibt, die sezieren müssen. Da es ein etabliertes Protokoll gibt, ist das Erforschen technischer Erklärungen ein viel zugänglicherer Ansatz. Aus technischer Sicht ist ein Versäumnis, Unterdrücker zu identifizieren, wahrscheinlich das Ergebnis einer geringen Transformationseffizienz der Hefegenombibliothek. Dieses Protokoll verwendet die ATCC S. cerevisiae AB320 teilweise verdaut genomische Bibliothek in pYEp13. Andere Bibliotheken können ebenso wie andere Vektoren ausreichen, aber dieses Protokoll verwendet speziell die ATCC-Bibliothek, und es gibt derzeit keine Studien, die alternative Bibliotheks- oder Vektorquellen melden. Es wird dringend empfohlen, dass die Abdeckung des Hefegenoms mindestens 10-fach sein sollte, oder eine Unterrepräsentation kann die Identifizierung von Unterdrückern behindern. Eine verringerte Transformationseffizienz kann diese Zahlen unter das 1-fache bringen. Daher können Teile des Hefegenoms nicht im Suppressor-Bildschirm dargestellt werden. Eine geringe Transformationseffizienz kann auf viele Probleme zurückzuführen sein, einschließlich schlechter Reagenzien oder schlechter Bibliotheksvorbereitung. Diese Methode entspricht weitgehend der DMSO/LiAc-Transformationsmethode, die zuerst von Hill et al.7dargelegt wurde. Es wird empfohlen, neue DMSO, 50% PEG, und frische Hering Spermien DNA gekauft und für die Umwandlungen vorbereitet werden und ausschließlich für diese Assays verwendet werden, um die Kontamination oder Abbau der Qualität der Reagenzien zu verringern. DMSO ist hochhygroskopisch und nimmt leicht Wasser aus der Atmosphäre auf. Daher wird empfohlen, viele individuelle Verwendungs-Aliquots zu machen, um das wiederholte Öffnen des Deckels eines Behälters und die Exposition gegenüber der Atmosphäre zu vermeiden. Hochwertige Heringsperma-DNA kann bei -20 °C gelagert werden und bleibt für mehrere Jahre einsatzbereit, obwohl für jede Umwandlung eine frische Zubereitung aus dem Bestand vorbereitet werden sollte. Einmal gekocht und abgekühlt, sollte die Hering Sperma DNA nicht wiederverwendet oder wiederverwendet werden, so ist es am besten, nur zu entfernen, was benötigt wird und vermeiden, mehr zu machen, als für die aktuelle Transformation notwendig ist. Die Liebe zum Detail kann die Transformationseffizienz von Hefe erheblich verbessern und die Chancen verbessern, einen Unterdrücker zu identifizieren.
Wenn man bedenkt, dass der Hefe-pYep13-Vektor 3-13 verschiedene Hefe-ORFs enthält, ist die Verringerung der Anzahl falsch-positiver Plasmide von größter Bedeutung für die Identifizierung von Unterdrückern. Hefe kann mehrere Kopien ähnlicher Vektoren aufnehmen und beherbergen, während die allgemeine Weisheit, die mit der Inkompatibilität von Plasmiden verbunden ist, traditionell vorschreibt, dass E. coli jeweils nur eine Art von Plasmid mit demselben Ursprung der Replikation (ORI) unterhält, obwohl dies nicht immer der Fall ist. Dies kann ein wichtiges Thema werden, wenn versucht wird, Unterdrückerkandidaten zu identifizieren. Wenn Suppressorhefe-Klone identifiziert werden, werden die Plasmide extrahiert und zur Vermehrung und anschließenden Sequenzierung zur Identifizierung in E. coli umgewandelt. Sobald das Kandidatensuppressorplasmid isoliert und in E. coliumgewandelt wurde, wird dringend empfohlen, dass mindestens fünf E. coli-Kolonien zur Sequenzierung ausgewählt werden, da es möglich ist, dass einzelne Klone verschiedenen Plasmiden. Da E. coli nur ein Plasmid nach dem anderen vermehren kann, wenn die Hefeisolierung mehrere Plasmide ergibt, sollten verschiedene E. coli-Klone auf der Platte jeweils nur eines davon tragen. Daher sollte die Auswahl von fünf Kolonien auf der Grundlage der normalen Transformationseffizienz in E. coli zeigen, ob die Klone die gleichen oder unterschiedliche Plasmide tragen. Wenn nach der Sequenzierung der Plasmide aus E. colimehrere Plasmide entstehen, sollte jedes plasmaidinin in den toxischen Hefeklon umgewandelt und zur Rettung des Wachstumsdefekts bewertet werden. Darüber hinaus wird, selbst wenn nur ein einziges Suppressor-Plasmid identifiziert wird, für Strenge und Reproduzierbarkeit eine Retransformation des Plasmids in den toxischen Klon gefördert.
Der Hefesuppressor-Assay ist ein sehr großes Experiment und entsprechende Zeit und Materialien sollten entsprechend geplant werden. Dieses Protokoll enthält viele Details, die strikt eingehalten werden müssen, und es wird empfohlen, dass der Forscher, der diese Assays durchführt, das Protokoll sorgfältig liest und beobachtet, bevor er einen Test startet. Dies ist ein multipartite Verfahren, das sowohl Bakterien als auch Hefe enthält, die bei unterschiedlichen Temperaturen kultiviert werden müssen. Die Isolierung von Plasmiden von Hefe kann aufgrund ihrer harten Zellwand manchmal schwierig sein und die Verwendung von DMSO trägt zu einer höheren Transformationseffizienz bei.
