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Biology

कंकाल मांसपेशी बायोप्सी से Myofibrils अलग और एक नैनो न्यूटन संकल्प बल Transducer के साथ अनुबंध समारोह का निर्धारण

Published: May 7, 2020 doi: 10.3791/61002
Automatic Translation
1, 1, 2, 1,3, 1
1Department of Physiology, Amsterdam UMC, 2Department of Kinesiology and Physical Education, Faculty of Education, McGill University, 3IONOptix BV

Summary

यहां प्रस्तुत नैनो-न्यूटन संकल्प के साथ स्ट्रिएटेड मांसपेशी माइोफिब्रिल के संकुचन गुणों का आकलन करने के लिए एक प्रोटोकॉल है। प्रोटोकॉल एक इंटरफेरोमेट्री आधारित, ऑप्टिकल फोर्स प्रोब के साथ एक सेटअप को नियोजित करता है। यह सेटअप उच्च सिग्नल-टू-शोर अनुपात के साथ डेटा उत्पन्न करता है और मायोफिब्रल्स के अनुबंधीय काइनेटिक्स के आकलन को सक्षम बनाता है।

Abstract

स्ट्रेटेड मांसपेशी कोशिकाएं मनुष्यों और जानवरों की गतिविधि के लिए अपरिहार्य हैं। एकल मांसपेशी फाइबर में मायोफिब्रिल शामिल होते हैं, जिसमें क्रमिक रूप से जुड़े सारकोर्स, मांसपेशियों में सबसे छोटी अनुबंधित इकाइयां शामिल होती हैं। सारकोमरिक रोग सारकोमरिक प्रोटीन के लिए एन्कोडिंग जीन में उत्परिवर्तन वाले रोगियों में मांसपेशियों की कमजोरी में योगदान देता है। myofibril यांत्रिकी का अध्ययन एकल मांसपेशी फाइबर की संकुचन को मापने पर क्षतिग्रस्त, आसन्न मायोफिब्रिल्स के संभावित जटिल प्रभावों के बिना ऐक्टिन-मायोसिन इंटरैक्शन के आकलन के लिए अनुमति देता है। अल्ट्रास्ट्रक्चरल क्षति और मायोफिब्रिल्स का गलत संरेखण बिगड़ा अनुबंध में योगदान दे सकता है। यदि संरचनात्मक क्षति मायोफ्लिल्स में मौजूद है, तो वे अलगाव प्रक्रिया के दौरान या प्रयोग के दौरान टूट सकते हैं। इसके अलावा, मायोफिब्रल्स में अध्ययन सारकोर्स की ज्यामितीय बाधाओं की उपस्थिति में ऐक्टिन-मायोसिन इंटरैक्शन का आकलन प्रदान करते हैं। उदाहरण के लिए, मायोफिब्रिल्स में माप यह स्पष्ट कर सकते हैं कि क्या मायोफिब्रिल्लर डिसफंक्शन एक सारकोमरिक प्रोटीन में उत्परिवर्तन का प्राथमिक प्रभाव है। इसके अलावा, कैल्शियम समाधान या यौगिकों के साथ पर्फ्यूजन मायोफिब्रिल के छोटे व्यास के कारण लगभग तुरंत होता है। यह बल उत्पादन के दौरान सक्रियण और छूट की दरों को मापने के लिए myofibrils को अत्यधिक उपयुक्त बनाता है। इस पेपर में वर्णित प्रोटोकॉल नैनो-न्यूटन रेंज में बलों को मापने में सक्षम फेब्री-पेरोट इंटरफेरोमीटर के सिद्धांत के आधार पर एक ऑप्टिकल फोर्स प्रोब को नियोजित करता है, जो एक पीजो लंबाई मोटर और एक फास्ट-स्टेप परफ्यूजन सिस्टम के साथ मिलकर होता है। यह सेटअप उच्च संकल्प बल माप के साथ मायोफिब्रिल यांत्रिकी के अध्ययन को सक्षम बनाता है।

Introduction

स्ट्राइपेटेड मांसपेशी कोशिकाएं दैनिक जीवन गतिविधियों के लिए अपरिहार्य हैं। अंग आंदोलन, श्वसन कार्य, और दिल की पंपिंग गति मांसपेशियों की कोशिकाओं द्वारा उत्पन्न बल पर निर्भर करती है। कंकाल की मांसपेशी में मांसपेशियों के फासिकल्स होते हैं जिनमें एकल मांसपेशी फाइबर(चित्रा 1 ए)के बंडल होते हैं। इन मांसपेशी फाइबर में मायोफिब्रिल्स शामिल हैं, जो धारावाहिक से जुड़े सारकोर्स(चित्रा 1बी, डी)द्वारा बनाए जाते हैं। सरकोमों में पतले और मोटे फिलामेंट्स होते हैं। इनमें मुख्य रूप से क्रमशः ऐक्टिन और मायोसिन अणुओं की श्रृंखलाएं(चित्रा 1B)शामिल हैं। ऐक्टिन-मायोसिन इंटरैक्शन मांसपेशियों की बल पैदा करने की क्षमता के लिए जिम्मेदार हैं। नेबुलिन, ऐक्टिन और ट्रोपोनिन टी जैसे सारकोमरिक प्रोटीन के लिए जीन एन्कोडिंग में म्यूटेशन वाले मरीज, संकुचन दोष1के कारण मांसपेशियों की कमजोरी से पीड़ित हैं ।

मांसपेशियों की संकुचन की गुणवत्ता का अध्ययन संगठन के विभिन्न स्तरों पर किया जा सकता है, जो वीवो पूरी मांसपेशियों से लेकर इन विट्रो मोटिविटी परख में ऐक्टिन-मायोसिन इंटरैक्शन तक है। पिछले दशकों के दौरान, कई शोध समूहों ने व्यक्तिगत मायोफिब्रल2, 3,,,,4, 5,,,6,7,,,3,8, 9,10की संकुचनता निर्धारित करनेकेलिए सेटअप विकसित किए हैं।5 ये सेटअप मायोफिब्रिल के संकुचन के कारण एक कैंटिलीवर (यानी ऑप्टिकल बीम विक्षेप) से लेजर विक्षेप में परिवर्तन का पता लगाने पर आधारित हैं (विवरण के लिए, लाबुडा एट अल11देखें)। यद्यपि मायोफिब्रल्स के अनुबंधीय कार्य का निर्धारण करने की कुछ सीमाएं हैं (उदाहरण के लिए, एक्सट्रेशन-संकुचन युग्मन प्रक्रियाओं की गतिशीलता जो मायोफिब्रल्स के ऊपर हैं, की कमी है), इस दृष्टिकोण के कई फायदे हैं। इनमें शामिल हैं: 1) सारकोमर की ज्यामितीय बाधाओं की उपस्थिति में ऐक्टिन-मायोसिन इंटरैक्शन का आकलन करने की क्षमता; 2) क्षतिग्रस्त, आसन्न मायोफिब्रिल्स (एकल मांसपेशी फाइबर की संकुचनता को मापने पर फाइबर अल्ट्रास्ट्रक्चरल क्षति और मायोफिल्स की गलत संरेखण बिगड़ा संकुचन में योगदान कर सकता है)(चित्र 1 डी)के संभावित भ्रामक प्रभावों के बिना ऐक्टिन-मायोसिन इंटरैक्शन का आकलन करने की क्षमता; 3) मायोफिब्रिल्स का छोटा व्यास (~ 1 माइक्रोन, फिगर 2ए)और झिल्ली की कमी सारकोर्स में लगभग तत्काल कैल्शियम प्रसार के लिए अनुमति देती है। इसके अलावा, यदि माओफिब्रिल में संरचनात्मक क्षति मौजूद है, तो वे अपने अलगाव के दौरान या प्रयोग के दौरान टूट सकते हैं। इसलिए, मायोफिल संकुचन का आकलन मांसपेशियों के संकुचन के बुनियादी तंत्रों का अध्ययन करने और यह समझने के लिए कि क्या परेशान ऐक्टिन-मायोसिन इंटरैक्शन सरकोमरिक प्रोटीन में म्यूटेशन के कारण मांसपेशियों की बीमारी का प्राथमिक कारण है।

यह प्रोटोकॉल नैनो-न्यूटन संकल्प (यानी ऑप्टिफोर्स) के साथ कैंटिलीवर फोर्स प्रोब को शामिल करते हुए मायोफिब्रल्स की संकुचनता का निर्धारण करने के लिए एक नव विकसित सेटअप प्रस्तुत करता है। यह बल जांच इंटरफेरोमेट्री के सिद्धांत पर आधारित है। इंटरफेरोमेट्री अपेक्षाकृत कठोर कैंटिलीवर्स के उपयोग को सक्षम बनाता है। इससे कैंटिलीवर के थोड़े विक्षेप के साथ बल को मापना संभव हो जाता है, जो मायोबिलिल के आइसोमेट्रिक संकुचन के पास पहुंचता है। जांच कम निष्क्रिय और सक्रिय ताकतों के आकलन के लिए अनुमति देती है जो विभिन्न मांसपेशी बायोप्सी से अलग एक माइोफिब्रल द्वारा उत्पादित की जाती हैं, जिसमें मानव विषयों से लोग शामिल हैं, जिसमें उच्च सिग्नल-टू-शोर अनुपात शामिल है। इस सेटअप में शामिल ऑप्टिकल कैंटिलीवर फोर्स प्रोब फेब्री-पेरोट इंटरफेरोमीटर12पर आधारित है । इंटरफेरोमीटर एक ऑप्टिकल फाइबर और एक फेरुल(चित्रा 3)पर घुड़सवार सोने के लेपित कैंटिलीवर के बीच छोटे विस्थापन का पता लगाता है । ऑप्टिकल फाइबर और कैंटिलीवर के बीच के अंतर को फेब्री-पेरोट गुहा कहा जाता है। Myofibrils जांच और पीजो मोटर के बीच दो गोंद लेपित ग्लास बढ़ते फाइबर का उपयोग कर रहे हैं । मायोफिब्रिल द्वारा उत्पादित बल को गणितीय रूप से इंटरफेरोमीटर डेटा से प्राप्त किया जा सकता है। इंटरफेरोमेट्री दो या अधिक तरंगों (इस सेटअप में तीन प्रकाश तरंगों) के सुपरपोजिशन या हस्तक्षेप पर आधारित है। 1,528.77-1,563.85 एनएम के बीच तरंगदैर्ध्य के साथ लेजर प्रकाश इंटरफेरोमीटर से उत्सर्जित होता है और ऑप्टिकल फाइबर के माध्यम से भेजा जाता है। जांच में, ऑप्टिकल फाइबर और माध्यम(चित्रा 3 ए)के बीच इंटरफ़ेस पर प्रकाश 1 परिलक्षित होता है; 2) माध्यम और कैंटिलीवर(चित्रा 3B) केइंटरफेस पर; और 3) धातु और कैंटिलीवर(चित्रा 3C)के सोने की कोटिंग के बीच इंटरफेस पर । इंटरफेस ए और बी पर प्रतिबिंब उस माध्यम के अपवर्तक सूचकांक(एन)पर निर्भर करता है जिसमें जांच जलमग्न होती है। प्रकाश, तीन आरोपित प्रतिबिंब से मिलकर, इंटरफेरोमीटर में एक फोटोडायोड में लौटता है। फोटोडिओड प्रकाश की तीव्रता को मापता है, जो तीन अतिरंजित प्रतिबिंबों के हस्तक्षेप पैटर्न का परिणाम है। जब एक मायोफ्ल्रिल को सक्रिय या खींचकर अनुबंध बल उत्पन्न होता है, तो मायोफिब्रिल कैंटिलीवर पर खींचता है। यह आंदोलन गुहा आकार(घ) को बदलता है और परिणामस्वरूप, गुहा में फिट होने वाले तरंगदैर्ध्य की संख्या। कैंटिलीवर में परिलक्षित प्रकाश में एक अलग चरण होगा, जिसके परिणामस्वरूप एक अलग हस्तक्षेप पैटर्न होगा। फोटोडायोड वोल्ट में बदलाव के रूप में हस्तक्षेप पैटर्न तीव्रता के इस परिवर्तन को रिकॉर्ड करता है। इसके बाद, कैंटिलीवर कठोरता को ध्यान में रखते हुए, इस परिवर्तन से मायोफिब्रिल फोर्स जेनरेशन की गणना की जाती है। बल जांच बढ़ते सुई की नोक धक्का द्वारा निर्माता द्वारा अंशांकित है, कैंटिलीवर के मुक्त सौंपने अंत से जुड़ी, एक वजन पैमाने के खिलाफ, जबकि कैंटिलीवर के झुकने को रीडआउट लेजर13की तरंगदैर्ध्य के एक ानुसार के बराबर रखते हुए । इस प्रकार, इंटरफेरोमेट्री दूरी में छोटे बदलावों का पता लगाने के लिए एक अत्यधिक संवेदनशील तरीका है, जो नैनो-न्यूटन संकल्प के साथ बलों के माप के लिए अनुमति देता है। यह संकल्प उच्च सिग्नल-टू-शोर अनुपात के साथ मायोफिब्रिलर बल उत्पादन के आकलन में सक्षम बनाता है। जबकि पारंपरिक इंटरफेरोमेट्री हस्तक्षेप वक्र के रैखिक भाग के लिए माप की सीमा को सीमित करता है, एक लॉक-इन एम्पलीफायर का उपयोग करके और लेजर तरंगदैर्ध्य के मॉड्यूलेशन इस सीमा14पर काबू पा लेते हैं। यह चर्चा अनुभाग में अधिक विस्तार से समझाया गया है।

