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Neuroscience

एक्सोन प्रारंभिक खंडों की असेंबली का अध्ययन करने के लिए प्राथमिक संस्कारित हिप्पोकैम्पल न्यूरॉन्स का उपयोग

Published: February 12, 2021 doi: 10.3791/61411
Automatic Translation
1,2,3, 2,3
1School of Basic Medical Sciences, Xi'an Jiaotong University, 2Department of Cell Biology, Duke University, 3Department of Biochemistry, Duke University

Summary

यहां, हमने हिप्पोकैम्पस न्यूरॉन्स के एक्सॉन प्रारंभिक खंडों (एआईएस) की असेंबली और संरचना का मात्रात्मक रूप से अध्ययन करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन किया है जिसमें एक विशाल एंकिरिन-जी की अनुपस्थिति के कारण पूर्व-इकट्ठे एआईएस की कमी है।

Abstract

न्यूरोनल एक्सॉन प्रारंभिक खंड (एआईएस) कार्रवाई क्षमता की शुरुआत की साइटें हैं और उनकी आणविक संरचना, असेंबली और गतिविधि पर निर्भर प्लास्टिसिटी के लिए बड़े पैमाने पर अध्ययन किया गया है। विशाल ankyrin-जी, AIS के मास्टर आयोजक, झिल्ली फैले वोल्टेज gated सोडियम (VSVG) और पोटेशियम चैनलों (KCNQ2/3), साथ ही साथ १८६ केडीए न्यूरोफैसिन, एक L1CAM सेल आसंजन अणु के साथ सीधे सहयोगियों । विशालकाय एंकिरिन-जी बीटा-4-स्पेक्ट्रिन, और माइक्रोट्यूबुले-बाइंडिंग प्रोटीन, ईबी 1/ईबी3 और Ndel1 सहित साइटोप्लाज्मिक एआईएस अणुओं को भी बांधता है और भर्ती करता है। विशालकाय एंकिरिन-जी एंकिरिन-जी की कमी न्यूरॉन्स में एआईएस गठन को बचाने के लिए पर्याप्त है। एंकिरिन-जी में एआईएस के बजाय डेंड्रिटिक कताई में स्थित एक छोटा 1 9 0 केडीए आइसोफॉर्म भी शामिल है, जो एआईएस को लक्षित करने या एआईएस को एंकिरिन-जी-कमी न्यूरॉन्स में एआईएस को बचाने में असमर्थ है। यहां, हमने ANK3-E22/23-flox चूहों से सुसंस्कृत हिप्पोकैम्पल न्यूरॉन्स का उपयोग करके एक प्रोटोकॉल का वर्णन किया, जो क्रे-बीएफपी से संक्रमित होने पर एंकिरिन-जी के सभी आइसोफॉर्म का नुकसान होता है और एआईएस के गठन को ख़राब करता है। एक संशोधित बैंकर ग्लिया/न्यूरॉन सह-संस्कृति प्रणाली को संयुक्त करते हुए, हमने 480 केडीए एंकिरिन-जी-जी-जीएफपी प्लाज्मिड के साथ एंकिरिन-जी नल न्यूरॉन्स को ट्रांसफेक्ट करने के लिए एक विधि विकसित की है, जो एआईएस के गठन को बचाने के लिए पर्याप्त है। हम हिप्पोकैम्पल न्यूरॉन संस्कृतियों में होने वाले न्यूरोनल सेल निकायों से एआईएस दूरी में भिन्नता से निपटने के लिए साल्जर और सहयोगियों द्वारा विकसित एक मात्राकरण विधि को नियोजित करते हैं। यह प्रोटोकॉल डी नोवो असेंबली और एआईएस के गतिशील व्यवहार के मात्रात्मक अध्ययन की अनुमति देता है।

Introduction

अक्षतंश प्रारंभिक खंड सबसे कशेरुकी न्यूरॉन्स में समीपस्थ अक्षांश पर स्थित है। कार्यात्मक रूप से, एआईएस वह जगह है जहां इस क्षेत्र में वोल्टेज-गेटेड सोडियम चैनलों के उच्च घनत्व के कारण कार्रवाई क्षमता शुरू की जाती है। कुछ उत्तेजक न्यूरॉन्स के एआईएस को भी गैबर्जिक सिनेप्स 1 , 2,3बनाने के माध्यम से निरोधात्मक इंटरन्यूरॉन्स द्वारा लक्षित कियाजाताहै । इसलिए, एआईएस सेल सिग्नलिंग को एकीकृत करने और न्यूरॉन्स की उत्तेजना को संशोधित करने के लिए एक महत्वपूर्ण साइट है। एआईएस आम तौर पर लंबाई में 20-60 माइक्रोन है और कोशिका शरीर के 20 माइक्रोन के भीतर स्थित है। एआईएस की लंबाई और स्थिति मस्तिष्क क्षेत्रों में न्यूरॉन्स में भिन्न होती है, साथ ही एक ही न्यूरॉन4,5के विभिन्न विकासात्मक चरणों में भी भिन्न होती है। संचित साक्ष्यों से यह पता चला कि न्यूरोनल गतिविधि 4,5,6,7के परिवर्तन का जवाब देने में एआईएस की संरचना और स्थिति गतिशील है ।

