Summary
在这里，我们提出了一个简单而有效的方法来从成年小鼠睾丸中分离活的美病细胞和后美生菌细胞。使用低细胞毒性、紫罗兰兴奋的DNA结合染料和荧光激活细胞分选，可以分离高度丰富的精子致原细胞群，用于许多下游应用。
Abstract
分离美的精子细胞对于研究美因病和精子生成背后的分子机制至关重要。虽然有既定的细胞隔离协议使用 Hoechst 33342 染色结合荧光激活细胞分选，但它需要配备紫外线激光的细胞分拣机。在这里，我们描述一个细胞隔离协议使用染料循环紫罗兰（DCV）污渍，低细胞毒性DNA结合染料结构类似于霍赫斯特33342。DCV 可以同时受到紫外线和紫罗兰激光器的兴奋，从而提高了设备选择的灵活性，包括未配备紫外线激光的电池分拣机。使用该协议，可以分离出三个活细胞亚群在美的正头 I，包括麻黄素/酶，帕奇滕，和二苯甲酸精子细胞，以及后美的圆形精子。我们还描述了一个协议，用于准备从鼠标睾丸的单细胞悬浮。总体而言，该过程需要很短的时间才能完成（4-5 小时取决于所需的单元数量），这有利于许多下游应用。
Introduction
精子生成是一个复杂的过程，其中一小群精子干细胞维持着大量精子在整个成年生中连续生产1，2。在精子生成过程中，动态染色质重塑发生在精子生成细胞经历美病产生单倍体精子3，4，5。分离美的精子细胞对于分子研究至关重要，并建立了几种不同的分离美亚精子细胞的方法，包括沉积分离6、7和荧光活性细胞分选（FACS）8、9、10、11、12、13、14、15、16、17。但是，这些方法有技术限制。虽然沉积基分离产生大量的细胞5，6，7，它是劳动密集型的。已建立的基于FACS的方法使用Hochst 33342（Ho342）根据DNA含量和光散射特性分离美的精子细胞，并要求FACS细胞分拣机配备紫外线（UV）激光8，9，10，11。基于FACS的替代方法要求转基因小鼠线表达荧光蛋白，精子生成12的同步，或细胞固定和抗体标签，不兼容分离活细胞13。虽然有另一种方法使用细胞渗透DNA结合染料，DyeCycle绿色染色14，15，16，17，此方法被推荐用于分离精子细胞从幼年睾丸。因此，迫切需要开发一种简单而坚固的分离方法，用于活体精子细胞，可应用于任何年龄的小鼠菌株，并可以使用任何 FACS 细胞分拣机进行。
在这里，我们描述这样一个长期寻求的细胞隔离协议使用染料循环紫罗兰（DCV）污渍。DCV是一种低细胞毒性，细胞渗透DNA结合染料结构类似于Ho342，但与激发光谱转向紫罗兰范围18。此外，与 DCG 相比，DCV 具有更广泛的发射频谱。因此，它可以通过紫外线和紫罗兰激光器，从而提高设备的灵活性，允许使用不配备UV激光的FACS细胞分拣机。此处介绍的 DCV 协议使用二维分离，具有 DCV 蓝色和 DCV 红色，模仿 Ho342 协议的优势。凭借这一优势，我们的DCV协议使我们能够从成人睾丸中分离出高度丰富的生殖细胞。我们提供详细的浇注方案，从一只小鼠的成年小鼠睾丸（从两个睾丸）分离出活的精子细胞。我们还描述了一个高效和快速的协议，用于准备单细胞悬浮从鼠标睾丸，可用于此细胞隔离。该程序需要很短的时间才能完成（准备单细胞悬浮 - 1小时，染色染色 - 30分钟，细胞分选 - 2-3小时：总计 - 4-5小时，视所需细胞数量不同; 图1）。细胞分离后，可以完成广泛的下游应用，包括RNA-seq、ATAC-seq、ChIP-seq和细胞培养。
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Protocol
该协议遵循机构动物护理和使用委员会的准则（协议号）。IACUC2018-0040）在辛辛那提儿童医院医疗中心。
1. 用于制备睾丸悬浮液的设备和试剂设置
- 将每种酶储存在1x汉克斯的平衡盐溶液（HBSS）中，储存在-20°C（表1）。
注：在实验前随时准备。 - 实验前一天：在4°C下用胎儿牛血清（FBS）收集管（1.5 mL管）。
