Summary
Здесь мы описали протокол количественного изучения сборки и структуры исходных сегментов аксона (AIS) нейронов гиппокампа, в которых отсутствует предварительно собранная АИС из-за отсутствия гигантского анкирина-G.
Abstract
Начальные сегменты аксона нейронов (АИС) являются участками инициации потенциалов действия и были широко изучены на предмет их молекулярной структуры, сборки и пластичности, зависящей от активности. Гигантский анкирин-G, главный организатор АИС, напрямую ассоциируется с мембранными напряжениями закрытого натриевого (VSVG) и калиевого каналов (KCNQ2/3), а также с нейрофасцином 186 кДа, молекулой адгезии клеток L1CAM. Гигантский анкирин-G также связывается и рекрутирует цитоплазматические молекулы АИС, включая бета-4-спектрин, и микротрубочки-связывающие белки, EB1 / EB3 и Ndel1. Гигантского анкирина-G достаточно для спасения образования АИС в нейронах с дефицитом анкирина-G. Анкирин-G также включает меньшую изоформу 190 кДа, расположенную в дендритных шипах вместо АИС, которая не способна нацеливаться на АИС или спасать АИС в нейронах с дефицитом анкирина G. Здесь мы описали протокол с использованием культивируемых нейронов гиппокампа у мышей ANK3-E22/23-flox, которые при трансфекции Cre-BFP демонстрируют потерю всей изоформы анкирина-G и ухудшают образование АИС. Объединив модифицированную систему кокультуры глии и нейронов Банкира, мы разработали метод трансфектации анкирин-G нулевых нейронов с плазмидой 480 кДа анкирин-G-GFP, что достаточно для спасения образования АИС. Мы также используем метод количественной оценки, разработанный Зальцером и его коллегами для борьбы с изменением расстояния АИС от тел нейронных клеток, которое происходит в культурах нейронов гиппокампа. Этот протокол позволяет проводить количественные исследования сборки de novo и динамического поведения АИС.
Introduction
Начальный сегмент аксона расположен в проксимальном аксоне в большинстве нейронов позвоночных. Функционально АИС - это место, где инициируются потенциалы действия из-за высокой плотности натриевых каналов с напряжением в этой области. АИС некоторых возбуждающих нейронов также нацелены на тормозные интернейроны путем образования ГАМКергических синапсов1,2,3. Таким образом, АИС является критическим участком для интеграции клеточной сигнализации и модуляции возбудимости нейронов. АИС обычно составляет 20-60 мкм в длину и расположена в пределах 20 мкм от тела клетки. Длина и положение АИС варьируется в нейронах по областям мозга, а также на разных стадиях развития одного и того женейрона4,5. Накопленные данные свидетельствуют о том, что состав и положение АИС динамичны в ответ на изменение активности нейронов4,5,6,7.
480 кДа анкырин-Г является мастер-организатором АИС. 480 кДа анкирин-G представляет собой мембранно-ассоциированный адапторный белок, который непосредственно связывается с напряжением закрытых натриевых каналов, а также с другими основными белками AIS, включая бета4-спектрин, каналы KCNQ2/3, которые модулируют активность натриевых каналов8,9и 186 кДа нейрофасцина, L1CAM, который направляет ГАМКергические синапсы к AIS2,10. 480 кДа анкирин-G разделяет канонические анкириновые домены, обнаруженные в короткой 190 кДа анкирин-G изоформе (ank repeats, спектрин-связывающий домен, регуляторный домен), но отличаются гигантским экзоном, который встречается только у позвоночных и специфически экспрессируется в нейронах(рисунок 1A)11,12. Специфический домен нейронов анкирин-G (НРД) 480 кДа необходим для формирования АИС12. 190 кДа анкирин-G не способствует сборке АИС и не нацеливает АИС в анкирин-G-нулевых нейронах12. Однако 190 кДа анкирина-Г сосредоточено на АИС, содержащей 480 кДа анкирина-Г12. Эта способность 190 кДа анкирина-G нацеливаться на предварительно собранную АИС нейронов дикого типа была источником путаницы в литературе и замедлила оценку критических специализированных функций 480 кДа анкирина-G в сборке АИС. Поэтому крайне важно изучать сборку АИС в анкирин-G-нулевых нейронах, в которым отсутствует предварительно собранная АИС.
