Summary
このプロトコルは、アラビノガラクタンタンパク質およびペクチンの免疫局在化のための植物材料が固定され、親水性アクリル樹脂に埋め込まれ、切り離され、ガラススライドに取り付けられる方法を詳細に記述する。我々は、細胞壁関連エピトープが特定の抗体で検出されることを示す。
Abstract
植物の開発には、内部および外部刺激の両方に応答して、細胞壁の組成と構造の一定の調整が含まれます。細胞壁は、タンパク質、フェノール化合物および水と共にセルロースおよび非セルロース性多糖類で構成されています。細胞壁の90%は、多糖類(例えば、ペクチン)およびアラビノガラクタンタンパク質(AMP)で構成されています。植物組織学的セクションにおける特定のグリカンエピトープの蛍光免疫局在化は、壁多糖ネットワーク、構造および構成要素のリモデリングを明らかにする重要なツールであり続けています。
ここでは、植物組織中のAMPおよびペクチンからグリカンエピトープを検出するための最適化された蛍光免疫局在化手順を報告する。パラホルムアルデヒド/グルタルアルデヒド固定は、植物サンプルのLR-White埋め込みと一緒に使用され、組織構造および組成のより良い保存を可能にする。超ミクロトームで得られた埋め込みサンプルの薄い部分は、特定の抗体による免疫局在化に使用された。この手法は、大きな解像度、高い特異性、および同じサンプル内の複数のグリカンエピトープを検出する機会を提供します。この技術は、グリカンの細胞内局在化を可能にし、細胞壁に蓄積のレベルを検出します。また、発達過程におけるAGPおよびペクチン分布の時空間的パターンの決定も可能となる。このツールの使用は、最終的に研究の方向を導き、植物の特定の機能にグリカンをリンクすることができます。さらに、得られた情報は、生化学的および遺伝子発現研究を補完することができる。
Introduction
植物細胞壁は、多糖類と糖タンパク質から構成される複雑な構造です。細胞壁は、そのアーキテクチャ、組織および構成が細胞の種類、局在化、発達段階、外部および内部刺激によって異なる非常に動的な構造である 1.アラビノガラクタンタンパク質(AMP)およびペクチンは、植物細胞壁の重要な構成要素である。AGPは、高グリコシル化タンパク質およびペクチンは、その組成、量および構造が異なる植物の発生段階2、3、4の間に大きく変化するホモガラクチュロン多糖である。ASPおよびペクチン研究は、プログラムされた細胞死、無生物性ストレスへの応答、性植物の生殖、他の多くの間でのいくつかの植物プロセスへの関与を明らかにした5。これらの研究のほとんどは、免疫局在性研究から得られた情報から始まりました。
その複雑さを考えると、細胞壁の研究には多くの異なるツールが必要です。モノクローナル抗体(mAbs)を用いたグリカンエピトープの検出は、この構造に沿った多糖類および糖タンパク質分布を解決するための貴重なアプローチです。グリカンエピトープを検出するために利用可能なmAbsの大規模なコレクションがあり、各mAbの特異性は6と同様に継続的に改善されている。ここで説明する技術はすべての植物種に適用可能であり、より高価で複雑な技術を伴うかもしれない将来の研究の方向性を導くのに最適なツールです。
この技術では、特定の抗体は、FITC(フルオレセイン・イソチオシアネート)、TRITC(テトラメチルローダミン-5-(および6)-イソチオシアネート)またはいくつかのアレクサフルオール染料などの蛍光色素に化学的に結合されます。免疫蛍光は、蛍光顕微鏡下で直接観察することができるグリカンの明確かつ迅速な細胞内局在化を可能にするいくつかの利点を提供する。それは、高い特異的かつ感受性であり、試料の調製は、より少量で存在する場合であっても、抗原の自然な構造を効果的に保護することができるので。それは同じサンプルの複数の抗原の検出を可能にし、最も重要な、高品質および視覚的に美しい結果を提供する。蛍光免疫局在化研究によって提供される大きな力にもかかわらず、彼らはしばしば、手順の異なるステップの視覚化を可能にする詳細なプロトコルの欠如のために、実行し、実装することが困難であると考えられている。ここでは、この手法を実行する方法と高品質の画像を取得する方法について、いくつかの簡単なガイドラインを提供します。
ここで示すプロトコルの場合、サンプルはまず修正され、最も適切な固定を使用して埋め込む必要があります。時間がかかり、比較的面倒な技術と考えられていますが、植物試料の適切な固定と埋め込みは、免疫局在アッセイを成功させるための鍵です。この目的のために、最も通常はアルデヒドのような架橋固定剤を用いた化学固定である。架橋固定剤は、組織の分子間の化学的結合を確立し、サンプルを安定化し硬化させる。ホルムアルデヒドとグルタルアルデヒドは、架橋性固定剤であり、そして時々両方の固定剤の混合が7を使用する。ホルムアルデヒドは、組織の構造保存を大きくし、長期間にわたって、小さな組織の引き込みと免疫染色との互換性を提供します。グルタルアルデヒドは、ホルムアルデヒドと組み合わせて通常使用される、より強力で安定した固定剤です。グルタルアルデヒドの使用は、いくつかの自由なアルデヒド基を固定組織に導入し、非特異的標識を生成する可能性があるため、考慮しなければならないいくつかの欠点を有する。また、タンパク質と他の分子との架橋は、時折、抗体に対してアクセスできない標的エピトープをレンダリングする可能性があります。これを回避するには、固定の数量と期間を慎重に定義する必要があります。
