Summary
Aqui, apresentamos um protocolo otimizado para medir rapidamente e semiquantitativamente as interações ligantes-receptores em trans em um sistema celular heterologous usando microscopia de fluorescência.
Abstract
As interações proteicas nas interfaces celulares ditam uma infinidade de desfechos biológicos que vão desde o desenvolvimento de tecidos e progressão do câncer até a formação e manutenção da sinapse. Muitas dessas interações fundamentais ocorrem em trans e são tipicamente induzidas por interações heterofílicas ou homofílicas entre células expressando pares de ligação ancorados na membrana. Elucidar como mutações relevantes para doenças interrompem essas interações proteicas fundamentais pode fornecer uma visão de uma miríade de campos de biologia celular. Muitos ensaios de interação proteína-proteína não normalmente desambiguam entre interações cis e trans, o que potencialmente leva a uma superestimação da extensão da ligação que está ocorrendo in vivo e envolve purificação intensiva de proteínas e/ou equipamentos de monitoramento especializados. Aqui, apresentamos um protocolo simples otimizado que permite a observação e quantificação de apenas interações trans sem a necessidade de purificações de proteínas longas ou equipamentos especializados. O ensaio de agregação celular HEK envolve a mistura de duas populações independentes de células HEK, cada uma expressando ligantes cognatos ligados à membrana. Após um curto período de incubação, as amostras são imagens e os agregados resultantes são quantificados.
Introduction
Interações sinápticas facilitadas por moléculas de adesão sináptica são fundamentais para o desenvolvimento, organização, especificação, manutenção e função das sinapses e da geração de redes neurais. A identificação dessas moléculas de adesão celular transsináptica está aumentando rapidamente; assim, é fundamentalmente importante identificar parceiros vinculantes e entender como essas novas moléculas de adesão interagem entre si. Além disso, o sequenciamento do genoma identificou mutações em muitas dessas moléculas de adesão que estão comumente ligadas a uma infinidade de distúrbios neurodesenvolvimentos, neuropsiquiátricos e de dependência1. Mutações em genes que codificam moléculas de adesão celular sináptica podem alterar prejudicialmente interações trans e podem contribuir para alterações fiofoficológicas na formação e ou manutenção da sinapse.
Existem ensaios múltiplos para avaliar quantitativamente interações proteína-proteína, como calrómetria isotérmica, dicromaísmo circular, ressonância de plasmon superficial2 e, embora quantitativa na natureza, eles têm várias limitações. Primeiro, eles requerem proteína recombinante, às vezes exigindo passos longos e tediosos de purificação. Em segundo lugar, exigem equipamentos especializados sofisticados e conhecimentos técnicos. Em terceiro lugar, eles podem superestimar a extensão da ligação, pois permitem interações cis e trans entre proteínas que são naturalmente amarradas a uma membrana in vivo. Aqui propomos um ensaio simples e relativamente rápido que testa exclusivamente interações trans.
Para contornar muitas das complicações associadas a ensaios proteicos purificados, otimizamos um ensaio de interação proteica baseado em células que recapitula interações trans em um sistema celular heterologos reduzido. Este ensaio tem sido usado anteriormente de várias formas para estudar interações transcelulares. Nesta abordagem, moléculas de adesão celular candidatas são transfectadas em células HEK293T. Em condições fisiológicas, as células HEK293T não apresentam auto-agregação, tornando-as modelos exemplares para este ensaio. No entanto, quando populações individuais de células HEK expressando receptor e ligante são combinadas, a ligação do receptor e do ligante força a agregação de células HEK a ocorrer. Esta agregação é mediada exclusivamente por interações trans e geralmente é observável em dezenas de minutos. Não são necessárias etapas de purificação de proteínas neste método, e a eficiência do método baseia-se no paradigma de que populações de células HEK expressando moléculas de adesão cogna estão sendo combinadas e, em seguida, imagens apenas dezenas de minutos depois. Além disso, este método é relativamente barato, pois nem anticorpos nem equipamentos caros são necessários. O único equipamento necessário para a aquisição de dados é um microscópio fluorescente padrão. Uma vantagem adicional para este ensaio baseado em células é a capacidade de rastrear rapidamente o efeito de mutações de pontos relevantes da doença nas interações trans. Isso pode ser realizado transfecando células HEK com cDNAs das variantes mutantes da proteína de interesse.