- 实验当天：将水浴设置为37°C。
- 在37°C下预热Dulbecco的改性鹰介质（DMEM），并在15 mL离心管中为每个样品准备2 mL的1x分离缓冲液（表1）。
注：为两个睾丸准备了 2 mL 分离缓冲器。有关分离缓冲区配方，请参阅表 1。
2. 动物解剖和睾丸细胞悬浮的准备
- 牺牲一只8周大的雄性老鼠，在二氧化碳室中离开至少10分钟。
- 去除睾丸，并放在含有 2 mL 冰冷磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 的 60 mm 培养皿上。
- 从睾丸上取下图尼卡阿尔布吉纳。用钳子轻轻分离，稍微分散半尼的管。
- 将半尼性管转到 100 mm 培养皿中，用一滴新的冰冷 PBS 和用钳子轻轻解开半尼性管。重复此洗涤 3 次，以尽可能去除间位细胞。
- 在含有2 mL分离缓冲液的15 mL管中孵育半尼特管，在37°C下孵育20分钟。
- 使用 1000 μL 微管轻轻移液管 20 次。
- 孵育6分钟。重复轻轻移液20次。
- 孵育3分钟。重复轻轻移液 10 次，直到没有可见的块保留。
- 将 10 mL 的 FACS 缓冲液添加到悬架中。在室温下以 300 x g 离心 5 分钟，然后丢弃上一代。
- 重复步骤2.9两次，以去除精子和尽可能多的碎片。
3. 细胞染色
- 用 3 mL 的 FACS 缓冲液（表 1）将细胞颗粒重新悬浮，并通过 70 μm 尼龙细胞滤网将细胞悬浮液过滤到 50 mL 管中。
注：预计细胞产量约为每两个睾丸1亿个细胞（来自8周大的B6野生型小鼠）。 - 计算细胞数，将10%的细胞分成新的管子，作为未污染的负对，并留在冰上。
- 将6μL的DCV污渍（原浓度为5 mM）加入剩余细胞悬浮液并混合好。最终浓度为10μM，容量约为1亿个细胞。
- 在黑暗中37°C孵育30分钟。每 10 分钟轻轻摇动一次电池悬架。
- 孵育后，无需洗涤步骤，直接将5μL的DNase I（库存浓度为10mg/mL）添加到细胞悬浮液中，并通过35μm尼龙网盖将细胞过滤成5 mL FACS管。将样品放在冰上直到分拣。
4. 流式细胞学和实验门
- 准备 FACS 单元分拣机。确保 FACS 细胞分拣机配备激励光学器件：紫罗兰 （405-nm） 激光器;检测光学元件：450/50带通的滤波器组合[用于DCV-蓝色检测的相同滤波器组4×6-6-6-2-苯酚（DAPI）]和665/30带通（用于DCV-红色检测的同一过滤器组）。在这里，我们使用索尼SH800S细胞分拣机作为例子。
- 创建新的实验并设置以下显示要优化的参数的工作图：单击"工作表工具"菜单栏上的"新密度"，以创建线性比例上的正向散点面积 （FSC-A） 与后散射 = 面积 （BSC-A） 密度图。单击"新直方图"以在对数刻度上创建 DCV 蓝色直方图图图。
- 简要地涡旋未沾污的负控制（从步骤 3.2 开始）并加载样品。
- 单击"开始"和"记录"开始处理未污染的样本。在样品运行时，单击"检测器和阈值设置"，通过向上或向下调整光电倍增管 （PMT） 电压来优化 FSC 和 BSC 电压，从而将未污染的电池放在 FSC/BSC 图的刻度上。
- 在样本运行时，在"FL1：DAPI"上上下调整PMT电压，以定位DCV-蓝色直方图对数图第一个十年中DCV负量的位置（图2A）。完成 PMT 电压调整后，单击"停止"卸载未污染的样品。
- 简要涡流样品（从步骤3.5开始）并加载样品。
- 单击"下一管"为 DCV 染色样本创建新工作表;并单击"开始"和"记录"获取 DCV 染色样本，记录 ≥ 1 x 106 事件 的记录。添加以下工作图：单击"工作表工具"菜单栏上的"新密度"，以在线性比例上创建 FSC-H（高度）与 FSC-W（宽度）密度图;单击"新密度"以线性比例创建 DCV 蓝色与 DCV 红色密度图。录制 1 ≥ x 106 事件后，单击"停止"并卸载示例。