मायोफिब्रिल सक्रिय तनाव को मापने के लिए, कैल्शियम समाधान(चित्रा 4A)के लिए मायोफिब्रिल को बेनकाब करने के लिए एक तेज कदम परफ्यूजन सिस्टम शामिल किया गया था। फास्ट-स्टेप परफ्यूजन सिस्टम समाधान परिवर्तन को 10 एमएस के भीतर होने में सक्षम बनाता है। उनके छोटे व्यास के कारण, मायोफिब्रिल्स में कैल्शियम प्रसार लगभग तात्कालिक है। इसलिए, यह प्रणाली सक्रियण के दौरान ऐक्टिन-मायोसिन बाध्यकारी की दरों को मापने और विश्राम के दौरान रिहाई के लिए विशेष रूप से उपयुक्त है। सक्रियण की दर (कश्मीरअधिनियम)और विश्राम (कश्मीरआरईएल)सक्रियण-विश्राम घटता से निर्धारित किया जा सकता है। इसके अलावा, बढ़ती एकाग्रता के कैल्शियम समाधान के लिए myofibrils को उजागर करके, बल-कैल्शियम संबंध और कैल्शियम संवेदनशीलता निर्धारित किया जा सकता है।

इसके अलावा, एक पीजो लंबाई मोटर तेजी से खींच और myofibril के छोटा करने में सक्षम बनाता है । यह मायोफिब्रिल के चिपचिपा गुणों (यानी निष्क्रिय तनाव) का अध्ययन करने की संभावना प्रदान करता है, साथ ही तनाव पुनर्विकास (केटीआर)की दर निर्धारित करने के लिए मायोफिब्रिल की तेजी से छोटा और रेस्ट्रॉच करने की संभावना प्रदान करता है। सक्रिय और निष्क्रिय तनाव प्रयोगों दोनों से प्राप्त मापदंडों को सारकोमरिक प्रोटीन में जीन म्यूटेशन द्वारा बदला जा सकता है।

इस कस्टम-निर्मित सेटअप का उपयोग स्वस्थ मानव, रोगी और माउस कंकाल की मांसपेशियों से अलग माइोफिब्रिल्स की सक्रिय और निष्क्रिय संकुचन विशेषताओं को मापने के लिए किया गया था।

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Protocol

मानव बायोप्सी प्राप्त करने के लिए प्रोटोकॉल को वीयू विश्वविद्यालय चिकित्सा केंद्र (#2014/396) में संस्थागत समीक्षा बोर्ड द्वारा अनुमोदित किया गया था और विषयों से लिखित सूचित सहमति प्राप्त की गई थी । पशु मांसपेशी बायोप्सी प्राप्त करने के लिए प्रोटोकॉल को VU विश्वविद्यालय में स्थानीय पशु नैतिकता समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था (AVD114002016501)

1. तैयारी और मायोफिब्रिल अलगाव

नोट: बायोप्सी को ग्लिसरीनेट करने के लिए पहले वर्णित तरीकों का उपयोग करें, विभिन्न कैल्शियम एकाग्रता (पीसीए) समाधान7,16,,17तैयार करें, और मायोफिब्रल्स,2,,18को अलग करें।

  1. आराम (पीसीए 9.0, आरएक्स) और सक्रिय (पीसीए 4.5, अधिनियम) समाधानों के साथ-साथ अवरोधकों (1 एम ई64, 1 एम डीटीटी, 1 एम ल्यूपेप्टिन, 1 एम पीएमएसएफ) को पिघलाएं, जो -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत होते हैं।
  2. लगभग 1 मिमी3 की स्ट्राइडेटेड मांसपेशी बायोप्सी का एक ग्लिसरीनेटेड टुकड़ा लें और इसे 1:1 आरएक्स/ग्लिसरोल (v/v) समाधान के साथ एक छोटे पेट्री डिश में रखें और पेट्री डिश को 4 डिग्री सेल्सियस पर ठंडी प्लेट पर रखें।
  3. विच्छेदन माइक्रोस्कोप और संदंश का उपयोग करके मांसपेशियों के टुकड़े को विच्छेदन करें, मांसपेशियों के टुकड़े से अलग किए बिना एकल मांसपेशी फाइबर को अलग करें।
    नोट: मायोफिब्रिल निलंबन के प्रदूषण को रोकने के लिए जितना संभव हो उतना फैटी और कनेक्टिव ऊतक निकालें।
  4. अवरोधकों के साथ आराम समाधान के 1.5 एमएल के साथ एक 5 एमएल ट्यूब के साथ विच्छेदित ऊतक के टुकड़े को स्थानांतरित करें (1 μL/mL E-64, 1 μL/mL leupeptin, 1 μL/l DTT, और 125 μL/mL PMSF) । ऊतक को 1 घंटे के लिए लगभग 4 डिग्री सेल्सियस पर गुस्सा करने दें।
  5. इनक्यूबेशन के दौरान, पीसी दोनों को बूट करें, उपकरणों को चालू करें, और संबंधित सॉफ्टवेयर खोलें (सामग्री की तालिकादेखें)।
  6. पेट्री डिश में अल्ट्रापुरे पानी में फोर्स की जांच को जलमग्न करें और जांच को कैलिब्रेट करें ।
    1. इंटरफेरोमीटर पर'स्टार्ट विजार्ड'दबाएं और ऑनस्क्रीन निर्देशों का पालन करें। कैलिब्रेटदबाने के बाद, माइक्रोस्कोप चरण पर टैप करें।
      नोट: माइक्रोस्कोप चरण पर टैप करने से कैंटिलीवर को किनारे से मोड़ने और गुजरने का कारण बनेगा। यह जांच के अंशांकन में सक्षम बनाता है।
    2. कैलिब्रेशन के बाद पेट्री डिश में अल्ट्रापुरे पानी में डूबे जांच को छोड़ दें।
  7. पीजो मोटर स्थिति को शुरू करें। ऐसा करने के लिए, नीचे दिए गए चरणों में से एक का पालन करें।
    1. जब पीजो मोटर का उपयोग कश्मीरटीआर तनाव के लिए किया जाएगा, तो लंबाई को 0 माइक्रोन सेट करें।
      सिग्नल जनरेटर सेटिंग्स टेबल 1, चित्रा 5Aमें पाई जा सकती हैं।
    2. जब पीजो मोटर निष्क्रिय तनाव के लिए इस्तेमाल किया जाएगा, 50 माइक्रोन करने के लिए लंबाई सेट।
      सिग्नल जनरेटर सेटिंग्स टेबल 1में पाई जा सकती हैं।
      नोट: चरणों के बीच अंतर पीजो लंबाई मोटर की प्रारंभिक स्थिति है। मायोफिब्रिल को फैलाने के लिए, पीजो मोटर को बढ़ते सुइयों के बीच की दूरी बढ़ाने और मायोफिब्रिल को लंबा करने के लिए खींचने की जरूरत है। मायोफिब्रिल को ढीला करने के लिए, पीजो मोटर को बढ़ते सुइयों के बीच की दूरी को कम करने और मायोफिब्रिल को छोटा करने के लिए धक्का देने की जरूरत है।
  8. माइक्रोस्कोप स्लाइड तैयार करें। पिपेट 150 माइक्रोल का पॉलीहाइड्रोक्सीथाइलमेथाक्रिलेट (पॉली-हेमा) सॉल्यूशन (5% पॉली-हेमा 95% इथेनॉल में, w/v) माइक्रोस्कोप स्लाइड पर और इसे स्लाइड में फैलाएं ताकि यह सब कवर हो।
    नोट: यदि एक मायोफिब्रिल निलंबन एक अनकोटेड माइक्रोस्कोप स्लाइड पर पिपेट किया जाता है, तो नीचे सिंक करने वाले मायोफिब्रिल माइक्रोस्कोप स्लाइड से चिपके रहेंगे और उन्हें गोंद करना संभव नहीं होगा।
  9. पीसीए समाधानों के साथ सीरिंज भरें (चित्रा 4Aदेखें) और प्राइम द परफ्यूजन सिस्टम।
    नोट: इन चरणों में सभी ट्यूबों को उचित समाधान के साथ पहले से भरा जाता है ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि ट्यूबिंग से सभी हवा के बुलबुले हटा दिए जाएं।
    1. आरएक्स के साथ प्रवाह कक्ष पृष्ठभूमि प्रवाह(चित्रा 3, 4A)प्रवाह के प्रवाह ट्यूबिंग भरें।
    2. जब उपयोग किया जाता है, तो हवा को हटाने के लिए अल्ट्रापुरे पानी के साथ कई गुना फ्लश करें। ऐसा करने के लिए, सिरिंज को अल्ट्रापुरे पानी से आउटलेट से कनेक्ट करें और उसमें रिवर्स दिशा में फ्लश करें। कई गुना के अप्रयुक्त बंदरगाहों को ब्लॉक करें।
    3. पीसीए समाधान के साथ अपने संबंधित ट्यूबों को भरने के लिए प्रत्येक पीसी सिरिंज सक्षम करें। इसके बाद उन्हें कई गुना और Ɵ-ग्लास से कनेक्ट करें।
    4. डेटा अधिग्रहण पैनल सॉफ्टवेयर के साथ 1 और 6 खोलें (सामग्री की तालिकादेखें) बटन की जांच करके'1+6'(चित्रा 6A)आराम (पीसीए 9.0) के साथ Ɵ-ग्लास भरने के लिए और सक्रिय (4.5) समाधान और बंद वाल्व जब Ɵ-ग्लास भरा जाता है(चित्रा 6B)।