Здесь мы представляем метод изучения сборки и структуры АИС с использованием культивируемых нейронов гиппокампа у мышей ANK3-E22/23-flox, который устраняет все изоформы анкирина-G13 (рисунок 1B). Трансфектируя нейроны с помощью конструкции Cre-BFP до сборки AIS, мы генерировали анкирин-G-дефицитные нейроны, полностью лишенные AIS(рисунок 1B, рисунок 2). Сборка АИС полностью спасена после совместной трансфекции плазмиды анкирин-G-GFP 480 кДа с плазмидой Cre-BFP. Этот метод обеспечивает способ изучения сборки АИС в несборной среде АИС. Мы также модифицировали систему кокультуры глиа-нейрон от Гэри Бэнкера без использования антибиотиков, ранее разработанную для эмбриональных нейронов 18-го дня, для применения к постнатальным нейронам мыши и адаптировали метод количественного определения АИС для усреднения измерений АИС от нескольких нейронов для нормализации вариации АИС14,15.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот метод культивирования нейронов гиппокампа из постнатальных 0-дневных мышей ANK3-E22/23f/f адаптирован из системы кокультуры глии/нейронов Гэри Банкира. Поэтому крайне важно выполнять все шаги после вскрытия в чистом вытяжке с использованием стерилизованных инструментов. Этот протокол занимает до 1 месяца. Рабочий процесс показан на рисунке 3. Протокол следует рекомендациям по животным Университета Дьюка.
1. Приготовление укрытий и блюд для нанесения нейронной обшивки
- По крайней мере, за неделю до дня культивного культивеса загрузите крышки на стойку для чехлов и замочите ее в азотной кислоте (70% Вт / Вт) на ночь (может быть продлена на несколько дней).
- Обработанные азотной кислотой крышки промыть дистиллированной водой на низкоскоростном шейкере в стеклянной банке 2 раза по 1 часу каждая.
- Инкубационные покровные листы в насыщенном KOH растворенные в 100% этаноле на ночь. Добавьте KOH в этанол до тех пор, пока он больше не растворится.
- Повторите этап промывки дистиллированной водой. Промойте крышки 100% этанолом один раз в течение 10 минут.
- Перенесите крышки со стойки на стеклянный стакан. Накройте замок алюминиевой фольгой. Запекайте крышки в духовке с 225 °C на ночь, чтобы стерилизовать крышки. (Чехлы могут храниться в мукере неделями).
- Поместите обложки в чашку Петри, а затем нанесите 3-4 восковые точки на крышку, чтобы они служили ножками. Используйте пипетку Пастера, чтобы окунуть в кипяченый воск в стеклянной бутылке. Затем быстро коснитесь крышки, чтобы создать точку. Чашка Петри 60 мм может вместить 4 крышки. Чашка Петри 10 мм может вместить ~ 10 обложек.
- За 2 дня до дня культивной обработки обложите покровами (сторону с восковыми точками) фильтром, стерилизовав 1 мг/мл поли-L-лизина в 0,1 М борной кислоты (рН 8,5) минимум на 6 часов и смойте водой 2 раза по 1 час каждый раз. Обложки остаются в той же чашке Петри.
- Добавляйте гальваночную среду (MEM, дополненную глюкозой 0,6% (масс./об.) и 10% (об/об.) конской сыворотки) в пластины медленно, не нарушая покровов. Поставьте пластины в инкубатор до дня культивации, чтобы посеять нейроны.
2. Приготовление блюд для кормления клеток глии (за 2 недели до дня культивирования)
- Рассеките кору головного мозга 1-дневной мыши и отклейте мозг мозгов.
- Ткань коры головного мозга измельчить как можно тоньше чистыми ножницами в чистой чашке Петри на чистой скамейке.
- Переместите измельченную ткань в 12 мл HBSS и добавьте 1,5 мл 2,5% трипсина и 1% (мас./об.) ДНКазы. Насиживайте на водяной бане 37 °C в течение 15 мин, качайте каждые 5 мин. Хорошо переваренные ткани становятся липкими и образуют большой кластер. Тритурат 10-15 раз пипеткой 10 мл, чтобы разрушить ткани и получить лучшее пищеварение.
