Summary
Dit protocol beschrijft de detectie van CCL5-gemedieerde periostale skeletstamcelmigratie in realtime met behulp van levende intravitale microscopie van dieren.
Abstract
Periostale skeletstamcellen (P-SSC's) zijn essentieel voor levenslang botonderhoud en -herstel, waardoor ze een ideale focus zijn voor de ontwikkeling van therapieën om de genezing van fracturen te verbeteren. Periostale cellen migreren snel naar een verwonding om nieuwe chondrocyten en osteoblasten te leveren voor fractuurgenezing. Traditioneel is de werkzaamheid van een cytokine om celmigratie te induceren alleen in vitro uitgevoerd door een transwell- of scratch-assay uit te voeren. Met vooruitgang in intravitale microscopie met behulp van multifoton excitatie, werd onlangs ontdekt dat 1) P-SSC's het migrerende gen CCR5 tot expressie brengen en 2) behandeling met het CCR5-ligand bekend als CCL5 de fractuurgenezing en de migratie van P-SSC's verbetert als reactie op CCL5. Deze resultaten zijn in real-time vastgelegd. Hier wordt een protocol beschreven om de P-SSC migratie van de calvariale hechting skeletstamcel (SSC) niche naar een verwonding na behandeling met CCL5 te visualiseren. Het protocol beschrijft de constructie van een muisbevestiging en beeldvormingsbevestiging, chirurgische voorbereiding van de muiscalfalaria, inductie van een calvariadefect en verwerving van time-lapse beeldvorming.
Introduction
Fractuurherstel is een dynamisch, meercellig proces dat verschilt van embryonale skeletontwikkeling en remodellering. Tijdens dit proces wordt de inductie van letselsignalen van beschadigd weefsel gevolgd door de snelle rekrutering, proliferatie en daaropvolgende differentiatie van skeletstam / voorlopercellen, die allemaal van cruciaal belang zijn voor de algehele stabiliteit en fixatie van fracturen1. In het bijzonder vereisen vroege stadia van fractuurgenezing zachte eeltvorming, die voornamelijk wordt toegeschreven aan periostale residente cellen2. Wanneer botten gewond zijn, reageert een subset van periostale cellen snel en draagt bij aan nieuw gedifferentieerde kraakbeentussenproducten en osteoblasten in het eelt3, wat de aanwezigheid van een afzonderlijke skeletstam / voorlopercelpopulatie in het botvlies impliceert. Daarom vormen de identificatie en functionele karakterisering van de periosteum-residente skeletstamcellen (SSC's) een veelbelovende therapeutische aanpak voor degeneratieve botziekten en botdefecten4.
SSC's worden verondersteld zich op meerdere weefsellocaties te bevinden, waaronder het beenmerg. Net als bij beenmerg zijn osteogene/chondrogene SSC's ook geïdentificeerd in het botvlies4,5,6. Deze periostale SSC's (P-SSC's) kunnen worden gelabeld met vroege mesenchymale afstammingsmarkers (d.w.z. Prx1-Cre5, Ctsk-Cre7 en Axin2-CreER8) tijdens de foetale botontwikkeling4,7,8,9,10. Een belangrijke beperking van deze single genetic lineage tracing modellen is dat er een aanzienlijke heterogeniteit is binnen gelabelde celpopulaties. Bovendien kunnen ze gelabelde SSC's niet onderscheiden van hun nageslacht in vivo. Om deze beperking aan te pakken, hebben we onlangs een dubbele reportermuis ontwikkeld (Mx1-Cre + Rosa26-Tomato + α SMA-GFP +) om P-SSC's duidelijk te visualiseren van beenmerg-SSC's (BM-SSC's)11. Met dit model is vastgesteld dat P-SSC's worden gekenmerkt door Mx1+αSMA+ dual labeling, terwijl meer gedifferentieerde Mx1+ cellen zich bevinden in het beenmerg, endosteale en periostale oppervlakken, en corticale en trabeculaire botten11,12.
Van meerdere cytokines en groeifactoren is bekend dat ze botremodellering en -reparatie reguleren en zijn getest op de verbetering van skeletherstel in kritieke segmentdefecten1,13. Vanwege de cellulaire complexiteit van letselmodellen die worden gegenereerd door verstoring van de fysieke barrière van het botcompartiment, zijn de directe effecten van deze moleculen op endogene P-SSC-migratie en activering tijdens genezing onduidelijk. De functionele kenmerken en migratiedynamiek van SSC's worden vaak in vitro beoordeeld door een transwell- of scratch-assay uit te voeren, in combinatie met cytokines of groeifactoren waarvan bekend is dat ze migratie in andere celpopulaties induceren. De interpretatie van de resultaten van deze in vitro experimenten voor toepassing in hun overeenkomstige in vivo systemen is dus een uitdaging. Momenteel wordt in vivo beoordeling van de migratie van skeletstam/voorlopercellen doorgaans niet in realtime waargenomen; in plaats daarvan wordt het gemeten op vaste tijdspunten na de breuk5,7,14,15,16.
