肺扁平上皮癌進行をモデル化する多次元共培養システム
Summary
肺扁平上皮癌(LUSC)進行中の組織構造変化を、がん関連線維芽細胞(CAF)との3次元(3D)共培養で捉えるin vitroモデルシステムが開発されました。このオルガノイドシステムは、腫瘍表現型を調節する多様な腫瘍細胞内および外因性変化の役割を調査するためのユニークなプラットフォームを提供する。
Abstract
腫瘍-ストロマ相互作用は、肺扁平上皮癌(LUSC)の発症に重要な役割を果たす。しかし、これらの動的相互作用が腫瘍形成中に観察された組織の建築変化にどのように寄与するかを理解することは、適切なモデルがないため依然として困難である。本プロトコルでは、TUM622として知られるLUSC一次細胞培養を用いた3Dコカルチャーモデルの生成について述べている。TUM622細胞は、LUSC患者由来の異種移植片(PDX)から樹立され、基膜マトリックスに播種すると、アシナル様構造を形成するユニークな性質を有する。我々は、3DコカルチャーにおけるTUM622アキニが、LUSC進行中の組織アーキテクチャの主要な特徴と、細胞外を含む腫瘍微小環境(TME)のLUSC細胞と成分間の動的相互作用を再現することを実証する。マトリックス(ECM)および癌関連線維芽細胞(CAF)。さらに、このシステムをさまざまな下流分析にどのように活用できるかを実証するために、主な3D培養プロトコルを適応させます。全体的に、このオルガノイドモデルは、癌進行中の上皮アーキテクチャの破壊を促進する細胞組み込みおよび外因性メカニズムに関する洞察を得ることを可能にする生物学的に豊かで適応可能なプラットフォームを作成し、それを助ける新しい治療標的および診断マーカーの探索。
Introduction
肺癌は、世界中のがん関連死亡率の主な原因です。肺扁平上皮癌(LUSC)は、非小細胞肺癌(NSCLC)の2番目に一般的なタイプであり、全肺癌の約30%を占めるが、進行期で診断されることが多く、予後不良1である。LUSC患者のための治療オプションは、LUSC腫瘍形成を促進する基礎となる細胞および分子メカニズムのより良い理解によって改善することができる主要な満たされていない必要性である。
ほとんどのヒト癌と同様に、LUSCの病因は、無傷の、秩序ある上皮組織アーキテクチャ2の破壊によって特徴付けられる。このプロセスの間に、適切な尖体基底細胞の極性、細胞細胞および細胞マトリックスの接触が失われ、腫瘍細胞の制御不能な成長および侵襲的な行動を可能にする。癌細胞とそれらの局所腫瘍微小環境(TME)3との重要な相互作用なしに癌細胞の悪性の特徴が現れないことは、今では広く3理解されている。細胞外マトリックス(ECM)、がん関連線維芽細胞(CAF)、内皮細胞および浸潤免疫細胞を含むTMEの主要成分は、TMEを積極的に形成し、腫瘍形成を促進する4。それにもかかわらず、TMEにおける腫瘍細胞とこれらの主要成分が、LUSC進行中に組織構造の変化を促進するためにどのように相互作用するかに関する現在の理解は非常に限られています。
三次元(3D)培養は、正常組織と疾患組織の両方における組織アーキテクチャの変化を調節する際の細胞内および外因性の変化の生物学的活性を研究する重要なツールである5。3D カルチャは、従来の 2 次元 (2D) カルチャに欠けている適切な構造および機能コンテキストを提供します。このようなシステムの追加された次元は、増殖、分化、遊球、タンパク質発現および薬物治療への応答を含む細胞生理および細胞行動の多くの側面において、生体内の組織をより密接に模倣する。近年、様々な研究室からの取り組みにより、NSCLC66、7、87,8の両方のin vitro 3Dモデルが開発されています。しかし、腫瘍形成中の動的組織アーキテクチャの変化を再現し、主要な間質成分を組み込むことができる肺扁平上皮癌のモデルは利用できなかった。
ここでは、一次PDX由来LUSC細胞(TUM622と呼ばれます)とCAF9,10を用いて新規3次元(3D)コカルチャーシステムを確立9,10するための方法について説明する。TUM622とCAFは、いずれも腫瘍10の分化が不十分なNSCLC患者由来である。ECMに単一細胞として埋め込まれると、TUM622細胞のまれな亜集団は、適切な尖体基底細胞極性を示すアシナル様構造を有するオルガノイドを形成する能力を有する。これらのアシナ様構造は、過形成性であり、非侵襲的なまま、元の腫瘍に類似した茎様および分化マーカーの異種発現を示し、したがって、LUSCの開発の初期段階を模倣する。重要なことに、アシナル様構造の組織アーキテクチャは、低分子阻害剤を有する細胞固有シグナル伝達経路の阻害またはCAFなどのECMの主要成分の追加によって変化し、後者はアキニ形成を増強し、近接時にアキニが侵襲的になることをさらに引き起こすことを示した。これらのデータは、これらの3D共培養系のLUSCオルガノイドが、LUSC細胞とTMEとの動的相互関係の調査に貴重なプラットフォームを提供し、薬物治療11に対するLUSC細胞の応答をモニタリングするために適応できることを示唆している。
Protocol
Representative Results
Discussion