- Тритурировать хорошо переваренные ткани 10-15 раз пипеткой объемом 5 мл до тех пор, пока большинство кусков не исчезнет и среда не станет мутной. Пропустите через клеточный ситечко, чтобы удалить оставшиеся куски и добавить 15 мл среды глии (минимальная необходимая среда (MEM), дополненная глюкозой (0,6% масс. / об.), 10% (об./об.) конской сывороткой и пенициллин-стрептомицином (1x), чтобы остановить пищеварение.
- Центрифугируют клетки при 120 х г в течение 5 минут и аспирируют супернатант. Повторно суспендируют клеточную гранулу со свежей глийной средой и семенами в блюдах для клеточных культур (около 105 клеток/см2).
- Замените среду свежей средой глии на следующий день, чтобы удалить неприкрепленные клетки.
- Подкармливаете блюда из глии каждые 3-4 дня свежей глией. Шлепните колбу 5-10 раз рукой, чтобы выбить свободно прикрепленные клетки перед сменой среды.
- После 10 дней посева клетки глии должны быть почти сливаться. Отсоедините клетки глии с 0,25% трипсина-ЭДТА и помейте около 105 клеток в новую чашку для культивирования клеток 60 мм. Оставшиеся клетки могут быть заморожены для будущего использования.
- За 3 дня до дня культивации измените глию среду на нейрональную культуральную среду (нейробазальная среда А с 1x GlutaMAX-I и 1x B27 добавкой).
3. Культура нейронов гиппокампа
ПРИМЕЧАНИЕ: Все этапы выполняются при комнатной температуре.
- Рассекайте 6-8 гиппокампов от послеродовых 1-дневных детенышей от мышей ANK3-E22/23f/f со средой HBSS в чашке Петри в комнате умеренного пояса. Нарежьте гиппокампы ножницами для рассечения на более мелкие кусочки. Перенесите гиппокампы из чашки Петри в трубку 15 мл.
- Вымойте гиппокампи 2x с 5 мл HBSS в трубке. Оставьте гиппокамп в 4,5 мл 1x HBSS после промывки.
- Добавьте 0,5 мл 2,5% трипсина в 4,5 мл HBSS и инкубировать на водяной бане при 37 °C в течение 15 минут. Инвертировать трубку каждые 5 минут. Хорошо переваренные гиппокампы должны стать липкими и образовать скопление. При необходимости продлите пищеварение еще на 5 минут.
- Мойте гиппокампы HBSS 3 раза по 5 минут каждый. Не используйте пылесос для удаления HBSS. Очень легко удалить гиппокамп.
- Добавьте 2 мл HBSS после стирки и пипетку гиппокампа вверх и вниз пипеткой Пастера 15 раз.
- Обрубьте ткань огнеполированной пипеткой Пастера (диаметр открытого сужается вдвое) 10 раз. Не выходите за рамки 10 раз, даже если еще остались куски. Подслушивание убивает нейроны.
- Устройте трубку в течение 5 минут, пока все куски не уложиться на дно. Осторожно используйте наконечник пипетки 1 мл, чтобы перенести супернатант, содержащий диссоциированные нейроны, на тарелку для покрытия (105 клеток / 60 мм тарелки). Добавьте его непосредственно в предварительно инкубированную гальваническое средство и аккуратно встряхните тарелку.
- Повторяйте шаг 3.6-3.7 с оставшимися кусками до тех пор, пока большинство кусков не исчезнут.
- Через 2-4 часа после посева проверьте обшивку посуды световым микроскопом. Большинство нейронов должны были прикрепляться к крышке. Прикрепленные клетки круглые и яркие. Переворачивайте крышки с помощью тонкого наконечника щипцов к тарелкам для подачи клеток глии с предварительно подготовленной нейрональной питательной средой с восковыми точками стороной вниз.
- Нейроны могут расти в кормушках для клеток глии до 1 месяца. Подкармливаем нейроны каждые 7 дней 1 мл свежей нейрональной питательной среды.