Neste protocolo, apresentamos um exemplo no qual investigamos se uma mutação missense em Neurexin3α (Neurexin3αA687T), identificada em um paciente diagnosticado com profunda deficiência intelectual e epilepsia, altera interações em trans com proteína trans trans reito transmembrana 2 (LRRTM2). Neurexin3α é um membro da família evolutivamente conservada de moléculas de adesão celular pré-sináptica e, embora o trabalho recente tenha identificado múltiplos papéis na sinapse3,4,5,6,7, nossa compreensão sináptica desta molécula e todos os membros da família neurexina permanecem incompletos. LRRTM2 é uma proteína de adesão celular pós-sináptica excitatória que participa da formação e manutenção da sinapse8,9,10. É importante ressaltar que o LRRTM2 interage exclusivamente com isoformas de neurexina que não possuem o local da emenda 4 exon alternativo (SS4-), mas não com isoformes de neurexina contendo o local da emenda 4 exon alternativo (SS4+). A mutação missense humana (A687T) identificada em Neurexin3α está localizada em uma região extracelular não estudada que é evolutivamente conservada e é conservada entre todas as neurexinas alfa7. Como a interação entre essas duas moléculas foi estabelecida8,9,11, colocamos a questão: a capacidade de ligação de Neurexin3α SS4- para LRRTM2 é alterada por uma mutação de ponto A687T? Este ensaio revelou que a mutação de ponto A687T aumentou inesperadamente a agregação de Neurexin3α para LRRTM2 sugerindo que a região extracelular em que a mutação de ponto está localizada, desempenha um papel na mediação de interações transsinápticas.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Cultura celular e transfecção
- Faça mídia celular HEK com DMEM, 1x (Modificação do Meio da Águia) de Dulbecco com glicose de 4,5 g/L, l-glutamina & piruato de sódio e 10% FBS. Filtro estéril.
- Ligantes e receptores adequados para agregação de pré-determinantes e receptores para ensaio de agregação.
NOTA: Neurexin3α SS4+/- e um de seus ligantes conhecidos, LRRTM2, foram utilizados neste estudo. Ligantes e receptores de interesse foram expressos a partir de cDNAs em pcDNA3.1. Um conjunto Gibson foi usado para inserir Neurexin3α no pcDNA3.112. Neurexin3α F/R: TTTAAACTTAAGCTTGGTACCGAGCTCGGATCCGCCACCATGAGCTTTACCCTCCCTACTC/
GAGCGGCCGCCCCGTGCTGGATATCTGCAGAATTCTTACACATAATACTCCTTGTCCTT. - Prepare células HEK293T.
- Cresça células HEK293T para confluência em um frasco T-75.
- Uma vez confluente, use 2 mL de trippsina e coloque em incubadora de 37 °C por 2 min. Adicione 6 mL de mídia HEK ao frasco para resuspend células e transfira todos os 8 mL para um tubo cônico de 15 mL.
- Pelota a 500 x g por 5 min e resuspend na mídia de células HEK para um total de 8 mL.
- Conte células e adicione 735.000 células em cada poço de uma placa de 6 poços. Ajuste o volume final para 2 mL para cada poço usando mídia de célula HEK.
- Coloque na incubadora de 37 °C e permita que as células cresçam durante a noite ou até atingirem 50-60% de confluência.
- Células HEK293T transfectas utilizando o método fosfato de cálcio13.
- Transfetar bem-1 com 3 μg da proteína de interesse e co-transfeto com 1 μg de proteína fluorescente (3 μg de pcDNA3.1-Neurexin3αWT SS4- e 1 μg de mCherry).
- Transfect well-2 como na etapa 1.4.1. mas com a proteína mutante de interesse (pcDNA3.1-Neurexin3αA687T SS4-).
- Transfect well-3 com 3 μg do ligante de interesse e co-transfeito com 1 μg de outra proteína fluorescente (3 μg de pcDNA3.1 LRRTM2 e 1 μg de GFP).
- Transfect well-4 e well-5 para servir como controles negativos: bem-4 com 1 μg de GFP e bem-5 com 1 μg de mCherry.
- Prepare outra placa (como na etapa 1.4.1-1.4.4) se exigir condições ou controles adicionais (Neurexin3αWT/A687T SS4+).