Einer der größten Vorteile der HefeToxizität und Suppressor-Bildschirm ist, dass der bakterielle Effektor nicht physisch an die WirtSubstrate für eine nennenswerte Menge an Zeit zu binden, um den vermeintlichen Weg gezielt zu erkennen. Nur eine kleine Handvoll Studien haben berichtet, mit dieser oder einer ähnlichen Technik1-5. Es gibt jedoch Berichte über Techniken, die Wirtswege identifizieren, und viele Techniken, um auf Bindungspartner von bakteriellen Effektorproteinen zu überprüfen. Kramer et al. berichteten über einen neuartigen systembiologischen Ansatz zur Identifizierung von Pfaden, die von bakteriellen Effektorproteinen ins Visier genommen werden8. Die Technik verwendete eine haploide Deletionsstammsammlung von S. cerevisiae, um Mutanten zu überprüfen, die empfindlich auf den Shigella-Effektor Osp4 reagieren. Mit dieser Technik wurde Osp4 mit der Regulation der MAPK-Signalisierung und der Dämpfung der angeborenen Immunität in Wirtszellen in Verbindung gebracht. Array-basierte, hochdurchsatzstarke, automatisierte Hefe-zwei Hybrid-Screens können nun schnell vermeintliche bakterielle Effektorbindungspartner identifizieren, indem sie viele gleichzeitig gegen Millionen von Wirtsproteinen screeningen9. In ähnlicher Weise werden Immunpräzipitationen mit hohem Durchsatz in Verbindung mit Massenspektrometrie verwendet, um vermeintliche Bindungspartner ganzer Familien von bakteriellen Effektorproteinen massenhaft zu identifizieren10. Während viele dieser Studien den Zeitplan der Effektorproteincharakterisierung beschleunigen können, geben sie selten Einen Einblick, welche physiologischen Prozesse manipuliert werden und was das ganzheitliche Ergebnis dieser Wechselwirkungen ist. Daher sind Techniken wie die Hefetoxizität und der Suppressor-Bildschirm unerlässlich, um die zellulären Prozesse zu beleuchten, die von diesen Effektorproteinen manipuliert werden. Irgendwann müssen Beobachtungen, die Bindungspartner oder Pfade identifizieren, die von bakteriellen Effektorproteinen angegriffen werden, zu zellulären Infektionsmodellen zurückkehren, um festzustellen, ob diese In-vitro-Befunde in physiologisch relevanten Szenarien zutreffen. Die genetische Manipulation von obligaten intrazellulären Krankheitserregern wie C. trachomatis war bisvor kurzem eine große Hürde, und die Erzeugung von standortspezifischen Mutanten zur Untersuchung von Effektorproteinen war nicht möglich. In den letzten Jahren hat es jedoch eine Revolution bei der Erzeugung von ChlamydenMutanten, deren Ergänzung und überexzierenden Zielproteinen gegeben. Diese jüngsten Fortschritte haben den Wert der Informationen, die aus Studien mit Toxizitäts- und Unterdrücker-Bildschirmen abgeleitet wurden, erheblich erhöht, da es jetzt möglich ist, von Hefe direkt in die Infektion zu gehen, um die Gültigkeit der Ergebnisse zu untersuchen.
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Disclosures
Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.
Acknowledgments
Wir danken Shelby Andersen, Abby McCullough und Laurel Woods für ihre Unterstützung bei diesen Techniken. Diese Studie wurde durch Start-up-Fonds der University of Iowa Department of Microbiology and Immunology an Mary M. Weber finanziert.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar | Fisher Scientific | BP2641500 | |
| Galactose | MilliporeSigma | G0750-1KG | |
| GeneJet Gel extraction kit | ThermoFisher Scientific | K0691 | |
| GeneJet PCR purification kit | ThermoFisher Scientific | K0701 | |
| GeneJet plasmid miniprep kit | Thermo | K0503 | |
| Glucose | MilliporeSigma | G8270-1KG | |
| Herring Sperm DNA | Promega | D1811 | |
| KpnI-HF | New England Biolabs | R3142S | |
| Lithium acetate dihydrate | MilliporeSigma | L6883-250G | |
| Peptone | Fisher Scientific | ||
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | New England Biolabs | M0530 | |
| Poly(ethylene glycol) 3350 | MilliporeSigma | 1546547-1G | |
| pYep13 | ATCC | 37323 | |
| T4 DNA ligase | New England Biolabs | M0202S | |
| Tryptophan | MilliporeSigma | 470031-1G | |
| XhoI-HF | New England Biolabs | R0146S | |
| Yeast extract | Fisher Scientific | BP1422-500 | |
| Yeast miniprep kit | Zymo | D2001 | |
| Yeast nitrogen base without amino acids | MilliporeSigma | Y0626-250G | |
| Yeast Synthetic Drop-out Medium Supplements | MilliporeSigma | Y1501-20G | without uracil |
| Yeast Synthetic Drop-out Medium Supplements | MilliporeSigma | Y1771-20G | without uracil, leucine, tryptophan |
References
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