480 केडीए ेंकिरिन-जी एआईएस के मास्टर ऑर्गनाइजर हैं। 480 केडीए एंकिरिन-जी एक झिल्ली से जुड़े एडाप्टर प्रोटीन है जो सीधे वोल्टेज गेटेड सोडियम चैनलों के साथ-साथ बीटा 4-स्पेक्ट्रिन, केसीएनक्यू 2/3 चैनलों सहित अन्य प्रमुख एआईएस प्रोटीन को बांधता है जो सोडियम चैनल गतिविधि8,9और186 केडीए न्यूरोफासिन को मिलाते हैं, एक एल1कैम जो गैबेर्गिक सिंपस को ए2,100को निर्देशित करता है। 480 केडीए एंकिरिन-जी शेयर कम 190 केडीए एंकिरिन-जी आइसोफॉर्म (एएनके रिपीट्स, स्पेक्ट्रिन बाइंडिंग डोमेन, रेग्युलेटरी डोमेन) में पाए जाने वाले कैनोलॉजिकल एंकिरिन डोमेन, लेकिन एक विशालकाय एक्सोन द्वारा प्रतिष्ठित किए जाते हैं जो केवल कशेरुकी में पाया जाता है और विशेष रूप से न्यूरॉन्स में व्यक्त किया जाता है(चित्रा 1A)11,12। एआईएस गठन12के लिए 480 केडीए एंकिरिन-जी न्यूरॉन विशिष्ट डोमेन (एनएसडी) की आवश्यकता है। 1 9 0 केडीए एंकिरिन-जी एआईएस असेंबली को बढ़ावा नहीं देता है या एंकिरिन-जी-नल न्यूरॉन्स12में एआईएस को लक्षित नहीं करता है। हालांकि, 190 केडीए एंकिरिन-जी एआईएस पर केंद्रित है जिसमें 480 केडीए एंकिरिन-जी12है। वाइल्डटाइप न्यूरॉन्स के पूर्व-इकट्ठे एआईएस को लक्षित करने के लिए 1 9 0 केडीए एंकिरिन-जी की यह क्षमता साहित्य में भ्रम का स्रोत रही है और एआईएस असेंबली में 480 केडीए एंकिरिन-जी के महत्वपूर्ण विशेष कार्यों की सराहना धीमी हो गई है। इसलिए, एंकिरिन-जी-नल न्यूरॉन्स में एआईएस असेंबली का अध्ययन करना महत्वपूर्ण है जिसमें पूर्व-इकट्ठे एआईएस की कमी है।

यहां, हम ANK3-E22/23-flox चूहों से सुसंस्कृत हिप्पोकैम्पल न्यूरॉन्स का उपयोग करके एआईएस की असेंबली और संरचना का अध्ययन करने के लिए एक विधि प्रस्तुत करते हैं जो एंकिरिन-जी 13(चित्रा 1B)के सभी आइसोफॉर्म को समाप्त करता है। एआईएस के इकट्ठा होने से पहले क्रे-बीएफपी निर्माण के साथ न्यूरॉन्स को ट्रांसफेक्ट करके, हमने एंकिरिन-जी-कमी वाले न्यूरॉन्स को पूरी तरह से एआईएस(चित्रा 1 बी, चित्रा 2)की कमी पैदा की। एआईएस की असेंबली को क्रे-बीएफपी प्लाज्मिड के साथ 480 केडीए एंकिरिन-जी-जीएफपी प्लाज्मिड के सह-ट्रांसफैक्शन के बाद पूरी तरह से बचाया गया है। यह विधि एक गैर-पूर्व-इकट्ठे एआईएस वातावरण में एआईएस असेंबली का अध्ययन करने का एक तरीका प्रदान करती है। हमने एंटीबायोटिक दवाओं का उपयोग किए बिना गैरी बैंकर से ग्लिया-न्यूरॉन सह-संस्कृति प्रणाली को भी संशोधित किया, जो पहले भ्रूणीय दिन 18 न्यूरॉन्स के लिए डिज़ाइन किया गया था, पोस्टनेटल माउस न्यूरॉन्स के लिए आवेदन के लिए और एआईएस14, 15की भिन्नता को सामान्य बनाने के लिए कई न्यूरॉन्स से औसत एआईएस माप के लिए एआईएस क्वांटिटेशन विधि को अनुकूलित किया।

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Protocol

नोट: प्रसवोत्तर 0 दिन ANK3-E22/23f/f चूहों से हिप्पोकैम्पल न्यूरॉन्स की यह संस्कृति विधि गैरी बैंकर की ग्लिया/न्यूरॉन सह-संस्कृति प्रणाली से अनुकूलित है । इसलिए, निष्फल उपकरणों का उपयोग करके एक साफ हुड में विच्छेदन के बाद सभी चरणों को करना महत्वपूर्ण है। इस प्रोटोकॉल में 1 महीने तक का समय लगता है। वर्कफ्लो को चित्र 3में प्रदर्शित किया गया है । प्रोटोकॉल ड्यूक विश्वविद्यालय के पशु दिशा निर्देशों का पालन करता है ।