NOTA: A eficiência da transfecção é analisada 24 h após a transfecção sob um microscópio de epifluorescência e quantificada como o número de células expressando a proteína fluorescente com a qual foram transfecidas. Uma abordagem mais simplificada incluiria a transfecção de células HEK com uma codificação vetorial bicistrônica para uma proteína fluorescente e o ligante de interesse e é altamente recomendado acima da co-transfecção. No caso deste estudo, as neurexinas alfa são ~4,3 kb e a baixa intensidade de fluorescência foi observada usando um sistema bicistronic que necessita de co-transfecção.
- 48 horas após a transfecção, colhe células para agregação.
- Lave cada poço duas vezes com PBS.
- Adicione 1 mL de 10 mM EDTA em PBS em cada poço para dissociar suavemente as interações célula-célula e incubar a placa a 37 °C por 5 minutos.
NOTA: A trippsina não é recomendada para a etapa 1.5.2 devido ao potencial decote proteolítico de moléculas de adesão em estudo. Além disso, após a adição de EDTA, o protocolo pode não ser interrompido até a conclusão, pois as células serão agora expostas a condições ambientais. - Bata suavemente a placa para desprender as células e colher cada poço em tubos cônicos separados de 15 mL.
- Centrífuga tubos cônicos a 500 x g e temperatura ambiente por 5 min.
- Enquanto as células estão pelotando, prepare 6 tubos de incubação rotulando a parte superior de cada tubo de microcentrifuuagem com cada condição.
NOTA: Cada permutação das condições de GFP e mCherry deve ser usada para abranger todas as condições experimentais e controles adequados. Por exemplo: 1. GFP/mCherry, 2. mCherry/LRRTM2-GFP 3. GFP/Neurexin3αWT SS4-- mCherry, 4. GFP/Neurexin3αA687T SS4- –mCherry, 5. Neurexin3αWT SS4-— mCherry/LRRTM2 — GFP, 6. Neurexin3αA687T SS4- –mCherry/LRRTM2-GFP. Faça tubos adicionais para acomodar outras condições e controles. - Remova as células supernascidas e resuspend em 500 μL de mídia HEK com 10 mM CaCl2 e 10 mM MgCl2 aquecidos a 37 °C.
NOTA: A adição de CaCl2 e MgCl2 permite que moléculas de adesão restabeleçam a vinculação e só é necessária se os parceiros de interação transcelular em questão exigirem cáções divalentes para adesão. - Conte as células em cada tubo cônico de 15 mL usando um hemocitômetro e alíquota de 200.000 células de cada condição em tubo apropriado a partir da etapa 1.6.1 para uma mistura de 1:1 em um volume total de 500 μL.
NOTA: Deve levar apenas 5 minutos por condição para contar e parcelar valores. - Incubar tubos à temperatura ambiente em um rotador de tubo lento.
2. Aquisição de imagens
- Otimize parâmetros de aquisição de microscópio para amostras específicas. Neste exemplo, as imagens foram tiradas em um microscópio de campo largo. Use um objetivo de ar 5x (NA: 0,15; WD: 20000 μm) para obter um campo grande o suficiente para análise.
- Avalie a agregação da linha de base imediatamente após misturar as duas condições das células HEK na etapa 1.8. Estas são agora as imagens do "tempo zero".
- Pipeta 40 μL de cada mistura de amostra em um slide de microscópio carregado e imagem sob fluorescência nos canais 488 e 561.
- Adquira três diferentes campos de visão em um plano focal por gota de amostra.
- Adquira imagens finais a 60 min como a imagem do "tempo 60".
- Para obter a imagem 'time 60' da mistura após uma incubação de 60 minutos, pegue outra amostra de 40 μL de cada condição a partir de tubos rotativos e pipeta cada amostra em um slide carregado. Imagem como na etapa 2.2.2.
NOTA: A agregação celular deve ser verificada a cada 15 minutos até que ocorra a saturação. O tempo de agregação dependerá das proteínas que estão sendo testadas.
- Para obter a imagem 'time 60' da mistura após uma incubação de 60 minutos, pegue outra amostra de 40 μL de cada condição a partir de tubos rotativos e pipeta cada amostra em um slide carregado. Imagem como na etapa 2.2.2.
3. Análise ImageJ/Fiji
- Para quantificar a extensão da agregação usando Fiji/ImageJ, salve arquivos de análise.
- Salve os arquivos de codificação suplementar fornecidos na pasta de macros imageJ no computador.
