Multidimensionales Cokultursystem zur Modellierung der Fortschreitender Karzinomprogression der Lunge
Summary
Ein In-vitro-Modellsystem wurde entwickelt, um architektonische Veränderungen des Gewebes während des Fortschreitens des Plattenepithelkarzinoms (LUSC) in einer dreidimensionalen (3D) Kokultur mit krebsassoziierten Fibroblasten (CAFs) zu erfassen. Dieses Organoidsystem bietet eine einzigartige Plattform, um die Rollen verschiedener Tumorzell-intrinsinininsische und extrinsische Veränderungen zu untersuchen, die den Tumorphänotyp modulieren.
Abstract
Tumor-Stroma-Wechselwirkungen spielen eine entscheidende Rolle bei der Entwicklung des Plattenepithelkarzinoms (LUSC). Das Verständnis, wie diese dynamischen Wechselwirkungen zu architektonischen Veränderungen des Gewebes beitragen, die während der Tumorigenese beobachtet werden, bleibt jedoch aufgrund des Fehlens geeigneter Modelle eine Herausforderung. In diesem Protokoll beschreiben wir die Generierung eines 3D-Kokulturmodells unter Verwendung einer LUSC-Primärzellkultur, die als TUM622 bekannt ist. TUM622-Zellen wurden aus einem LUSC-Patienten-abgeleiteten Xenograft (PDX) hergestellt und haben die einzigartige Eigenschaft, acinarartige Strukturen zu bilden, wenn sie in einer Kellermembranmatrix gesät werden. Wir zeigen, dass TUM622 acini in 3D-Cokultur wichtige Merkmale der Gewebearchitektur während der LUSC-Progression sowie die dynamischen Wechselwirkungen zwischen LUSC-Zellen und Komponenten der Tumormikroumgebung (TME), einschließlich der extrazellulären Matrix (ECM) und krebsassoziierte Fibroblasten (CAFs). Wir passen unser Hauptprotokoll zur 3D-Kultivierung weiter an, um zu zeigen, wie dieses System für verschiedene nachgelagerte Analysen genutzt werden könnte. Insgesamt schafft dieses Organoidmodell eine biologisch reiche und anpassungsfähige Plattform, die es einem ermöglicht, Einblicke in die zellintrinsischen und extrinsischen Mechanismen zu gewinnen, die die Störung epitheliale Architekturen während der Karzinomprogression fördern und helfen, die Suche nach neuen therapeutischen Zielen und diagnostischen Markern.
Introduction
Lungenkrebs ist weltweit die hauptursache für die krebsbedingte Sterblichkeit. Lungenplattenzellkarzinom (LUSC), die zweithäufigste Art von nicht-kleinzelligem Lungenkrebs (NSCLC) und etwa 30% aller Lungenkrebserkrankungen ausmacht, wird oft im fortgeschrittenen Stadium diagnostiziert und hat eine schlechte Prognose1. Behandlungsmöglichkeiten für LUSC-Patienten sind ein großer unerfüllter Bedarf, der durch ein besseres Verständnis der zugrunde liegenden zellulären und molekularen Mechanismen verbessert werden kann, die die LUSC-Tumorgenese antreiben.
Wie bei den meisten menschlichen Krebsarten ist die Pathogenese von LUSC durch die Störung der intakten, gut geordneten Epithelgewebearchitektur2gekennzeichnet. Dabei gehen die richtige apikal-basale Zellpolarität, Zellzell- und Zellmatrixkontakte verloren, was ein unkontrolliertes Wachstum und invasives Verhalten der Tumorzellen ermöglicht. Es wird heute allgemein geschätzt, dass die bösartigen Merkmale von Krebszellen nicht ohne ein wichtiges Zusammenspiel zwischen Krebszellen und ihrer lokalen Tumormikroumgebung (TME)3manifestiert werden können. Schlüsselkomponenten in der TME, einschließlich extrazellulärer Matrix (ECM), krebsassoziierte Fibroblasten (CAFs) sowie endotheliale Zellen und infiltrierende Immunzellen prägen aktiv die TME und treiben die Tumorigenese4an. Dennoch ist unser derzeitiges Verständnis darüber, wie die Tumorzellen und diese Schlüsselkomponenten in der TME interagieren, um architektonische Veränderungen im Gewebe während der LUSC-Progression voranzutreiben, sehr begrenzt.
Dreidimensionale (3D) Kultur ist ein wichtiges Werkzeug, um die biologischen Aktivitäten der zellintrininellen und extrinsischen Veränderungen bei der Regulierung von Gewebearchitektonischen Veränderungen in normalen und kranken Geweben zu studieren5. 3D-Kulturen bieten den geeigneten strukturellen und funktionalen Kontext, der in traditionellen zweidimensionalen (2D) Kulturen normalerweise fehlt. Die zusätzlichen Dimensionen solcher Systeme imitieren Gewebe in vivo in vielen Aspekten der Zellphysiologie und des zellulären Verhaltens, einschließlich Proliferation, Differenzierung, Migration, Proteinexpression und Reaktion auf die medikamentöse Behandlung. In den letzten Jahren haben Bemühungen verschiedener Labore zur Entwicklung von In-vitro-3D-Modellen sowohl für die normale Lunge als auch für NSCLC6,7,8geführt. Ein Modell für Lungenplattenkrebs, das sowohl die dynamischen Gewebe-Architekturänderungen während der Tumorigenese als auch wichtige stromale Komponenten rekapitulieren kann, war jedoch nicht verfügbar.