Een beperking van deze methode is dat migratie niet op eencellig niveau wordt beoordeeld; in plaats daarvan wordt het gemeten via veranderingen in celpopulaties. Vanwege recente vooruitgang in intravitale microscopie van levende dieren en het genereren van extra reportermuizen, is in vivo tracking van individuele cellen nu mogelijk. Met behulp van levende dier intravitale microscopie observeerden we de verschillende migratie van P-SSC's van de calvaria hechting niche naar een botletsel binnen 24-48 uur na verwonding in Mx1 / Tomato / αSMA-GFP muizen.
CCL5/CCR5 werd onlangs geïdentificeerd als een regulerend mechanisme dat de rekrutering en activering van P-SSC's beïnvloedt tijdens de vroege blessurerespons. Interessant is dat er geen detectie was van substantiële P-SSC-migratie als reactie op een verwonding in realtime. Behandeling van een verwonding met CCL5 produceert echter een robuuste, richtingsafhankelijke migratie van P-SSC's, die in realtime kan worden vastgelegd. Daarom is het doel van dit protocol om een gedetailleerde methodologie te bieden voor het registreren van de in vivo migratie van P-SSC's in realtime na behandeling met CCL5.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle muizen werden in pathogeenvrije omstandigheden gehouden en alle procedures werden goedgekeurd door het Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) van het Baylor College of Medicine.
1. Muisvoorbereiding
- Kruis Mx1-Cre17 en Rosa26-loxP-stop-loxP-tdTomato (Tom)18 muizen (gekocht bij het Jackson Laboratory) met αSMA-GFP muizen (hier geleverd door Drs. Ivo Kalajzic en Henry Kronenberg) om Mx1-Cre+Rosa26-Tomato+α SMA-GFP+ (Mx1/Tomato/αSMA-GFP) reporter muizen te genereren (Figuur 2A).
- Voor Mx1-Cre inductie, injecteer muizen met 25 mg / kg pIpC om de andere dag gedurende 10 dagen.
- Bestraal muizen met 9,5 Gy 1 dag voorafgaand aan intraveneuze transplantatie van 1 x 106 mononucleaire beenmergcellen van wild-type C57BL/6 muizen (WT-BMT)19.
- Na 6 tot 8 weken herstel worden muizen onderworpen aan de in vivo beeldvorming van het periosteale celmigratieprotocol dat hieronder wordt beschreven.
OPMERKING: Bestraling en WT-BMT van Mx1-Cre-muizen zijn nodig om endogene Mx1-gelabelde hematopoëtische cellen te elimineren die kunnen reageren op een verwonding. Zes tot acht weken na de bestraling is het aantal hematopoëtische cellen van de gastheer <5% en dus klaar voor beeldvorming19.
2. Muis fixatie en imaging mount
- Maak een muissteun met een conische buis van 50 ml (figuur 1A).
- Prik met een puntige schaar een gat door de onderkant van het conische. Snijd van het onderste gat naar de bovenkant van het conische (de snijzijde is de bovenkant van de fixatie).
- Maak een snede van ongeveer 4-5 cm lang parallel aan de vorige snede en halverwege (~ 2 cm) van de bovenkant van het beveiligingssysteem. Verwijder dit deel van de conische en maak de randen glad.
- Construeer een conische buisbeeldvormingsbevestiging met behulp van een verstelbare hoekplaat, een optische paal van 0,5" en een haakse klem voor de 0,5"-paal, 0,1875" hex (figuur 1B en materiaaltabel).
- Stel de hoekplaat in op een hoek van 35°. Schroef aan de linkerkant van de hoekplaat de optische paal vanaf de achterkant van de plaat in het tweede gat.
- Plaats aan de rechterkant van de verstelbare plaat een veerbelaste 0,1875" hex-vergrendelende 0,25" duimschroef in het tweede gat van de voorkant en de laatste gaten op de plaat. De haakse klem wordt gebruikt met de optische paal om de conische muisvergrendeling op zijn plaats te houden.
3. Preoperatieve chirurgische ingreep
- Muis anesthesie
- Voor pijnbestrijding, subcutaan injecteren van de muis met aanhoudende afgifte buprenorfine (1 mg / kg LG) 30-60 minuten voorafgaand aan de operatie.