1. कवरस्लिप और न्यूरोनल चढ़ाना व्यंजन की तैयारी

  1. संस्कृति दिवस से कम से कम एक सप्ताह पहले, कवरस्लिप रैक पर लोड कवरस्लिप और इसे नाइट्रिक एसिड (70% डब्ल्यू/डब्ल्यू) में रात भर भिगोना (दिनों के लिए बढ़ाया जा सकता है)।
  2. एक ग्लास जार में एक कम गति शेखर पर आसुत पानी के साथ नाइट्रिक एसिड का इलाज कवरस्लिप धोएं 2 बार, 1 घंटे प्रत्येक ।
  3. संतृप्त कोह में इनक्यूबेट कवर्लिप्स रातोंरात 100% इथेनॉल में भंग हो जाते हैं। कोह को इथेनॉल में तब तक जोड़ें जब तक कि यह अब भंग न हो जाए।
  4. डिस्टिल्ड पानी के साथ वॉश स्टेप दोहराएं। कुल्ला 10 मिनट के लिए एक बार 100% इथेनॉल के साथ कवर्लिप्स।
  5. रैक से एक ग्लास बीकर को कवर्लिप्स स्थानांतरित करें। एल्यूमीनियम पन्नी के साथ बीकर कवर। कवरस्लिप को स्टरलाइज करने के लिए रात भर 225 डिग्री सेल्सियस ओवन में कवरस्लिप बेक करें। (कवरस्लिप को सप्ताह के लिए बीकर में संग्रहीत किया जा सकता है)।
  6. एक पेट्री डिश में कवरलिप रखें और फिर पैरों की तरह काम करने के लिए कवरस्लिप पर 3-4 वैक्स डॉट्स लगाएं। कांच की बोतल में उबले मोम में डुबकी लगाने के लिए एक पाश्चर पिपेट का उपयोग करें। फिर बिंदी बनाने के लिए कवरस्लिप को जल्दी से टच करें। एक 60 मिमी पेट्री डिश 4 कवरस्लिप पकड़ कर सकते हैं। एक 10 मिमी पेट्री डिश ~ 10 कवरस्लिप पकड़ सकता है।
  7. संस्कृति दिवस से 2 दिन पहले, कोट कवर्लिप्स (मोम डॉट्स के साथ पक्ष) फिल्टर के साथ 1 मिलीग्राम/एमएल पॉली-एल-lysine में 0.1 एम बोरिक एसिड (पीएच 8.5) न्यूनतम 6 घंटे के लिए और पानी के साथ कुल्ला 2 बार, 1 घंटे हर बार। कवरलिप एक ही पेट्री डिश में रहते हैं।
  8. प्लेटिंग माध्यम (एमईएम ग्लूकोज 0.6% (wt/vol) और 10% (vol/vol) घोड़ा सीरम के साथ पूरक जोड़ें धीरे-धीरे कवरस्लिप को परेशान किए बिना प्लेटों में। न्यूरॉन्स को सीड करने के लिए कल्चर डे तक इनक्यूबेटर में प्लेटें लगाएं।

2. ग्लिया सेल फीडर व्यंजन तैयार करना (संस्कृति दिवस से 2 सप्ताह पहले)

  1. एक प्रसवोत्तर 1 दिन पुराने चूहों मस्तिष्क से प्रांतस्था विच्छेदन और मेनिंग से छील ।
  2. कॉर्टेक्स ऊतक को एक साफ बेंच में एक साफ पेट्री डिश में एक साफ कैंची के साथ जितना संभव हो उतना बारीक काट लें।
  3. कटे हुए ऊतक को एचबीबीएस के 12 एमएल में स्थानांतरित करें और 2.5% ट्राइपसिन और 1% (wt/vol) DNase के 1.5 एमएल जोड़ें। 15 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पानी स्नान में इनक्यूबेट, हर 5 मिनट स्विंग करें। अच्छी तरह से पचा ऊतक चिपचिपा हो जाते हैं और एक बड़ा क्लस्टर बनाते हैं। टिशू को तोड़ने और बेहतर पाचन पाने के लिए 10 एमएल पिपेट के साथ 10-15 बार ट्राइटुरेट करें।
  4. अच्छी तरह से पचा ऊतक को 5 एमएल पिपेट के साथ 10-15 बार ट्रिट करें जब तक कि अधिकांश हिस्सा गायब न हो जाए और मध्यम बादल बन जाए। शेष हिस्सा हटाने के लिए एक सेल छन्नी के माध्यम से गुजरें और पाचन को रोकने के लिए ग्लूकोज (0.6% wt/vol), 10% (vol/vol) घोड़ा सीरम और पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन (1x) के साथ पूरक ग्लिया माध्यम (न्यूनतम आवश्यक माध्यम (एमईएम) के 15 एमएल जोड़ें।
  5. 5 मिनट के लिए 120 x ग्राम पर कोशिकाओं को अपकेंद्रित्र करें और सुपरनेट को एस्पिरेट करें। सेल कल्चर डिश (लगभग 105 कोशिकाओं/सेमी2)में ताजा ग्लिया माध्यम और बीज के साथ सेल पेलेट को फिर से रीसुस्ल करें।
  6. असेकीकृत कोशिकाओं को हटाने के लिए अगले दिन ताजा ग्लिया माध्यम के साथ माध्यम की जगह ।
  7. ताजा ग्लिया माध्यम के साथ हर 3-4 दिनों में ग्लिया व्यंजन खिलाएं। माध्यम बदलने से पहले शिथिल संलग्न कोशिकाओं को उखाड़ फेंकने के लिए एक हाथ से फ्लास्क 5-10 बार थप्पड़ ।
  8. संस्कृति के 10 दिनों के बाद, ग्लिया कोशिकाओं को लगभग संकुचित होना चाहिए। 0.25% ट्राइप्सिन-ईडीटीए के साथ अलग ग्लिया कोशिकाएं और एक नए 60 मिमी सेल कल्चर डिश में बीज लगभग 105 कोशिकाएं। शेष कोशिकाओं को भविष्य के उपयोग के लिए फ्रीज किया जा सकता है ।
  9. कल्चर डे से 3 दिन पहले ग्लिया मीडियम को न्यूरोनल कल्चर मीडियम (न्यूरोबेसल-ए मीडियम विद 1x ग्लूटामैक्स-I और 1x B27 सप्लीमेंट) में बदलें।