固定後、サンプルは、セクションを得る前に硬化するために適切な樹脂に埋め込まれます。ロンドン樹脂(LR-白)アクリル樹脂は、免疫局在性試験に適した樹脂です。他の樹脂とは異なり、LR-Whiteは親水性であり、抗体が抗原に到達することを可能にし、それを容易にする治療を必要としない。LR-Whiteは低い自己蛍光を提供する利点もあり、免疫蛍光イメージング中のバックグラウンドノイズの低減を可能にする。
アルシアンブルー染色、トルイジンブルー染色、周期酸-シッフ(PAS)染色など、細胞壁の異なる成分を検出するために利用可能な多くの染色技術があります。これらのどれも免疫局在性分析の力を提供していません8.このアプローチは、グリカンの検出に大きな特異性を与え、細胞壁の構成と構造に関するより広大な情報を提供します。
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Protocol
1. サンプル調製:固定、脱水、LR-白埋め込み
- 固定と脱水
注: 固定プロセスは、サンプルを保存するために重要です。分子を架橋することで細胞代謝が停止し、細胞の完全性を確保し、分子拡散を防止する。固定剤および使用する濃度は、抗体と相互作用するために十分に露出した抗原を残して、その目的に合わせて調整されなければならない。以下のプロトコルは、グルタルアルデヒドのより強い効果と、パラホルムアルデヒドの軽度の固定能力を兼ね備えています。その比率はAMPおよび細胞壁成分に最適化されたが、他のタンパク質および細胞構造に適している。その後の脱水処理により、LR-White埋め込み用サンプルが準備されます。この実験では、いくつかの植物種の植物組織が使用された。 ケルカスバーサンプル は、フィールドで栽培された木から収集しました。 トリスリアの水中植物の サンプルは、ポーラ・ルトール(キューガーデンズ、ロンドン、英国)によって親切に私たちと共有されました。- すべてのシロイヌナズナズ植物を直接土壌にまき、60%の相対湿度と18°Cで21°Cで16時間光の昼/夜のサイクルを持つ屋内成長施設で成長します。 分析する植物組織を選択し、サンプルを16mm2以下のサイズにトリミングします。
- 十分な冷たい固定液溶液(2%ホルムアルデヒド(w/v)、2.5%グルタルアルデヒド(w/v)、25 mM PIPES pH 7および0.001%Tween-20(v/v))で満たされたガラスバイアルにサンプルを直ちに移して、サンプルを完全に水没させます(図1A)。
注意: ホルムアルデヒドとグルタルアルデヒドは、吸入および接触によって有害であり得る固定剤である。ヒュームフードの固定ステップを実行し、適切な防護服とニトリル手袋を着用してください。アルコールシリーズから70%までのこのステップ以降のすべてのソリューションは、後で専門スタッフによる除染のために保管する必要があります。 - すべてのサンプルを収集した後、固定を更新します。
- バイアルを真空チャンバーに移し、ゆっくりと真空を適用します。60 kPaに達すると、浮遊材料はバイアルの底部に沈み始めます(図1B)。
- 室温で2時間-80 kPa以下の真空下に保管してください。
- 真空をゆっくり解放し、ガラスバイアルを密封し、4°Cで一晩置きます。
- 夜間固定中にシンクされなかったサンプルを破棄します。残りのサンプルを25 mM PBS pH 7で10分間洗浄し、続いて25 mM PIPESバッファpH 7.2で20分洗浄します。
- エタノール系列(25%、35%、50%、70%、80%、90%、および3x100%エタノール)でサンプルを脱水し、それぞれ20分間乾燥させます。脱水サンプルを埋め込み用にラベル付きガラスバイアルに直ちに移す(図1C)。
注:脱水プロセスは、70%エタノールステップで一時停止することができます。
- LR-ホワイト樹脂埋め込み
注:LR-whiteは、低粘度の非疎水性アクリル樹脂であり、多くの厚い細胞壁層を持つ組織を貫通するのに理想的です。LR-Whiteはまたほとんどの植物のサンプルを切ることのための互換性があるいくつかの硬度の等級入って来。使用樹脂に適切な触媒が混入していることを確認するか、サプライヤーの指示に従って樹脂を準備してください。次の埋め込みプロセスは遅いですが、結果は手段を大いに正当化します。- 一連の三日単位の樹脂濃度(1:3、2:3、1:1、3:2、3:1、1:0)の一連の樹脂でLR-白樹脂をインキュベートし、各ステップで4°Cで24時間インキュベートします。
注意:LR-ホワイト樹脂は低毒性アクリル樹脂です。しかし、接触や吸入によって皮膚に刺激を与える可能性があります。換気の良い場所や、適切な保護用の着用とニトリル手袋を備えたヒュームフードの下での作業は強くお勧めします。 - LR-白色樹脂をリフレッシュし、4°Cでさらに12時間インキュベートします。