- Instale a macro de agregação fornecida (Plugins, Macros, Install e selecione o arquivo "AgregaçãoSsay.txt").
- Determine limiares.
- Carregue um arquivo de .tif 'time zero' em imageJ e divida os canais (Imagem | | de cor Canais Divididos).
NOTA: A imagem 'time zero' é usada para determinar o limiar e o menor tamanho de puncta para todo o experimento. - Mascarar cada canal(Plugins | Macros | AggregationAssay_MakeMask). A janela Make Mask From Image será exibida. Verifique as caixas ao lado de Determine Threshold for Image e Determine Cluster Params from Histogram e clique em OK.
- Determine o limiar da imagem usando a barra de slides, grave o número à direita da barra de slides e clique em OK.
- Um Histograma do Tamanho do Cluster aparecerá. Selecione um tamanho de cluster do histograma que se adapte ao experimento, digite este número no Tamanho do Cluster Min: caixa e clique em OK. Clusters abaixo deste tamanho não serão analisados.
- Carregue um arquivo de .tif 'time zero' em imageJ e divida os canais (Imagem | | de cor Canais Divididos).
- Analise a análise.
- Abra a imagem 'time 60' da condição 1 na imagemJ e divida os canais como na etapa 3.2.1.
- Mascarar cada canal (Plugins, Macros, AggregationAssay_MakeMask). Use o mesmo limiar e tamanho determinados na etapa 3.2.3 e na etapa 3.2.4. Desmarque as caixas ao lado de Determine Threshold for Image e Determine Cluster Params do Histograma e digite manualmente o tamanho e os limiares nos campos apropriados e clique em OK.
- Calcular o índice de agregação (Plugins | Macros | AggregationAssay_CalculateOverlap). Selecione os canais mascarados a serem comparados e o diretório no qual os arquivos resultantes serão salvos.
- Repita as etapas 3.3.1-3.3.3 para cada imagem 'time 60' em cada condição.
NOTA: O índice de agregação é definido como a área de sobreposição total dividida pela soma das duas áreas de canal menos a área de sobreposição multiplicada por 100 (Índice de agregação = área de sobreposição/[área do canal 1 + área do canal 2 – área de sobreposição] x 100). Esta normalização é uma operação 'OR' entre os dois canais mascarados representando os pixels totais em qualquer máscara.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
A mutação A687T aumenta a ligação Neurexin3α SS4 ao LRRTM27
Para investigar como as interações intercelulares de duas proteínas sinápticas conhecidas são afetadas pela introdução de uma mutação pontual encontrada em um paciente com deficiência intelectual e epilepsia, utilizamos o ensaio de agregação celular HEK acima(Figura 1). As células foram transfeinadas de acordo com a seção 1 e preparadas para imagens de acordo com as seções 1 e 2 do protocolo. As células foram imagens na linha de base onde nenhuma agregação foi observada como esperado (não mostrada). As imagens adquiridas em 60 minutos foram analisadas como na seção 3 do protocolo. Para minimizar o viés de seleção, as condições foram aleatórias para cegar o experimentador. Por razões semelhantes, todo o campo de visão de cada imagem foi selecionado como um ROI.
As condições em que as células não expressavam ligantes sinápticos (GFP/mCherry) apresentaram agregação mínima após uma incubação de 60 minutos(Figura 2). Igualmente, condições em que apenas uma das duas populações de células expressava ligantes sinápticos (mCherry/LRRTM2-GFP ou GFP/Neurexin3αWT/A687T SS4- —mCherry) exibiam agregação mínima após uma incubação de 60 min(Figura 2). Como esperado, as condições que continham duas populações de células com moléculas de aderências incompatíveis (Neurexin3αWT/A687T SS4+—mCherry/LRRTM2-GFP) não apresentaram agregação em 60 minutos(Figura 2B). Essas condições serviram como controles negativos críticos, pois o LRRTM2 é conhecido por vincular-se exclusivamente ao SS4 carece de isoforms (SS4-) de Neurexins e destaca a especificidade deste ensaio de agregação.