2. एक माइओफिब्रिल बढ़ते

  1. कोट पॉली-हेमा के साथ एक माइक्रोस्कोप स्लाइड जिससे मायोफिब्रिल्स को शीशे से चिपके रहने से रोका जा सके।
  2. ऊतक समरूपता के लिए होमोजेनाइजर (सामग्री की तालिकादेखें) तैयार करें। आंतरिक रोटर रॉड को साफ ऊतक कागज के साथ साफ करें, होमोजेनाइजर को इकट्ठा करें, और शराब में 15 एस के लिए 1x स्पिन करें और अल्ट्रापुरे पानी में 15 एस प्रत्येक के लिए तीन बार स्पिन करें। बर्फ पर 15 एस के लिए समाधान 1 x आराम में होमोजेनाइजर को प्रीराइज करें।
  3. मांसपेशियों के ऊतकों वाले ट्यूब में होमोजेनाइजर रॉड रखें जैसा कि चरण 1.4 में वर्णित है और, ट्यूब को बर्फ पर रखते हुए, मांसपेशियों के ऊतकों को फाड़ने और एक मायोफिब्रिल निलंबन प्राप्त करने के लिए गति 5 पर 15 एस के लिए रोटर स्पिन करें।
  4. पिपेट ~ 50 माइक्रोन ऑफ मायोफिब्रिल सस्पेंशन और टिश्यू बाथ में पॉली-हेमा के साथ लेपित माइक्रोस्कोप स्लाइड पर आराम समाधान के ~ 250 माइक्रोन। इससे लिक्विड ड्रॉप बनेगी। धूल से बचाने के लिए स्नान को ढक्कन से ढक दें और 5-10 मिनट इंतजार करें ताकि मायोफिब्रल्स को नीचे तक डूबने दिया जा सके।
    नोट: निलंबन और आराम समाधान के बीच अनुपात अलगाव की गुणवत्ता पर निर्भर है, इसलिए, तदनुसार समायोजित करें । उदाहरण के लिए, यदि मायोफिब्रिल यील्ड कम है और निलंबन में कुछ उपयुक्त मायोफिब्रिल मौजूद हैं, तो कम आराम समाधान के साथ अधिक माइफिब्रल सस्पेंशन और पतला जोड़ें (उदाहरण के लिए, 75 माइक्रोन मायोफिब्रिल निलंबन और आराम समाधान के 225 माइक्रोन)। दिल और कंकाल मांसपेशी ऊतक अपने स्ट्रेशन पैटर्न के कारण पहचानने के लिए आसान है। 10x या 40x उद्देश्य का उपयोग करके, यह पैटर्न एक ही मायोफ्ल्रिल में भी दिखाई देता है। यदि निलंबन में अन्य ऊतक मौजूद हैं, तो माओफिब्रिल नेत्रहीन चुने जा सकते हैं। कोई भी 5-10 मिनट का इंतजार छोड़ सकता है। हालांकि, इससे मायोफिब्रिल को चिपकाने की मुश्किल बढ़ जाती है।
  5. गोंद के साथ कोट बढ़ते सुई (शेलक + इथेनॉल; 70% इथेनॉल के 2 मिलील में 120 मिलीग्राम शेलक)। ऐसा करने के लिए, गोंद को 30-60 एस के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर गर्म करें और एक नई अनकोटेड ग्लास स्लाइड पर ~ 6 माइक्रोन करें। गोंद में प्रत्येक बढ़ते सुई की नोक डुबकी और गोंद की एक परत दिखाई देता है जब तक दोहराने। माइक्रोस्कोप चरण पर ऊतक स्नान करने के लिए जगह बनाने के लिए माइक्रोमैनीपुलेटर के साथ जांच और पीजो को लंबवत ले जाएं। गोंद युक्त ग्लास स्लाइड को हटा दें।
  6. मायोफिब्रल्स बढ़ते
    1. माइक्रोस्कोप स्टेज पर मायोफ्रिल सस्पेंशन युक्त पॉली-हेमा के साथ लेपित माइक्रोस्कोप स्लाइड के साथ टिश्यू बाथ रखें। 40x उद्देश्य के साथ एक उपयुक्त myofibril खोजने के लिए मंच का उपयोग करें। यदि आवश्यक हो, तो मायोफिब्रिल को माउंटेबल स्थिति में ले जाने के लिए ऊतक स्नान को स्थानांतरित करें और घुमाएं।
      नोट: एक दृश्य त्रय पैटर्न के साथ myofibrils के लिए देखो कि लगभग 30 μm लंबे हैं । जैसा कि चरण 3.1 और 3.2.1 में विस्तार से वर्णित है, मायोफिब्रिल को चिपकाने से पहले लंबाई और सारकोमेरे लंबाई की जांच करना संभव है। फटे मायोफिब्रिल्स को गोंद न करें, क्योंकि संकुचन के दौरान ये टूटने की संभावना है।
    2. प्रवाह कक्ष को सीधे तरल ड्रॉप के ऊपर रखें जिसमें ऊतक स्नान में मायोबिल्स होते हैं (चरण 2.4 में स्लाइड पर पिपेट करें) और इसे कम करें। तरल ड्रॉप से टकराने से पहले बंद हो जाओ।
    3. पीजो बढ़ते सुई को कम करें और इसे मायोकिब्रिल के नीचे की नोक पर दबाएं। यह जांचने के लिए थोड़ा उठाएं कि क्या मायोफिब्रिल सुई से जुड़ा हुआ है।
    4. प्रवाह कक्ष को छूने वाली जांच के बिना नीचे तक पहुंचने के लिए जांच की बढ़ती सुई के लिए प्रवाह कक्ष को काफी कम करें।
    5. मायोफ्ल्रिल के शीर्ष सिरे पर जांच की बढ़ती सुई दबाएं। यह जांचने के लिए थोड़ा उठाएं कि क्या मायोफिब्रिल सुई से जुड़ा हुआ है।
    6. गिलास के नीचे को छूने वाले उद्देश्य के बिना ध्यान केंद्रित करने की क्षमता खोने के बिना जहां तक संभव हो, स्नान के नीचे से मायोफिब्रिल उठाएं।

3. प्रारंभ प्रयोग

  1. सारकोमेरे लंबाई को मापने के लिए माइक्रोमैनीपुलेटर, कैमरा और सिस्टम कंट्रोलर सॉफ्टवेयर(चित्रा 7 ए, सामग्री की तालिकादेखें) का उपयोग करें। 2.5 माइक्रोन के लिए myofibril की प्रारंभिक सारकोमेरे लंबाई निर्धारित करने के लिए पीजो और/या बल जांच ले जाएँ।
    नोट: 2.5 माइक्रोन की एक सारकोम लंबाई मायोसिन सिर और ऐक्टिन के बीच इष्टतम ओवरलैप सुनिश्चित करती है।
  2. सिस्टम कंट्रोलर सॉफ्टवेयर के पोत कार्य का उपयोग करके मायोफिब्रिल लंबाई और चौड़ाई(चित्रा 7B,C)को मापता है।
    नोट: जब कैमरा घूर्णन, यह क्षैतिज झुकाव और/ कैमरे के संरेखण की जांच करने के लिए, एक आत्मा स्तर का उपयोग यह सत्यापित करने के लिए किया जा सकता है कि कैमरा घुमाया गया है और झुका हुआ नहीं है।
    1. माइक्रोस्कोप चरण का उपयोग कर वीडियो छवि के केंद्र में myofibril स्थिति।
    2. मायोफिब्रिल के एक तरफ से दूसरे हिस्से में एक वर्ग ड्रा करें। लंबाई के लिए, वर्ग में गोंद बूंदों(चित्रा 2A)के अंधेरे किनारे को शामिल करना सुनिश्चित करें क्योंकि छवि प्रसंस्करण इसके विपरीत पर आधारित है।
    3. सिस्टम कंट्रोलर सॉफ्टवेयर (टेबल ऑफ मैटेरियलदेखें) में'स्टार्ट'दबाकर डाटा रिकॉर्ड करना शुरू करें और 5 एस के बाद'पॉज'बटन दबाकर सिस्टम कंट्रोलर सॉफ्टवेयर डाटा रिकॉर्डिंग को थामें। इसकी लंबाई अब आंकड़ों में दर्ज है।
    4. चौड़ाई के लिए पहले कैमरे को 90 ° (सामग्री की तालिकादेखें) घुमाएं और फिर मायोफिब्रिल के किनारे के विपरीत का उपयोग करें।
    5. सिस्टम कंट्रोलर सॉफ्टवेयर (टेबल ऑफ मैटेरियलदेखें) में'स्टार्ट'दबाकर डाटा रिकॉर्ड करना शुरू करें और 5 एस के बाद'पॉज' बटन दबाकर सिस्टम कंट्रोलर सॉफ्टवेयर डाटा रिकॉर्डिंग को थामें। अभी इसकी चौड़ाई आंकड़ों में दर्ज है।
  3. यदि मायोफिब्रिल के सक्रिय तनाव को निर्धारित करने की आवश्यकता है, तो परफ्यूजन सेटअप का उपयोग करने की आवश्यकता है। यदि हां, तो 3.4 कदम जारी रखें। यदि केवल निष्क्रिय तनाव निर्धारित किया जाएगा, तो चरण 3.4-4.1.3.7 को छोड़ दें और चरण 4.2 पर जारी रखें।
  4. परफ्यूजन सेटअप की स्थिति और शुरुआत करें।
    नोट: यह केवल सक्रिय बल की पीढ़ी के लिए आवश्यक है। निष्क्रिय तनाव प्रयोगों का प्रदर्शन करते समय 4.2 चरण जारी रखें।
    1. 4 वी(चित्रा 5B)पर फास्ट-स्टेप मोटर स्थिति निर्धारित करें।
    2. मेज पर टेप के साथ स्टैंड के बाएं नीचे कोने संरेखित करने के लिए मेज पर परफ्यूजन स्टैंड स्लाइड करें।
      नोट: सावधान रहें कि बल जांच या पीजो मोटर को हिट न करें।
    3. आंखों से Ɵ-ग्लास को मोटे तौर पर स्थिति में रखने के लिए जोड़तोड़ का उपयोग करें।
    4. आईपीस के माध्यम से देखें और जोड़तोड़ का उपयोग करके Ɵ-ग्लास को मायोफिब्रिल की ओर सावधानी से स्थानांतरित करें।
    5. Ɵ-ग्लास के शीर्ष चैनल को मैनिपुलेटर का उपयोग करके मायोफ़िब्रिल के साथ संरेखित करें और सिस्टम कंट्रोलर सॉफ्टवेयर(चित्रा 2बी-सी, सामग्री की तालिकादेखें) के साथ एक फास्ट-स्टेप (सिग्नल जनरेटर सेटिंग्स टेबल 1में पाया जा सकता है) का प्रदर्शन करके स्थिति की जांच करें।
      नोट: सुनिश्चित करें कि फास्ट-स्टेप(चित्रा 2बी-सी)के सक्रियण चरण के दौरान नीचे चैनल को मायोफिब्रिल के साथ गठबंधन किया जाएगा।
  5. प्रवाह कक्ष में एक लैमिनार पृष्ठभूमि प्रवाह बनाने के लिए आरएक्स(चित्रा 4A)की पृष्ठभूमि प्रवाह चालू करें।
    नोट: Ɵ-ग्लास से पीसीए समाधान प्रवाह के परिणामस्वरूप अशांत प्रवाह को रोकने के लिए पृष्ठभूमि प्रवाह आवश्यक है।
    1. एक लूयर वाल्व लीवर के साथ प्रवाह कक्ष की आमद चालू करें।
      1. प्रवाह कक्ष को समाप्त करना शुरू करने और प्रवाह कक्ष के बह जाने को रोकने के लिए बहिर्वाह पंप पर निम्नलिखित मापदंडों को भेजें(चित्रा 9):वाल्व = बाथ वाल्व (2); माइक्रोस्टेप मोड = माइक्रो; प्लंजर लक्ष्य = 48,000; प्लंजर गति = 38-40 (मनमाना)।
        नोट: सुनिश्चित करें कि तरल पदार्थ का स्तर हर समय स्थिर है। मायोफिब्रिल को सूखा नहीं चलाना चाहिए और न ही कैंटिलीवर को चलाना चाहिए। बहुत कम प्रवाह की तुलना में थोड़ा ओवरफ्लो होना बेहतर है।
  6. थर्मोइलेक्ट्रिक तापमान नियंत्रक(चित्रा 8, सामग्री की तालिकादेखें) के साथ तापमान को वांछित मूल्य पर सेट करने के लिए, वांछित तापमान में प्रवेश करें और'स्टार्ट' दबाएं। थर्मोइलेक्ट्रिक तापमान नियंत्रक सॉफ्टवेयर में ग्राफ की जांच करके वांछित तापमान तक पहुंचने तक प्रतीक्षा करें और जारी रखें।
    नोट: कमरे के तापमान पर प्रयोग करते समय, थर्मोइलेक्ट्रिक तापमान नियंत्रक का उपयोग नहीं करना पड़ता है।