- 適切なサイズの埋め込みゼラチンカプセル(サイズ1(0.5 mL)をサンプルに3mmまで、最大5 mmまたは3 x 0.3 mLまでのサンプルに対して2 x 0.37 mL、および紙タグ(図1D)を準備します。
注:試料を樹脂に完全に封じ込めることができるように、サンプルよりもわずかに大きいカプセルサイズを選択します。また、ペンや印刷されたインクは樹脂を汚染し、サンプルを損なうので、タグに鉛筆でラベルを付けることを忘れないでください。 - 各カプセルの底に新鮮なLR-白樹脂を1滴塗布します。
- 各ゼラチンカプセルにサンプルを入れ、新鮮な樹脂で最大容量に充填します。カプセルキャップを置き、静かに押して密閉シールを形成します(図1E)。
- 樹脂を58°Cで24〜48時間重合し、完全に硬化するまで重合します。
- サンプルは室温で保存します。
注:ポスト重合LR白色樹脂は不活性です。
- 一連の三日単位の樹脂濃度(1:3、2:3、1:1、3:2、3:1、1:0)の一連の樹脂でLR-白樹脂をインキュベートし、各ステップで4°Cで24時間インキュベートします。
2. スライド準備
注:ガラススライドは、ほこり、グリース、その他の汚染物質を含まず、清潔でなければなりません。一部のサプライヤーは、スライドがくっつくのを防ぐために油と洗剤を使用するので、新しいスライドを清掃する必要があります。ポリL-リジンで処理しても、グリースや洗剤は、スライドへのセクション接着を妨げます。糸くずとほこりは標本の観測に影響を与え、実験を台無しにする可能性が非常に高い。反応ウェル付きのテフロンコーティングスライドは、このタスクに最適です。それらは現実的で再利用可能であり、必要な抗体溶液の量を劇的に減らす。適切な洗浄により、優れた品質の蛍光免疫局在化を非常に手頃なコストで実行できます。
-
スライド洗浄
- スライドを染色ラックに入れ、洗浄液(0.1%SDS(w/v)、酢酸1%(v/v)、エタノール10%(v/v))で覆います。
- 20分間軽度の攪拌を維持します。
- 染色ラックを軽度の攪拌でddH2Oバスに10分間移します。4回繰り返します。
- 100%エタノールに短時間浸漬する前にラックを慎重に排水し、スライドをほこりのない環境で乾燥させます。
- 使用するまで保管してください。
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ポリL-リジンコーティング(オプション)
注:小さなセクションは、通常、ガラスのスライドをきれいにするために非常によく固執します。この手順は、大きなセクション (>2 mm2)にのみ推奨されます。大きなセクションは折り目やしわになりがちで、お勧めできません。それにもかかわらず、必要に応じて、より大きな穴を持つ反応スライドを使用します。上記のように清掃し、次のように進めます。- 正方形のペトリ皿にきれいなスライドを置きます。ピペット0.001%ポリL-リジン溶液(w/v)は、オーバーフローすることなく、スライドの穴をカバーします。
- スライドは、閉じたペトリ皿で40°Cで一晩乾燥させてください。
注:コーティングされたスライドはすぐに使用する準備ができて、数ヶ月間、室温で、ほこりのない環境に保存することができます。
3. サンプルのトリミングと切り離し
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サンプルトリミング
- 鋭利なカミソリの刃で、LR-Whiteブロックを実体顕微鏡でトリムして、試料の対象領域に対して頂点が垂直であるピラミッド型の構造を形成する(補足図1A)。
注:超ミクロトームの標本のホールダーはブロックをしっかり止める優秀な用具である。デバイスにユニバーサル試料ホルダーがない場合は、ラウンドブロックに最も適合したものを使用してください。 - 余分な樹脂の細かいスライスをピラミッドの長軸に垂直に取り除くことによって、ピラミッド構造をトリムします。
- 切断面を形成するサンプルに到達するまで進みます。切断面内では、ターゲットサンプルを台形で囲むのが理想的です。
メモ:樹脂ブロックは、スリット角度でさらにトリミングして、鋭い刃で断面表面積を小さくすることができます(図1F)。
- 鋭利なカミソリの刃で、LR-Whiteブロックを実体顕微鏡でトリムして、試料の対象領域に対して頂点が垂直であるピラミッド型の構造を形成する(補足図1A)。
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半薄い切断
注:ガラスナイフ付きのミクロトームが使用されます。エピトープに結合する抗体の能力は、免疫標識反応の成功を条件とします。LR-White樹脂の親水性により、抗体と試料切片との接触が良好に認められます。薄いセクションは、セクションを見つけ、イメージングプロセスを支援するために使用されるかすかなカルコフルーター着色を提示します。後で適用される可能性のある他の汚れについても同じことが言えます。また、厚さが過ぎると、画像取得品質にも影響します。断面の厚さに対する優れた妥協点は、組織の特性に応じて、200〜700 nmの間で見つけることができます。超ミクロトームの標本ホルダーにしっかりとブロックを取り付けます。- 超ミクロトームを使用して、厚さが200~700nmの断面を作ります(図1G)。