- Anesthetiseer muizen met knaagdier III CCM combinatie (combo III) anesthesie met 37,5 mg / ml ketamine, 1,9 mg / ml xylazine en 0, 37 mg / ml acepromazine. De juiste dosering voor muizen is 0,75-1,50 ml per 1 kg lichaamsgewicht. De dosis duurt 30-45 minuten.
- Zodra de muis is verdoofd, brengt u oogheelkundige zalf aan op de ogen met een steriel wattenstaafje om uitdroging van de ogen te voorkomen.
- Voor langetermijnbeeldvorming (>45 min), dien opnieuw anesthesie toe om de juiste anesthesiediepte als volgt te behouden.
- Bereid een spuit van 1 ml voor met een voldoende hoeveelheid combo III om de anesthesie te behouden voor de geplande beeldvormingsduur (0,75 ml/kg LG per 30 minuten extra sedatie). Bevestig een 25 G vlindernaaldinfusieset met 12"-slang aan de spuit en duw de verdoving door de slang en naald.
- Breng de vlindernaald intraperitoneaal in en plak de naald vervolgens op zijn plaats.
OPMERKING: Dit is hoe de extra combo III tijdens het afbeelden zal worden toegediend, zodat het niet nodig is om het dier te verplaatsen of het gezichtsveld te verstoren.
- Zorg voor thermische ondersteuning met een verwarmingskussen dat gedurende de hele procedure op 37 °C wordt gehouden. Voor langdurige beeldvorming (>1 uur) is extra vloeistofondersteuning nodig. Aanvullende vloeistoffen kunnen worden voorzien van I.P. met extra Combo III tijdens beeldvorming of 33 ml / kg zoutoplossing (0,9 NaCl) subcutaan.
- Muisbeperking en voorbereiding van de operatieplaats
- Gebruik tondeuses om zoveel mogelijk haar van de bovenkant van het hoofd te verwijderen. Breng ontharingscrème aan op het geschoren gebied om het resterende haar op de operatieplaats te verwijderen.
- Zorg ervoor dat de muis volledig wordt verdoofd door een gebrek aan reactie op teenknijpen. Als de muis niet volledig is verdoofd, dient u na 15 minuten een tweede kleinere dosis combo III (<0,75 ml/kg LICHAAMSGEWICHT) toe.
- Plaats de muis eerst in de staart van de fixatie en schuif hem ver genoeg naar achteren zodat de neus iets over de rand van de conische hangt.
- Plak de voorpoten aan de onderkant van de conische buis met behulp van medische tape.
- Plaats de conische buis met muis op een beeldbevestiging die in een hoek van 35° is ingesteld en vastzet met de haakse klem (figuur 1C).
- Zodra de muis veilig is in de beeldvormingsbevestiging, reinigt u de operatieplaats 3x met afwisselende scrubs van betadinescrub en 70% isopropylalcohol. Controleer nogmaals of het dier volledig verdoofd is.
- Beweeg de muis naar een schoon absorberend kussen en plaats een gordijn over de muis om een groot steriel veld te creëren.
4. Chirurgische ingreep
- Opening incisie
- Gebruik een tang met fijne punt en pak de huid onmiddellijk mediaal naar het rechteroor. Knip met een microdissectieschaar de huid die door de tang wordt vastgehouden.
OPMERKING: Het starten van de incisie met behulp van de hierboven beschreven methode creëert een afgeronde incisie die meer geschikt is om na de procedure te hechten. - Maak een transversale incisie vanaf de eerste incisie naar het linkeroor (<1 cm). Maak nog een incisie, beginnend bij de eerste incisie, naar de neus van het dier (~ 2-3 mm voorbij het rechteroog).
- Scheid de huid van het botvlies met behulp van de tang en schaar om voorzichtig door het bindweefsel te snijden dat de huid scheidt van het calvaria-botvlies.
- Breng met behulp van een steriel wattenstaafje wat oogzalf aan op de bovenkant van de huidflap. Pak de huidflap voorzichtig op en vouw deze over het linkeroog. Het snijpunt van de sagittale en coronale hechtingen moet duidelijk worden belicht (figuur 1E).
OPMERKING: De oogheelkundige zalf wordt gebruikt om de huidflap op zijn plaats te houden. - Spoel het open oppervlak met steriel PBS om het gebied van bloed en achtergebleven haar te reinigen.
OPMERKING: Gebruik indien nodig een tang met fijne punt om haren te verwijderen die overblijven na het spoelen, maar pas op dat u het botvlies niet beschadigt.
