Summary
العلاج الضوئي بالأشعة تحت الحمراء القريب (NIR-PIT) هو استراتيجية علاجية ناشئة للسرطان تستخدم جهاز امتصاص ضوئي للأجسام المضادة (IR700Dye) يترافق مع ضوء NIR لتدمير الخلايا السرطانية. هنا، نقدم طريقة لتقييم تأثير مضاد للورم من NIR-PIT في نموذج الماوس من سرطان الرئة الجنبي المنتشر ورم الظهارة المتوسطة الجنبي الخبيث باستخدام التصوير الإضاءة الحيوية.
Abstract
يمكن تقييم فعالية العلاج الضوئي بالموطنين بدقة أكبر باستخدام نموذج فأر تقويم العظام مقارنة بصورة تحت الجلد. يمكن استخدام نموذج نشر الجنبي لتقييم طرق العلاج لأمراض داخل الصدر مثل سرطان الرئة أو ورم الظهارة المتوسطة الجنبي الخبيث.
العلاج الضوئي بالأشعة تحت الحمراء القريب (NIR-PIT) هو استراتيجية علاج السرطان التي تم تطويرها مؤخرا التي تجمع بين خصوصية الأجسام المضادة التي تستهدف الورم مع السمية الناجمة عن امتصاص ضوئي (IR700Dye) بعد التعرض لضوء NIR. وقد أبلغ عن فعالية NIR-PIT باستخدام مختلف الأجسام المضادة; ومع ذلك، أظهرت تقارير قليلة فقط التأثير العلاجي لهذه الاستراتيجية في نموذج تقويم العظام. في هذه الدراسة، نظهر مثالا على تقييم فعالية نموذج سرطان الرئة المنشور الجنبي، والذي عولج باستخدام NIR-PIT.
Introduction
لا يزال السرطان أحد الأسباب الرئيسية للوفيات على الرغم من عقود من البحث. أحد الأسباب هو أن العلاج الإشعاعي والعلاج الكيميائي تقنيات شديدة التوغل ، مما قد يحد من فوائدها العلاجية. تحظى العلاجات الخلوية أو الجزيئية المستهدفة، وهي تقنيات أقل توغلا، باهتمام متزايد. العلاج الضوئي هو طريقة العلاج التي تعزز بشكل تآزري التأثير العلاجي من خلال الجمع بين العلاج المناعي والعلاج الضوئي. يعزز العلاج المناعي مناعة الورم من خلال زيادة المناعة في البيئة الدقيقة للورم والحد من قمع المناعة ، مما يؤدي إلى تدمير الأورام في الجسم. يدمر العلاج الضوئي الأورام الأولية بمزيج من الحساسات الضوئية والأشعة الخفيفة ، وتعزز المستضدات الخاصة بالورم الصادرة من الخلايا السرطانية مناعة الورم. يمكن علاج الأورام بشكل انتقائي باستخدام أجهزة الحساسية الضوئية لأنها محددة وانتقائية للخلايا المستهدفة. طريقة العلاج الضوئي تشمل العلاج الضوئي (PDT) ، والعلاج الحراري الضوئي (PTT) ، والعلاجات القائمة على الكيمياء الضوئية1.
العلاج الضوئي بالأشعة تحت الحمراء القريب (NIR-PIT) هو طريقة تم تطويرها مؤخرا للعلاج الضوئي المضاد للتشوير الذي يجمع بين العلاج القائم على الكيماويات الضوئية والعلاج المناعي1،2. NIR-PIT هو علاج مستهدف جزيئيا يستهدف جزيئات سطح خلية محددة من خلال اقتران صبغة الفثالوسيانين السيليكونية القريبة من الأشعة تحت الحمراء ، IRdye 700DX (IR700) ، إلى جسم مضاد أحادي النسيلة (mAb). يتم تدمير غشاء الخلية من الخلية المستهدفة عند التشعيع مع ضوء NIR (690 نانومتر)3.
مفهوم استخدام العلاج بالضوء المستهدف من خلال الجمع بين الحساسات الضوئية التقليدية والأجسام المضادة أو PDT المستهدفة هو أكثر من ثلاثة عقود من العمر4،5. وقد حاولت الدراسات السابقة لاستهداف وكلاء PDT التقليدية عن طريق ربطها بالأجسام المضادة. ومع ذلك ، كان هناك نجاح محدود لأن هذه المترافقات كانت محاصرة في الكبد ، بسبب رهاب الماء من الحساسات الضوئية6،7. وعلاوة على ذلك، فإن آلية NIR-PIT مختلفة تماما عن آلية PDT التقليدية. تولد أجهزة الحساسية الضوئية التقليدية إجهاداأكسديا ينتج عن تحويل الطاقة الذي يمتص طاقة الضوء ، ويخلع إلى حالة متحمسة ، وينتقل إلى الحالة الأرضية ، ويسبب موت الخلايا المبرمج. ومع ذلك ، يسبب NIR-PIT نخرا سريعا عن طريق تدمير غشاء الخلية مباشرة عن طريق تجميع الأجهزة الحساسة للضوء على الغشاء من خلال تفاعل كيميائي ضوئي8. NIR-PIT متفوقة على PDT المستهدفة التقليدية في نواح كثيرة. تحتوي أجهزة الحساسية الضوئية التقليدية على معاملات انقراض منخفضة ، مما يتطلب ربط أعداد كبيرة من أجهزة الحساسية الضوئية بجزيء واحد من الأجسام المضادة ، مما قد يقلل من تقارب الربط. معظم أجهزة الحساسية الضوئية التقليدية هي مسعورة ، مما يجعل من الصعب ربط البخاخات الضوئية بالأجسام المضادة دون المساس بحماستها المناعية أو تراكم هدف الجسم الحي. تمتص الحساسات الضوئية التقليدية الضوء عادة في النطاق المرئي، مما يقلل من اختراق الأنسجة.