- Необязательный этап: через 1 неделю после посева добавить цитозина арабинозид (1-β-D-арабинофураносилцитозина) до конечной концентрации 5 мкМ для сдерживания глиальной пролиферации.
4. Нарушение АИС нокаутом Анкирина-G на более ранней стадии развития нейронов
- На 3 див (день in vitro)переверните крышки с восковыми точками стороной вверх к тарелке для подачи клеток глии с кондиционированной нейрональной питательной средой.
- Смешайте 0,25 мкг ДНК Cre-BFP с 0,5 мкг ДНК анкирина-G-GFP (WT/мутант) в пробирке 1,7 мл для трансфектации 4 покровных листа (~ 2:1 соотношение числа копий ДНК). Добавить 100 мкл питательной среды (например, Opti-MEM), перемешать и уложить на стойку. Если трансфицируется только Cre-BFP, плазмидная основа GFP используется для сопоставления общего количества ДНК.
- Смешайте 3 мкл трансфекционного реагента (например, Lipofectamine 2000) (~ 3 раза ДНК) со 100 мкл культуральной среды в новой пробирке 1,7 мл. Инкубировать в течение 5 минут на RT.
- Смешайте 100 мкл раствора ДНК со ступени 4.2 со 100 мкл трансфекционного реагента со ступени 4.3. Отдохните 5-10 минут на стойке.
- Добавьте 50 мкл смеси ДНК с шага 4.4 прямо поверх каждого обтекателя, вставив наконечник чуть ниже среды, не касаясь обтекателей. Пипетка медленно, чтобы избежать распространения смеси ДНК.
- Медленно доведите блюдо обратно в инкубатор и высиживите в течение 30-45 минут.
- Переверните крышки обратно в домашнюю тарелку для подачи глии с восковыми точками стороной вниз и поставьте тарелку обратно в инкубатор.
5. Количественная оценка начального сегмента аксона
- Фиксируют нейроны на 7-10 div и окрашивают маркером АИС по стандартному протоколу иммуноцитохимии для белка интересного.
- Собирайте флуоресцентные снимки с помощью нужной микроскопии.
- Возьмите секции серии Z, чтобы собрать сигнал всей АИС. Сохраняйте одинаковую Z-глубину для всех изображений.
- Отрегулируйте интенсивность лазера для достижения наилучшего динамического диапазона интенсивности пикселей.
- Убедитесь, что все снимки AIS сделаны на одном и том же микроскопе.
- Всегда проверяйте сигнал Cre-BFP.
- Количественная оценка АИС
- Открыть картинку с Фиджи (https://fiji.sc).
- Генерация максимальной проекции изображений Z-серии.
- Вычтите из изображения пустой фоновый сигнал обложки.
- Провести линию вдоль АИС. Ширина линии должна полностью охватывать АИС. Начните линию до того, как сигнал AIS будет поднят над фоном, и остановитесь после того, как он опустится на задний план.
- Измерьте среднюю интенсивность пикселей только линии и экспортируйте в электронную таблицу (требуется ~10-15 AIS).
- Сгенерировать кривую средней интенсивности АИС с помощью скрипта MATLAB, адаптированного из Berger et al.15.
- Для каждого эксперимента включайте только Cre и Cre плюс трансфективные нейроны дикого типа 480 кДа анкирин-G в качестве отрицательного и положительного контроля, чтобы убедиться, что нокаут АИС является эффективностью и спасение успешным.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Полный набор эксперимента должен включать только трансфекцию Cre-BFP в качестве отрицательного контроля, Cre-BFP плюс 480 кДа анкирин-G ко-трансфекцию в качестве положительного контроля и неперетерфраженное состояние в качестве контроля техники. В контроле только Cre-BFP трансфектированные нейроны не имеют накопления маркеров АИС, включая анкирин-G (ankG), бета4-спектрин (β4), нейрофасцин (Nf) и напряжение закрытых натриевых каналов (VSVG)(Рисунок 4A)16. Напротив, ко-трансфефицированные нейроны Cre и 480 кДа анкирин-G полностью собраны АИС, выявленные по настоящему наличию маркеров АИС(рисунок 4B). Важно подтвердить качество культуры, сравнивая с неперераженными блюдами. Нездоровые нейроны, как правило, демонстрируют аномальную структуру АИС, такую как прекращенная или внематочная АИС(рисунок 4C).