- 在 FSC-A 与 BSC-A 密度图上，单击"绘图工具"菜单栏上的"多边形"以绘制大门"单元格"以包括大多数单元格并排除小碎片（图 2B）。将门"细胞"应用于FSC-H与FSC-W密度图。单击"矩形"绘制"单细胞"门以排除非单个单元格（图 2C）。
- 将"单单元"门应用于 DCV 蓝色与 DCV 红色密度图，并调整比例以捕获扩展轮廓，如图2D 所示。单击"绘图工具"菜单栏上的"多边形"以绘制一个"DCV"门以排除未污染的单元格和侧总体（图 2D）。
- 将"DCV" 门应用于线性刻度上的 DCV 蓝色直方图图。三个主要峰是指不同的DNA含量：1C、2C和4C（图2E）。
- 单击"新密度"以线性比例创建 DCV 蓝色与 DCV-红色密度图，并应用"DCV"门从图 2E 执行反向浇注以定位 1C 和 4C 比例（图 2F）。单击"椭圆"在 1C 总体（位于压缩区域（门 1C）内绘制门。单击"多边形"在 4C 总体上绘制一个门，即连续曲线（门 4C）。
- 单击"新密度"以线性比例创建 DCV 蓝色与 DCV 红色密度图，并应用"4C"门;调整比例以放大并单击"多边形"以绘制"4C_1"门，以进行更精确的选择（图 2G）。
- 单击"新密度"以线性比例创建新的 FSC-A 与 BSC-A 密度图，并应用"4C_1"门;将有三个富集种群，其大小与与钩端氨酸（L）/zygotene（Z）、帕奇泰尼（P）和二苯（D）精子细胞对应的大小分离。单击"多边形"或"椭圆"以绘制 3 个门："L/Z"，"P"和"D"基于不断增长的大小 （图 2H）。
- 单击"新点图"，以线性比例创建 DCV 蓝色与 DCV-红色颜色点图，以应用栅极，并确保三个比例在"4C_1"门内连续排列（图 2I）。
- 同样，对于 1C总体，单击"新密度"以在线性比例上创建新的 FSC-A 与 BSC-A 密度图，并应用"1C"门，选择细胞的统一大小作为纯圆形精子群体，然后单击"椭圆"绘制"RS"门（图 2J）。
5. 排序雄性生殖细胞亚细胞
- 准备含有 500 μL 50% FBS 的 1.5 mL 管，用于细胞收集，将收集管加载到收集器中，然后单击"负载收集"。
- 点击"下一管"，"开始"，"记录"和"排序开始"。对于使用双向系统，允许两个感兴趣的群体同时分类到收集设备中，遵循成对组合：结合（L）/zygotene （Z） 和基于L/Z和P背门的帕奇腾（P）精子细胞;圆形精子 （RS） 和二甲苯 （D） 精子细胞基于 RS 和 D 背门。
- 在示例运行时，将流速调整为 +3000 事件/s，以获得最有效的排序。
6. 已排序细胞的纯度分析
- 收集≥ 10，000 个细胞/每个群体。执行细胞免疫，以确认子阶段。
- 在 4 °C 下 以 300 x g 离心 5 分钟，并小心丢弃上清液，将大约 110 μL 的液体留在管底。
- 在显微镜下观察10μL的细胞悬浮液，并评估细胞形态和数量。
- 将 100 μL 的细胞悬浮液涂抹到每个样品室幻灯片上（ 参见材料表），然后将腔室加载到细胞平上。
- 在室温下以30 x g 旋转样品5分钟。用疏水笔在细胞周围画一个圆圈。在室温下，在实验室工作台上干燥幻灯片几分钟。
- 在幻灯片的圆圈中放置 50 μL 的 PBS 并点击关闭。
- 在幻灯片的圆圈中加入原抗体溶液（PBS中5%驴血清的稀释原抗体，聚糖20）在4°C下孵育。
注：为了判断美的精子细胞的亚位，检测出SYCP3，这是美的染色体轴的标记，而+2AX是DNA损伤反应的标记。（关于抗体工作浓度，请参阅 材料表）。 - 从幻灯片中点击掉主抗体溶液。
- 在幻灯片的圆圈中放置 50 μL 的 PBS 并点击关闭。重复一次。
- 在幻灯片的圆圈中加入二次抗体溶液（用0.02%聚糖20稀释PBS中的二次抗体），并在室温下在黑暗中孵育1小时。
- 在幻灯片的圆圈中放置 50 μL 的 PBS 并点击关闭。重复一次。