3. संस्कृति हिप्पोकैम्पल न्यूरॉन्स

नोट: सभी कदम कमरे के तापमान पर किए जाते हैं।

  1. कमरे में शीतोष्ण में एक पेट्री डिश में HBSS माध्यम के साथ ANK3-E22/23f/f चूहों से प्रसवोत्तर 1 दिन पुराने पिल्ले से 6-8 हिप्पोकैम्पी विच्छेदन । छोटे टुकड़ों के लिए विच्छेदन कैंची के साथ हिप्पोकैम्पी काट लें। पेट्री डिश से हिप्पोकैम्पी को 15 एमएल ट्यूब में ट्रांसफर करें।
  2. ट्यूब में एचबीएसएस के 5 एमएल के साथ हिप्पोकैम्पी 2x धोएं। धोने के बाद 1x एचबीएसएस के 4.5 एमएल में हिप्पोकैम्पी छोड़ दें।
  3. एचबीएसएस के 4.5 एमल में 2.5% ट्राइपसिन का 0.5 मिलील जोड़ें और 15 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पानी स्नान में इनक्यूबेट करें। हर 5 मिनट में ट्यूब को उलटा करें। अच्छी तरह से पचा हिप्पोकैम्पी चिपचिपा हो जाना चाहिए और एक क्लस्टर के रूप में। यदि आवश्यक हो, तो पाचन को 5 मिनट तक बढ़ाएं।
  4. प्रत्येक 5 मिनट के लिए 3 बार एचबीएसएस के साथ हिप्पोकैम्पी धोएं। एचबीएस को हटाने के लिए वैक्यूम का इस्तेमाल न करें। हिप्पोकैम्पी को हटाना बहुत आसान है।
  5. धोने के बाद एचबीबीएस के 2 एमएल जोड़ें और 15 बार एक पाश्चर पिपेट के साथ हिप्पोकैम्पी को ऊपर और नीचे पिपेट करें।
  6. एक आग पॉलिश पाश्चर पिपेट (खुले का व्यास आधे से संकुचित है) 10 बार के साथ ऊतक को ट्रिट करें। 10 गुना से आगे न जाएं भले ही अभी भी हिस्सा शेष हो । ओवरशीरिंग न्यूरॉन्स को मारता है।
  7. ट्यूब को 5 मिनट तक आराम करें जब तक कि सभी हिस्सा नीचे सेट न हो जाए। धीरे-धीरे एक 1 एमएल पिपेट टिप का उपयोग करें ताकि अलग न्यूरॉन्स युक्त सुपरनैट को चढ़ाना व्यंजन (105 कोशिकाओं/60 मिमी पकवान) में स्थानांतरित किया जा सके। इसे सीधे प्री-इनक्यूबेटेड प्लेटिंग मीडियम में डालें और प्लेट को धीरे-धीरे हिलाएं।
  8. शेष हिस्सों के साथ 3.6-3.7 दोहराएं जब तक कि अधिकांश हिस्सा गायब न हो जाए।
  9. सीडिंग के 2-4 घंटे बाद, हल्के माइक्रोस्कोप से चढ़ाना व्यंजनों की जांच करें। न्यूरॉन्स के बहुमत कवरस्लिप से जुड़ा होना चाहिए था। संलग्न कोशिकाएं गोल और उज्ज्वल होती हैं। फ्लिप कवर्लिप्स एक ठीक टिप का उपयोग करके ग्लिया सेल फीडर व्यंजनों में मोम डॉट्स साइड के साथ प्रीकंडीशनल न्यूरोनल कल्चर माध्यम के साथ नीचे की ओर।
  10. न्यूरॉन्स 1 महीने तक ग्लिया सेल फीडर व्यंजनों में बढ़ सकते हैं। ताजा न्यूरोनल संस्कृति माध्यम के 1 एमएल के साथ हर 7 दिनों में न्यूरॉन्स को खिलाएं।
  11. वैकल्पिक चरण: सीडिंग के 1 सप्ताह बाद, ग्लियल प्रसार को रोकने के लिए साइटोसाइन अरेबिनोसाइड (1-β-डी-अरेबिनोफुरिनोसिलसाइटोसिन) को 5 माइक्रोन की अंतिम एकाग्रता में जोड़ें।

4. न्यूरॉन विकास के पहले चरण में Ankyrin-G के नॉकआउट द्वारा AIS का व्यवधान

  1. 3 div (दिन में विट्रो)पर, वातानुकूलित न्यूरोनल संस्कृति माध्यम के साथ एक ग्लिया सेल फीडर डिश तक का सामना कर रहे मोम डॉट्स साइड के साथ कवरस्लिप को फ्लिप करें।
  2. 4 कवरस्लिप (डीएनए कॉपी नंबर के ~ 2:1 अनुपात) को ट्रांसफेक्ट करने के लिए 1.7 एमएल ट्यूब में 1.7 एमएल ट्यूब में 0.5 माइक्रोन के साथ क्रे-बीएफपी डीएनए का 0.25 माइक्रोन मिलाएं। संस्कृति माध्यम के 100 माइक्रोन जोड़ें (जैसे, ऑप्टी-एमईएम), मिश्रण और एक रैक पर आराम करें। यदि केवल क्रे-बीएफपी संक्रमित है, तो जीएफपी प्लाज्मिड बैकबोन का उपयोग डीएनए की कुल राशि से मेल खाने के लिए किया जाता है।
  3. एक नई 1.7 मिलील ट्यूब में 100 माइक्रोन कल्चर मीडियम के साथ ट्रांसफैक्शन रीएजेंट (जैसे, लिपोफेटामाइन 2000) (डीएनए के ~ 3 गुना) के 3 माइक्रोन मिलाएं। आरटी में 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट ।
  4. चरण 4.3 से ट्रांसफैक्शन रीएजेंट के 100 माइक्रोन के साथ स्टेप 4.2 से डीएनए समाधान के 100 माइक्रोन मिलाएं। एक रैक पर 5-10 मिनट के लिए आराम करें।
  5. कवरस्लिप को छुए बिना माध्यम के ठीक नीचे टिप डालकर प्रत्येक कवरस्लिप के शीर्ष पर चरण 4.4 से डीएनए मिश्रण के 50 μL जोड़ें। डीएनए मिश्रण के प्रसार से बचने के लिए धीरे-धीरे पिपेट।
  6. धीरे-धीरे डिश को इनक्यूबेटर में वापस लाएं और 30-45 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
  7. कवरस्लिप को वापस घर ग्लिया फीडर डिश में फ्लिप करें मोम डॉट्स साइड के साथ नीचे का सामना करना पड़ रहा है और प्लेट को इनक्यूबेटर में वापस डाल दें।