Condições com moléculas de adesão compatíveis8,9,10 (Neurexin3αWT SS4- —mCherry/LRRTM2-GFP) apresentaram agregação significativa após uma incubação de 60 min(Figura 2C). A agregação pode ser visualizada como amarela e está presente na sobreposição entre as células(Figura 1 e Figura 2). Surpreendentemente, a condição em que Neurexin3α A687T SS4- foi co-incubada com LRRTM2 (Neurexin3αA687T SS4- —mCherry/LRRTM2-GFP) exibiu significativamente mais agregação em comparação com sua contraparte do tipo selvagem (Neurexin3αWT SS4- —mCherry/LRRTM2-GFP). Isso sugere que a mutação de ponto A687T em Neurexin3α aumenta as capacidades de ligação de Neurexin3α SS4- para LRRTM2.
Figura 1. Fluxo de trabalho de ensaio de agregação. ( A )Ascélulas HEK293T são transfeinadas usando uma proteína-1/mCherry, ou uma proteína-2/GFP. (B) Expressão de Neurexin3α leva 48 h. (C) As células são colhidas usando 10 mM EDTA e depois pelotas(D). (E) As células são misturadas em uma proporção de 1:1 e resuspended em 500 μL de mídia HEK contendo 10 mM CaCl2 e MgCl2. (F) As células são incubadas à temperatura ambiente até que ocorra a agregação e uma imagem final seja adquirida no 'tempo 60'. A agregação é visualizada como o número de puncta amarela visível no campo de visão. Nenhuma agregação é observada quando as células não estão expressando os pares de ligantes receptores corretos e são, portanto, vistas como puncta vermelha ou verde individual. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Neurexin3αA687T SS4- tem agregação aprimorada com ligante excitatório LRRTM2 em comparação com Neurexin3αWT SS4-. (A) Imagens representativas de controles negativos após uma incubação de 60 min de mCherry com GFP, mCherry com LRRTM2, GFP com Neurexin3αWT SS4+/-, e GFP com Neurexin3αA687T SS4+/-. A agregação foi observada após 60 minutos em ambos LRRTM2 com Neurexin3αWT SS4-, e LRRTM2 com Neurexin3αA687T SS4-. (B) Quantificação do índice de agregação em todas as condições SS4+ após 60 minutos. Índice de agregação = área de sobreposição/(área do canal 1 + área do canal 2 – área de sobreposição) x 100. (C) Mesmo que(B) mas SS4-. Os dados apresentados representam a média ± SEM do número de experimentos (SEM: GFP/mCherry ± 0,0245, mCherry/LRRTM2 ± 0,02465, GFP/Neurexin3αWT SS4- ± 0,02453, GFP/Neurexin3αA687T SS4- ± 0,0109, Neurexin3αWT SS4-/LRRTM2 ± 0,0538, Neurexin3αA687T SS4-/LRRTM2 ± 0,0174; p= 0,0136). Os números apresentados nos bares representam o número de experimentos independentes realizados. As linhas pontilhadas representam a linha de base ou agregação mínima média das condições de controle. A significância estatística foi determinada por ANOVA unidirecional, múltiplas comparações; *p<0.05; p<0.0001.Este valor foi modificado a partir de Restrepo et al.7. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Arquivos de codificação suplementar. Clique aqui para baixar esses arquivos.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dissecar as interações proteína-proteína que ocorrem em trans durante a adesão celular pode levar a uma melhor compreensão dos mecanismos moleculares subjacentes aos processos celulares básicos, incluindo a formação, função e manutenção de sinapses durante a maturação e remodelação. As implicações das interações célula-célula se expandem além da neurobiologia e têm papéis mais amplos na transdução de sinais, migração celular e desenvolvimento de tecidos14. Aberrações na adesão celular podem interromper processos celulares imperativos para a função celular adequada e podem subjacente a uma variedade de etiologias como câncer, artrite, vício, autismo e esquizofrenia1,15,16. Aqui, fornecemos um protocolo detalhado otimizado envolvendo a agregação celular HEK que permite testar interações de adesão celular em trans.
Com este protocolo de agregação celular HEK, podemos dissecar diferenças na agregação à capacidade de ligação aproximada entre uma proteína pré-sináptica e seu ligante pós-sináptico. Como tal, podemos fazer perguntas como: a interação entre duas proteínas sinápticas essenciais é afetada por uma mutação de ponto? Mais especificamente, a interação trans de Neurexin3α com LRRTM2 é afetada pelo A687T? A mutação missense A687T estudada aqui está localizada em uma região de linker não estudada anteriormente do domínio extracelular de Neurexin3α7. Os resultados ilustram que a mutação A687T aumenta a agregação de células contendo Neurexin3αA687T para células que contêm LRRTM2 (Figura 2C). Este achado é significativo porque foi demonstrado anteriormente que os LRRTMs só se ligam a Neurexins através de um domínio neurexin chamado LNS617, e sugere ainda que sequências a montante do LNS6 podem exercer um efeito independente sobre as interações trans entre Neurexin3α SS4- e LRRTM27.