- 一部のセクションをガラススライド上のddH2Oドロップに移して、セクション領域を確認します。50°Cのホットプレートにスライドを置き、水が蒸発するまで置きます。30 sのセクションの上に1%ホウ酸溶液(w/v)に1%のトルイジンブルーO(w/v)の低下を置くステイン。すすいで顕微鏡で観察します。
- 所望の構造を見つけると、クリーンな反応スライドの各ウェルにあらかじめ置かれたddH2Oの各ドロップに1つまたは2つのセクションを移します。
- 各スライドを閉じた清潔な10cm平方シャーレに入れ、50°Cで乾燥させます。
- 使用するまで、スライドをクリーンなアーカイブ ボックスに保存します。
4. 免疫局在
注:蛍光免疫局在化手順は、2つの抗体の逐次使用に依存します。一次抗体は、特異的標的抗原に対して上昇する。二次抗体は、一次抗体に対して特異的に提起され、蛍光技術のために、フルオロフォア(この特定のプロトコルにおけるFITC)に結合される。一次抗体はサンプル中の標的抗原を検出するために使用され、二次抗体は、一次抗体の過剰を洗い流した後、サンプルに結合された一次抗体の位置をマークするために使用されます。制御はこのアッセイの重要な部分であり、観測の正確性を保証するために常に行われなければならない。スライド上の1つの井戸は、一次抗体治療がスキップされる陰性対照として予約されるべきであり、したがって、実験の最後に信号を観察してはならない。陽性のコントロールは、標識がすでに知られており、確実である抗体で1つをうまく治療することによって実験に含まれなければならない。陽性対照は、二次抗体の標識効果と反応条件を確認するために使用され、陰性対照は二次抗体特異性を試験する。
- 湿らせたペーパータオルをピペットチップボックスの底に置き、スズホイルで包んでインキュベーションチャンバーを準備します(補足図1B-1E)。スライドをインキュベーションチャンバーに設置します。
- ピペットはブロッキング溶液(1 M PBSで5%ノンファットドライミルク(w/v)の8mmウェルあたり50 μLの低下を、10分間インキュベートします。ブロッキング溶液を取り出し、PBSで2回10分間全てのウェルを洗います。
- 一次抗体溶液を調製( 補足表1参照)、ブロッキング溶液中の1:5(v/v)抗体;8 mm 当たり約40 μLの推定値を作ります。
注: 抗体の濃度は、製造プロトコルに従って調整する必要があります。 - ddH2Oで5分間最終洗浄を行い、井戸を完全に乾燥させないでください。
- 反応ウェルに対する一次抗体溶液をピペットする。コントロールウェルへのピペットブロッキング溶液。
- インキュベーションチャンバーを閉じ、室温で2時間放置し、続いて4°Cで一晩放置します。 2次抗体溶液を1%ブロッキング溶液(v/v)で調製し、1ウェルあたり約40μL。スズ箔で覆ったままにしておきなさい。
- PBSで10分間すべての井戸を2回洗浄し、続いてddH2O.で10分追加します。
- すべてのウェルに二次抗体溶液をピペットします。これからは、光からスライドを保護します。
- 室温で暗闇の中で3〜4時間インキュベートします。
- PBSで10分間すべての井戸を2回洗い、続いてddH2Oで10分の別の洗浄を行います。
- 各ウェルにカルコフルーア(1:10,000(w/v)蛍光明るい28の滴を適用します。洗浄せずに、各ウェルに取り付け媒体(材料表を参照)を適用し、カバースリップを配置します(図1H)。
- 10x/0.45、20x/0.75、40x/0.95、100x/1.40レンズを搭載した蛍光顕微鏡で観察し、UV(カルコフルーター染色用)とFITCフィルターを使用して細胞壁と免疫局在を検出します(図1I)。UV の場合は励起/放出 (nm) 358/461、FITC の場合は 485/530 の波長を使用します。
- 結果のより良い視覚化のために、両方の画像が ImageJ または類似の画像と重なっています。
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Representative Results
実験が成功すると、二次抗体は特異的に明るい緑色の特定のエピトープの位置を一貫した方法で特定し、細胞、組織または器官の特定の発達段階で細胞壁組成物の特徴付けを可能にする。例えばLM6抗体は、1,5-アラビナン、開発中のケルカス・スバー ・アンテル(図2A)の細胞壁に豊富にラベルを付けているI型ラムノガラクチュランを有する化合物に対する高い親和性を有し、したがって、このタイプのペクチンが豊富であり、一次細胞壁組成物の一部であると結論付けることができる。JIM5は、典型的にはケルカス・スベル胚の根端に見られるほとんどエステル化されていないホモガラクトゥロン類に対する親和性を有し、器官の機械的特性を指定する(図2B)。キシログラクロナンは、細胞壁の緩みと関連するキシロースが豊富なペクチンの一種であり、退化細胞に見られる。この抗体LM8は、キシログラクトルナンを特異的に認識し、成熟器官において、ケルカス・シューバー・アグリイオン熟成の最終段階における胚乳細胞のような退行細胞または組織を検出するために使用され得る(図2C)。