5. अक्षतंतु प्रारंभिक खंड का क्वांटिफिकेशन

  1. दिलचस्प के प्रोटीन के लिए मानक इम्यूनोसाइटोकेमिस्ट्री प्रोटोकॉल के बाद 7-10 div और दाग पर न्यूरॉन्स को ठीक करें।
  2. वांछित माइक्रोस्कोपी के साथ फ्लोरोसेंट चित्रों को एकत्र करें।
    1. पूरे AIS के संकेत को इकट्ठा करने के लिए जेड-सीरीज अनुभाग लें। सभी चित्रों के लिए एक ही जेड-गहराई रखें।
    2. सबसे अच्छा पिक्सेल तीव्रता गतिशील रेंज तक पहुंचने के लिए लेजर तीव्रता को समायोजित करें।
    3. सुनिश्चित करें कि सभी AIS तस्वीरें एक ही माइक्रोस्कोप सेटअप पर लिया जाता है।
    4. हमेशा क्रे-बीएफपी के सिग्नल की जांच करें।
  3. एआईएस क्वांटिफिकेशन
    1. फिजी (https://fiji.sc) के साथ खुली तस्वीर।
    2. जेड-सीरीज छवियों का अधिकतम प्रक्षेपण उत्पन्न करें।
    3. छवि से खाली कवर्लिप पृष्ठभूमि संकेत घटाना।
    4. एआईएस के साथ एक लाइन ड्रा। लाइन की चौड़ाई पूरी तरह से एआईएस को कवर करना चाहिए। एआईएस सिग्नल को पृष्ठभूमि से ऊपर उठाए जाने से पहले लाइन शुरू करें और पृष्ठभूमि में गिरने के बाद बंद हो जाते हैं।
    5. मतलब पिक्सेल तीव्रता अकेले लाइन और एक स्प्रेडशीट के लिए निर्यात उपाय (~ 10-15 AISs की जरूरत है) ।
    6. बर्जरएट अल से अनुकूलित मैटलैब स्क्रिप्ट का उपयोग करके एआईएस की औसत तीव्रता वक्र उत्पन्न करें।
    7. प्रत्येक प्रयोग के लिए, क्रे केवल और क्रे प्लस वाइल्डटाइप 480 केडीए एंकिरिन-जी संक्रमित न्यूरॉन्स को नकारात्मक और सकारात्मक नियंत्रण के रूप में शामिल करें ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि एआईएस का नॉकआउट दक्षता है और बचाव सफल है।

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Representative Results

प्रयोग के एक पूर्ण सेट में क्रे-बीएफपी केवल नकारात्मक नियंत्रण के रूप में ट्रांसफैक्शन, क्रे-बीएफपी प्लस 480 केडीए एंकिरिन-जी सह-ट्रांसफैक्शन को सकारात्मक नियंत्रण के रूप में और तकनीक नियंत्रण के रूप में एक गैर-संक्रमित स्थिति शामिल होनी चाहिए। क्रे-बीएफपी में केवल नियंत्रण, संक्रमित न्यूरॉन्स में एआईएस मार्कर के संचय की कमी होती है, जिसमें एंकिरिन-जी (ankG), बीटा4-स्पेक्ट्रिन (4), न्यूरोफासिन (एनएफ) और वोल्टेज गेटेड सोडियम चैनल (वीएसवीजी)(चित्रा 4A)16शामिल हैं। इसके विपरीत, क्रे और 480 केडीए एंकिरिन-जी सह-संक्रमित न्यूरॉन्स ने एआईएस मार्कर(चित्रा 4B)के वर्तमान द्वारा प्रकट एआईएस को पूरी तरह से इकट्ठा किया है। गैर-संक्रमित व्यंजनों के साथ तुलना करके संस्कृति की गुणवत्ता की पुष्टि करना महत्वपूर्ण है। अस्वास्थ्यकर न्यूरॉन्स असामान्य एआईएस संरचना दिखाते हैं, जैसे बंद या एक्टोपिक एआईएस(चित्रा 4C)।