4. प्रायोगिक प्रोटोकॉल

  1. तय करें कि कौन से सक्रिय बल प्रोटोकॉल किए जाने की आवश्यकता है।
    नोट: अध्ययन के लिए आवश्यक डेटा के आधार पर, कई प्रकार के सक्रिय बल प्रयोग किए जा सकते हैं: चरण 4.1.1, संतृप्ति पर अधिकतम बल का माप [Ca2+]; चरण 4.1.2, चरण 4.1.1 के अलावा कैल्शियम संवेदनशीलता निर्धारित करने के लिए एक बल-पीसीए वक्र प्राप्त करना; चरण 4.1.3, चरण 4.1.1 या 4.1.2 के अलावा एक छोटा-रेस्ट्रेच प्रोटोकॉल करके तनाव पुनर्विकास की दर का निर्धारण करना।
    1. अधिकतम सक्रिय बल को मापें।
      1. 'स्टार्ट' दबाकर सिस्टम कंट्रोलर सॉफ्टवेयर (टेबल ऑफ मैटेरियलदेखें) में डाटा रिकॉर्डकरना शुरू करें।
      2. डेटा अधिग्रहण पैनल के साथ खुले वाल्व 1 और 6 (सामग्री की तालिकादेखें) सॉफ्टवेयर बटन'1 +6'की जांच करके आराम समाधान के Ɵ-ग्लास प्रवाह शुरू करने और Ɵ-ग्लास(चित्रा 6A)के माध्यम से समाधान को सक्रिय करने के लिए।
      3. इंटरफेरोमीटर की रेंज को रीसेट करें ताकि बेसलाइन फोर्सReset Rangeइंटरफेरोमीटर (सामग्रियों की टेबलदेखें) का चयन और दबाने के द्वारा 0 वी हो।
      4. जब बल का निशान स्थिर हो, तो Ɵ-ग्लास फास्ट-स्टेप (स्टेप साइज = 100 माइक्रोन) करें।
        सिग्नल जनरेटर सेटिंग्स टेबल 1 (चित्रा 5C)में पाई जा सकती हैं। चित्रा 4डी के समान एक सक्रियण-विश्राम ट्रेस रिकॉर्ड किया जाएगा और सिस्टम नियंत्रक सॉफ्टवेयर में दिखाई देगा।
      5. 'पॉज'बटन दबाकर सिस्टम कंट्रोलर सॉफ्टवेयर डाटा रिकॉर्डिंग को रोकें।
      6. यदि अधिक सक्रियता नहीं दी जानी है, तो वाल्व 1 और 6 को बंद करें Ɵ-ग्लास प्रवाह को'1+6'(चित्रा 6 बी)को अनचेक करके, सिरिंज पंप को बंद करें(चित्रा 9, सामग्री की तालिकादेखें) को'टर्मिनेट'दबाकर, और लूयर वाल्व को बंद करके पृष्ठभूमि प्रवाह को रोकें।
    2. फोर्स-पीसीए वक्र
      नोट: यह अधिकतम सक्रिय बल प्राप्त करने के लिए चरण 4.1.1 के समान है, लेकिन विभिन्न पीसीए समाधानों का उपयोग करके कई सक्रियताओं के साथ।
      1. 'स्टार्ट' दबाकर सिस्टम कंट्रोलर सॉफ्टवेयर में डाटा रिकॉर्डकरना शुरू करें।
      2. Ɵ-ग्लास के माध्यम से आराम समाधान और पीसीए 6.2 के प्रवाह को शुरू करने के लिए डेटा अधिग्रहण पैनल सॉफ्टवेयर के साथ वाल्व 1 और 2 खोलें।
      3. इंटरफेरोमीटर की रीसेट रेंज इतनी कि बेसलाइन फोर्स इंटरफेरोमीटर पर'रीसेट रेंज'का चयन और दबाव बनाकर 0 वी है।
      4. जब बल का निशान स्थिर हो, तो Ɵ-ग्लास फास्ट-स्टेप (स्टेप साइज = 100 माइक्रोन) करें।
        सिग्नल जनरेटर सेटिंग्स टेबल 1में पाई जा सकती हैं।
      5. 'पॉज' बटन दबाकर सिस्टम कंट्रोलर सॉफ्टवेयरको रोकें।
      6. वाल्व 1 और 3 (पीसीए 5.8), वाल्व 1 और 4 (पीसीए 5.6), वाल्व 1 और 5 (पीसीए 5.4), वाल्व 1 और 5 (पीसीए 5.4), और वाल्व 1 और 6 (पीसीए 4.5) के लिए कदम 4.1.2.1.1.2.4 दोहराएं।
      7. यदि अधिक सक्रियता नहीं की जानी है, तो वाल्व 1 और 6 को बंद करें Ɵ-ग्लास प्रवाह को'1+6'(चित्रा 6ए)को अनचेक करके, सिरिंज पंप(चित्रा 9)को'टर्मिनेट'दबाकर बंद करें, और लूयर वाल्व को बंद करके पृष्ठभूमि प्रवाह को रोकें।
    3. तनाव पुनर्विकास (कश्मीरटीआर)की उपाय दर ।
      नोट: यह अधिकतम सक्रिय बल के लिए चरण 4.1.1 के समान है, लेकिन कुछ परिवर्तनों और जोड़े गए चरणों के साथ।
      1. मायोफिब्रल 15% को ढीला करने के लिए आवश्यक पीजो आंदोलन की गणना करें और सिग्नल जनरेटर(चित्रा 5D, टेबल 1)में इस मूल्य में प्रवेश करें।
      2. 'स्टार्ट'दबाकर सिस्टम कंट्रोलर सॉफ्टवेयर में डाटा रिकॉर्ड करना शुरू करें।
      3. Ɵ-ग्लास के माध्यम से आराम समाधान और पीसीए 4.5 का प्रवाह शुरू करने के लिए डेटा अधिग्रहण पैनल(चित्रा 6 ए)सॉफ्टवेयर के साथ 1 और 6 वाल्व खोलें।
      4. इंटरफेरोमीटर की रीसेट रेंज इतनी कि बेसलाइन फोर्स इंटरफेरोमीटर पर'रीसेट रेंज'का चयन और दबाव बनाकर 0 वी है।
      5. जब बल का निशान स्थिर हो, तो Ɵ-ग्लास फास्ट-स्टेप (स्टेप साइज = 100 माइक्रोन) करें।
        सिग्नल जनरेटर सेटिंग्स टेबल 1में पाई जा सकती हैं।
      6. जब बल पठार तक पहुंच जाता है, तो पीजो के साथ छोटा-रेस्ट्रेच करें।
        सिग्नल जनरेटर सेटिंग्स में पाया जासकता है (चित्रा 5D, टेबल 1)। चित्रा 4E के समान एक सक्रियण-विश्राम ट्रेस रिकॉर्ड किया जाएगा और सिस्टम नियंत्रक सॉफ्टवेयर में दिखाई देगा।
        नोट: ऊपर दिए गए चरणों को स्वचालित करने के लिए एक कस्टम प्रोटोकॉल बनाया जा सकता है।
      7. 'पॉज' बटन दबाकर सिस्टम कंट्रोलर सॉफ्टवेयरको रोकें।
      8. यदि अधिक सक्रियता नहीं की जानी है, तो वाल्व 1 और 6 को बंद करें Ɵ-ग्लास प्रवाह को'1+6'(चित्रा 6 बी)को अनचेक करके, सिरिंज पंप(चित्रा 9)को 'टर्मिनेट'दबाकर बंद करें, और लूयर वाल्व को बंद करके पृष्ठभूमि प्रवाह को रोकें।
  2. निष्क्रिय बल माप करें।
    1. एक निरंतर खिंचाव प्रदर्शन करते हैं।
      1. मायोफिब्रिल को फैलाने और सिग्नल जनरेटर(टेबल 1)में इस मूल्य में प्रवेश करने के लिए आवश्यक पीजो आंदोलन की गणना करें।
        नोट: ये उदाहरण सेटिंग्स हैं। सरकोमेरे लंबाई के सापेक्ष खिंचाव और खिंचाव के समय की मात्रा की गणना करें। ये सेटिंग्स यह सुनिश्चित करने के लिए आवश्यक हैं कि प्रति सारकोमेरे खिंचाव की गति मायोफिब्रिल्स में बराबर बनी रहे।
      2. 'स्टार्ट'दबाकर सिस्टम कंट्रोलर सॉफ्टवेयर में डाटा रिकॉर्ड करना शुरू करें।
      3. इंटरफेरोमीटर की रीसेट रेंज इतनी कि बेसलाइन फोर्स इंटरफेरोमीटर पर'रीसेट रेंज'का चयन और दबाव बनाकर 0 वी है।
      4. पीजो को संचालित करने के लिए सिस्टम कंट्रोलर सॉफ्टवेयर में सिग्नल जनरेटर के साथ निरंतर खिंचाव करें। उदाहरण सिग्नल जनरेटर सेटिंग्स टेबल 1में पाया जा सकता है।
      5. खिंचाव समाप्त होने के बाद पीजो के साथ सुस्त लंबाई के लिए मायोफ्लिल को छोटा करें(तालिका 1)।
    2. स्टेपवाइज स्ट्रेच करें।
      1. 'स्टार्ट'दबाकर सिस्टम कंट्रोलर सॉफ्टवेयर में डाटा रिकॉर्ड करना शुरू करें।
      2. इंटरफेरोमीटर की रीसेट रेंज इतनी कि बेसलाइन फोर्स इंटरफेरोमीटर पर'रीसेट रेंज'का चयन और दबाव बनाकर 0 वी है।
      3. पीजो को संचालित करने के लिए सिस्टम कंट्रोलर सॉफ्टवेयर में सिग्नल जनरेटर के साथ एक स्टेपवाइज स्ट्रेच करें। उदाहरण सिग्नल जनरेटर सेटिंग्स टेबल 1 (चित्रा 5E)में पाई जा सकती हैं।
    3. खिंचाव समाप्त होने के बाद पीजो के साथ सुस्त लंबाई के लिए मायोफ्लिल को छोटा करें। उदाहरण सिग्नल जनरेटर सेटिंग्स टेबल 1में पाया जा सकता है।
  3. 'पॉज' बटन दबाकर सिस्टम कंट्रोलर सॉफ्टवेयरको रोकें।
  4. सिस्टम कंट्रोलर सॉफ्टवेयर मेंस्टॉपबटन दबाकर डाटा की रिकॉर्डिंग बंद करें।
  5. सिस्टम कंट्रोलर सॉफ्टवेयर में'फाइल'और सेव डाटा दबाकरडाटा सेवकरें।

5. सफाई

  1. मापा मायोफिब्रिल निकालें और अगले myofibril के लिए तैयार करें।
    1. ऐसा करने के लिए, ध्यान से 40x उद्देश्य के साथ नेत्र के माध्यम से देखते हुए myofibril आंसू ।
    2. बल जांच और पीजो को आगे बढ़ाया जाए। Ɵ ग्लास सभी तरह से ऊपर ले जाएँ, सही करने के लिए और वापस करने के लिए। फिर ऊपर ले जाएं और प्रवाह कक्ष को दूर करें। टिश्यू बाथ निकालें।
    3. बढ़ते सुई को साफ करने के लिए, इसे 10x और नेत्र का उपयोग करके ध्यान में लाएं। ब्रश को इथेनॉल में डुबोएं और ध्यान से ब्रश करें और सुई से गोंद निकालें।
      नोट: ध्यान रखें कि गोंद से आने से पहले कुछ समय लग सकता है।
    4. अल्ट्रापुरे पानी के साथ प्रवाह कक्ष और ऊतक स्नान कुल्ला।
    5. जांच को छोटे से अल्ट्रापुरे पानी से भरे पेट्री डिश में रखें। सुनिश्चित करें कि जांच पूरी तरह से पनडुब्बी है।
  2. जब प्रयोग समाप्त हो जाएं, तो सेटअप को ऊपर की तरह साफ करें और निम्नलिखित अतिरिक्त चरणों को करें।
    1. प्रवाह स्नान से टयूबिंग खाली करें। आउटफ्लो सिरिंज पंप पर पैरामीटर भेजें (सामग्री की तालिकादेखें, चित्रा 9)। वाल्व = स्नान वाल्व (2); माइक्रोस्टेप मोड = सामान्य; प्लंजर लक्ष्य = 0; प्लंजर गति = 30।
      नोट: ट्यूबिंग खाली होने पर कमांड को समाप्त करें।
    2. पंप को कई बार शुरू करें(चित्रा 9B)।
    3. सीरिंज को छान लें। ऐसा करने के लिए, सभी लूयर वाल्व बंद करें, सभी वाल्व खोलें, सिरिंज की सुई से टयूबिंग को हटा दें, सुई के नीचे विशिष्ट पीसीए की ट्यूब पकड़ें, और लूयर वाल्व खोलें। प्रक्रिया को गति देने के लिए प्रेशर प्लग का उपयोग करें।
    4. सिरिंज की सुई के लिए टयूबिंग फिर से संलग्न करें। अल्ट्रापुरे पानी के ~5 एमएल से सीरिंज भरें। Ɵ-ग्लास के नीचे एक कप रखें। सभी वाल्व खोलें और सिस्टम को फ्लश करने के लिए प्रेशर वाल्व खोलें।
    5. सिस्टम को बंद कर दिया। पीसी, इंटरफेरोमीटर और पीजो कंट्रोलर पावर ब्लॉक बंद कर दें।