وقد تم الإبلاغ عن العديد من الدراسات على NIR-PIT التي تستهدف الأورام داخل الصدر مثل سرطان الرئة ورم الظهارة المتوسطة الجنبي الخبيث (MPM)9،10،11،12،13،14،15،16،17. ومع ذلك، إلا أن تقارير قليلة وصفت فعالية NIR-PIT في MPM نشر الجنبي أو نماذج سرطان الرئة9،10،11،12. ويعتقد أن نماذج الورم تحت الجلد xenograft لتكون نماذج الورم القياسية وتستخدم حاليا على نطاق واسع لتقييم آثار antitumor من العلاجات الجديدة18. ومع ذلك ، فإن البيئة الدقيقة للورم تحت الجلد ليست متساهلة لتطوير بنية نسيج مناسبة أو حالة تلخص بشكل صحيح النمط الظاهري الخبيث الحقيقي19،20،21،22. من الناحية المثالية ، ينبغي إنشاء نماذج أمراض العظام لتقييم أكثر دقة لآثار مضادات الورم.
هنا، نظهر طريقة لتقييم الفعالية في نموذج الماوس لسرطان الرئة الجنبي المنتشر، والذي عولج باستخدام NIR-PIT. يتم إنشاء نموذج فأر النشر الجنبي عن طريق حقن الخلايا السرطانية في تجويف الصدر وأكد باستخدام التلألؤ لوسيفراز. عولج الفأر بحقنة وريدية من mAb مترافقة مع IR700 وNIR التشعيع في الصدر. تم تقييم التأثير العلاجي باستخدام التلألؤ لوسيفيراز.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
أجريت جميع التجارب في الجسم الحي امتثالا لدليل رعاية واستخدام الموارد الحيوانية المختبرية التابع للجنة رعاية الحيوانات واستخدامها في جامعة ناغويا (الموافقة #2017-29438، #2018-30096، #2019-31234، #2020-20104). تم شراء فئران عارية متجانسة عمرها ستة أسابيع وصيانتها في مركز الحيوانات بجامعة ناغويا. عند إجراء العملية في الفئران ، تم تخديرهم بالإيزوفلوران (مقدمة: 4-5 ٪ ، الصيانة 2-3٪) ؛ تم الضغط على مخلب مع ملاقط لتأكيد عمق التخدير.
1. اقتران IR700 مع ماب
- حضانة mAb (1 ملغ، 6.8 نانومول) مع IR700 NHS استر (66.8 ملغ، 34.2 نانومول، 5 ملليمول / لتر في DMSO) في 0.1 مول / لترنا 2HPO4 (درجة الحموضة 8.6) في 15-25 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
- تنقية الخليط باستخدام عمود (على سبيل المثال، Sephadex). إعداد وغسل العمود مع برنامج تلفزيوني. ثم، تطبيق الخليط على العمود وجمع قطرة، والذي يحتوي على الأجسام المضادة IR700-مترافقة منقى. ويشار إلى هذا الجسم المضاد IR700 مترافق باسم الأجسام المضادة للضوء مترافق (APC).
- قياس تركيز البروتين وIR700 في APC.
- إعداد منحنيات المعايرة للبروتين وIR700 باستخدام مطياف.
- مزيج تركيزات قياسية من الألبومين مع مجموعة اختبار البروتين بعد بروتوكول عدة (انظر جدول المواد، Coomassie الأزرق اللامع (مصرف البحرين المركزي) تلطيخ البروتين). قياس امتصاص الألبومين في الطول الموجي 595 نانومتر، ورسم منحنى المعايرة (صيغة تقريب خطي) للبروتين باستخدام المعادلة التالية: ص = الفأس + ب (س: التركيز، ص: الامتصاص).
- الحصول على منحنيات المعايرة لIR700 مع امتصاص في 690 نانومتر باستخدام نفس الإجراء. يوصى بالتركيز القياسي ل IR700 عند 0.1-5 ميكرومتر (0.1954-9.77 ميكروغرام/مل).
- قياس تركيز البروتين وتركيز IR700 في APC باستخدام منحنى المعايرة [س = (ص ب)/أ (س: التركيز، ص: الامتصاص)].
- تحديد عدد الأصباغ IR700 ملزمة لكل ماب مع نتائج تركيز الضرس.
ملاحظة: من المهم تحديد العدد الأمثل من الجزيئات IR700 لكل جزيء ماب. عموما، ما يقرب من ثلاثة جزيئات IR700 ملزمة على جزيء واحد ماب ستكون فعالة على حد سواء في المختبر وفي الجسم الحي. العديد من IR700 ملزمة لكل الأجسام المضادة (على سبيل المثال، ستة) يجعل من الأسهل أن تكون محاصرين في الكبد أثناء التجارب في الجسم الحي. وكانت نسبة الأجسام المضادة ملزمة IR700 في حدود 1:2-1:4. تم تخفيض نسبة IR700، إذا لزم الأمر.