फिर हमने मूल्यांकन करने का एक उदाहरण दिखाया कि कैसे एक एंकिरिन-जी मानव न्यूरोडेवलपमेंटल डिसऑर्डर उत्परिवर्तन (ankG-K2864N) AIS विधानसभा(चित्रा 5)को प्रभावित करता है। 3 div ANK3-E22/23f/f न्यूरॉन्स क्रे-बीएफपी और वाइल्डटाइप ४८० केडीए एंकिरिन-जी (ankG-WT) या ४८० केडीए ankyrin-G baring मानव उत्परिवर्तन (ankG-K2864) के साथ संक्रमित थे । न्यूरॉन्स div7 पर तय किया गया और ankyrin-जी के लिए दाग । छवियों को 10-15 संक्रमित न्यूरॉन्स और एक ही कवरस्लिप पर 10-15 नियंत्रण न्यूरॉन्स से एकत्र किया गया था और अधिकतम तीव्रता प्रक्षेपण के साथ संसाधित किया गया था। फिर हम एआईएस पर एक लाइन खींचते हैं जैसा कि दिखाया गया है और लाइन के पार औसत तीव्रता को मापते हैं। एआईएस तीव्रता का औसत होने के बाद हम सोमा से डिस्टल एक्सॉन तक एआईएस तीव्रता की साजिश रचते हैं । AIS समृद्ध प्रोटीन आम तौर पर समीपस्थ अक्षतंप से संकेत की तेजी से वृद्धि और डिस्टल अक्षतंप के लिए संकेत की धीमी कमी दिखाई । मानव उत्परिवर्ती के साथ ankyrin-जी द्वारा इकट्ठे AIS एक वृद्धि और संकेत की कमी से पता चला । लेकिन जब गैर-संक्रमित AIS के साथ गठबंधन किया जाता है, तो उत्परिवर्ती वक्र व्यापक होता है, और वक्र का शिखर एआईएस की संरचना परिवर्तन का सुझाव देता है। जंगली प्रकार ankyrin-जी इकट्ठे AIS बारीकी से गैर संक्रमित एक के साथ गठबंधन किया ।

Figure 1
चित्रा 1: ANK3-E22/23-flox के जीनोमिक संपादन ।   (क) 3 एंकिरिन-जी आइसोफॉर्म के लिए प्रोटीन डोमेन का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व । कैनोनिकल डोमेन में एक्सोन 22 और 23 इनकोडेड क्षेत्रों का स्थान डैश लाइन द्वारा इंगित किया गया है। (ख) एएनके3-ई22/23-फ्लॉक्स चूहों में लोक्सपी साइटों की स्थिति त्रिकोण द्वारा दर्शाई गई है । क्रे रिकॉम्बेशन के वर्तमान में, एक्सोन 22 और 23 को हटा दिया जाता है और एंकिरिन-जी के सभी 3 आइसोफॉर्म की अभिव्यक्ति को नुकसान पहुंचाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: CRE recombinase के वर्तमान में ANK3-E22/23-flox न्यूरॉन्स में AIS का नुकसान ।  एक आरेख 3 div पर क्रे ट्रांसफैक्शन के साथ एंकिरिन-जी अभिव्यक्ति और एआईएस असेंबली बनाम जंगली प्रकार के न्यूरॉन्स में-E22/23f/f न्यूरॉन्स में दिखाती है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: प्रोटोकॉल का कार्यप्रवाह। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: ANK3में 480kDa AnkG द्वारा AIS का एक पूरा बचाव-E22/23-flox न्यूरॉन्स सीआरई के साथ संक्रमित ।  ANK3के 3 div न्यूरॉन्स-E22/23f/f चूहों क्रे-बीएफपी (ए) या एक क्रे-बीएफपी और जंगली प्रकार के साथ ४८० केडीए ankyrin-जी-GFP (बी)के साथ संक्रमित थे । न्यूरॉन्स 7 div पर तय किया गया और ankyrin-जी (ankG), 14-स्पेक्ट्रिन (14), न्यूरोफासिन (Nf) और वोल्टेज gated सोडियम चैनलों (VSVG) के लिए दाग । सफेद तीर सिर एक संक्रमित न्यूरॉन के एआईएस को इंगित करता है। स्केल बार 20 माइक्रोन है। यह आंकड़ा यांग एट अल16से अनुकूलित किया गया था । (ग) टीडीटीएम और 480 केडीए एंकिरिन-जी-जीएफपी से संक्रमित दो अस्वस्थ न्यूरॉन्स दिखाए गए। समुच्चय (सफेद और बढ़े हुए में परिक्रमा) का गठन अस्वस्थ न्यूरॉन्स का संकेत है। शीर्ष: 480 केडीए ेंकिरिन-जी गैर-एआईएस क्षेत्र में दिखाता है (सफेद तीर सिर से बताया गया। नीचे: न्यूरॉन ने सोमा पर एंकिरिन-जी के 3 एआईएस और एक्टोपिक संचय का गठन किया। स्केल बार 20 माइक्रोन है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्र 5: AIS संरचनात्मक परिवर्तन की मात्रा । ANK3के div3 न्यूरॉन्स-E22/23f/f चूहों क्रे-BFP और जंगली प्रकार ४८० केडीए ankyrin-जी या ४८० केडीए ankyrin-जी-K2864N के साथ संक्रमित थे । 7 div पर, न्यूरॉन्स तय किया गया और ankyrin-जी के लिए दाग । प्रतिनिधि छवियां AIS पर ankyrin-जी संकेत दिखाते हैं । ग्रीन लाइन और येलो लाइन से संकेत मिलता है कि एआईएस तीव्रता माप के लिए लाइन कहां खींची गई थी । सफेद डैश लाइन ने संक्रमित न्यूरॉन के सेल शरीर की परिक्रमा की। स्केल बार 20 माइक्रोन है। दोनों स्थितियों के लिए औसत AIS तीव्रता अकेले दूरी की साजिश रची है और गैर संक्रमित कोशिकाओं (n = 10) के साथ गठबंधन किया है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