6. डेटा विश्लेषण

  1. डेटा फ़ाइल खोलकर और वांछित सेगमेंट का चयन करके सिस्टम कंट्रोलर सॉफ्टवेयर (टेबल ऑफ मैटेरियल)से स्प्रेडशीट सॉफ्टवेयर प्रोग्राम या क्लिपबोर्ड तक डेटा ट्रेस निर्यात करें। दिखाए गए निशान (उदाहरण के लिए, कच्चे बल, सारकोमेरे लंबाई, और पीजो स्थिति) का निर्यात किया जाएगा।
  2. पसंद के सॉफ्टवेयर (जैसे, MATLAB) के साथ विश्लेषण करें।

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Representative Results

सिस्टम नियंत्रक सॉफ्टवेयर (सामग्री की तालिकादेखें) के साथ डेटा ट्रेस रिकॉर्ड किए गए और खोले गए। एक वांछित सॉफ्टवेयर के साथ आगे के विश्लेषण के लिए क्लिपबोर्ड या टेक्स्ट फाइल को पूर्ण निशान या चयनित खंडों का निर्यात किया गया था। विभिन्न समाधानों के प्रवाह को नियंत्रित करने के लिए वाल्व कस्टम सॉफ्टवेयर या मैन्युअल रूप से बंद किए गए थे। सक्रियण, तनाव पुनर्विकास और विश्राम की दरों का विश्लेषण करने के लिए एक कस्टम मैटलैब स्क्रिप्ट का उपयोग किया गया था। अधिकतम सक्रिय बल और निष्क्रिय बल प्रयोगों के शिखर और पठार बल को सीधे सिस्टम नियंत्रक सॉफ्टवेयर फोर्स ट्रेस से लिया गया था। एक myofibril(चित्रा 2)बढ़ते के बाद, वांछित प्रोटोकॉल का चयन किया गया था।

अधिकतम सक्रिय बल और कैल्शियम- माउस और मानव कंकालमांसपेशी बायोप्सी से अलग माइोफिब्रल्स में बल की संवेदनशीलता
चित्रा 4A में सक्रिय बल प्रयोगों के लिए उपयोग किए जाने वाले प्रयोगात्मक सेटअप को योजनाबद्ध ढंग से चित्रित किया गया है। स्वस्थ मानव क्वाड्रिसेप्स मांसपेशियों से अलग माइओफिब्रिल के साथ एक सक्रिय बल प्रयोग के बल निशान दिखाए जाते हैं। मायोफ्लिल को अलग-अलग पीसीए (पीसीए 6.2, 5.8, 5.6, 5.4, 4.5; चित्रा 4Bमें दिखाए गए डेटा) के साथ समाधान के साथ 5 बार सक्रिय किया गया था। इस प्रयोग में सभी मायोफिब्रल्स का औसत अधिकतम बल ~ 123एमएन/मिमी 2था। पांच कैल्शियम समाधानों में से प्रत्येक में प्रत्येक सक्रियण के दौरान पहुंचे पठार बलों से एक बल-पीसीए वक्र का निर्माण किया गया था । परिणाम चित्रा 4Cमें दिखाए गए हैं । इस वक्र से अधिकतम बल उत्पादन (पीसीए 50) के50%पर पीसीए की गणना की गई थी। इस मायोफिब्रिल में पीसीए50 5.75 था।

इसके अतिरिक्त, मायोफिब्रिल द्वारा उत्पादित बल पर इसके प्रभाव को मापने के लिए एक या कई यौगिकों को परफ्यूस्ड समाधान में जोड़ा जा सकता है। चित्रा 4 डीमें, एन-बेंजाइल-पी-टोल्यूईन सल्फोनामाइड (बीटीएस), एक तेज चिकोटी मांसपेशी (टाइप II) मायोसिन भारी श्रृंखला II (MHCII) अवरोधक का प्रभाव सचित्र है। 19 एक मायोफ़िब्रिल को पहले पीसीए 5.6 समाधान के साथ और बाद में पीसीए 5.6 + बीटीएस समाधान के साथ सक्रिय किया गया था। दूसरी सक्रियण के दौरान कम बल का उत्पादन किया गया था, यह दर्शाता है कि यह एक मायोकिब्रिल था जिसमें MHCII निहित था । प्रोटीन में उत्परिवर्तन होते हैं जो विशेष रूप से विशिष्ट मांसपेशियों के प्रकारों में मौजूद होते हैं, और इस प्रकार केवल उस विशिष्ट मांसपेशियों के प्रकार से मायोफिब्रल को प्रभावित करते हैं। उस मामले में, विभिन्न मांसपेशियों पर उत्परिवर्तन प्रभाव को समझने के लिए मायोफिब्रिल्स को 'टाइपिंग' करना महत्वपूर्ण है। इसके अलावा, यह उदाहरण मायोफिब्रल में चिकित्सीय यौगिकों की प्रभावकारिता का परीक्षण करने की संभावना को दिखाता है।

चित्रा 4E माउस कंकाल एकमात्र मांसपेशी ऊतक से अलग एक myofibril के एक सक्रिय बल का पता लगाने से पता चलता है । मायोफ़िब्रिल को सेटअप में रखा गया था और आराम समाधान (पीसीए 9.0) के साथ प्रेरित किया गया था, जिसके बाद सक्रिय समाधान (पीसीए 4.5, ~ 0.032 एमएम कैल्शियम) के साथ परफ्यूजन किया गया था। हमने एक साथ बल और सारकोमेरे लंबाई दर्ज की। यह एक निकट आइसोमेट्रिक संकुचन था, क्योंकि कैंटिलीवर विक्षेप ~ 0.5 माइक्रोन था, जो मायोफिब्रिल की सुस्त लंबाई (~ 50 माइक्रोन) का लगभग 1% था। चित्रा 4E में तनाव पुनर्विकास (कश्मीरटीआर,पीले धराशायी लाइन) की दर का आकलन करने के लिए सक्रिय संकुचन के दौरान एक तेजी से छोटा-रेस्ट्रेच प्रोटोकॉल किया गया था। केटीआर क्रॉस-ब्रिज साइक्लिंग काइनेटिक्स का एक उपाय है। इसके अलावा, सक्रियण और विश्राम घटता क्रमशः सक्रियण (कश्मीरअधिनियम,लाल धराशायी लाइन) और विश्राम (कश्मीररिलायंस एनर्जी,ग्रीन धराशायी लाइन) की दर निर्धारित करने के लिए फिट किया गया । चित्रा 4 चित्रा 4Fमें हाइलाइट किए गए विश्राम चरण का अधिक विस्तृत दृश्य दिखाता है । दो चरण स्पष्ट हो गए: 1) विश्राम का एक प्रारंभिक धीमा चरण (क्रॉस-ब्रिज टुकड़ी का प्रभुत्व) और 2) विश्राम का एक तेज चरण (क्रॉस-ब्रिज टुकड़ी और कैल्शियम-वियोजन का प्रभुत्व)20।

मानव कंकाल मांसपेशी बायोप्सी से अलग माइोफिब्रल्स में निष्क्रिय बल
चित्रा 10 स्वस्थ मानव डायाफ्राम मांसपेशियों के ऊतकों से अलग एक मायोफिब्रिल के साथ एक निष्क्रिय बल प्रयोग का एक निशान दिखाता है। पहले प्रोटोकॉल में सारकोमर्स के चिपचिपा गुणों को निर्धारित करने के लिए एक या कई निष्क्रिय हिस्सों को शामिल किया गया था। चित्रा 10 एक मायोबिलिल के निरंतर खिंचाव का एक बल ट्रेस दिखाता है (सारकोमेरे लंबाई 2.2-3.0 माइक्रोन से खिंचाव)। खिंचाव के दौरान, मायोफिब्रल्स ने चिपचिपा और लोचदार विशेषताओं दोनों को प्रदर्शित किया। यह चित्र 10एमें दिखाए गए वक्र से स्पष्ट है । तेज चोटी दोनों विशेषताओं का प्रतिनिधित्व करती है, जबकि पठार बल लोच का एक उपाय है। चिपचिपाहट तनाव का विरोध करती है। इस प्रकार तनाव दूर होने के बाद फोर्स गिरा दी गई। चित्रा 10B खिंचाव पर प्रकाश डाला गया और उच्च संकेत से शोर अनुपात दिखाता है । ध्यान दें कि बल के निशान अनफ़िल्टर्ड हैं।