- تنفيذ الصوديوم دودسيل كبريتات البولي أكريلاميد هلام electrophoresis (SDS-PAGE) كتأكيد لتشكيل APC. صورة هلام في 700 نانومتر باستخدام صور الفلورسنت، وصمة عار البروتين في هلام باستخدام عدة تلطيخ البروتين بعد بروتوكول عدة (انظر جدول المواد،تلطيخ البروتين مصرف البحرين المركزي).
2. إنشاء نموذج نشر الجنبي
- إعداد الخلايا المستهدفة المعبرة عن لوسيفيراز وتعليق 1.0 × 106 خلايا مستهدفة في 100 ميكرولتر من المالحة العازلة بالفوسفات (PBS)
ملاحظة: الخلايا السرطانية داخل الصدر مثل سرطان الرئة و MPM مناسبة كخلايا مستهدفة. تم إعداد الخلايا المعبرة عن لوسيفيراز عن طريق انتقال جين لوسيفيراز، وتم تأكيد التعبير العالي عن لوسيفراز بعد > 10 مقاطع من الخلايا. تم استزراع الخلايا في وسط مكمل بمصل بقري جنيني 10٪ وبينسلين (100 وحدة في اللولب/مل) وستريبتومايسين (100 ملغم/مل). تم تعديل عدد الخلايا وفقا لمعدل نمو الورم والمسار الزمني للعلاج (1.0. × 105-6.0 × 106 خلايا / وزن الجسم). - إعداد الفئران العارية الإناث المثلية التي تبلغ من العمر 8-12 أسبوعا ، بوزن جسم أفضل من 19-21 جراما.
- تخدير الفئران أثناء الإجراء مع isoflurane (مقدمة: 4-5٪، والصيانة 2-3٪). اضغط على الذيل مع ملاقط للتأكد من عدم وجود رد فعل.
- جعل سدادة مع رغوة البوليسترين وإرفاق سدادة لإبرة 30 G بحيث تبقى في تلميح 5 ملم لمنع إصابة الرئة. ثني طرف الإبرة مع ملقط نظيفة أو عن طريق الضغط عليه ضد كائن الثابت تنظيفها مع 70٪ EtOH لتجنب استرواح الصدر (الشكل 1).
تحذير: يجب الحرص على عدم اختراق النفس. استخدام ملقط لثني الإبرة. لا تحمل سدادة عند إرفاقه إلى الإبرة. من الآمن وضع سدادة قبل ملء الخلايا في الحقنة. - ملء حقنة (1 مل) مع الخلايا المستهدفة، وإرفاق إبرة 30G مع سدادة.
- تطهير صدر الحيوان مع 70٪ EtOH قبل الإجراء.
- ثقب إبرة في صدر الفأر من خلال الفضاء الوربي. بسبب المقاومة في حين ضرب ضد الأضلاع في ذلك الوقت، تحركت طرف إبرة صعودا وهبوطا. بعد المرور عبر الفضاء الوربي، اضغط على الحقنة ضد الماوس وحقن 100 ميكرولتر من الخلايا المستهدفة (الشكل 2).
ملاحظة: يتنفس الفأر بعمق عندما تدخل الإبرة تجويف الصدر بشكل صحيح. مع الانحناء من طرف الإبرة، يمكن تجنب استرواح الصدر وحقن غير مناسب من الخلايا في الرئة.
ملاحظة: ينصح ثقب جدار الصدر الأيمن لتجنب خطر ثقب جدار القلب. - لفة الماوس 2-3 مرات لنشر الخلايا في جميع أنحاء تجويف الصدر.
- أعد الماوس إلى قفص نظيف ودافئ وراقبه حتى يصبح متنقلا. بعد العملية، سوف يستيقظ الفأر من التخدير ويتصرف بشكل طبيعي.
3. قياس الإضاءة الحيوية
ملاحظة: يتم سرد البرنامج المستخدم للحصول على البيانات في جدول المواد.
- لتأكيد توليد نموذج النشر الجنبي ، قم بتقييم صور الإضاءة الحيوية كل يوم بعد حقن الخلايا في تجويف الصدر.
- تخدير الفئران (الخطوة 2.3) وحقن intraperitoneally مع D-لوسيفيرين (15 ملغ / مل, 200 ميكرولتر).
- تأكد من أن الفأرة تتنفس بشكل طبيعي قبل وبعد التصوير. استخدام سخان إذا لزم الأمر لمنع انخفاض حرارة الجسم أثناء التخدير.
- بعد عشر دقائق من الحقن، قم بتعيين الماوس في معدات قياس التصوير بالإضاءة الحيوية (BLI). للحصول على الصورة، افتح لوحة التحكم في الاستحواذ على البرنامج. حدد الإنارة والصورة والتراكب (الشكل 3).
- تعيين وقت التعرض ك تلقائي. تعيين Binning صغيرة.
- تعيين و / وقف 1 للإنارة و 8 للصورة؛ و / وقف تسيطر على كمية الضوء التي تلقاها جهاز كشف مشحونة مقرونة.
- تعيين حقل العرض ك C.
- بمجرد أن تكون عينة الماوس جاهزة للتصوير، انقر فوق اكتساب للحصول على التصوير. تم اختيار الفئران التي لها نشاط لوسيفيراز كاف لمزيد من الدراسات.