एआईएस की असेंबली का आयोजन 480 केडीए ेंकिरिन-जी द्वारा किया जाता है। हालांकि, एंकिरिन-जी में छोटे आइसोफॉर्म हैं जो वाइल्डटाइप न्यूरॉन्स के एआईएस को लक्षित कर सकते हैं, जिससे एआईएस असेंबली के संरचना-कार्य विश्लेषणों की व्याख्या में कठिनाई हो सकती है। यहां हम ANK3-E22/23-flox चूहों से न्यूरॉन्स का उपयोग कर एक विधि पेश करते हैं जो एआईएस के डी नोवो असेंबली के अध्ययन की अनुमति देता है। 3 डिव में क्रे-बीएफपी के साथ ट्रांसफेक्टिंग करके, हम एंकिरिन-जी के सभी अंतर्जात आइसोफॉर्म को खत्म करते हैं। हम एआईएस के गठन को बचाने के लिए 480 केडीए एंकिरिन-जी को भी सह-स्थानांतरित कर सकते हैं। यह एक स्वच्छ प्रणाली में एआईएस गठन के अध्ययन की अनुमति देता है। बैंकर संस्कृति प्रणाली को आगे अपनाकर जो ग्लियल सेल ओवर-ग्रोथ की जटिलताओं के बिना व्यवहार्यता में सुधार करता है, हम एक उच्च ट्रांसफैक्शन दक्षता तक पहुंच सकते हैं, जो हमें एआईएस आयामों के मात्रात्मक मापन के लिए पर्याप्त न्यूरॉन्स प्रदान करते हैं।

इस प्रोटोकॉल में कई महत्वपूर्ण कदम हैं। पहला महत्वपूर्ण कदम ट्रांसफैक्शन करने के लिए सबसे अच्छा समय खिड़की पर विचार कर रहा है, जिसे एआईएस की असेंबली को रोकने के लिए पर्याप्त जल्दी और उच्चतम ट्रांसफैक्शन दक्षता तक पहुंचने के लिए काफी देर से होना चाहिए। हमने 0 div इलेक्ट्रोपॉक्रेशन ट्रांसफैक्शन की कोशिश की, जिसने केवल क्रे-बीएफपी के साथ लगभग 10% ट्रांसफैक्शन दक्षता दी, लेकिन हम 0 div पर 480 केडीए ेंकिरिन-जी को स्थानांतरित करने में सक्षम नहीं थे। हमें संदेह है कि यह प्लाज्मिड (लगभग 20 केबी) के बड़े आकार के कारण है। प्राथमिक सुसंस्कृत हिप्पोकैम्पस न्यूरॉन्स में ट्रांसफैक्शन के लिए एक संकीर्ण खिड़की होती है, जो 3-5 दिनों के बीच होती है। एआईएस में ेंकिरिन-जी का संचय 3 डिव से शुरू होता है। जब हम 3 div पर क्रे-बीएफपी को ट्रांसप्लांट करते हैं, तो ट्रांस संक्रमित न्यूरॉन्स(चित्रा 4A)में कोई एआईएस गठन नहीं देखा गया। हम एक 18 मिमी कवरलिप से 480 केडीए एंकिरिन-जी से 10-20 न्यूरॉन्स संक्रमित हो सकते हैं। इसके अलावा, सह-ट्रांसफैक्शन बचाव प्रयोग के लिए, सभी डीएनए को एक ही प्रमोटर के तहत उत्पन्न किया जाना चाहिए और क्रे-बीएफपी और 480 केडीए ेंकिरिन-जी-जी-एफएफपी के अनुपात का मिलान किया जाना चाहिए। इस प्रयोग में हमने चिकन बीटा ऐक्टिन प्रमोटर का इस्तेमाल किया।

एक और महत्वपूर्ण कदम बैंकर संस्कृति में संशोधन है । बैंकर संस्कृति भ्रूण चूहा न्यूरॉन्स खेती के लिए विकसित किया गया था। अधिक संवेदनशील माउस पोस्टनेट हिप्पोकैम्पल न्यूरॉन का बेहतर समर्थन करने के लिए, हम ट्राइपसिनाइजेशन दक्षता में सुधार करने के लिए हिप्पोकैम्पी को छोटे टुकड़ों में काटने का एक कदम शामिल करते हैं। नाइट्रिक एसिड उपचार के बाद कोह उपचार जोड़ना ग्लास कवरस्लिप से विषाक्तता को और कम करता है, जो न्यूरॉन्स को संलग्न करने और बेहतर बढ़ने में मदद करता है।

एक शेष चुनौती यह है कि ेंकिरिन-जी के अभिव्यक्ति स्तर को कैसे नियंत्रित किया जाए। एक खुराक स्क्रीन ने ट्रांसफैक्शन के लिए उपयोग किए जाने वाले प्लाज्मिड की इष्टतम मात्रा निर्धारित करने में मदद की। आगे जा रहे हैं, अभिव्यक्ति के स्तर को नियंत्रित करने के लिए एक न्यूरॉन-विशिष्ट प्रमोटर का उपयोग करना बेहतर है। वर्तमान डेटा विश्लेषण ने एआईएस की स्थिति को मापने के लिए नहीं किया । इस समारोह को भविष्य में शामिल किया जाना चाहिए।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