Os resultados da Figura 2 exibem a especificidade deste ensaio como todos os controles negativos (GFP/mCherry; Neurexin3αWT/A687T SS4- —mCherry/GFP ou LRRTM-GFP/mCherry) não teve agregação observável após 60 minutos. Um controle crítico usado neste estudo, Neurexin3αWT/A687T SS4+ —mCherry/LRRTM-GFP, também não apresentou agregação após 60 min porque o LRRTM2 é conhecido por se ligar exclusivamente aos isoforms SS4 carecendo (SS4-) de Neurexin. Este controle demonstra que a simples superexpressão de moléculas ligadas à membrana é insuficiente para forçar a agregação neste sistema, o que ilustra ainda mais a especificidade deste ensaio.
O ensaio de adesão celular descrito aqui tem sido amplamente utilizado para testar as interações das moléculas transsinápticas de adesão celular8,18,19; no entanto, pode ser usado para testar interações adesivas célula-célula de proteínas tethered membrana. Este protocolo, que evoluiu ao longo do tempo, foi otimizado a partir do protocolo publicado original e das variações subsequentes do protocolo, alterando três parâmetros experimentais. Primeiro, a temperatura de incubação das células foi alterada. O protocolo original exige a incubação de células na etapa 1.9 a 4 °C. Essa baixa temperatura pode atuar como um estressor ambiental e pode diminuir a viabilidade celular levando à morte celular e à lise celular. Durante a lise celular, as células secretam DNA genômico e detritos celulares na mídia que faz com que as células se desprestrem em soluções que levam a falsos positivos durante a imagem. Segundo, o número de células por condição foi aumentado para 200.000 por população e o tamanho objetivo foi alterado para 5x; isso permite ao pesquisador visualizar um maior número de interações por campo de visão, a fim de aumentar o poder estatístico dentro de cada n. Três, o índice de agregação foi medido de forma diferente. Os índices de agregação anteriores foram limitados pela seleção do tamanho do cluster pelo experimentador que levou à exclusão de clusters "subtenente". Em contraste, os limiares são agora definidos para o tamanho individual da célula no 'tempo zero', e a agregação agora é calculada como a área sobreposta dividida pela soma das duas áreas de canal menos a área de sobreposição multiplicada por 100 no 'tempo 60' que permite a inclusão de clusters positivos menores tornando o ensaio mais sensível a outros pares de proteína-ligantes(Figura 2B,C).
A solução de problemas e a otimização podem ser necessárias dependendo das proteínas interativas testadas. Embora o período de incubação até a aquisição final de imagens difere dependendo das proteínas testadas, é fundamental que nenhuma agregação seja observada no 'tempo zero'. Se a agregação é vista no momento zero, pode implicar que as células não eram saudáveis para começar. Isso pode ser devido a vários fatores, incluindo exposição súbita a temperaturas abaixo de 37 °C ou procedimento experimental lento. É importante ressaltar que a mídia de resuspensão para a etapa 1.7 deve ser de 37 °C, o que permitirá que as células atinjam gradualmente a temperatura ambiente sem uma queda brusca repentina da temperatura. Uma maneira de ter a saúde celular ideal durante todo o experimento é garantir que as etapas 1.7 a 1.9 sejam concluídas dentro de um prazo de 25 minutos sem intervalos entre si. Recomenda-se que o microscópio esteja configurado e pronto para uso antes das células de colheita celular na etapa 1.5; isso garante que uma imagem verdadeira de "tempo zero" possa ser tomada imediatamente na etapa 2.2.