ملاحظة: يظهر نموذج نشر الجنبي مناسبة التلألؤ قوية على موقع منتشر في الصدر عند النظر إليها من الجانب البطني. إذا لم يتم نشر صور BLI في الصدر ، وفقط في موقع الحقن ، فقد يتم زرع الورم تحت الجلد. - بعد عرض الصورة، قم بتعيين تنسيق العرض إلى التألق. افتح لوحة لوحة الأدوات (الشكل 4A).
- حدد أدوات عائد الاستثمار. نوصي باستخدام الدائرة لنطاق منطقة الإنارة الحيوية على الصور.
- انقر فوق قياس ROIs لقياس كثافة الإنارة الحيوية السطحية(الشكل 4B).
- استخدم تكوين القياس في الركن الأيسر من لوحة قياس عائد الاستثمار لتحديد القيم/المعلومات المطلوبة. تصدير جدول البيانات هذا كملف .csv (الشكل 4C).
- استخدم قيم Total Flux (p/s) كتقيم كمي لشدة الإنارة الحيوية في ملف .csv.
4. التصوير المقطعي للتسليم المنتشر (DLIT)
ملاحظة: يتم سرد البرنامج المستخدم للحصول على البيانات في جدول المواد.
- قم بتشغيل الزر "مسلح بالأشعة السينية".
- تخدير الفئران (الخطوة 2.3) ومن ثم حقن D-لوسيفيرين (15 ملغم / مل، 200 ميكرولتر) intraperitoneally في الفئران. لتصوير DLIT باستمرار من 3.2 إلى 3.7، تخطي هذه الخطوة.
- بعد عشر دقائق من الحقن، قم بتعيين الماوس في معدات BLI.
- افتح لوحة التحكم في الاستحواذ على البرنامج. حدد Luminescent, صورة , CT, ماوس واحد قياسي, وتراكب. وكانت الإعدادات الأخرى هي نفسها كما في 3.4-3.6(الشكل 5A).
- حدد معالج التصوير على لوحة التحكم اكتساب.
- حدد الإضاءة الحيوية ثم DLIT (الشكل 5B).
- حدد اليراع كطول موجي لقياس (الشكل 5C).
- تعيين موضوع التصوير كما Mouse، معلمات التعرض كإعدادات تلقائية، حقل الرؤية ك C-13.4 سم، وارتفاع الموضوع ك 1.5 سم ( الشكل5D).
- سيتم إنتاج دفع الأشعة السينية عندما تنشيط. الحصول على.
- افتح بيانات الصورة التسلسلية CT.
- فتح تضاريس السطح على لوحة الأدوات. حدد إظهار (الشكل 6A).
- ضبط عتبة كما تظهر الشاشة الأرجواني فقط سطح الجسم (الشكل 6B). ثم حدد الماوس عارية الموضوع وانقر فوق إنشاء سطح. تأكد من رسم مخطط الماوس بدقة(الشكل 6C).
- فتح لوحة أدوات، DLIT 3D خصائص إعادة الإعمار التبويب. حدد خصائص الأنسجة كما أنسجة الماوس والطيف المصدر كما اليراعة (الشكل 6D). بعد ذلك، افتح علامة التبويب تحليل وتأكد من البيانات لكل بيانات الطول الموجي المحددة. وأخيرا، انقر فوق الزر إعادة البناء (الشكل 6E).
- تأكد من وجود BLI في تجويف الصدر في صورة DLIT المكونة.
5. NIR-PIT لنموذج النشر الجنبي في الجسم الحي
- قياس جرعة خفيفة من الطول الموجي 690 نانومتر (NIR) ليزر مع متر الطاقة، وضبط الإخراج إلى 100 كيلوواط / سم2.
ملاحظة: ضوء الليزر متماسك مع حجم لفائف دقيق. وبالتالي، فإن الطاقة الخفيفة لا تكاد تتغير بغض النظر عن المسافة في غضون 50 سم. إذا كان هناك العديد من الأحداث السلبية، مثل الحروق، والحد من الناتج في حدود 40 كيلوواط / سم2. - تنظيف الذيل مع 70٪ EtOH وحقن عن طريق الوريد APC (100 ميكروغرام) عن طريق الوريد الذيل 24 ح قبل إشعاع NIR. ممارسة الضغط على موقع الحقن للسيطرة على النزيف.
ملاحظة: ضبط حجم APC إلى 50-200 ميكرولتر للحقن. - تخدير الفئران (الخطوة 2.3) ، ووضعها على ظهورهم. لتجنب إشعاع NIR إلى الموقع غير المستهدف ، دروع المواقع الأخرى مع رقائق الألومنيوم(الشكل 7A). تشعيع مع ضوء NIR مع ليزر من 100 J/cm2; إذا تم نشر الورم مرة أخرى إلى البطن، يمكن تقسيم جرعة تشعيع ضوء NIR في اتجاهات متعددة(الشكل 7B).
ملاحظة: ضبط الجرعة في 30-150 J/cm2 اعتمادا على النتائج في المختبر والأحداث الضائرة مثل الحروق. - عندما يكتمل إشعاع NIR والفأر مستيقظا، إعادته إلى القفص.
- مراقبة BLI وقياس العائد على الاستثمار مع مرور الوقت (كل يوم) (انظر 3.2-3.12).
- للتصوير السابق في الجسم الحي، قتل الفئران مع ثاني أكسيد الكربون 24 ساعة بعد حقن APC، مباشرة قبل تشعيع NIR.