हम न्यूरोनल कल्चर प्रोटोकॉल पर सुझाव के लिए डॉ गैरी बैंकर को धन्यवाद देते हैं । यह काम हावर्ड ह्यूजेस मेडिकल इंस्टीट्यूट, एनआईएच से अनुदान, और जॉर्ज बार्थ गेलर संपन्न प्रोफेसरशिप (V.B.) द्वारा समर्थित है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10xHBSS Thermo Fisher Scientific 14065-056
18mm coverglass (1.5D) Fisher Scientific 12-545-84-1D
190kDa ankyrin-G-GFP Addgene #31059
2.5% Tripsin without phenol red Thermo Fisher Scientific 14065-056
480kDa ankyrin-G-GFP lab made Provide upon request
ANK3-E22/23f/f mice JAX Stock No: 029797 B6.129-Ank3tm2.1Bnt/J;
B27 serum-free supplement Thermo Fisher Scientific A3582801
Boric acid Sigma-Aldrich B6768
Cell strainer with 70-mm mesh BD Biosciences 352350
Ceramic coverslip-staining rack Thomas Scientific 8542E40
Cre-BFP Addgene #128174
D-Glucose Sigma-Aldrich G7021
DMEM Thermo Fisher Scientific 11995073
GlutaMAX-I supplement Thermo Fisher Scientific A1286001
Lipofectamine 2000 Thermo Fisher Scientific 11668030
MEM with Earle’s salts and L-glutamine Thermo Fisher Scientific 11095-080
Neurobasal Medium Thermo Fisher Scientific 21103-049
Nitric acid 70% Sigma-Aldrich 225711
Opti-MEM I Reduced Serum Medium Thermo Fisher Scientific 31985062
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich P6148
Penicillin-streptomycin Thermo Fisher Scientific 15140122
Poly-L-lysine hydrochloride Sigma-Aldrich 26124-78-7
Potassium hydroxide Sigma-Aldrich 1310-58-3

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References

  1. Nelson, A. D., et al. Correction: Ankyrin-G regulates forebrain connectivity and network synchronization via interaction with GABARAP. Molecular Psychiatry. , (2019).
  2. Tseng, W. C., Jenkins, P. M., Tanaka, M., Mooney, R., Bennett, V. Giant ankyrin-G stabilizes somatodendritic GABAergic synapses through opposing endocytosis of GABAA receptors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the U S A. 112 (4), 1214-1219 (2015).
  3. Tai, Y., Gallo, N. B., Wang, M., Yu, J. R., Van Aelst, L. Axo-axonic Innervation of Neocortical Pyramidal Neurons by GABAergic Chandelier Cells Requires AnkyrinG-Associated L1CAM. Neuron. 102 (2), 358-372 (2019).
  4. Hofflin, F., et al. Heterogeneity of the Axon Initial Segment in Interneurons and Pyramidal Cells of Rodent Visual Cortex. Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 332 (2017).
  5. Schluter, A., et al. Structural Plasticity of Synaptopodin in the Axon Initial Segment during Visual Cortex Development. Cerebral Cortex. 27 (9), 4662-4675 (2017).
  6. Kuba, H., Oichi, Y., Ohmori, H. Presynaptic activity regulates Na(+) channel distribution at the axon initial segment. Nature. 465 (7301), 1075-1078 (2010).
  7. Grubb, M. S., Burrone, J. Activity-dependent relocation of the axon initial segment fine-tunes neuronal excitability. Nature. 465 (7301), 1070-1074 (2010).
  8. Pan, Z., et al. A common ankyrin-G-based mechanism retains KCNQ and NaV channels at electrically active domains of the axon. Journal of Neuroscience. 26 (10), 2599-2613 (2006).
  9. Cooper, E. C. Made for "anchorin": Kv7.2/7.3 (KCNQ2/KCNQ3) channels and the modulation of neuronal excitability in vertebrate axons. Seminars in Cell & Developmental Biology. 22 (2), 185-192 (2011).
  10. Zhou, D., et al. AnkyrinG is required for clustering of voltage-gated Na channels at axon initial segments and for normal action potential firing. The Journal of Cell Biology. 143 (5), 1295-1304 (1998).
  11. Kordeli, E., Lambert, S., Bennett, V. AnkyrinG. A new ankyrin gene with neural-specific isoforms localized at the axonal initial segment and node of Ranvier. Journal of Biological Chemistry. 270 (5), 2352-2359 (1995).
  12. Jenkins, P. M., et al. Giant ankyrin-G: a critical innovation in vertebrate evolution of fast and integrated neuronal signaling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the U S A. 112 (4), 957-964 (2015).
  13. Jenkins, P. M., et al. E-cadherin polarity is determined by a multifunction motif mediating lateral membrane retention through ankyrin-G and apical-lateral transcytosis through clathrin. Journal of Biological Chemistry. 288 (20), 14018-14031 (2013).
  14. Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nature Protocol. 1 (5), 2406-2415 (2006).
  15. Berger, S. L., et al. Localized Myosin II Activity Regulates Assembly and Plasticity of the Axon Initial Segment. Neuron. 97 (3), 555-570 (2018).
  16. Yang, R., et al. Neurodevelopmental mutation of giant ankyrin-G disrupts a core mechanism for axon initial segment assembly. Proceedings of the National Academy of Sciences of the U S A. 116 (39), 19717-19726 (2019).

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रिऐक्शन अंक 168 विशालकाय एंकिरिन-जी एक्सन प्रारंभिक खंड प्राथमिक सुसंस्कृत न्यूरॉन्स ट्रांसफैक्शन इमेजिंग एआईएस तीव्रता मात्राकरण
एक्सोन प्रारंभिक खंडों की असेंबली का अध्ययन करने के लिए प्राथमिक संस्कारित हिप्पोकैम्पल न्यूरॉन्स का उपयोग
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Yang, R., Bennett, V. Use of Primary … More

Yang, R., Bennett, V. Use of Primary Cultured Hippocampal Neurons to Study the Assembly of Axon Initial Segments. J. Vis. Exp. (168), e61411, doi:10.3791/61411 (2021).

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