JIM13は、シ ロイヌナズナ の微小生殖に関連する細胞株の再生に関連する構造に見られるAMPに親和性を有する(図2D)。JIM8はまた、基底血管精子 トリスリア水没者 の汚名乳頭および微小ピレのような生殖に関連する細胞および器官に存在するAMPのエピトープを認識する(図2E-2F)。両方の抗体は、植物9における培養細胞株の分子マーカーであることが示唆されている。
このプロトコルの一般的な間違いは、通常、検出して識別するのは簡単です。この化し込み液が飛ばされたり、反応ウェルが乾燥させたりすると、二次抗体は通常、細胞、組織、樹脂およびスライド上で無差別に覆われる非特異的なスミアとして現れる(図3A)。緑色のフルオロクロムの凝集体は、非有限の一次抗体が適切に洗浄されなかった場合に形成される(図3B)。この手法の失敗のもう一つの一般的な原因は、セクションの折り畳みやデタッチ(図3C)に関連しており、実験は役に立たなくなります。この問題は通常、汚れたスライドの使用、および/または積極的な洗浄のために、スライドへのセクションの密着性が悪い場合に関連しています。
サンプル準備もこの手順の重要なステップです。さいわい、最も一般的な固定および埋め込み問題は簡単に見つけることができます (図 3D)。すべてがうまくいけば、樹脂ブロックは亀裂がなく、サンプルは淡い黄色から明るい茶色ではっきりと見えます(図3D-1)。サンプルが非効率に埋め込まれた場合、粉末状の白色の斑点または領域が示されます(図3D-2)。サンプルサイズを8 mm以下に保つことは、固定溶液の浸透を保証するために重要です。サンプルの固定が不十分な場合、ほとんど黒い濃い茶色に見えます(図3D-3)。また、重合の温度は、エピトープの保存と樹脂の適切な硬化の両方にとって重要です。過度の温度は、樹脂がサンプルの切り離しを不可能にする原因となる可能性があります(図3D-4)。
図 1.完全なプロトコルの概要。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:植物サンプルにおけるAMPとペクチン免疫局在化の典型的な結果(A) MEIOSIsにおける ケルカス・スバー ・アンテルにおけるペクチンのアラビナン部分のLM6標識 I. (B) JIM5による ケルカス・スベル胚 根端における低メチルエステル化ペクチンの特異的標識。(C) ク エルカスの熟 成ドングリの後退した胚乳に LM8 によって標識されたキシログラクトルナン。(D) シロイヌナズナ・ア サーのタペタムおよび四面体におけるAGPのJIM13標識。(E) TRITHURIA水中の汚名乳頭にJIM8によって標識されたAGP. (F) 三尿症水中の マイクロピール(白い矢印)でASPを標識するJIM8微小胞子(Mc)、タペタム(Tp)、ルート(R)、ルート先端(Rt)、テスタ(Ts)、子宮内精子(エド)、胚(エム)、表皮(Ep)、スティグマチ乳頭(SP)、オヴレ(OV)。スケールバー:100 μm. この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 3: プロトコル中の一般的な誤りと問題(A)洗浄工程の障害は、サンプル樹脂上の二次抗体(+)の非特異的なスミアの存在によって同定される。(B)一次抗体の特異性または洗浄不全が悪い場合、特定の位置に結合していないFITC凝集体(+)の形成が生じる。(C)折り目とセクションの剥離は、多くの場合、積極的な洗浄と汚れのスライドの結果です。(D) サンプル固定と埋め込みの例(1)完全なサンプルサイズ及び埋め込み、(2)埋め込み不良、(3)サンプル固定不良、(4)樹脂硬化不良。FITC標識抗体(緑色)およびカルコフルオール白色染色(青)。スケールバー:100 μm.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
補足図 1.(A)ウルトラミクロトームで切り離すサンプル(黄色ブロック)を準備するためのブロックトリミングシーケンスの概略図。まず、ゼラチンカプセルを除去する(1)。次に、まずサンプル(2)に対してタンジェントにカプセルの側面に40°〜45°の角度でトリミングされ、2回目のカットは最初の(3)の90°で行われ、次いで3番目の(4)と4番目のカットが同じ規則(5)に従います。トリミング結果のこの第1段階から、サミットがサンプルの上に位置するピラミッド型の構造。最後に、鋭い刃で山頂は埋め込まれたサンプルに達するために樹脂ブロックの長軸に垂直に剃られる。四角形または台形面は、手順(6)の最後に取得する必要があります。(B)インキュベーションチャンバーを作るために必要な供給。