- لمراقبة داخل الصدر من الماوس، وإزالة الصدر وقطع الأضلاع والقص. التقط صورة الفلورسينس (700 نانومتر) إلى جانب عنصر التحكم بدون إدارة APC. ثم، تطبيق D-لوسيفيرين (150 ميكروغرام / مل) على الصدر المكشوفة، واتخذت BLI (الرجوع 3.2-3.7).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تم اقتران الأجسام المضادة للبودوبلانين NZ-1 مع IR700 لتوليد نيوزيلندي-1-IR700. أكدنا ربط نيوزيلندي-1 و IR700 على SDS-PAGE(الشكل 8). تم إعداد لوسيفيراز التعبير عن H2373 (H2373 لوك) عن طريق تحويل خلايا ورم الظهارة المتوسطة الخبيثة (H2373) مع جين لوسيفيراز10.
قمنا بالتخدير 8-12 أسبوعا أنثى homozygote الفئران العارية الهومية وحقن 1 × 105 H2373-luc الخلايا في تجويف الصدر. تمت الإشارة إلى يوم حقن الخلايا السرطانية في الفئران على أنه اليوم الأول.
في اليوم 4، تم إجراء BLI وDLIT بعد حقن D-لوسيفيرين (15 ملغم / مل، 200 ميكرولتر) intraperitoneally، وتم اختيار الفئران مع نشاط لوسيفيراز كافية في تجويف الصدر لمزيد من الدراسات (الشكل 9). تم حقن مائة ميكروغرام من NZ-1-IR700 (100 ميكرولتر) عن طريق الوريد عبر الوريد الذيل. تم حقن مجموعة التحكم مع برنامج تلفزيوني (100 ميكرولتر).
في اليوم الخامس، تم التضحية بشئنين باستخدام اختناق ثاني أكسيد الكربون من أجل الجسم الحي. وأظهر الفأر حقن NZ-1-IR700 كل من IR700 عالية الفلورسينس وأنشطة لوسيفيراز في أورام الصدر، مشيرا إلى أن حقن عن طريق الوريد NZ-1-IR700 وصلت إلى مواقع الورم الجنبي المنشورة(الشكل 10).
لتقييم تأثير NIR-PIT في نموذج الماوس المنشور الجنبي، تم تطبيق ضوء NIR عند 15 J/cm2 من اتجاهين (إجمالي 30 J/cm2)عند 40 كيلوواط/سم2 عبر الجلد في اليوم 5 (تم تشعيع ضوء NIR خارجيا)، يليه المسلسل BLI. لم يتم تشعيع مجموعة التحكم بضوء NIR.
بعد علاج الفئران مع NIR-PIT ، أظهرت المجموعة المعالجة انخفاضا في نشاط لوسيفيراز. ومع ذلك، أظهرت وحدة الضوء النسبي في مجموعة التحكم زيادة تدريجية (* p < 0.05 مقابل التحكم، t-test)(الشكل 11).
الشكل 1:جهاز سهل الصنع لزرع الخلايا. إرفاق سدادة مصنوعة من رغوة البوليسترين إلى إبرة 30G بحيث تبقى في تلميح 5 ملم. يجب أن تكون عازمة غيض من الإبرة لتجنب استرواح الصدر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2:حقن الخلايا المستهدفة في تجويف الصدر. تحويل الماوس جانبية واخترق الإبرة في الماوس نحو الرئة. منذ سدادة وإبرة تلميح عازمة، الإبرة يدخل تجويف الصدر دون التمسك الرئتين. حقن الخلايا المستهدفة أثناء الضغط على الإبرة ضد الماوس. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: لوحة التحكم في الاستحواذ. حدد الإنارة والصورة والتراكب. تعيين وقت التعرض للسيارات، Binning الصغيرة، و / وقف كما 1 للضوء و 8 للصورة ، ومجال الرؤية كما جيم. بمجرد أن تكون عينة الماوس جاهزة للتصوير، انقر فوق اكتساب للحصول على التصوير. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: القياس (BLI). (A) لوحة لوحة الأدوات. حدد أدوات عائد الاستثمار. نوصي الدائرة بنطاق منطقة الإنارة الحيوية على الصور. (ب)BLI القياس الكمي. بعد تحديد عائد الاستثمار في كل صورة، انقر فوق قياس ROIs لتحليل. (ج)معلومات القياس الكمي. استخدم تكوين القياس في الركن الأيسر من لوحة قياسات عائد الاستثمار لتحديد القيم/المعلومات المطلوبة. تصدير جدول البيانات هذا كملف .csv. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5:اقتناء DLIT. (أ) لوحة التحكم في الاستحواذ على DLIT. حدد Luminescent، والصورة، والتصوير المقطعي، وستاندرد وان ماوس، وتراكب. إعدادات أخرى هي نفسها 3.4-3.6(الشكل 3). (ب) لوحة معالج التصوير. حدد الإضاءة الحيوية، وDLIT. (C) حدد الطول الموجي للقياس. حدد الطول الموجي كاليراعة. (D) تعيين موضوع التصوير كما الماوس، معلمات التعرض والإعدادات التلقائية، مجال الرؤية كما C - 13.4 سم، وارتفاع الموضوع كما 1.5 سم. ثم انقر فوق سيتم إنتاج الأشعة السينية عندما تنشيط. اقتبس. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6: إعادة بناء DLIT. (أ) لوحة لوحة الأدوات. فتح تضاريس السطح على لوحة الأدوات. حدد إظهار. (ب) ضبط التعرف على سطح الماوس. ضبط عتبة كما تظهر الشاشة الأرجواني سطح الجسم فقط. حدد موضوع الفأرة العارية، ثم انقر فوق إنشاء سطح. تأكد من رسم المخطط التفصيلي للفأرة بدقة. (C) لوحة أدوات. افتح علامة التبويب خصائص إعادة الإعمار ثلاثية الأبعاد DLIT، وحدد خصائص الأنسجة كأنسجة الماوس وطيف المصدر كيراعة. (D) افتح علامة التبويب تحليل وحدد البيانات لكل بيانات الطول الموجي. (E) انقر فوق الزر إعادة البناء. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 7: NIR التشعيع. (أ) درع بطنها مع رقائق الألومنيوم لمنع تشعيع NIR إلى البطن. (ب) ضوء NIR المشعع باستخدام الليزر حيث BLI قوية؛ في بعض الحالات، يتم تقسيم الليزر NIR في اتجاهات متعددة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 8: SDS-الصفحة. تأكيد ناجح من نيوزيلندي-1-IR700 مترافق على هلام SDS-PAGE (اليسار، تلطيخ الأزرق الغرواني؛ اليمين، مضان في قناة 700 نانومتر). المخفف نيوزيلندي-1 بمثابة السيطرة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 9: DLIT. تأكيد الخلايا السرطانية المعبرة عن لوسيفيراز في تجويف الصدر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 10: التصوير في الجسم الحي السابق. توصيف نموذج MPM المنشور الجنبي 24 ساعة بعد حقن NZ-1-IR700 مع BLI. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 11: تأثير Antitumor من NIR-PIT على نموذج نشر الجنبي. (أ) يظهر نظام NIR-PIT المستهدف بالبودوبلانين في خط. بودوبلانين المستهدفة NIR-PIT مع نيوزيلندي-1-IR700 على نموذج نشر الجنبي مع أورام H2373 لوك. يظهر BLI من النموذج المنشور الجنبي. (ب)في حين أن أنشطة لوسيفيراز التي تم قياسها مع BLI لم يزد في مجموعة NIR-PIT، أظهرت مجموعة التحكم زيادة تدريجية جنبا إلى جنب مع نمو الورم. (ن ≥ 3 في كلتا المجموعتين ، تي الاختبار). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
في هذه الدراسة، أظهرنا طريقة لقياس التأثير العلاجي ل NIR-PIT على نموذج النشر الجنبي لل MPM. وقد تم قتل الخلايا بشكل انتقائي للغاية باستخدام NIR-PIT؛ وهكذا، فإن الأنسجة الطبيعية تضررت بالكاد23،24،25. مع هذا النوع من القتل الانتقائي للخلايا، تبين أن NIR-PIT آمنة في النماذج المنشورة9،26. ومع ذلك، يمكن استخدام طرق بديلة في بعض الخطوات. وقد تم الإبلاغ عن أساليب مختلفة لنموذج النشر الجنبي27،28،29،30. اخترنا نموذج الحقن لأنه إجراء بسيط أقل إرهاقا للفئران. استخدمنا BLI لقياس التأثير العلاجي ل NIR-PIT لأننا نستطيع التقييم الكمي مع الفئران الحية. فعلى سبيل المثال، يمكن أن يكون التصوير المقطعي للانبعاثات البوزيترونية/التصوير المقطعي المحوسب (PET/CT)27 طريقة بديلة لتقييم حجم الورم في نموذج النشر الجنبي. وقد أبلغ عن NIR-PIT مع BLI في نماذج تقويم العظام الأخرى; يمكن استخدام NIR-PIT لنموذج نشر البطن ، نموذج الورم النقيلي المتعدد في الرئة ، وورم الدماغ12،26،31،32،33،34،35،36. حتى بؤر الورم النقيلي الصغيرة يمكن ملاحظتها مع BLI ، ويمكن إجراء NIR-PIT11،12.
وصفنا بعض أجزاء البروتوكول بناء على التجارب الأولية. أولا، الوقت من إدارة APC إلى إشعاع NIR. تم تقييم الدوائية مقدما باستخدام نموذج الورم تحت الجلد. APC قمم في الورم 24 ح بعد التدخل عن طريق الوريد الذيل باستخدام ماب; يمكن إجراء إشعاع NIR 24 ساعة بعد إدارة APC9،10،11،12. ثانيا، تختلف الجرعة الخفيفة NIR المطلوبة لقتل الخلايا السرطانية في NIR-PIT اعتمادا على الأجسام المضادة وخطوط الخلايا المستهدفة، والتي من المتوقع استخدام نتائج المختبر.
هذه الدراسة لديها بعض القيود. أولا، تم توزيع الأورام على نطاق واسع في تجويف الصدر، ولم يكن من الممكن قياس الطاقة المشععة NIR بدقة. الطول الموجي للضوء الإثارة NIR (الذروة في 690 نانومتر) يسمح اختراق ما لا يقل عن 2-3 بوصة في الأنسجة37. لذلك ، في حالة الفئران ، يصل ضوء NIR إلى تجويف الصدر حتى خارجيا. حاليا، وتستخدم أجهزة الليزر NIR لنموذج نشر الماوس الجنبي9،10،11،12. ومع ذلك، في الاستخدام السريري الفعلي، ونحن نعتزم استخدام الألياف البصرية الدقيقة لتشعيع تجويف داخل الصدر بأكمله عن طريق أنبوب الصرف الصدري34. ثانيا، جرعة NIR-الإشعاع محدودة اعتمادا على خصوصية mAb إلى المستضدات المعبر عنها على الخلايا السرطانية. ربط غير محددة من APC يمكن أن يسبب تلف الجهاز غير متوقع.