- Gebruik een tang met fijne punt en pak de huid onmiddellijk mediaal naar het rechteroor. Knip met een microdissectieschaar de huid die door de tang wordt vastgehouden.
- Microfractuur
- Om microfracturen op de calvaria te genereren, verwijdert u de zuiger van een insulinespuit van 29 G en snijdt u de achterkant van de spuit, rond de 300-400 uL markeringen.
OPMERKING: Deze stap maakt het gemakkelijker om onder een dissectiebereik te manoeuvreren bij het produceren van het letsel. - Plaats de punt van een schuine kant (één tot twee naaldbreedtes) naar de neus toe vanaf de coronale hechting en één tot twee naaldbreedtes rechts van de sagittale hechting (figuur 1E).
- Draai de spuit voorzichtig met de klok mee en vervolgens meerdere keren tegen de klok in.
OPMERKING: Bij jonge muizen is een zeer kleine hoeveelheid neerwaartse druk nodig om een circulaire microfractuur te creëren. Zorg ervoor dat de naald de hersenen niet binnendringt, omdat dit bloedingen zal veroorzaken en de beeldvorming zal verstoren. - Gebruik een naald van 27 G om de microfractuur te verbreden tot ~0,4 mm. Als er botfragmenten in de microfractuur achterblijven, spoel het gebied dan met PBS. Als er nog steeds botfragmenten in de microfractuur achterblijven, gebruik dan de 29 G-naald om ze voorzichtig uit te scheppen.
- Herhaal stap 4.2.1–4.2.4 om een verwonding aan de linkerkant van de sagittale hechting te creëren.
OPMERKING: Op dit punt zijn er twee opties: 1) onmiddellijk doorgaan met CCL5-behandeling (rubriek 4.3) en beeldvorming (rubriek 5); of 2) sluit de operatieplaats na de postoperatieve procedures in rubriek 6. Verdoof de muis na 24 uur opnieuw, heropen het chirurgische zicht, behandel het letsel met CCL5 (rubriek 4.3) en voer intravitale beeldvorming (rubriek 5) en postoperatieve zorg (rubriek 6) uit.
- Om microfracturen op de calvaria te genereren, verwijdert u de zuiger van een insulinespuit van 29 G en snijdt u de achterkant van de spuit, rond de 300-400 uL markeringen.
- CCL5 behandeling
- Maak uit een voorraad RANTES (100 ng /ml) een oplossing van 10 ng / ml met behulp van keldermembraanmatrix (tabel met materialen). Houd deze oplossing op ijs om de matrix in vloeibare vorm te houden.
- Behandel elke verwonding met 2 μL CCL5 (10 ng/μL) met behulp van een pipet van 2-20 μL (deze pipetpunt heeft een grotere diameter, wat effectiever is bij gebruik van een viskeuze vloeistof). Laat de matrix stollen.
- Zodra de matrix is gestold, bedek je de calvaria voorzichtig met de huidflap om ervoor te zorgen dat het weefsel niet uitgedroogd raakt. Incubateer gedurende 1 uur voorafgaand aan de beeldvorming.
5. Intravitale beeldvorming
- Microscoop instellingen
- Schakel de multifotonenlaser (femtoseconde titanium-saffierlaser) in. Stel de golflengte in op 880 nm en pas het vermogen aan voor beeldvorming van de tweede harmonische generatie (SHG) (440 nm) van het bot.
- Schakel de 488 nm en 561 nm solid state lasers in voor excitatie van respectievelijk GFP- en tdTomato-expresserende cellen.
- Schakel PMT-detectoren (photomultiplier tube) in voor signalen van de tweede harmonische generatie (405-455 nm detectie) en GFP(505-550 nm detectie). Schakel de HyD 3-detector in voor het tomatensignaal (590-620 nm detectie).
- Montage
- Voordat u de muis naar de scope beweegt, controleert u het visuele vlak van de calvaria door zachtjes op de achterkant van het hoofd van de muis te drukken. Als het vlak niet waterpas is, past u de positie aan door de muissteun voorzichtig naar links of rechts te draaien.
OPMERKING: Dit is een cruciale stap om voldoende beeldkwaliteit te garanderen. - Breng steriele 2% methylcellulose aan in water (w/v) om de gehele calvarie en huidflap te bedekken en uitdroging van het weefsel te voorkomen.
- Plaats de muis op de gemotoriseerde microscooptrap van de XYZ-as (figuur 1G). Gebruik het epifluorescente licht om de muis zo uit te lijnen dat 1) deze naar de microscoop is gericht en 2) de kruising van de coronale en sagittale hechtingen het gecentreerde referentiepunt van het stadium is.