スズ箔(1)、両面ダクトテープ(2)、ペーパータオル(3)、ピペットチップボックス。(C)最初のステップは、スズ箔が両面ダクトテープで箱に固定されています。(D)第2ステップでは、ピペットチップホルダーを取り外し、箱の底にペーパータオルを置く。(E)第3のステップは、ペーパータオルは水で湿らされ、ピペットチップホルダーは、スライド用のトレイを持って行動するために戻って配置されます。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足表1:有用なモノクローナル抗体のリスト。 上記の表は、利用可能な抗体の例を示し、その標的およびそれらがどこで購入できるかに関する情報を示しています。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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Discussion
ここで説明する植物における蛍光免疫局在化法は、シームレスに簡単に説明する一方で、いくつかの小さなステップの成功に依存しています。最初のサンプル調製と固定です。この最初のステップでは、ホルムアルデヒドとグルタルアルデヒドの混合物が細胞成分の大部分を架橋するために使用されます。溶液中のホルムアルデヒドは、グルタルアルデヒドが強いより永続的な結合を提供しながら、軽度で可逆的な固定を提供します。2つの固定剤間のバランスは、適切な量の架橋を提供し、エピトープの曝露が一次抗体10と反応することを可能にする。固定ソリューションが正常に動作するためには、サンプルが小さくなければなりません。直径7mmを超える大きな構造物は、固定が非常に難しく、固定性浸透を確実にするために切り取る必要があります。
傷やストレスの後、一部の植物は、固定プロセスを妨害するホルムアルデヒドと反応する可能性のある暗い沈殿物を形成する大量のタンニンを分泌する。試料を氷の上に置き、曇りになるたびに固定液を交換することで、この効果を軽減できます。空気はまた、固定プロセスと後で樹脂の埋め込みと硬化に干渉することができます。提案された真空処理は、空気の大部分を除去する必要があります。特に風通しの良い組織の場合、真空ステップは、サンプルからそれ以上の空気が出て、底部に沈むまで、2時間以上延長することができます。夜間固定化ステップの後に浮遊しているサンプルは破棄する必要があります。樹脂埋め込みは保存されたサンプルを切断するためのサポートを提供し、その硬度は埋め込まれた組織10に近いはずです。LR-Whiteは、木質の多い組織の硬度の硬度、葉から花粉粒までの組織の大部分の中程度グレード、より繊細な組織のための柔らかいグレードの3つの硬度グレードがあります。完全な埋め込みのために、樹脂は完全にサンプルを貫通する必要があります。これは、ゆっくりと徐々に浸透する方が良いです。事前のテストでは、より短い潜伏期間が使用されるかもしれません。ゼラチンカプセルは小さく、密閉性の両方であり、LR-White樹脂硬化に最適です。サイズ2(0.37 mL)の場合、58°Cで24時間後に硬化が完了する必要があります。 他のカプセルサイズについては、硬化時間を調整する必要があります。LR-白硬化樹脂は、ほとんど無色から明るい黄金/琥珀色に行き、爪に硬く感じる必要があります。サンプルトリミングと超ミクロトームの使用は練習が必要ですが、明確な数字を生成します。断面の厚みと大きさは、イメージングおよび免疫局在アッセイにとって重要です。断面の厚さは500 nm前後に保つ必要があります。薄すぎるセクションは染色が不十分になり、700 nmを超える断面の厚さが画像の取得と解像度に干渉します。LR-White樹脂の親水性により、樹脂を除去することなく、染色および免疫局在化においてセクションを直接使用することができます。
ブロッキング溶液(1M PBS中の5%非脂肪乾燥乳)は、抗体の非特異的結合を低減する。ノンファットドライミルクは、BSAまたは他の従来のブロッキング剤に代わる信頼性の高い代替手段であり、大幅に安価です。ブロッキング溶液は、骨材を洗い流し、抗体を保持し、実験を妥協することが困難な沈殿を避けるために、使用前に紙のフィルターを通してフィルタリングする必要があります。提案された抗体比およびインキュベーション時間は、いくつかの研究で最適化され、さまざまな種に適用され、9,11,12,13,14,15,16.
蒸発と光への博覧会は、免疫局在化手順で避けなければならない2つの問題です。湿度と暗いインキュベーションチャンバーは、これらの問題の両方を解決します。暗い部屋を作る方法についてのチュートリアルは 補足図1B-1Eで見つけることができます。この免疫局在性プロトコルは、自身の標識のない標的エピトープに向けられた一次抗体と、一次抗体IgGに対して発生するフルオロクロム(FITC)に結合した二次抗体の使用を求めている。この方法は、二次抗体が標的試料種に親和性を有さないため、検出のストリンジェンシーの増加による単一の抗体検出システムの使用に対していくつかの利点を提供する。このシステムは、一次抗体分子が、フルオロクロム17をそれぞれ担持する二次抗体の数分子によって標的とされ得るように、シグナルを増大させる。