Figure 1
चित्रा 1: कंकाल की मांसपेशी और इसकी आकृति विज्ञान के योजनाबद्ध चित्रण और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी छवियां। (क)कंकाल की मांसपेशी की संरचना को दर्शाता है और(ख)सारकोमेरे की संरचना को दर्शाता है, जो सबसे छोटी अनुबंध इकाई है । इन योजनाबद्ध छवियों को सर्वियर मेडिकल आर्ट से अनुकूलित किया जाता है।(C)एक मांसपेशी फाइबर की एक छवि दिखाता है और(डी)एक मांसपेशी फाइबर की एक इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी छवि से पता चलता है जो मायोफिब्रिलर क्षति के साथ-साथ संरक्षित मायोफिब्रिलर अल्ट्रास्ट्रक्चर को प्रकट करता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: एक घुड़सवार myofibril, Ɵ ग्लास संरेखण, और पीजो बढ़ते सुई दिखा छवियां । (क)एक मायोफ़िब्रिल ग्लास फाइबर सुइयों के बीच सुस्त लंबाई पर घुड़सवार के रूप में एक 40x उद्देश्य के माध्यम से देखा के रूप में शेलक के साथ लेपित । (ख)मायोफिब्रिल (सफेद अंडाकार के साथ हाइलाइट किए गए) के सापेक्ष Ɵ-ग्लास की स्थिति की छवियां, जैसा कि 10x उद्देश्य के माध्यम से देखा गया है। (शीर्ष) शीर्ष चैनल के साथ गठबंधन (आराम समाधान, पीसीए 9.0); (नीचे) कैल्शियम के साथ मायोफिल को छिद्रित करने और संकुचन को प्रेरित करने के लिए नीचे चैनल (सक्रिय समाधान, पीसीए 4.5) के साथ गठबंधन किया गया। (ग)मायोफिब्रिल के सापेक्ष Ɵ-ग्लास की स्थिति का योजनाबद्ध चित्रण। (शीर्ष) शीर्ष चैनल के साथ गठबंधन (आराम समाधान, पीसीए 9.0); (नीचे) कैल्शियम के साथ मायोफिल को छिद्रित करने और संकुचन को प्रेरित करने के लिए नीचे चैनल (सक्रिय समाधान, पीसीए 4.5) के साथ गठबंधन किया गया। (घ)पीजो धारक की कार्बन रॉड से जुड़ी बढ़ती सुई। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: सेटअप का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व और ऊतक प्रवाह कक्ष का अंत हिस्सा। गहरे नीले रंग में ऊतक प्रवाह कक्ष एल्यूमीनियम से बना है, और सफेद गुहा में जिसमें बल जांच और Ɵ ग्लास स्थिति में दिखाए जाते हैं; (केंद्र) फोर्स प्रोब और पीजो लेंथ मोटर से जुड़ी दो ग्लास फाइबर माउंटिंग सुइयों के बीच जुड़ी मायोफ्लिल। Ɵ ग्लास मायोफिब्रिल के साथ गठबंधन किया गया है। Ɵ-ग्लास कैल्शियम समाधान के लिए मायोफरिल को बेनकाब करने के लिए ऊपर और नीचे जा सकते हैं। (दाएं) कैंटिलीवर फोर्स जांच के करीब। संकेत दिया गुहा आकार (या फैब्री-पेरोट गुहा, डी); प्रतिबिंब इंटरफेस ए, बी, और सी; और लेजर (लाल) द्वारा उत्सर्जित एक प्रकाश तरंग का एक उदाहरण। कैंटिलीवर फेरुल के कंधे पर चढ़कर किया जाता है। इंटरफेरोमीटर से लेजर ले जाने वाला फाइबर कैंटिलीवर की नोक पर फेरुल से बाहर निकलता है। मोम का उपयोग करके कैंटिलीवर पर एक ग्लास माउंटिंग फाइबर तय किया जाता है। (ऊपर बाएं) इंटरफेरोमीटर सिस्टम कंट्रोलर सॉफ्टवेयर को प्रेषित इंटरफेरोमीटर सिग्नल का विश्लेषण करता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्र 4: सक्रिय तनाव प्रयोगों से प्रायोगिक सेटअप और डेटा। (A)परफ्यूजन सेटअप और उपयोग किए गए समाधानों का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। ध्यान दें कि पहली और आखिरी ट्यूब (हल्के नीले) में कैल्शियम मुक्त समाधान (यानी आराम समाधान) होता है। (ख)उदाहरण मानव कंकाल मांसपेशी ऊतक से अलग एक myofibril के साथ एक सक्रिय तनाव प्रयोग के निशान बल आराम समाधान (पीसीए 9.0) से कई सक्रियण समाधान (पीसीए 6.2 - 4.5) के लिए पांच सक्रियण दिखा। (ग)एक बल-कैल्शियम वक्र; पैनल(बी)में पठारों पर बल के स्तर को सामान्यीकृत किया गया था और उनके संबंधित कैल्शियम के स्तर के खिलाफ साजिश रची गई थी। (घ)उदाहरण के बल एक प्रकार द्वितीय (तेजी से चिकोटी) का निशान मानव कंकाल मांसपेशी पीसीए 5.6 समाधान (नीला) के साथ सक्रिय और बाद में पीसीए 5.6 + बीटीएस (एक प्रकार द्वितीय विशिष्ट क्रॉस-ब्रिज अवरोधक, लाल) के साथ सक्रिय है। (ई)उदाहरण के लिए तनाव पुनर्विकास की दर निर्धारित करने के लिए सक्रियण के दौरान तेजी से छोटा-रेस्ट्रैच प्रोटोकॉल के साथ माउस सोलियस कंकाल मांसपेशी ऊतक से अलग मायोफिब्रिल्स के साथ एक सक्रिय तनाव प्रयोग का डेटा ट्रेस (कश्मीरटीआर,पीली धराशायी रेखा) । इसके अलावा, सक्रियण और विश्राम वक्र क्रमशः सक्रियण (कश्मीरअधिनियम,लाल धराशायी लाइन) और विश्राम (कश्मीरआरईएल,ग्रीन धराशायी लाइन) की दर निर्धारित करने के लिए फिट किए गए थे। (F)विश्राम चरण (शीर्ष बाएं) का एक ज़ूम,(ई)में प्रकाश डाला गया । फास्ट-स्टेप मोटर सिग्नल (बॉटम लेफ्ट) ने उस समय बिंदु का संकेत दिया जिस पर समाधान एक सक्रियण समाधान (पीसीए 4.5) से आराम समाधान (पीसीए 9.0) में बदल गया। विश्राम चरण में एक रैखिक, धीमा चरण (शीर्ष दाएं) और एक घातीय, तेज चरण (नीचे दाएं) शामिल थे। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5: सिस्टम नियंत्रण सॉफ्टवेयर में सिग्नल जनरेटर के लिए उदाहरण सेटिंग। (सामग्री की तालिकादेखें) । 1) सिग्नल जनरेटर में दर्ज कमांड को निष्पादित करने के लिए बटन को इंगित करता है। (क)पीजो लेंथ मोटर की स्थापना। (ख)फास्ट-स्टेप मोटर की स्थापना । (ग)5 एस(डी)की अवधि के लिए एक मायोफिब्रिल को सक्रिय करने के लिए एक तेज कदम का प्रदर्शन करते हुए केटीआरका निर्धारण करने के लिए एक मायोफिब्रिल का तेजी से छोटा-रेस्ट्रेच करना । (ई)चिपचिपा गुणों का निर्धारण करने के लिए एक मायोफिब्रिल के एक स्टेपवाइज खिंचाव का प्रदर्शन करना। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 6
चित्रा 6: पीसी पर उपयोग किए जाने वाले वाल्व नियंत्रक सॉफ्टवेयर। }वाल्व1 (आरएक्स) और 6 (एक्ट) खोलने के लिए इस्तेमाल किया जाने वाला बटन। (ख)सभी वाल्व बंद होने पर बटनों की स्थिति। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 7
चित्रा 7: सिस्टम नियंत्रक सॉफ्टवेयर के साथ सारकोमेरे लंबाई, मायोफिब्रिल लंबाई और मायोबिलिल चौड़ाई को मापना। एक शासक एक उदाहरण के रूप में प्रयोग किया जाता है। (क)सारकोमेरे लंबाई को मापने: बैंगनी बॉक्स मायोफिब्रिल के चारों ओर रखा गया है और सारकोमेरे लंबाई (1) में दिखाया गया है। (ख)लंबाई मापने: सियान बॉक्स को मायोफिब्रिल के शुरू से अंत तक रखा जाता है। (ग)मापने की चौड़ाई: कैमरे को 90 डिग्री घुमाने के बाद, सियान बॉक्स को मायोफिब्रिल के एक तरफ से दूसरे में रखा जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 8
चित्रा 8: थर्मोइलेक्ट्रिक तापमान नियंत्रक सॉफ्टवेयर। (क)थर्मोइलेक्ट्रिक तापमान नियंत्रक के साथ संबंध स्थापित करें। (ख)तापमान सेटिंग्स का विस्तार करें। (ग)वांछित तापमान सेट करें, इस मामले में: 15 डिग्री सेल्सियस (D)थर्मोइलेक्ट्रिक तापमान नियंत्रक चालू करें और पेल्टियर थर्मोइलेक्ट्रिक कूलर मॉड्यूल को वोल्टेज भेजें। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 9
चित्रा 9: सिरिंज बहिर्वाह पंप के लिए सेटिंग्स। (A)दबाने से पंप का खुला कनेक्शन (1) । (ख)पंप को दबाकर पूर्वनिर्धारित सेटिंग्स के साथ शुरू करें (2) । (ग)'वाल्व कमांड्स'को'बाथ वाल्व'(2) में सेट करके और दिखाए गए'कमांड सेट पैरामीटर्स'में प्रवेश करके पंपिंग शुरू करें। (3) दबाकर कमांड को निष्पादित करें। आदेश दबाने से समाप्त किया जा सकता है (4) । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 10
चित्रा 10: उदाहरण डेटा मानव कंकाल मांसपेशी ऊतक से अलग myofibrils के साथ एक निष्क्रिय तनाव प्रयोग का निशान । (A)एक खंड और रिलीज प्रोटोकॉल के दौरान बल (ऊपरी) और सारकोमेरे लंबाई (लोअर) की रिकॉर्डिंग। (ख)जूम ऑफ(ए)मायोफिब्रिल के स्ट्रेच फेज के दौरान फोर्स (अपर) और सारकोमेरे लेंथ दिखाता है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 11
चित्रा 11: प्रायोगिक सेटअप और कार्डियोमायोसाइट कैल्शियम पूर्वसक्रियण प्रयोगों से डेटा। (A)परफ्यूजन सेटअप का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। ध्यान दें कि आखिरी ट्यूब (हल्के नीले) में कैल्शियम-मुक्त समाधान (आराम समाधान) होता है। (ख)कार्डियोमायोसाइट के सक्रियण के अतिरंजित घटता (हल्के नीले) और (गहरे नीले) कैल्शियम प्रीएक्टिवेशन के साथ, क्रमशः 1 एनएम और 80 एनएम की कैल्शियम सांद्रता के साथ। (ग)जंगली प्रकार (डब्ल्यूटी) में कैल्शियम प्रीएक्टिवेशन और हेट्रोजिगस आरबीएम20 (एचईटी) कार्डियोमायोसाइट्स की तुलना चूहे के बाएं वेंट्रिकल से अलग। इस आंकड़े को नजफी एट अल21से संशोधित किया गया है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

चरण उपकरण विवरण आकार प्रारंभिक
1.7.1. पीजो आरंभीकरण निष्क्रिय तनाव निश्चित 51.6 माइक्रोन
1.7.2. पीजो प्रारंभिक सक्रिय तनाव निश्चित 0 माइक्रोन
चरण उपकरण विवरण आकार प्रारंभिक देरी प्रतिनिधि स्तर देरी स्तर देरी
3.4.4. / 4.1.1.4. / 4.1.2.4. तेजी से कदम परीक्षण ɵ ग्लास स्थिति/ धड़कन पल्स 4 वी 1 एस 1 x 3 वी 5 एस 4 वी 1 एस
4.1.3.4. तेजी से कदम मायोफ़िब्रिल की सक्रियता (कश्मीरटीआरशामिल करें) धड़कन पल्स 4 वी 1 एस 1 x 3 वी 10s 4 वी 1 एस
चरण उपकरण विवरण आकार प्रारंभिक देरी प्रतिनिधि रैंप स्तर रैंप अवधि देरी रैंप स्तर रैंप अवधि देरी
4.1.3.1. / 4.1.3.6. पीजो कश्मीरटीआर के लिए छोटा-रेस्ट्रेच ट्रैपेज़ॉइड 0 माइक्रोन 0.5 एस 1 x 0 + 0.15 * एल0 = __ μm 0.01 एस 0.01 एस 0 माइक्रोन 0.01 एस 1 एस
4.2.1.1. / 4.2.1.4. पीजो जारी है खिंचाव ट्रैपेज़ॉइड 51.6 माइक्रोन 2 एस 1 x 51.6 - 0.30 * एल0 = __ μm 2 एस 0 एस 51.6 - 0.30 * एल0 = __ μm 0 एस 1 एस
4.2.1.4. पीजो सुस्त लंबाई के लिए myofibril वापसी ट्रैपेज़ॉइड 1.6 माइक्रोन 2 एस 1 x 51.6 माइक्रोन 5 एस 0 एस 51.6 माइक्रोन 0 एस 1 एस
4.2.2.3. पीजो स्टेपवाइज स्ट्रेच ट्रैपेज़ॉइड 51.6 माइक्रोन 2 एस 10 x 51.6 - 5 माइक्रोन 0.5 एस 10 एस 51.6 - 5 माइक्रोन 0 एस 0 एस
4.2.3. पीजो सुस्त लंबाई के लिए myofibril वापसी ट्रैपेज़ॉइड 1.6 माइक्रोन 2 एस 1 x 51.6 माइक्रोन 5 एस 0 एस 51.6 माइक्रोन 0 एस 0 एस

तालिका 1: पीजो लंबाई मोटर और फास्ट-स्टेप मोटर को संचालित करने के लिए सिस्टम कंट्रोलर सॉफ्टवेयर में उपयोग किए जाने वाले विभिन्न सिग्नल जनरेटर सेटिंग्स का वर्णन करने वाली तालिका।