- 加入 50 μL 的 DAPI（库存浓度为 0.1 μg/mL）污渍 5 分钟，然后点开。
- 在幻灯片上添加 1-2 滴安装介质。用盖玻璃小心地盖住安装介质，轻轻按压盖玻璃以去除额外的安装介质和气泡。幻灯片已准备好进行显微镜评估。
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Representative Results
此排序协议的代表性结果如图3 所示。两个睾丸（一只鼠标）的总分拣时间通常为3小时左右，这取决于细胞悬浮液的浓度和分拣速度。分类后，通过SYCP3和+2AX的免疫处理确认精子细胞的纯度（图3A）。排序L/Z、P、D精子细胞分数的代表性纯度分别约为80.4%、90.6%和87.6%（图3C）。我们根据先前19日公布的标准确定子阶段。简言之，在钩端氨酸和酶氨酸阶段，同源染色体之间的突触是不完整的，这从SYCP3染色的细线中得到说明。由于编程的DNA双链断裂，在整个核染色质中观察到宽+H2AX域。在pachytene阶段，同源染色体完全突触，而+2AX专门积累在性染色体上。在二甲苯阶段，同源染色体逐渐经历脱辛。RS的纯度由DCV的核染色确认（图3B）。RS可以精确判断与DNA染色：一个独特的DAPI强烈色中心包围于欧铬素;或与特定的标记相结合，如Sp56，在精子和组蛋白变异H1T的发展中表达，在中质阶段后在细胞核中高度表达（图3B）。
RS 纯度约为 90.1% 排序（图 3C）。每次实验的纯度分析样本量超过1，000个细胞;L/P和D基的纯度是6个独立实验的平均值;P和RS的纯度是3个独立实验的平均值。这些分离细胞的生存能力通常超过95%（图S1）。图3C中估计并列出了单个成年小鼠各分数的总产量，为各种下游分析提供了足够的细胞。最近，我们利用这个协议分离野生型帕奇特内精子细胞为ChIP-seq分析20，21。
| 试剂 | 成分 | 库存浓度 | 体积 |
| （HBSS 基地） | |||
| 分离缓冲区 | 德梅姆 | - | 2 毫升 |
| （DMEM 基数） | Fbs | - | 40 μl |
| 透明 质 酸 酶 | 100毫克/毫升 | 30 μl | |
| 德纳塞一 | 10毫克/毫升 | 50 μl | |
| 胶原蛋白酶 I 型 | 100毫克/毫升 | 40 μl | |
| 重组胶原蛋白酶 | 14000 单位/毫升 | 100 μl | |
| FACS 缓冲区 | Pbs | - | 980毫升 |
| （PBS 基数） | Fbs | - | 20毫升 |
表1：试剂配方。 分离缓冲区必须在使用前准备好。开始解剖前预热 DMEM 。酶库可以在实验前随时准备，储存在-20°C。 FACS缓冲液需要真空过滤，储存在4°C;使用前预热室温。
图1：基于DCV的分选中，对小鼠精子生成细胞分离的工作流程。此图说明了从组织分离到 FACS 分类的一般程序，以及在一天内采集分离的精子生成细胞。 请单击此处查看此图的较大版本。
图2：基于DCV荧光和光散射的成人月脑睾丸细胞的FACS分析。（A） 在 DCV-蓝色直方图（红条左侧）的第一个十年中获得未污染的细胞。（B）（C） 由光散射排除的碎片和非单细胞。（D） 基于DDCV荧光的未污染细胞和侧位排位。（E） 基于DV-蓝色荧光的DNA含量测定.左峰（绿色）和右峰（粉红色）对应于1C和4C人口。（F） 基于DCV-蓝色/DCV-红色荧光的1C和4C睾丸组上的浇注。（G） 4C睾丸群的精确浇注。（H） 门 4C 的后门从 FSC/BSC 图上的 DCV 图进行回门。基于 FSC/BSC 图上最小重叠的区域，创建 L/Z、P 和 D 门以丰富各自的精子细胞群。（I） 显示 L/Z、P 和 D 填充的彩色点图在门 4C. （J） 门 1C 的后门门内连续排列，从 FSC/BSC 绘图上的 DCV 图进行回门。RS 门被创建，以丰富圆精子群体与均匀的大小，导致在分拣过程中更高的种群纯度。 请单击此处查看此图的较大版本。