この技術では、強烈な光、または写真の漂白によるフッ素クロムの崩壊が重要な問題です。特に、微弱な局在信号を探索する場合、画像化の前に信号が不可逆的に失われる可能性があります。実装媒体は、フッ素色素18の安定性と寿命を大幅に増加させます。しかし、一部のメディアは、汚れやフルオロクロムと反応し、沈殿物を形成し、画像をぼかす可能性があるため、取り付けメディアをテストすることをお勧めします。免疫局在の観察と登録に用いられる光学系の構成は、この実験の成功にとって最も重要な側面の1つである。セクションの厚さの減少により、共焦点顕微鏡を使用する利点は限られています。最も成功したセットアップは、蛍光灯光源、LEDまたは水銀電球19を備えた従来の直立性の蛍光顕微鏡を必要とし、適切な蛍光グレードの目的を有する。また、励起/放出(nm)358/461用のUV用358/461、FITC用485/530用の良質の光フィルタが必要です。蛍光画像取得のために、冷蔵単色デジタルカメラは、その高速および感度のために推奨されるが、真の色情報20を犠牲にする。多色カメラは、バックグラウンド蛍光から信号を簡単に選別する能力を提供しますが、単色のカメラよりも遅く、はるかに敏感ではありません。
この方法は、特定の抗体の入手可能性によって制限される。植物エピトープを対象とした膨大で拡大する抗体のコレクションが利用可能であるにもかかわらず、当然のことながら、すべての植物化合物がまだカバーされているわけではありません。また脂質は、記載の埋め込み方法によって抽出される傾向があり、従って、油分が多い組織には推奨されない。クライオスタットセクションは、画像解像度を犠牲にしても代替手段となる場合があります。LR-ホワイト樹脂重合の温度は、より敏感なエピトープを変える場合がある。ターゲットエピトープが温度に敏感な場合は、LR-Gold樹脂に対してLR-Whiteを切り替えます。白色光下で-25°Cで重合するLR-Goldは、熱感受性エピトープの優れた保存を提供しますが、特殊な重合装置の取得を必要とし、LR-Whiteの後、わずかに毒性があります。
この方法は、種や組織の広い範囲にわたって使用されています。特定のエピトープ分布に関する信頼できる情報に迅速にアクセスできます。進化モデルのサポートデータを提供し、細胞や組織におけるマーカーと特異的な適応を特定しながら、視覚的に魅力的な結果を提供します。ペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼコンジュゲーション代替物10を介してフルオロクロームと共役する抗体の使用は、時間がかかりにくく、過剰反応アーティファクトを起こしやすく、他の技術と一致しにくい明確な細胞下解像度を提供します。細胞壁関連ポリマーに特異的な抗体を用いることが非常に制限されたドメインへの化合物の配置に関する洞察を可能にする。このような解決は、従来の生化学的ツールから得ることは困難であろう。利用可能な一次抗体の拡大し続けるセットは、植物細胞の内部の働きに絶え間ない新しい発見の機会を提供します。
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Disclosures
著者らは利益相反を宣言しない。
Acknowledgments
著者らは、H2020-MSCA-RISE-2015およびSeedWheels FCT PTDC/BIA-FBT/27839/2017が資金を提供するEUプロジェクト690946'SexSeed'(性植物生殖–種子形成)から支援を受けた。AMPは、欧州連合(EU)のMSCA-IF-2016プロジェクト(No. 753328)から助成金を受けました。MCはFCT PhD助成金SFRH/BD/111781/2015から助成金を受けました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 25% (w/v) Gluteraldehyde | Agar Scientific | AGR1010 | aq. Solution, methanol free |
| 8 wells Glass reaction slides | Marinfeld | MARI1216750 | other brands may be used |
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | A6283 | |
| Anti-Rat IgG (wole molecule)-FITC antibody produced in GOAT | Sigma-Aldrich | F6258 | |
| cover slips, 24 mm x 50 mm | Marinfeld | MARI0100222 | The cover slip should cover all the wells. Other brands may be used |
| ddH2O | na | na | |