- Plaats de glazen afdekking op het beeldvormingsgebied en controleer de uitlijning (figuur 1H).
- Voordat u de muis naar de scope beweegt, controleert u het visuele vlak van de calvaria door zachtjes op de achterkant van het hoofd van de muis te drukken. Als het vlak niet waterpas is, past u de positie aan door de muissteun voorzichtig naar links of rechts te draaien.
- Time-lapse beeldvorming
- Gebruik een lens met lage vergroting (25x waterdompelingsobjectief met NA = 0,95) om de calvaria te scannen. Verkrijg een referentiebeeld van het snijpunt van sagittale en coronale hechtingen.
- Gebruik de SHG en fluorescerende signalen van de cellen om elk verwondingszicht te lokaliseren en de XYZ-coördinaten en de afstanden van de sagittale en coronale hechtingen vast te leggen (figuur 2B).
- Kies een locatie op de coronale of sagittale hechtingen voor beeldvorming op lange termijn. Maak een gedetailleerde Z-stack-afbeelding van dit gebied uit referentie tijdens het fotograferen.
OPMERKING: Aangezien de hechtingen een bekende P-SSC-niche vertegenwoordigen, is dit waar de cellen vandaan migreren als reactie op de calvaria-verwonding. - Gebruik de time-lapse-software-instellingen om elke 1 minuut gedurende ten minste 1 uur een afbeelding op te nemen. Vergelijk in de tijd tussen snapshots het huidige gezichtsveld met het initiële gezichtsveld. Als ze verschillend zijn, gebruikt u de Z-stack-afbeelding om te bepalen in welke richting het gezichtsveld moet worden aangepast.
6. Postoperatieve dierverzorging
- Spoel na beeldvorming de blootgestelde calvaria met steriel PBS om de methylcellulose te verwijderen.
- Om de incisie te sluiten, plaatst u de huidflap voorzichtig over de calvaria. Gebruik steriele wattenstaafjes om resterende oogzalf te verwijderen en de incisieplaats te drogen.
- Gebruik monofilament nylon 5-0 maat niet-absorbeerbare hechtingen met een bevestigde C-1 omgekeerde snijnaald, sluit de operatieplaats. Gebruik een steriel wattenstaafje om drievoudige antibiotische zalf op de gesloten incisie aan te brengen.
OPMERKING: Littekens worden verminderd met hoogwaardige hechttechnieken en minimale bloedingen. - Plaats de muis in een schone kooi op een warm oppervlak en controleer elke 15 minuten totdat de sternale ligtijd is bereikt.
- Dien een tweede dosis buprenorfine met aanhoudende afgifte toe 72 uur na de operatie.
- Controleer dagelijks op knuffelgedrag, gegolfde vacht en / of gebrek aan ambulatie totdat hechtingen zijn verwijderd (~ 1 week).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Er is voorgesteld dat skeletvoorlopers migratie- of bloedsomlooppotentieel hebben20. Onlangs werden Mx1-Cre+Rosa26-Tomato+α SMA-GFP+ (Mx1/Tomato/αSMA-GFP) reportermuizen gegenereerd, waarbij P-SSC's worden gemarkeerd door Mx1+α SMA+ dual labeling (Figuur 2A,B). Substantiële migratie van Mx1+α SMA+ P-SSC's vond plaats uit het mesenchym van de hechting binnen 24-48 uur na het letsel11. Ook werd de mogelijkheid getest om in vivo P-SSC migratie in real-time 24 uur na een calvariadefect te detecteren. Er werd weinig tot geen migratie van Mx1+αSMA+ P-SSC's waargenomen binnen 1 uur na beeldvorming (figuur 2C).
Mx1+α SMA+ P-SSC's brengen op unieke wijze de CCL5-receptor tot expressie die bekend staat als CCR511. Behandeling van een calvariadefect 24 uur na het letsel met CCL5 veroorzaakte dus een richtingsafhankelijke migratie weg van de coronale hechting en naar het verwondingszicht (figuur 2D,E). Binnen 1 uur na de beeldvorming migreerde een van de Mx1+αSMA+ P-SSC's ongeveer 50 μm naar de verwonding (figuur 2E). Andere Mx1+αSMA+ P-SSC's werden ook waargenomen als gevolg van de behandeling met CCL5, maar in mindere mate.