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Discussion

वर्णित मानव या पशु कंकाल मांसपेशी ऊतकों से अलग myofibrils के संकुचन समारोह का आकलन करने के लिए एक प्रोटोकॉल है। इस सेटअप के बल संकल्प को चव्हाण एट अल12द्वारा पहले वर्णित किया गया है । संक्षेप में, यह फेब्री-पेरोट गुहा की लंबाई के यादृच्छिक उतार-चढ़ाव से निर्धारित होता है, जो पता लगाने वाले फाइबर और कैंटिलीवर के बीच गठित होता है, जो रीडआउट (वी में व्यक्त) के उत्पादन में शोर के प्रमुख भाग का उत्पादन करता है, जो विक्षेप संवेदनशीलता (एम/वी में व्यक्त) से गुणा होता है और कैंटिलीवर (एन/एम में व्यक्त) के वसंत स्थिर द्वारा, शोर बल प्रदान करता है। हमारे सेटअप के लिए, रीडआउट के उत्पादन पर हवा में रूट मतलब स्क्वायर (आरएमएस) शोर, 1,000 डेटा पॉइंट्स/एस (नमूना/एस) पर नमूना, लगभग 2 एमवी है। एक ठेठ myofibril माप के लिए, एक ferrule शीर्ष जांच ~०.७ N/m (विक्षेप संवेदनशीलता ∼३०० एनएम/V) के एक वसंत स्थिर के साथ प्रयोग किया जाता है । यह आरएमएस मूल्य 0.6 एनएम के कैंटिलीवर विक्षेपण संकल्प से मेल खाता है, जो ~ 0.37 एनएम की बल संवेदनशीलता का अनुवाद करता है। रेडीलीवर के झुकने को रीडआउट लेजर13की तरंगदैर्ध्य के बराबर रखते हुए बढ़ते सुई की नोक को वजनी पैमाने पर धकेलकर बल जांच को कैलिब्रेट किया जाता है । अंशांकन की इस विधि में कैंटिलीवर और बढ़ते सुई कठोरता के साथ-साथ मायोफिब्रिल संकुचन की गति और परिमाण के कारण कैंटिलीवर और बढ़ते सुई के टॉर्क में संभावित विविधताओं दोनों को शामिल किया गया है। वर्तमान में, myofibril संकुचन का आकलन करने के लिए एक सेटअप उपलब्ध है, जो कैंटिलीवर से विक्षेपित लेजर का पता लगाने पर आधारित है, यानी, ऑप्टिकल बीम विक्षेप (1,700 ए; ~ 1 एनएन फोर्स रिज़ॉल्यूशन)। इस प्रणाली को लाबुडा एट अल द्वारा विकसित किया गया था। एक ऑप्टिकल पेरिस्कोप का उपयोग करके11 विन्यासोंको बाधित करने में कैंटिलीवर की ओर और दूर लेजर प्रकाश का मार्गदर्शन करने के लिए। इस प्रणाली में, परमाणु बल कैंटिलीवर और एक कठोर कांच की सुई के बीच एक मायोफ्लिल मुहिम शुरू की जाती है। यहां वर्णित प्रणाली का एक लाभ उच्च बल संवेदनशीलता और सिग्नल-टू-शोर अनुपात है। इसके अलावा, इस सेटअप में, अपेक्षाकृत कठोर कैंटिलीवर का उपयोग किया जा सकता है, जिसके परिणामस्वरूप माइोफिब्रिलर बल लागू होने पर छोटे कैंटिलीवर विक्षेप होते हैं। यह महत्वपूर्ण है, क्योंकि यह लगभग निरंतर सारकोमेरे लंबाई में बल माप की अनुमति देता है। अंत में, लैबुडा एट अल द्वारा वर्णित प्रणाली की तुलना में, यहां सिस्टम तापमान को नियंत्रित करने, मायोफिब्रिल पर लंबाई में परिवर्तन को प्रेरित करने और Ɵ-ग्लास और फास्ट-स्टेप मोटर का उपयोग करके परफ्यूजन समाधानों को बदलने के लिए समान या समान तरीकों का उपयोग करता है। लाबुडा एट अल द्वारा वर्णित प्रणाली का लाभ यह है कि समाधान संरचना (कैंटिलीवर और ऑप्टिकल पेरिस्कोप के बीच) का परिवर्तन सिग्नल आउटपुट को प्रभावित नहीं करता है। यहां वर्णित प्रणाली में, कैंटिलीवर और ऑप्टिकल फाइबर के बीच समाधान संरचना स्थिर रहना चाहिए। इस सीमा का समाधान नीचे अधिक विस्तार से वर्णित है।

अनुकूलन
फास्ट-स्टेप परफ्यूजन सिस्टम के संयोजन में ऑप्टिकल फोर्स प्रोब ने जटिलताओं का नेतृत्व किया । कम और उच्च एकाग्रता Ca2 + समाधान के बीच ऑप्टिकल गुणों में अंतर बल माप के साथ हस्तक्षेप करता है। उच्च कैल्शियम समाधान के बैकफ्लो को रोकने के लिए, एक कस्टम फ्लो चैंबर(चित्रा 3)इंजीनियर किया गया था। ऑप्टिकल फाइबर और कैंटिलीवर(चित्रा 3 डी)के शीर्ष के बीच समाधान को स्थिर रखने के लिए कैल्शियम-मुक्त समाधान का निरंतर पृष्ठभूमि प्रवाह दाएं से बाएं प्रेरित होता है।

तापमान को नियंत्रित करने के लिए, तरल शीतलन के साथ एक पेल्टियर तत्व प्रवाह कक्ष पर रखा जाता है। यह प्रवाह कक्ष माइक्रोस्कोप से प्लास्टिक एडाप्टर पर बढ़ते हुए थर्मल रूप से अनकपल है। एक टीईसी प्रणाली द्वारा नियंत्रित पेल्टियर तत्व के साथ, 0.1 डिग्री सेल्सियस सटीकता के साथ समय के साथ समाधान के तापमान को नियंत्रित करना संभव है। तापमान की निगरानी प्रवाह कक्ष पर लगे तापमान सेंसर द्वारा की जाती है। बल ट्रांसड्यूसर की प्रकृति के कारण तापमान स्थिरता महत्वपूर्ण है। कैंटिलीवर में सोने से लेपित ग्लास स्ट्रिप होती है, जो प्रभावी रूप से इसे थर्मामीटर बना देती है। इस प्रकार, कैंटिलीवर तापमान परिवर्तन के साथ झुकता है।

सेटअप Ɵ-ग्लास के आंदोलन को नियंत्रित करने के लिए एक फास्ट-स्टेप परफ्यूजन सिस्टम (सामग्रीकी तालिका देखें) का उपयोग करता है। यह सिस्टम 10 एमएस के भीतर परफ्यूजन स्विच के लिए अनुमति देता है। तापमान नियंत्रण और समाधान स्विचिंग की विधि का संयोजन इस प्रणाली को विशेष रूप से मायोफिल्स में सारकोमेरे अनुबंध (यानी, बल विकास की दर, तनाव पुनर्विकास और विश्राम की दर) की गतिज को मापने के लिए उपयुक्त बनाता है।

प्रारंभ में, इंटरफेरोमेट्री का उपयोग करने का नकारात्मक पक्ष हस्तक्षेप वक्र (λ/8 के रैखिक भाग का उपयोग करने की आवश्यकता के कारण छोटी प्रयोग करने योग्य सीमा थी, जिसमें λ लेजर की तरंगदैर्ध्य है)। हालांकि, हाल के नवाचारों ने लॉक-इन एम्पलीफायर के साथ तरंगदैर्ध्य मॉड्यूलेशन के संयोजन से इस आवश्यकता को समाप्त कर दिया। इसलिए, सिस्टम हस्तक्षेप वक्र के एक भी रैखिक हिस्से तक सीमित नहीं है। इससे कैंटिलीवर14के अनंत विक्षेप का मापन होता है . इस प्रकार, इस प्रणाली के कैंटिलीवर विक्षेप रीडआउट की सीमा पारंपरिक इंटरफेरोमेट्री की तुलना में बहुत बढ़ी हुई है। इसके अतिरिक्त, वर्णित बल जांच को बदलना आसान है और कई कैंटिलीवर उपलब्ध हैं, जिनमें 0.5 एन/एम से लेकर >20 N/m तक कठोरता है । इसलिए, कैंटिलीवर्स के बीच जल्दी से बदलना और किए गए प्रयोग के लिए सबसे उपयुक्त कठोरता का चयन करना संभव है।

चुनौतियों
वर्तमान प्रणाली एक प्रोटोटाइप है जो कार्डियोमायोसाइट मापने की प्रणाली (सामग्रियों की तालिकादेखें) पर आधारित है। बेहतर उपयोगकर्ता अनुभव और उच्च गुणवत्ता का डेटा प्रदान करने के लिए कई घटकों में सुधार किया जा सकता है। सबसे पहले, सिस्टम में ऐड-ऑन के कारण, कंपन और प्रतिध्वनि एक ऐसा मुद्दा हो सकता है जो सिग्नल में शोर जोड़ देगा। साथ ही Ɵ-ग्लास होल्डर और फास्ट-स्टेप मोटर अटैचमेंट मेथड में सुधार किया जा सकता है ताकि कंपन का खतरा कम हो सके ।

दूसरा, समाधान स्विचिंग की गति बढ़ाने और अधिक सुसंगत गति प्राप्त करने के लिए फास्ट-स्टेप मोटर को पीजो लेंथ एक्ट्यूएटर के साथ बदलना वांछनीय है।

तीसरा, कैल्शियम समाधान हम पहले एकल स्ट्रेटेड मांसपेशी फाइबर को सक्रिय करने के लिए इस्तेमाल किया प्रोपियोनिक एसिड शामिल है, लेकिन इन समाधानों के पास अवरक्त प्रकाश अवशोषित, बल माप के साथ हस्तक्षेप । प्रोपियोनिक एसिड की आवश्यकता को खत्म करने के लिए कैल्शियम क्लोराइड का उपयोग किया जाता था, जिससे इस प्रभाव को बहुत कम कर दिया जाता था। यह मुद्दा इंटरफेरोमेट्री पर आधारित प्रणाली के लिए अंतर्निहित है और ऑप्टिकल बीम विक्षेप का उपयोग करते समय मौजूद नहीं है।

चौथा, एक कस्टम प्रवाह स्नान के लिए एक लेमिनार प्रवाह बनाने के लिए इंजीनियर किया गया था, Ɵ के प्रवाह से मेल खाते है ग्लास । यह कैल्शियम युक्त समाधान की अशांति के कारण बैकफ्लो को रोकता है। इसलिए, ऑप्टिकल फाइबर और कैंटिलीवर की नोक के बीच समाधान स्थिर रहता है। मायोफिब्रिल्स के साथ कवरलिप प्रवाह कक्ष के नीचे स्वतंत्र रूप से स्थानांतरित हो सकता है और इसलिए, उपयुक्त माओफिब्रिल का चयन प्रवाह कक्ष के छोटे क्षेत्र तक ही सीमित नहीं है।

प्रजनन और परिवर्तनशीलता
सिस्टम और प्रोटोकॉल के कई तत्व हैं जो प्राप्त डेटा की प्रजनन क्षमता और परिवर्तनशीलता की डिग्री के लिए महत्वपूर्ण हैं।

सबसे पहले, माप की गुणवत्ता दृढ़ता से मायोफिब्रिल अलगाव की गुणवत्ता पर निर्भर करती है। समान प्रोटोकॉल विभिन्न बायोप्सी से विभिन्न गुणों और मायोफिब्रिल की मात्रा उत्प्रंस करते हैं। कुछ मामलों में, बायोप्सी मुश्किल से इस्तेमाल करने योग्य myofibrils या बिल्कुल भी नहीं उपज । आम सहमति यह है कि क्षतिग्रस्त myofibrils संकुचन के दौरान टूट जाएगा और इस तरह के परिणामों में हिसाब नहीं कर रहे हैं ।