Se a agregação não for observada após 60 minutos de incubação, vários fatores podem estar contribuindo para essa falta de adesão. Em primeiro lugar, as proteínas em questão podem não ser parceiros vinculantes ou podem se envolver em interações de baixa afinidade não detectáveis por este ensaio. Neste caso, um ensaio mais sensível pode ser necessário. Em segundo lugar, as proteínas de interesse podem não se localizar para a membrana quando expressas sozinhas nas células HEK. Neste caso, confirme que a proteína é localizada por meio de técnicas bioquímicas (biotintilação superficial) ou marque diretamente a proteína de interesse com uma etiqueta fluorescente e células HEK293T em 40x ou maior ampliação para avaliar a expressão superficial. No entanto, após a confirmação da localização da membrana, recomendamos o uso de variantes não-grampeadas para este ensaio de agregação de células HEK, a fim de avaliar com mais precisão a capacidade de ligação da proteína nativa. Em terceiro lugar, neste protocolo permitimos que Neurexin3α se expressasse por 48 h; no entanto, o tempo de expressão proteica pode variar dependendo das proteínas testadas. Em quarto lugar, é fundamental complementar a mídia na etapa 1.7 com MgCl2 e CaCl2 se as proteínas em questão dependerem de cára divalent, como é o caso do exemplo de Neurexins e LRRTM211. Se não se sabe se os parceiros de interação requerem cations divalent para adesão, adicione EDTA em uma condição. O EDTA deve quelatar cations de reminação naturalmente presentes no DMEM garantindo uma solução livre de cálcio e magnésio. Se a adesão for observada após a adição de EDTA, as proteínas em questão não requerem cations divalent para adesão.
Existem muitos métodos para testar interações proteicas; no entanto, a maioria não é específica para testar apenas interações trans que ocorrem de célula para célula e requerem passos tediosos de purificação de proteínas. Embora o ensaio de agregação celular HEK não seja uma medida direta de afinidade e não deva ser usado para substituir uma abordagem mais quantitativa para recuperar as constantes de dissociação, pelo que sabemos, este ensaio representa uma abordagem para testar interações trans verdadeiras de forma semi-quantitativa e relativamente eficiente. Além disso, devido à relativa facilidade deste ensaio, o ensaio de agregação celular HEK pode ser usado em conjunto com essas abordagens mais quantitativas para obter uma caracterização mais ampla e completa das interações que ocorrem.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado por Subsídios do Instituto Nacional de Saúde Mental (R00MH103531 e R01MH116901 a J.A.), bolsa de formação pré-doutorado do Instituto Nacional de Medicina Geral (T32GM007635 a S.R.), e uma Bolsa Lyda Hill Gilliam para Estudos Avançados (GT11021 a S.R.). Agradecemos ao Dr. Kevin Woolfrey pela ajuda com o microscópio, Dr. K Ulrich Bayer pelo uso de seu microscópio epifluorescente, e Thomas Südhof (Universidade de Stanford) para o plasmídeo LRRTM2.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL disposable microtubes with snap caps | VWR | 89000-028 | Incubation of mixed population of HEK cells |
| 1000 mL Rapid—Flow Filter Unit, 0.2 um aPES membrane | Thermo Fisher | 567-0020 | Sterilization of HEK media |
| 15 mL SpectraTube centrifuge tubes | Ward’s Science | 470224-998 | Harvesting HEK cells |
| 6 well sterile tissue culture plates | VWR | 100062-892 | culturing HEK cells |
| Calcium Chloride | Sigma | 223506-500G | Calcium phosphate transfection, HEK cell resuspension |
| Centrifuge- Sorvall Legend RT | Kendro Laboratory Products | 75004377 | Harvesting HEK cells |
| CO2 cell incubator | Thermo Scientific | HERACELL 150i | Incubation of HEK cells during growth |
| DMEM, 1x (Dulbecco's Modification of Eagle's Medium) with 4.5 g/L glucose, L-glutamine & sodium pyruvate | Corning | 10-013-CV | HEK cell maintenance |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline PBS (1X) | Gibco | 14190-144 | Passaging/harvesting HEK cell |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma | ED-500G | Harvesting HEK cells |
| Falcon Vented culture flasks, 75cm2 growth area | Corning | 9381M26 | Culturing HEK cells |
| Fetal Bovine Serum | Sigma | 17L184 | HEK cell maintenance |
| HEK293T cells | ATCC | Model system | |
| ImageJ | NIH | V: 2.0.0-rc-69/1.52p | Image analysis |
| Magnesium Chloride hexahydrate | Sigma | M9272-500G | HEK cell resuspension |
| Sodium phosphate dibasic anhydrous | Fisher BioReagents | BP332-500 | Calcium phosphate transfection |
| Trypsin 0.25% (1X) Solution | GE Healthcare Life Sciences | SH30042.01 | Passaging HEK cells |
| Tube rotator | Incubation of mixed population of HEK cells | ||
| UltraClear Microscope slides. White Frosted, Positive Charged | Denville Scientific Inc. | M1021 | Image acquisition |
| Wide-field microscope | Zeiss | Axio Vert 200M | Image acquisition |
References
- Südhof, T. C. Neuroligins and neurexins link synaptic function to cognitive disease. Nature. 455 (7215), 903-911 (2008).