Затем мы показали пример оценки того, как мутация расстройства нервного развития человека (ankG-K2864N) влияет на сборку АИС(рисунок 5). 3-х див ANK3-E22/23f/f нейроны были трансфектированы Cre-BFP и диким типом 480 кДа анкирин-G (ankG-WT) или 480 кДа анкирин-G обнажающей человеческой мутацией (ankG-K2864). Нейроны были зафиксированы на div7 и окрашены для анкирина-G. Изображения собирали из 10-15 трансфекционных нейронов и 10-15 контрольных нейронов на одинаковых покровах и обрабатывали с максимальной интенсивностью проекции. Затем мы проводим линию на АИС, как показано на рисунке, и измеряем среднюю интенсивность по всей линии. После усреднения интенсивности АИС мы строим график интенсивности АИС от сомы до дистального аксона. Белок, обогащенный АИС, обычно показывал быстрое увеличение сигнала от проксимального аксона и медленное снижение сигнала к дистальной аксоне. АИС, собранная анкирином-G с человеческим мутантом, показала увеличение и уменьшение сигнала. Но при выравнивании с непреродированной АИС мутантная кривая шире, а пик кривой ниже, что свидетельствует об изменении структуры АИС. Дикий тип анкирин-G собран АИС тесно связан с неперераженным.
Рисунок 1: Геномное редактирование ANK3-E22/23-flox. (A) Схематическое представление белковых доменов для 3 изоформ анкирин-G. Расположение закодированных областей экзона 22 и 23 в канонической области указывается линией тире. (B) Положение участков LoxP у мышей ANK3-E22/23-flox обозначается треугольником. В настоящем Cre рекомбиназе экзоны 22 и 23 удаляются и вызывают потерю экспрессии всех 3 изоформ анкирина-G. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Потеря АИС в нейронах ANK3-E22/23-flox в настоящем Cre recombinase. Диаграмма показывает временные рамки экспрессии ankyrin-G и сборки AIS в нейронах дикого типа по сравнению с нейронами ANK3-E22/23f/f с трансфекцией Cre при 3 div. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Рабочий процесс протокола. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Полное спасение АИС 480 кДа AnkG в нейронах ANK3-E22/23-flox, трансфектированных Cre. 3 div нейрона мышей ANK3-E22/23f/f были трансфектированы Cre-BFP (A) или Cre-BFP и диким типом 480 кДа ankyrin-G-GFP (B). Нейроны были зафиксированы при 7 div и окрашены для анкирин-G (ankG), β4-спектрин (β4), нейрофасцин (Nf) и напряжения закрытых натриевых каналов (VSVG). Белая стрелка указывает на АИС трансфекфицированный нейрон. Шкала шкалы составляет 20 мкм. Эта цифра была адаптирована из Yang et al16. (C) Были показаны два нездоровых нейрона, трансфектированных tdTM и 480 кДа анкирин-G-GFP. Образование агрегатов (обведенные белым цветом и увеличенные) является признаком нездоровых нейронов. Вверху: 480 кДа анкирин-G появляется в регионе, не ва-АИС (заостренный белыми наконечниками стрел. Внизу: Нейрон образует 3 АИС и эктопическое накопление анкирина-G на соме. Шкала шкалы составляет 20 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Количественная оценка структурных изменений АИС. нейроны div3 мышей ANK3-E22/23f/f трансфектировали Cre-BFP и диким типом 480 кДа анкирин-G или 480 кДа анкирин-G-K2864N. При 7 div нейроны были зафиксированы и окрашены для анкирина-G. Репрезентативные изображения показывают сигнал анкирин-G на АИС. Зеленая и желтая линии указывают, где была прорисовываться линия для измерения интенсивности АИС. Белая черта обвела тело клетки трансфекированного нейрона. Шкала шкалы составляет 20 мкм. Средняя интенсивность АИС для обоих состояний строится отдельно на расстоянии и выравнивается с неперераженными клетками (n=10). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Сборка АИС организована 480 кДа анкырин-Г. Однако анкирин-G имеет более короткие изоформы, которые могут нацеливаться на АИС нейронов дикого типа, что может привести к трудностям в интерпретации структурно-функционального анализа сборки АИС. Здесь мы представляем метод с использованием нейронов мышей ANK3-E22/23-flox, который позволяет изучать сборку de novo АИС. Путем трансфектирования Cre-BFP при 3 div мы устраняем все эндогенные изоформы анкирина-G. Мы также могли бы совместно трансфицировать 480 кДа анкирин-Г для спасения формирования АИС. Это позволяет изучать формирование АИС в чистой системе. Путем дальнейшего внедрения системы культуры Банкира, которая повышает жизнеспособность без осложнений чрезмерного роста глиальных клеток, мы могли бы достичь высокой эффективности трансфекции, которая обеспечивает нам достаточно нейронов для количественного измерения размеров АИС.