腫瘍は、がん関連線維芽細胞、内皮細胞、ECM内の免疫細胞などの間質細胞と並んで共存する癌細胞からなる異種組織である。これらの多様な成分が一緒にクロストークし、腫瘍微小環境に影響を与え、腫瘍形成を促進する上で積極的な役割を果たし、腫瘍アーキテクチャの進行性の変化を伴うプロセスである。理想的には、腫瘍発生のin vitroモデルは、生体内のヒト腫瘍で観察される動的組?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ファイザー・腫瘍学組織病理学およびバイオマーカー・グループのマガリ・ガフロイ、ジョン・クリーガー、ステファニー・ビスルコの病理学/組織学支援、マイケル・アレンスマンの原稿の批判的なレビューに感謝します。また、ファイザー博士後期課程および腫瘍学の研究開発グループ、特にロバート・エイブラハム、プジャ・サプラ、カレン・ウィドビン、ジェニファー・テヘダの支援に感謝します。
Materials
| Bronchial Epithelial Growth Medium | Lonza | CC-3170 | BEGM |
| Cell Strainer 40um | ThermoFisher | 352340 | For passing TUM622 cells |
| Cleaved Caspase 3 antibody | Cell Signaling Technology | 9661 (RRID:AB_2341188) | Rabbit |
| CoolRack CFT30 | Biocision | BCS-138 | For 3D culture |
| CoolSink XT96F | Biocision | BCS-536 | For 3D culture |
| Cultrex 3D Cell Harvesting Kit | Bio-Techne | 3448-020-K | |
| Cultrex (preferred for co-culture) | Bio-Techne | 3443-005-01 | For 3D culture |
| CXCR4 antibody | Abcam | Ab124824 (RRID:AB_10975635) | Rabbit |
| E-cadherin antibody | BD Biosciences | 610182 (RRID:AB_397581) | Mouse |
| GelCount | Oxford Optronix | For Acini counts and measurements | |
| GM130 antibody | BD Biosciences | 610822 (RRID:AB_398141) | Mouse |
| Goat Serum | Vector Labs | S1000 (RRID:AB_2336615) | For Immunofluorescence |
| Heat-inactivated FBS | Gibco | 10082-147 | For CAFs |
| Histology sample gel | Richard Allan Scientific | HG-4000-012 | For Immunofluorescence |
| Integrin alpha 6 antibody | Millipore Sigma | Mab1378 (RRID:AB_2128317) | Rat |
| Involucrin antibody | Abcam | Ab68 (RRID:AB_305656) | Mouse |
| Ki67 antibody | Abcam | Ab15580 (RRID:AB_443209) | Rabbit |
| Lab-Tec II chambered #1.5 German Coverglass System | Nalge Nunc International | 155379 (2) | For 3D culture |
| Lab-Tec II chambered #1.5 German Coverglass System | Nalge Nunc International | 155409 (8) | For 3D culture |
| L-Glutamine | Gibco | 25030-081 | For CAFs |
| Matrigel (preferred for mono-culture) | Corning | 356231 | For 3D culture |
| p63 antibody | Cell Signaling Technology | 13109 (SRRID:AB_2637091) | Rabbit |
| Pen/Strep | Gibco | 15140-122 | For CAFs |
| ReagentPack Subculture Reagents | Lonza | CC-5034 | For TUM622 cell dissociation |
| RPMI | ThermoFisher | 11875-093 | For CAFs |
| Sox2 antibody | Cell Signaling Technology | 3579 (RRID:AB_2195767) | Rabbit |
| TrypLE Express | Gibco | 12604-021 | For CAF dissociation |
| Vi-Cell | Bechman Coulter | Automatic cell counter | |
| Vimentin antibody | Abcam | Ab92547 (RRID:AB_10562134) | Rabbit |
| β-catenin antibody | Cell Signaling Technology | 2677s (RRID:AB_1030943) | Mouse |
References
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