Figuur 1: Opstelling voor in vivo beeldvorming van muiskalfalaria. Representatieve beelden van de muisvergrendeling (A) en beeldbevestiging (B) die worden gebruikt tijdens live beeldvorming. (C) Muis in het beveiligingssysteem en bevestigd aan de beeldbevestiging. (D) Schematische weergave van de calvariastructuur van muizen, waarbij de frontale (FS), coronale (CS), sagittale (SS) en lambdoïde (LS) hechtingen worden geïdentificeerd. (E) Representatieve plaatsing van calvaria microfractuurletsels. (F) Postoperatieve chirurgische hechtingsplaatsing voor optimale genezing en toekomstige beeldvorming. Representatieve afbeeldingen van de plaatsing van de houder op microscooptrap (G) en de plaatsing van de coverslip (H). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Real-time in vivo beeldvorming van Mx1+αSMA+ P-SSC migratie. (A) Schema van Mx1/Tomato/αSMA-GFP dual reporter mice voorbereiding. Muizen werden intraperitoneaal geïnjecteerd met 25 mg/kg pIpC om de andere dag gedurende 10 dagen (1). Mx1/Tomato/αSMA-GFP muizen werden dodelijk bestraald met 9,5 Gy (2) 1 dag vóór intraveneuze transplantatie van 1 x 106 mononucleaire beenmergcellen van WT C57BL/6 muizen (3). Na 6-8 weken herstel (wanneer de hematopoëtische cellen van de gastheer minder dan 5% werden), werden muizen onderworpen aan botletselexperimenten. Mx1+ (Tomato+), αSMA+ (GFP+), Mx1+α SMA+ (Tomato+GFP+) en bone (blauw). (B) Maximale Z-projectie van een representatieve calvaria-verwonding (witte cirkel) en beeldvormingslocaties (wit vierkant) ten opzichte van sagittale (SS) en coronale (CS) hechtingen van Mx1/Tomato/αSMA-GFP-muis. Stippellijnen vertegenwoordigen calvaria-hechtingen. (C) In vivo beeldvorming van mx1+α SMA+ P-SSC's respons 24 uur na het letsel. Schaalbalk = 25 μm. (D) 24 uur na het letsel werd CCL5 toegediend bij het zien van het letsel en in vivo beeldvorming werd 1 uur later uitgevoerd met betrekking tot de coronale hechting (CS). Wit vierkant vertegenwoordigt de locatie van celmigratieafbeeldingen die worden weergegeven in (E). Schaalbalk = 75 μm. (E) Migratie van Mx1+α SMA+ P-SSC's op het bot (blauw) oppervlak naar het letselzicht (rechtsboven). Schaalbalk = 25 μm. In (C,D,E) geven de getallen het tijdstip van beeldvorming aan. De gele pijl geeft de richting van de locatie van het letsel aan. Asterisk geeft het migratiepad van Mx1+α SMA+ P-SSC aan. Het beeld is representatief voor resultaten van drie tot vijf muizen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Tijdens botgenezing zijn periostale cellen de belangrijkste bron van nieuw gedifferentieerde chondrocyten en osteoblasten binnen een verwonding eelt3. Net als bij beenmerg zijn osteogene/chondrogene SSC's ook geïdentificeerd in het botvlies4,5,6. Het beoordelen van endogene P-SSC functionele kenmerken is technisch uitdagend. Vaak wordt de migratiedynamiek van SSC's in vitro beoordeeld, waardoor de interpretatie van hun overeenkomstige in vivo systemen een uitdaging wordt. Dankzij recente ontwikkelingen in de intravitale microscopie van levende dieren en het genereren van extra reportermuizen (Mx1/Tomato/αSMA-GFP), is in vivo tracking van individuele cellen nu mogelijk. Deze methode maakt dus de in vivo registratie van CCL5 geïnduceerde P-SSC-migratie in realtime mogelijk.
Er zijn verschillende technische uitdagingen verbonden aan deze methode die de consistentie van beeldvorming kunnen beïnvloeden. Een grote technische uitdaging bij deze methode is het behoud van het Z-as gezichtsvlak. Z-as drift (Z-drift) is een veel voorkomend probleem bij langetermijnbeeldvorming van vaste en levende monsters en wordt grotendeels toegeschreven aan temperatuurveranderingen in de beeldvormingsomgeving. Hoewel dit artefact niet volledig kan worden tegengegaan, helpt het bedekken van het podium, objectieve lenzen en ondersteunende structuren om Z-drift21 te verminderen.