В этом протоколе есть несколько важных шагов. Первым критическим шагом является рассмотрение наилучшего временного окна для выполнения трансфекции, которое должно быть достаточно ранним, чтобы предотвратить сборку АИС, и достаточно поздним, чтобы достичь наивысшей эффективности трансфекции. Мы попробовали электропорационную трансфекцию 0 div, которая дала около 10% эффективности трансфекции только с Cre-BFP, но мы так и не смогли трансфектировать 480 кДа Ankyrin-G при 0 div. Мы подозреваем, что это связано с большим размером плазмиды (около 20 кб). Первичные культивируются нейроны гиппокампа имеют узкое окно для трансфекции, которое составляет от 3 до 5 дней. Накопление анкирина-Г на АИС начинается с 3 див. Когда мы трансфектированы Cre-BFP при 3 div, в трансфектированных нейронах не наблюдалось образования AIS(рисунок 4A). Мы могли бы получить 10-20 нейронов, трансфекированных 480 кДа анкирин-G из одного 18-миллиметрового покрова. Кроме того, для эксперимента по спасению ко-трансфекции вся ДНК должна быть сгенерирована под одним и тем же промотором, и соотношение Cre-BFP и 480 кДа анкирин-G-GFP должно быть сопоставлено. В этом эксперименте мы использовали промотор бета-актина курицы.
Другим важным шагом является модификация культуры банкиров. Культура Банкира была разработана для культивирования эмбриональных нейронов крыс. Чтобы лучше поддерживать более чувствительный постнатальный нейрон гиппокампа мыши, мы включаем этап измельчения гиппокампа на более мелкие кусочки для повышения эффективности трипсинизации. Добавление лечения KOH после обработки азотной кислотой еще больше снижает токсичность от стеклянных покровов, которые помогают нейронам прикрепляться и расти лучше.
Оставшаяся проблема заключается в том, как контролировать уровень экспрессии ankyrin-G. Скрининг дозировки помог определить оптимальное количество плазмиды, используемой для трансфекции. В дальнейшем лучше использовать нейрон-специфический промотор для контроля уровня экспрессии. Текущий анализ данных не измеряет положение АИС. Эта функция должна быть включена в будущем.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Мы благодарим доктора Гэри Банкира за предложение по протоколу нейронной культуры. Эта работа поддерживается Медицинским институтом Говарда Хьюза, грантом NIH и профессорским саном Джорджа Барта Геллера (V.B.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10xHBSS | Thermo Fisher Scientific | 14065-056 | |
| 18mm coverglass (1.5D) | Fisher Scientific | 12-545-84-1D | |
| 190kDa ankyrin-G-GFP | Addgene | #31059 | |
| 2.5% Tripsin without phenol red | Thermo Fisher Scientific | 14065-056 | |
| 480kDa ankyrin-G-GFP | lab made | Provide upon request | |
| ANK3-E22/23f/f mice | JAX | Stock No: 029797 | B6.129-Ank3tm2.1Bnt/J; |
| B27 serum-free supplement | Thermo Fisher Scientific | A3582801 | |
| Boric acid | Sigma-Aldrich | B6768 | |
| Cell strainer with 70-mm mesh | BD Biosciences | 352350 | |
| Ceramic coverslip-staining rack | Thomas Scientific | 8542E40 | |
| Cre-BFP | Addgene | #128174 | |
| D-Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| DMEM | Thermo Fisher Scientific | 11995073 | |
| GlutaMAX-I supplement | Thermo Fisher Scientific | A1286001 | |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher Scientific | 11668030 | |
| MEM with Earle’s salts and L-glutamine | Thermo Fisher Scientific | 11095-080 | |
| Neurobasal Medium | Thermo Fisher Scientific | 21103-049 | |
| Nitric acid 70% | Sigma-Aldrich | 225711 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Thermo Fisher Scientific | 31985062 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Penicillin-streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Poly-L-lysine hydrochloride | Sigma-Aldrich | 26124-78-7 | |
| Potassium hydroxide | Sigma-Aldrich | 1310-58-3 |
References
- Nelson, A. D., et al. Correction: Ankyrin-G regulates forebrain connectivity and network synchronization via interaction with GABARAP. Molecular Psychiatry. , (2019).