| Absolute ethanol | na | na | |
| Fluorescent brightner 28 | Sigma-Aldrich | F-6259 | |
| Gelatin capsules | Agar scientific | AGG29211 | The capsule size should fit the size of the sample. |
| Glass vials | na | na | Any simple unexpensive glass vials that can be sealed, may be used. The vials may be cleaned with 96% ethanol after use to remove LR-White residue and reused. |
| LR-white medium grade, embdeding resin | Agar Scientific | AGR1281 | LR-White comes in several forms; the medium grade provides an adequate cutting support for most tissues, while for harder tissues a harder grade of LR-white may be recommendable. If possible use a resin already mixed with the polimeration activator (benzoyl peroxide), if not please follow the instructions of the supplier to prepare the resin. |
| Non fat dry milk | Nestlé | na | any non fat dry milk is adequate |
| Oven | na | na | generic laboratory oven |
| Petri dish, 10 cm x 10 cm square | na | na | |
| PIPES | Sigma Aldrich | P1851 | |
| Rat generated Monoclonal Anti-Body | Plant probes | na | Several antibodies that recognize cell wall components are available at both the Complex Carbohydrate research center (CCRC, Georgia University USA) and Plant Probes (Paul Knox Cell Wall Lab, at Leeds University UK). A short list of some commonly used MABS and where they can be purchased is presented in Supplemental Table 1 |
| Razor blades | na | na | regular razor blades |
| SDS | Sigma-Aldrich | L6026 | |
| Toluidine Blue-O | Agar Scientific | AGR1727 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
| Ultramicrotome | Leica Microsystems | UC7 | |
| Upright epifluorescence microscope with UV and FITC fluorescence filters | Leica Mycrosistems | DMLb | |
| Vacuum chamber | na | na | |
| Vacuum pump | na | na | |
| Vectashield | vecta Labs | T-1000 | Other anti-fade may be used. Please do check for compatibility with FITC and the Fluorescente brightner 28. (Note: for a non-commercial alternative, (see Jonhson et al 198218) An anti-fade medium can be made by mixing 25 mg/mL of 1,4-Diazobicyclo-(2,2,2)octane (DABCO) in 9:1 (v/v) glycerol to 1xPBS. Adjust pH to 8.6 with diluted HCl.) |
References
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