Bovendien zal het verkrijgen van een Z-stack-serie van de beeldvormingslocatie voorafgaand aan time-lapse-beeldvorming een referentie van de Z-as vaststellen waarnaar kan worden verwezen tussen beeldacquisities (d.w.z. beelden worden meestal om de 30-60 s gemaakt, wat tijd biedt voor aanpassingen aan de Z-as, indien nodig). Een andere technische uitdaging is het maken van een consistente microfractuur die dezelfde grootte, vorm en afstand heeft van de calvaria-hechtingen. De afstand tot de coronale en sagittale hechtingen is van cruciaal belang, omdat de calvaria-hechtingen een niche zijn voor rustige SSCs10. De beste methode om de variabiliteit van de microfractuur te verminderen, is om deze techniek te oefenen bij muizen die niet in de uiteindelijke analyse zijn opgenomen.
Ondanks de beperkingen biedt deze methode een uniek systeem om de individuele cellulaire respons in vivo op een botletsel te beoordelen. Aangezien fractuurherstel een zeer complex proces is waarbij meerdere celtypen betrokken zijn, zijn er verschillende aspecten die niet volledig worden begrepen. Een daarvan omvat de vroege migratierespons van P-SSC's op een verwonding. Hoewel CCR5/CCL5 een uniek mechanisme is waarmee P-SSC's worden gerekruteerd voor een verwonding, is het mogelijk dat extra cytokines en groeifactoren een belangrijke rol spelen bij de genezing van fracturen. Voorheen heeft de behandeling van fracturen met verschillende cytokines en groeifactoren geresulteerd in zeer variabele uitkomsten in de algehele fractuurgenezing22. Deze beeldvormingsmethode biedt een uniek platform om de fysiologische effecten van potentiële geneesmiddel/cytokine/groeifactortherapieën op individuele cellulaire responsen te bepalen. Ten slotte biedt het in vivo mechanistische gegevens die de verbetering van de fractuurgenezing door een specifieke therapie kunnen ondersteunen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
L.C.O. en D.P. onthullen een patent dat in behandeling is met de titel "Periosteal Skeletal Stem Cells in Bone Repair" (BAYM. P0264US. P1). De overige auteurs verklaren geen tegenstrijdige belangen te hebben.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door de Bone Disease Program of Texas Award, de Caroline Wiess Law Fund Award en de NIAMS van de National Institutes of Health onder de awardnummers R01 AR072018, R21 AG064345, R01 CA221946 tot D.P. We bedanken M.E. Dickinson en T.J. Vadakkan in de BCM Optical Imaging and Vital Microscopy Core en de BCM Advanced Technology Cores met financiering van NIH (AI036211, CA125123 en DK056338).
.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ½” optical post | ThorLabs | TR2 | For imaging mount |
| 1 mL syringe | BD | 309659 | |
| 27G needle | BD PercisionGlide | 305111 | |
| 29G insulin syringe | McKesson | 102-SN05C905P | |
| 50 mL conicol tube | Falcon | 352098 | For mouse restraint |
| Adjustable angle plate | Renishaw | R-PCA-5023-50-20 | For imaging mount |
| Alcohol wipes | Coviden | 6818 | |
| betadine surgical scrub | Henry Schen | 67618-151-16 | |
| Buprenorphine SR-LAB | ZooPharm | 1mg/mL Sustained Release | |
| Combo III | Obtained from staff veterinarian | N/A | 37.6 mg/mL Ketamine; 1.9 mg/mL Xylazine; 0.37 mg/mL Acepronazine |
| Coverslip | Fisher | 12-545-87 | 24 x 40 premium superslip |
| Fine tip forcepts | FST | 11254-20 | |
| Ketamine | KetaVed | 50989-161-06 | 100 mg/mL |
| Leica TCS SP8MP with DM6000CFS | Leica Microsystems | N/A | |
| Matrigel | R & D Systems | 344500101 | |
| Medical tape | McKesson | 100199 | 3" x 10 yds (7.6 cm x 9.1 m) |
| Methocellulose | Electron Microscopy Sciences | 19560 | |
| Microdissection scissors | FST | 1456-12 | |
| Motorized stage | Anaheim automation | N/A | |
| Needle holder | FST | 12500-12 | |
| Nonabsorbable sutures | McKesson | S913BX | monofilament nylon 5-0 nonabsorbable sutures with attached C-1 reverse cutting needle |
| Opthalmic ointment | Rugby | 0536-1086-91 | |
| RANTES | Biolegend | 594202 | 10 µg/50 µL |
| Right-angle clamp for ½” post, 3/16” Hex | ThorLabs | RA90 | For imaging mount |
| Spring-loaded 3/16” Hex-locking ¼” thumbscrew | ThorLabs | TS25H | For imaging mount |
| Sterile cotton swabs | Henry Schen | 100-9249 | |
| Sterile DPBS (1x) | Corning | 21-030-CV | |
| Sterile drapes | McKessen | 25-517 | |
| Surgical gloves | McKessen | 3158VA | |
| Triple antibiotic ointment | Taro Pharmaceuticals U.s.a., Inc. | 51672-2120-2 | |
| Vacutainer blood collection set | BD | REF 367298 | 25G butterfly needle infusion set with 12" tubing |
References
- Einhorn, T. A., Gerstenfeld, L. C. Fracture healing: mechanisms and interventions. Nature Reviews Rheumatology. 11 (1), 45-54 (2015).