दूसरा, मायोफिब्रिल के क्रॉस-सेक्शनल क्षेत्र के निर्धारण में अनिश्चितता है । तकनीकी दिक्कतों के कारण केवल एक प्लेन में मायोफिब्रिल की चौड़ाई मापना संभव है। इसलिए, क्रॉस-सेक्शनल क्षेत्र की गणना करने के लिए हम मानते हैं कि चौड़ाई और गहराई बराबर है। जब अधिकतम सक्रिय तनाव की गणना करने के लिए बल को क्रॉस-सेक्शनल क्षेत्र में सामान्यीकृत किया जाता है, तो किसी को इस धारणा के बारे में पता होना चाहिए।

मायोफिब्रिल बढ़ते कोण, स्थिति, और गोंद की अखंडता के कारण myofibrils के बढ़ते।
हालांकि बढ़ते कोण और स्थिति काफी हद तक नेत्रहीन नियंत्रित किया जा सकता है, myofibrils के बीच छोटे बदलाव मौजूद हो सकता है । गोंद अखंडता की बड़े पैमाने पर जांच नहीं की गई है । हालांकि, गोंद अखंडता से पहले और सक्रियण के बाद मायोफिब्रिल में सारकोमेरे लंबाई की निगरानी करके सत्यापित किया जा सकता है। जब एक प्रोटोकॉल के बाद गोंद के बीच अधिक सारकोमर होते हैं, तो इससे पता चलता है कि गोंद में मायोबिलिल की फिसलन हुई है। नतीजतन, इस मायोफिब्रिल को डेटासेट से बाहर रखा जाना चाहिए।

सेटअप के अन्य अनुप्रयोग: चूहे के बाएं वेंट्रिकल से अलग कार्डियोमायोसाइट्स में कैल्शियम प्रीएक्टिवेशन
मायोफिब्रिल्स के संकुचन कार्य का आकलन करने के अलावा, सिस्टम का उपयोग कार्डियोमायोसाइट यांत्रिकी को मापने के लिए भी किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, चित्रा 11 चूहे बाएं वेंट्रिकल21से अलग झिल्ली-पारमेबिलीकृत एकल कार्डियोमायोसाइट्स के उपयोग को दर्शाता है। ऊपर वर्णित प्रयोगों के विपरीत, आराम समाधान बदल गया था और सक्रिय समाधान स्थिर रखा गया था। प्रत्येक कार्डियोमायोसाइट ने सक्रियणों के पांच सेट किए, इसे 1 एस के लिए 2 माइक्रोन मुफ्त कैल्शियम समाधान के लिए उजागर किया। 1 एस समय की कमी को कार्डियक संकुचन की समय-सीमित प्रकृति की नकल करने के लिए चुना जाता है, जहां कम कैल्शियम एकाग्रता समाधानों का संपर्क डायस्टोलिक चरण की नकल करता है और उच्च कैल्शियम एकाग्रता समाधानों के संपर्क में हृदय की मांसपेशियों के संकुचन(चित्रा 11A)के सिस्टोलिक चरण की नकल करता है। पांच सेटों में से प्रत्येक के लिए डायस्टोलिक कैल्शियम भिन्न था (1, 80, 160, 250, और 400 एनएम कैल्शियम), जबकि सिस्टोलिक कैल्शियम स्थिर रहा(चित्रा 11A)। एक सेट में विभिन्न प्रयोगात्मक समूहों के लिए 1.8 माइक्रोन बनाम 2.0 माइक्रोन और 2.0 माइक्रोन बनाम 2.2 माइक्रोन पर तीन सक्रियण-विश्राम चक्रों के दो सेट शामिल थे। पीक फोर्स को पिपेट के स्विच से 1 एस पर मापा गया था और तीन सक्रियण-विश्राम चक्रों के सेट के लिए औसत था। उच्च सिग्नल-टू-शोर अनुपात और इस बल ट्रांसड्यूसर की उच्च गतिशील रेंज ने हमें डायस्टोलिक बल में छोटे परिवर्तनों और बहुत बड़े सिस्टोलिक बलों(चित्रा 11B)दोनों को मापने की अनुमति दी। डायस्टोलिक कैल्शियम बढ़ाने के परिणामस्वरूप पहली सक्रियण(चित्रा 11B)के सापेक्ष 2 माइक्रोन कैल्शियम पर उच्च बल हुआ। डब्ल्यूटी रैट कार्डियोमायोसाइट्स की तुलना हेट्रोजिगस (एचईटी) आरएमबी20 रैट कार्डियोमायोसाइट्स से की गई थी। वैकल्पिक स्प्लिसिंग के कारण, एचईटी चूहों में डब्ल्यूटी चूहों की तुलना में अधिक अनुपालन टिटिन प्रोटीन होता है। प्रभाव 80 और 160 माइक्रोन कैल्शियम(चित्रा 11C)पर HET कार्डियोमायोसाइट्स में अतिरंजित किया गया था।

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Disclosures

मिचेल हेल्म्स शेयरधारक और आयनऑप्टिक्स इंक के सह-मालिक हैं ।

Acknowledgments

इस परियोजना को एएफएम-टेलीथॉन और नेमलीन मायोपैथी के लिए फाउंडेशन बिल्डिंग स्ट्रेंथ द्वारा वित्त पोषित किया गया था। लेखक इस लेख में उल्लिखित उत्पादों के निर्माता को स्वीकार करना चाहते हैं, आयनऑप्टिक्स इंक

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bio Spec Products, Inc. 985370-XL To isolate myofibrils
Custom coded Matlab
Custom fabricated Includes Labview program to control over serial connection; To control valves
Custom fabricated To cool the Peltier module
Custom fabricated
Custom fabricated Aluminum tissue chamber
Custom fabricated To control the valves; Includes PC software to control over USB
IonOptix System controller software: data recording software with advanced signal generator for piezo and fast-step
IonOptix MCS100 To record sarcomere length
IonOptix Includes: Optiforce (interferometer), Micromanipulators, Signal interface, Piezo motor and controller. Based on the MyoStretcher
IonOptix Force probe
Koolance ADT-EX004S
Koolance EX2-755 To cool the Peltier module
Microsoft Data registration
Olympus IX71
Olympus TH4-200
Sigma-Aldrich 529265 Poly(2-hydroxyethyl methacrylate); Coating for microscope slides to prevent sticking of tissue
Sigma-Aldrich 78471 Crystals to dissolve in ethanol resulting in glue
TE Technology, Inc. TE-63-1.0-1.3 To cool the tissue flow chamber
TE Technology, Inc. TC-720 Includes PC software to control over USB
Tecan Trading AG 20736652
Tecan Trading AG 20739263 Syringe pump to induce backgroundflow together with fast-step perfusion system; Outflow from tissue flow chamber
Thermo scientific 2441081
Warner Instruments (Harvard Bioscience, Inc.) Discontinued Alternative: SF-77CST/VCS-77CSP
Warner Instruments (Harvard Bioscience, Inc.) TG150-4 To perfuse the tissue
1 PC for IonWizard and 1 PC for other software

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References

  1. Winter, J. M., Ottenheijm, C. A. C. Sarcomere Dysfunction in Nemaline Myopathy. J. Neuromuscular. Disease. 4, 99-113 (2017).
  2. Colomo, F., Piroddi, N., Poggesi, C., te Kronnie, G., Tesi, C. Active and passive forces of isolated myofibrils from cardiac and fast skeletal muscle of the frog. Journal of Physiology. 500, Pt 2 535-548 (1997).
  3. Kulke, M., et al. a major source of myofibrillar stiffness in Drosophila indirect flight muscle. Journal of Cell Biology. 154, 1045-1057 (2001).
  4. Stehle, R., et al. Isometric force kinetics upon rapid activation and relaxation of mouse, guinea pig and human heart muscle studied on the subcellular myofibrillar level. Basic Research in Cardiology. 97, Suppl 1 127-135 (2002).
  5. Iorga, B., et al. Micromechanical function of myofibrils isolated from skeletal and cardiac muscles of the zebrafish. Journal of General Physiology. 137, 255-270 (2011).
  6. Ribeiro, P. A. B., et al. Contractility of myofibrils from the heart and diaphragm muscles measured with atomic force cantilevers: Effects of heart-specific deletion of arginyl-tRNA-protein transferase. International Journal of Cardiology. 168, 3564-3571 (2013).
  7. Joureau, B., et al. Dysfunctional sarcomere contractility contributes to muscle weakness in ACTA1-related nemaline myopathy (NEM3). Annals of Neurology. 83, 269-282 (2018).
  8. de Souza Leite, F., Minozzo, F. C., Altman, D., Rassier, D. E. Microfluidic perfusion shows intersarcomere dynamics within single skeletal muscle myofibrils. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114, 8794-8799 (2017).
  9. Shalabi, N., Cornachione, A., de Souza Leite, F., Vengallatore, S., Rassier, D. E. Residual force enhancement is regulated by titin in skeletal and cardiac myofibrils. Journal of Physiology. 595, 2085-2098 (2017).
  10. Cornachione, A. S., Leite, F., Bagni, M. A., Rassier, D. E. The increase in non-cross-bridge forces after stretch of activated striated muscle is related to titin isoforms. American Journal of Physiology - Cell Physiology. 310, 19-26 (2016).
  11. Labuda, A., Brastaviceanu, T., Pavlov, I., Paul, W., Rassier, D. E. Optical detection system for probing cantilever deflections parallel to a sample surface. Review of Scientific Instruments. 82, 013701 (2011).
  12. Chavan, D., et al. Ferrule-top nanoindenter: an optomechanical fiber sensor for nanoindentation. Review of Scientific Instruments. 83, 115110 (2012).
  13. Beekmans, S. V., Iannuzzi, D. A metrological approach for the calibration of force transducers with interferometric readout. Surface Topography: Metrology and Properties. 3, (2015).
  14. van Hoorn, H., Kurniawan, N. A., Koenderink, G. H., Iannuzzi, D. Local dynamic mechanical analysis for heterogeneous soft matter using ferrule-top indentation. Soft Matter. 12, 3066-3073 (2016).
  15. Winter, J. M., et al. KBTBD13 is an actin-binding protein that modulates muscle kinetics. Journal of Clinical Investigation. , (2019).
  16. Winter, J. M., et al. Mutation-specific effects on thin filament length in thin filament myopathy. Annals of Neurology. 79, 959-969 (2016).
  17. Ottenheijm, C. A. C., et al. Deleting exon 55 from the nebulin gene induces severe muscle weakness in a mouse model for nemaline myopathy. Brain. 136, 1718-1731 (2013).
  18. Ribeiro, P. A., et al. Contractility of myofibrils from the heart and diaphragm muscles measured with atomic force cantilevers: effects of heart-specific deletion of arginyl-tRNA-protein transferase. International Journal of Cardiology. 168, 3564-3571 (2013).
  19. Pinniger, G. J., Bruton, J. D., Westerblad, H., Ranatunga, K. W. Effects of a Myosin-II Inhibitor (N-benzyl-p-toluene Sulphonamide, BTS) on Contractile Characteristics of Intact Fast-twitch Mammalian Muscle Fibres. Journal of Muscle Research and Cell Motililty. 26, 135-141 (2005).
  20. Stehle, R., Krüger, M., Pfitzer, G. Force kinetics and individual sarcomere dynamics in cardiac myofibrils after rapid Ca(2+) changes. Biophysics Journal. 83, 2152-2161 (2002).
  21. Najafi, A., et al. End-diastolic force pre-activates cardiomyocytes and determines contractile force: role of titin and calcium. Journal of Physiology. 597, 4521-4531 (2019).

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जीव विज्ञान अंक 159 कंकाल मांसपेशी सारकोमेरे काइनेटिक्स मायोफिल मैकेनिक्स कॉन्ट्रैक्टिलिटी कैल्शियम कैंटिलीवर नैनो-न्यूटन फोर्स प्रोब
कंकाल मांसपेशी बायोप्सी से Myofibrils अलग और एक नैनो न्यूटन संकल्प बल Transducer के साथ अनुबंध समारोह का निर्धारण
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