في الختام، قدمنا طريقة لتقييم التأثير العلاجي ل NIR-PIT مع BLI في نموذج النشر الجنبي لل MPM.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ويعلن أصحاب البلاغ أنه ليس لديهم مصالح مالية متنافسة.
Acknowledgments
اي
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25w/v% Trypsin-1mmol/l EDTA 4Na Solution with Phenol Red | Wako | 209-016941 | for cell culture |
| 1mL syringe | TERUMO | SS-01T | for mice experiment |
| 30G needle | Nipro | 1907613 | for mice experiment |
| BALB/cSlc-nu/nu | Japan SLC | ||
| Collidal Blue Staining Kit | Invitrogen | LC6025 | use for gel protein staining |
| Coomassie (bradford) Plus protein assay | Thermo Fisher Scientific Inc (Waltham, MA, USA) | PI-23200 | for measuring the APC concentration |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Wako | 043-07216 | use for conjugation of IR700 |
| D-Luciferin (potassium salt) | Cayman Chemical | 14681 | for bioluminescence imaging and DLIT |
| GraphPad Prism7 | GraphPad software | for statistical analysis | |
| Image Studio | Li-Cor Biosciences | for analyzing 700 nm fluorescent image | |
| IRDye 700DX Ester Infrared Dye | LI-COR Bioscience (Lincoln, NE, USA) | 929-70011 | |
| isoflurane | Wako | 095-06573 | for mice anesthesia |
| IVIS Spectrum CT | PerkinElmer | for capturing bioluminescent image and DLIT | |
| Living Image | PerkinElmer | for analyzing bioluminescent image and DLIT | |
| Na2HPO4 | SIGMA-ALDRICH (St. Louis, MO, USA) | S9763 | use for conjugation of IR700 |
| NIR Laser | Changchun New Industries Optoelectronics Technology | MRL-III-690R | for NIR irradiation |
| Novex WedgeWell 4 to 20%, Tris-Glycine, 1.0 mm, Mini Protein Gel, 12 well | Invitrogen | XP04202BOX | use for SDS-PAGE |
| NuPAGE LDS Sample Buffer (x4) | Invitrogen | NP0007 | use for SDS-PAGE |
| Optical power meter | Thorlabs (Newton, NJ, USA) | PM100 | for measuring the output of the NIR laser |
| PBS(-) | Wako | 166-23555 | |
| Pearl Trilogy imaging system | Li-Cor Biosciences | for capturing 700 nm fluorecent image | |
| Penicilin-Streptomycin Solution (x100) | Wako | 168-23191 | for cell culture |
| Puromycin Dihydrochloride | ThermoFisher | A1113803 | for luciferase transfection |
| RediFect Red-Fluc-Puromycin Lentiviral Prticles | PerkinElmer | CLS960002 | for luciferase transfection |
| RPMI-1640 with L-glutamine and Phenol Red | Wako | 189-02025 | for cell culture |
| Sephadex G25 column (PD-10) | GE Healthcare (Piscataway, NJ, USA) | 17-0851-01 | use for conjugation of IR700 |
| UV-1900i | Shimadzu | for measuring the APC concentration |
References
- Xu, X., Lu, H., Lee, R. Near Infrared Light Triggered Photo/Immuno-Therapy Toward Cancers. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, (2020).
- Mitsunaga, M., et al. Cancer cell-selective in vivo near infrared photoimmunotherapy targeting specific membrane molecules. Nature Medicine. 17, 1685-1691 (2011).
- Kobayashi, H., Choyke, P. L.
- Oseroff, A. R., Ohuoha, D., Hasan, T., Bommer, J. C., Yarmush, M. L. Antibody-targeted photolysis: Selective photodestruction of human T-cell leukemia cells using monoclonal antibody-chlorin e6 conjugates. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 83, 8744-8748 (1986).
- Mew, D., Wat, C. K., Towers, G. H., Levy, J. G. Photoimmunotherapy: treatment of animal tumors with tumor-specific monoclonal antibody-hematoporphyrin conjugates. Journal of Immunology. 130, 1473-1477 (1983).
- Vrouenraets, M. B., et al. Development of meta-tetrahydroxyphenylchlorin-monoclonal antibody conjugates for photoimmunotherapy. Cancer Research. 59, 1505-1513 (1999).
- Goff, B. A., et al. Photoimmunotherapy and biodistribution with an OC125-chlorin immunoconjugate in an in vivo murine ovarian cancer model. British Journal of Cancer. 70, 474-480 (1994).
- Sato, K., et al. Photoinduced Ligand Release from a Silicon Phthalocyanine Dye Conjugated with Monoclonal Antibodies: A Mechanism of Cancer Cell Cytotoxicity after Near-Infrared Photoimmunotherapy. ACS Central Science. 4, 1559-1569 (2018).
- Sato, K., Nagaya, T., Choyke, P. L., Kobayashi, H. Near infrared photoimmunotherapy in the treatment of pleural disseminated NSCLC: Preclinical experience. Theranostics. 5, 698-709 (2015).
- Nishinaga, Y., et al. Targeted Phototherapy for Malignant Pleural Mesothelioma: Near-Infrared Photoimmunotherapy Targeting Podoplanin. Cells. 9, 1019 (2020).