- Murao, H., Yamamoto, K., Matsuda, S., Akiyama, H. Periosteal cells are a major source of soft callus in bone fracture. Journal of Bone and Mineral Metabolism. 31 (4), 390-398 (2013).
- Colnot, C. Skeletal cell fate decisions within periosteum and bone marrow during bone regeneration. Journal of Bone and Mineral Research. 24 (2), 274-282 (2009).
- Roberts, S. J., van Gastel, N., Carmeliet, G., Luyten, F. P. Uncovering the periosteum for skeletal regeneration: the stem cell that lies beneath. Bone. 70, 10-18 (2015).
- Duchamp de Lageneste, O., et al. Periosteum contains skeletal stem cells with high bone regenerative potential controlled by Periostin. Nature Communications. 9 (1), 773 (2018).
- Olivos-Meza, A., et al. Pretreatment of periosteum with TGF-beta1 in situ enhances the quality of osteochondral tissue regenerated from transplanted periosteal grafts in adult rabbits. Osteoarthritis Cartilage. 18 (9), 1183-1191 (2010).
- Debnath, S., et al. Discovery of a periosteal stem cell mediating intramembranous bone formation. Nature. 562 (7725), 133-139 (2018).
- Ransom, R. C., et al. Axin2-expressing cells execute regeneration after skeletal injury. Scientific Reports. 6, 36524 (2016).
- Ouyang, Z., et al. Prx1 and 3.2kb Col1a1 promoters target distinct bone cell populations in transgenic mice. Bone. 58, 136-145 (2013).
- Wilk, K., et al. Postnatal Calvarial Skeletal Stem Cells Expressing PRX1 Reside Exclusively in the Calvarial Sutures and Are Required for Bone Regeneration. Stem Cell Reports. 8 (4), 933-946 (2017).
- Ortinau, L. C., et al. Identification of Functionally Distinct Mx1+alphaSMA+ Periosteal Skeletal Stem Cells. Cell Stem Cell. 25 (6), 784-796 (2019).
- Deveza, L., Ortinau, L., Lei, K., Park, D. Comparative analysis of gene expression identifies distinct molecular signatures of bone marrow- and periosteal-skeletal stem/progenitor cells. PLoS One. 13 (1), 0190909 (2018).
- Schindeler, A., McDonald, M. M., Bokko, P., Little, D. G. Bone remodeling during fracture repair: The cellular picture. Seminars in Cell and Developmental Biology. 19 (5), 459-466 (2008).
- Shi, Y., et al. Gli1 identifies osteogenic progenitors for bone formation and fracture repair. Cell Stem Cell. 15 (2), 782-796 (2017).
- Zhou, B. O., Yue, R., Murphy, M. M., Peyer, J. G., Morrison, S. J. Leptin-receptor-expressing mesenchymal stromal cells represent the main source of bone formed by adult bone marrow. Cell Stem Cell. 15 (2), 154-168 (2014).
- Grcevic, D., et al. In vivo fate mapping identifies mesenchymal progenitor cells. Stem Cells. 30 (2), 187-196 (2012).
- Kuhn, R., Schwenk, F., Aguet, M., Rajewsky, K.
- Srinivas, S., et al. Cre reporter strains produced by targeted insertion of EYFP and ECFP into the ROSA26 locus. BMC Developmental Biology. 1, 4 (2001).
- Park, D., et al. Endogenous bone marrow MSCs are dynamic, fate-restricted participants in bone maintenance and regeneration. Cell Stem Cell. 10 (3), 259-272 (2012).
- Nitzsche, F., et al. Concise Review: MSC Adhesion Cascade-Insights into Homing and Transendothelial Migration. Stem Cells. 35 (6), 1446-1460 (2017).
- Adler, J., Pagakis, S. N. Reducing image distortions due to temperature-related microscope stage drift. Journal of Microscopy. 210, Pt 2 131-137 (2003).
- Roberts, S. J., Ke, H. Z. Anabolic Strategies to Augment Bone Fracture Healing. Current Osteoporosis Reports. 16 (3), 289-298 (2018).