- Lakey, J. H., Raggett, E. M.
- Aoto, J., Martinelli, D. C., Malenka, R. C., Tabuchi, K., Südhof, T. C. Presynaptic neurexin-3 alternative splicing trans-synaptically controls postsynaptic AMPA receptor trafficking. Cell. 154 (1), 75-88 (2013).
- Aoto, J., Földy, C., Ilcus, S. M. C., Tabuchi, K., Südhof, T. C. Distinct circuit-dependent functions of presynaptic neurexin-3 at GABAergic and glutamatergic synapses. Nature Neuroscience. 18 (7), 997-1007 (2015).
- Südhof, T. C. Synaptic Neurexin Complexes: A Molecular Code for the Logic of Neural Circuits. Cell. 171 (4), 745-769 (2017).
- Dai, J., Aoto, J., Südhof, T. C. Alternative Splicing of Presynaptic Neurexins Differentially Controls Postsynaptic NMDA and AMPA Receptor Responses. Neuron. 102 (5), 993-1008 (2019).
- Restrepo, S., Langer, N. J., Nelson, K. A., Aoto, J. Modeling a Neurexin-3α Human Mutation in Mouse Neurons Identifies a Novel Role in the Regulation of Transsynaptic Signaling and Neurotransmitter Release at Excitatory Synapses. The Journal of Neuroscience. 39 (46), 9065-9082 (2019).
- Ko, J., Fuccillo, M. V., Malenka, R. C., Südhof, T. C. LRRTM2 Functions as a Neurexin Ligand in Promoting Excitatory Synapse Formation. Neuron. 64 (6), 791-798 (2009).
- de Wit, J., et al. LRRTM2 Interacts with Neurexin1 and Regulates Excitatory Synapse Formation. Neuron. 64 (6), 799-806 (2009).
- Linhoff, M. W., et al. An Unbiased Expression Screen for Synaptogenic Proteins Identifies the LRRTM Protein Family as Synaptic Organizers. Neuron. 61 (5), 734-749 (2009).
- Siddiqui, T. J., Pancaroglu, R., Kang, Y., Rooyakkers, A., Craig, A. M. LRRTMs and Neuroligins Bind Neurexins with a Differential Code to Cooperate in Glutamate Synapse Development. Journal of Neuroscience. 30 (22), 7495-7506 (2010).
- Gibson, D. G., Young, L., Chuang, R. -Y., Venter, J. C., Hutchison, C. A., Smith, H. O. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
- Bacchetti, S., Graham, F. L. Transfer of the gene for thymidine kinase to thymidine kinase-deficient human cells by purified herpes simplex viral DNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (4), 1590-1594 (1977).
- Cerchiari, A. E., et al. A strategy for tissue self-organization that is robust to cellular heterogeneity and plasticity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (7), 2287-2292 (2015).
- Burdick, M. M., McCarty, O. J. T., Jadhav, S., Konstantopoulos, K. Cell-cell interactions in inflammation and cancer metastasis. IEEE Engineering in Medicine and Biology Magazine. 20 (3), 86-91 (2001).
- Fox, D. A., Gizinski, A., Morgan, R., Lundy, S. K. Cell-cell interactions in rheumatoid arthritis synovium. Rheumatic Diseases Clinics of North America. 36 (2), 311-323 (2010).
- Yamagata, A., et al. Structural insights into modulation and selectivity of transsynaptic neurexin-LRRTM interaction. Nature Communications. 9 (1), 3964 (2018).
- Nguyen, T., Südhof, T. C. Binding properties of neuroligin 1 and neurexin 1beta reveal function as heterophilic cell adhesion molecules. The Journal of Biological Chemistry. 272 (41), 26032-26039 (1997).
- Boucard, A. A., Ko, J., Südhof, T. C. High Affinity Neurexin Binding to Cell Adhesion G-protein-coupled Receptor CIRL1/Latrophilin-1 Produces an Intercellular Adhesion Complex. Journal of Biological Chemistry. 287 (12), 9399-9413 (2012).