- Tseng, W. C., Jenkins, P. M., Tanaka, M., Mooney, R., Bennett, V. Giant ankyrin-G stabilizes somatodendritic GABAergic synapses through opposing endocytosis of GABAA receptors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the U S A. 112 (4), 1214-1219 (2015).
- Tai, Y., Gallo, N. B., Wang, M., Yu, J. R., Van Aelst, L. Axo-axonic Innervation of Neocortical Pyramidal Neurons by GABAergic Chandelier Cells Requires AnkyrinG-Associated L1CAM. Neuron. 102 (2), 358-372 (2019).
- Hofflin, F., et al. Heterogeneity of the Axon Initial Segment in Interneurons and Pyramidal Cells of Rodent Visual Cortex. Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 332 (2017).
- Schluter, A., et al. Structural Plasticity of Synaptopodin in the Axon Initial Segment during Visual Cortex Development. Cerebral Cortex. 27 (9), 4662-4675 (2017).
- Kuba, H., Oichi, Y., Ohmori, H. Presynaptic activity regulates Na(+) channel distribution at the axon initial segment. Nature. 465 (7301), 1075-1078 (2010).
- Grubb, M. S., Burrone, J. Activity-dependent relocation of the axon initial segment fine-tunes neuronal excitability. Nature. 465 (7301), 1070-1074 (2010).
- Pan, Z., et al. A common ankyrin-G-based mechanism retains KCNQ and NaV channels at electrically active domains of the axon. Journal of Neuroscience. 26 (10), 2599-2613 (2006).
- Cooper, E. C. Made for "anchorin": Kv7.2/7.3 (KCNQ2/KCNQ3) channels and the modulation of neuronal excitability in vertebrate axons. Seminars in Cell & Developmental Biology. 22 (2), 185-192 (2011).
- Zhou, D., et al. AnkyrinG is required for clustering of voltage-gated Na channels at axon initial segments and for normal action potential firing. The Journal of Cell Biology. 143 (5), 1295-1304 (1998).
- Kordeli, E., Lambert, S., Bennett, V. AnkyrinG. A new ankyrin gene with neural-specific isoforms localized at the axonal initial segment and node of Ranvier. Journal of Biological Chemistry. 270 (5), 2352-2359 (1995).
- Jenkins, P. M., et al. Giant ankyrin-G: a critical innovation in vertebrate evolution of fast and integrated neuronal signaling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the U S A. 112 (4), 957-964 (2015).
- Jenkins, P. M., et al. E-cadherin polarity is determined by a multifunction motif mediating lateral membrane retention through ankyrin-G and apical-lateral transcytosis through clathrin. Journal of Biological Chemistry. 288 (20), 14018-14031 (2013).
- Kaech, S., Banker, G.
- Berger, S. L., et al. Localized Myosin II Activity Regulates Assembly and Plasticity of the Axon Initial Segment. Neuron. 97 (3), 555-570 (2018).
- Yang, R., et al. Neurodevelopmental mutation of giant ankyrin-G disrupts a core mechanism for axon initial segment assembly. Proceedings of the National Academy of Sciences of the U S A. 116 (39), 19717-19726 (2019).