Hier beschreiben wir die Methoden zur Einrichtung eines neuartigen dreidimensionalen (3D) Cokultursystems mit primären PDX-abgeleiteten LUSC-Zellen (tUM622) und CAFs9,10. Sowohl TUM622 als auch CAFs stammen von NSCLC-Patienten mit schlecht differenzierten Tumoren10. Wenn sie als Einzelzellen in ECM eingebettet wird, hat eine seltene Subpopulation von TUM622-Zellen die Fähigkeit, Organoide mit acinarähnlichen Strukturen zu bilden, die die richtige apikal-basale Zellpolarität aufweisen. Diese acinarartigen Strukturen sind hyperplastisch, zeigen heterogene Expression von Stamm- und Differenzierungsmarkern, die dem ursprünglichen Tumor ähneln, während sie nicht-invasiv bleiben, und imitieren somit das früheste Stadium der LUSC-Entwicklung. Wichtig ist, dass wir gezeigt haben, dass die Gewebearchitektur der acinarartigen Strukturen durch Hemmung zellintrininintrinischer Signalwege mit kleinen Molekülinhibitoren oder die Zugabe von Schlüsselkomponenten im ECM wie CAFs verändert werden kann, von denen letztere die Acini-Bildung verbessert und die Acini in unmittelbarer Nähe weiter invasiv wird. Zusammen deuten diese Daten darauf hin, dass dieses 3D-Kokultursystem von LUSC-Organoiden eine wertvolle Plattform für die Untersuchung der dynamischen Rezipatonität zwischen LUSC-Zellen und tME bietet und für die Überwachung der Reaktion von LUSC-Zellen auf die medikamentöse Behandlung angepasst werden könnte11.
Protocol
Representative Results
Discussion
Tumoren sind heterogene Gewebe, die aus Krebszellen bestehen, die nebeneinander mit stromalen Zellen wie krebsassoziierten Fibroblasten, Endothelzellen und Immunzellen innerhalb des ECM koexistieren. Zusammen gehen diese unterschiedlichen Komponenten ins Gespräch und beeinflussen die Tumormikroumgebung und spielen eine aktive Rolle bei der Förderung der Tumorgenese, einem Prozess, der progressive Veränderungen in der Tumorarchitektur mit sich bringt. Idealerweise sollte ein In-vitro-Modell der Tumorentwicklung in der …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Magali Guffroy, John Kreeger und Stephani Bisulco von der Pfizer-Oncology Histopathology and Biomarker Group für Pathologie/Histologie unterstützung und Michael Arensman für die kritische Überprüfung des Manuskripts. Wir danken auch dem Pfizer Postdoktorandenprogramm und der Oncology R&D-Gruppe, insbesondere Robert Abraham, Puja Sapra, Karen Widbin und Jennifer Tejeda für die Unterstützung des Programms.
Materials
| Bronchial Epithelial Growth Medium | Lonza | CC-3170 | BEGM |
| Cell Strainer 40um | ThermoFisher | 352340 | For passing TUM622 cells |
| Cleaved Caspase 3 antibody | Cell Signaling Technology | 9661 (RRID:AB_2341188) | Rabbit |
| CoolRack CFT30 | Biocision | BCS-138 | For 3D culture |
| CoolSink XT96F | Biocision | BCS-536 | For 3D culture |
| Cultrex 3D Cell Harvesting Kit | Bio-Techne | 3448-020-K | |
| Cultrex (preferred for co-culture) | Bio-Techne | 3443-005-01 | For 3D culture |
| CXCR4 antibody | Abcam | Ab124824 (RRID:AB_10975635) | Rabbit |
| E-cadherin antibody | BD Biosciences | 610182 (RRID:AB_397581) | Mouse |
| GelCount | Oxford Optronix | For Acini counts and measurements | |
| GM130 antibody | BD Biosciences | 610822 (RRID:AB_398141) | Mouse |
| Goat Serum | Vector Labs | S1000 (RRID:AB_2336615) | For Immunofluorescence |
| Heat-inactivated FBS | Gibco | 10082-147 | For CAFs |
| Histology sample gel | Richard Allan Scientific | HG-4000-012 | For Immunofluorescence |
| Integrin alpha 6 antibody | Millipore Sigma | Mab1378 (RRID:AB_2128317) | Rat |
| Involucrin antibody | Abcam | Ab68 (RRID:AB_305656) | Mouse |
| Ki67 antibody | Abcam | Ab15580 (RRID:AB_443209) | Rabbit |
| Lab-Tec II chambered #1.5 German Coverglass System | Nalge Nunc International | 155379 (2) | For 3D culture |
| Lab-Tec II chambered #1.5 German Coverglass System | Nalge Nunc International | 155409 (8) | For 3D culture |
| L-Glutamine | Gibco | 25030-081 | For CAFs |
| Matrigel (preferred for mono-culture) | Corning | 356231 | For 3D culture |
| p63 antibody | Cell Signaling Technology | 13109 (SRRID:AB_2637091) | Rabbit |
| Pen/Strep | Gibco | 15140-122 | For CAFs |
| ReagentPack Subculture Reagents | Lonza | CC-5034 | For TUM622 cell dissociation |
| RPMI | ThermoFisher | 11875-093 | For CAFs |
| Sox2 antibody | Cell Signaling Technology | 3579 (RRID:AB_2195767) | Rabbit |
| TrypLE Express | Gibco | 12604-021 | For CAF dissociation |
| Vi-Cell | Bechman Coulter | Automatic cell counter | |
| Vimentin antibody | Abcam | Ab92547 (RRID:AB_10562134) | Rabbit |
| β-catenin antibody | Cell Signaling Technology | 2677s (RRID:AB_1030943) | Mouse |
References
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