- Sato, K., et al. Near infrared photoimmunotherapy prevents lung cancer metastases in a murine model. Oncotarget. 6, 19747-19758 (2015).
- Sato, K., Nagaya, T., Mitsunaga, M., Choyke, P. L., Kobayashi, H. Near infrared photoimmunotherapy for lung metastases. Cancer Letters. 365, 112-121 (2015).
- Isobe, Y., et al. Near infrared photoimmunotherapy targeting DLL3 for small cell lung cancer. EBioMedicine. 52, 102632 (2020).
- Nakamura, Y., et al. Near infrared photoimmunotherapy in a transgenic mouse model of spontaneous epidermal growth factor receptor (EGFR)-expressing lung cancer. Molecular Cancer Therapeutics. 16, 408-414 (2017).
- Nagaya, T., et al. Near infrared photoimmunotherapy with avelumab, an anti-programmed death-ligand 1 (PD-L1) antibody. Oncotarget. 8, 8807-8817 (2017).
- Sato, K., et al. Spatially selective depletion of tumor-associated regulatory T cells with near-infrared photoimmunotherapy. Science Translational Medicine. 8, (2016).
- Sato, K., et al. Comparative effectiveness of light emitting diodes (LEDs) and lasers in near infrared photoimmunotherapy. Oncotarget. 7, 14324-14335 (2016).
- Sato, K., Choyke, P. L., Kobayashi, H. Photoimmunotherapy of Gastric Cancer Peritoneal Carcinomatosis in a Mouse Model. PLoS One. 9, 113276 (2014).
- McLemore, T. L., et al. Comparison of intrapulmonary, percutaneous intrathoracic, and subcutaneous models for the propagation of human pulmonary and nonpulmonary cancer cell lines in athymic nude mice. Cancer Research. 48, 2880-2886 (1988).
- Manzotti, C., Audisio, R. A., Pratesi, G. Importance of orthotopic implantation for human tumors as model systems: relevance to metastasis and invasion. Clinical & Experimental Metastasis. 11, 5-14 (1993).
- Lwin, T. M., Hoffman, R. M., Bouvet, M. Advantages of patient-derived orthotopic mouse models and genetic reporters for developing fluorescence-guided surgery. Journal of Surgical Oncology. 118, 253-264 (2018).
- Sordat, B. C. M. From Ectopic to Orthotopic Tumor Grafting Sites: Evidence for a Critical Role of the Host Tissue Microenvironment for the Actual Expression of the Malignant Phenotype. , Humana Press. Cham. 43-53 (2017).
- Sato, K., et al. Photoimmunotherapy: comparative effectiveness of two monoclonal antibodies targeting the epidermal growth factor receptor. Molecular Oncology. 8, 620-632 (2014).
- Nakajima, T., et al. The effects of conjugate and light dose on photo-immunotherapy induced cytotoxicity. BMC Cancer. 14, 389 (2014).
- Nagaya, T., et al. Near infrared photoimmunotherapy of B-cell lymphoma. Molecular Oncology. 10, 1404-1414 (2016).
- Sato, K., et al. Near infrared photoimmunotherapy in the treatment of disseminated peritoneal ovarian cancer. Molecular Cancer Therapeutics. 14, 141-150 (2015).
- Colin, D. J., Bejuy, O., Germain, S., Triponez, F., Serre-Beinier, V. Implantation and monitoring by pet/ct of an orthotopic model of human pleural mesothelioma in athymic mice. Journal of Visualized Experiments. 2019, (2019).
- Opitz, I., et al. Local recurrence model of malignant pleural mesothelioma for investigation of intrapleural treatment. European Journal of Cardio-Thoracic Surgery. 31, 772-778 (2007).
- Bunn, P. A., Kelly, K. New chemotherapeutic agents prolong survival and improve quality of life in non-small cell lung cancer: a review of the literature and future directions. Clinical Cancer Research. 4, 1087-1100 (1998).
- Astoul, P., Wang, X., Hoffman, R. Patient-like nude-mouse and scid-mouse models of human lung and pleural cancer (review). International Journal of Oncology. 3, 713-718 (1993).
- Yamaguchi, H., Pantarat, N., Suzuki, T., Evdokiou, A. Near-infrared photoimmunotherapy using a small protein mimetic for HER2-overexpressing breast cancer. International Journal of Molecular Sciences. 20, (2019).
- Jing, H., et al. Imaging and selective elimination of glioblastoma stem cells with theranostic Near-Infrared-Labeled CD133-Specific antibodies. Theranostics. 6, 862-874 (2016).
- Burley, T. A., et al. Near-infrared photoimmunotherapy targeting EGFR-Shedding new light on glioblastoma treatment. International Journal of Cancer. 142, 2363-2374 (2018).
- Nagaya, T., et al. Near infrared photoimmunotherapy using a fiber optic diffuser for treating peritoneal gastric cancer dissemination. Gastric Cancer. 22, 463-472 (2019).
- Nagaya, T., et al. Endoscopic near infrared photoimmunotherapy using a fiber optic diffuser for peritoneal dissemination of gastric cancer. Cancer Science. 109, 1902-1908 (2018).
- Harada, T., et al. Near-infrared photoimmunotherapy with galactosyl serum albumin in a model of diffuse peritoneal disseminated ovarian cancer. Oncotarget. 7, 79408-79416 (2016).
- Journals, O. JNCI Journal of the National Cancer Institute Way to Better DNA. Annals of Internal Medicine. 37, 1-9 (2008).