图3：从分拣中获得的精子生成细胞的代表性结果图像和统计数据。（A） 分类精子细胞的免疫荧光表征。上面板：DCV染色显示活精子细胞的核模式后，正确的排序;L/Z（利普托滕/齐戈滕）、P（帕奇滕）和D（二氯苯）。下面板：通过SYCP3（绿色）和+2AX（红色）的免疫处理确认每个人群的美亚阶段。（B） 代表DCV图像显示RS的核模式。比例线：50 μm（上面板）和10 μm（下放大面板）。右面板：沾有Sp56和H1T的圆形精子的免疫荧光确认。（C） L/Z、P和D的纯度经免疫污染确认，每个独立实验的样本大小超过1，000个细胞，共6个独立实验。RS纯度通过核染色得到确认，共进行了3次独立实验。一只8周大的WT B6小鼠睾丸细胞悬浮液的总细胞数约为1亿个细胞，在分拣前。 请单击此处查看此图的较大版本。
图S1：分离的帕奇滕精子细胞的可行性。 一张具有代表性的图像显示了分离的帕奇滕精子细胞的细胞生存能力（红色：PI;蓝色：DCV）。在排序过程中，PI 不能与 DCV 结合使用。然而，在显微镜下，DCV-红色信号相当低;因此，PI阳性的死细胞很容易与其他活细胞区分开来。生存能力通常超过 95%。比例线：10 μm。 请点击这里下载此图。
图 S2：不完全分离或碎屑干扰浇注。 A 人口（红色圆圈）包含精子的碎屑和聚合物（用箭头表示）。较大的 A 人口将穿过 B 人口（黄圈），最终污染 4C 人口。比例线：200 μm。 请点击这里下载此图。
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Discussion
在这里，我们提出了一个实用和简单的协议，从单个成年雄性小鼠中分离精子细胞和精子的亚群。为了确保此协议的可重复性，有一些关键步骤需要注意。在酶消化之前，洗涤步骤旨在去除间分裂细胞;消化后，这一步有助于去除精子和碎片。洗/离心3次很重要。在我们的分离缓冲液配方中，几种不同酶的组合有助于将睾丸分离到单细胞悬浮液中，而不会造成过多的细胞损伤。轻轻移液以避免造成气泡也有助于保护细胞的完整性。分离后，请在显微镜下检查细胞悬浮液，以确保悬浮液达到单细胞水平。过度消化的不完全分离或碎屑污染会影响分拣细胞的纯度;如图 S2所示，直立体含有精子碎片和四分位。DCV 染色需要在黑暗中孵育，之后无需清洗。
为了排除精子细胞亚细胞的浇注和背对，作为优化选项，我们建议使用同步野生型小鼠来帮助定位精子细胞22、23、24的特定阶段。值得注意的是，一些与精子生成阻止表型的淘汰小鼠菌株可能有罕见的DCV配置文件，因为他们缺少一些亚人口。在这种情况下，强烈建议进行适当的野生类型控制。此外，此协议可能适用于任何年龄的成年小鼠。然而，由于生殖细胞的比例变化，实验小鼠的年龄可能是一个混淆的因素。
多年来，已经开发出几种净化生殖细胞的协议。作为最流行的方法之一，STA-PUT速度沉积通过BSA梯度分离生殖细胞，并提供了完整的生殖细胞6，7的良好的产量。然而，STA-PUT 不仅需要许多实验室无法轻易获得的特殊设备，而且在 4°C 的冷室中进行操作既耗时又耗费人力。 与适用于大规模分离的STA-PUT不同，这种基于FACS的方法可以为小规模实验提供高纯度和精确分数。使用我们的协议进行大规模排序是可能的，但会显著延长排序时间，并可能损害细胞的生存能力。因此，当需要大量细胞时，STA-PUT 仍然是一个实用的选择。
与以往基于Ho342染色染色8、9、10、11的FACS方法相比，我们的协议采用DCV，具有更广泛的激发光谱，可应用于目前配备UV或405nm紫光激光18的FACS分拣机。虽然有另一个协议使用DCG14，15，16，17，我们的协议和DCG协议的区别是，我们的DCV协议使用二维分离与DCV蓝色和DCV红色，模仿Ho342协议的优势。凭借这一优势，我们的DCV协议使我们能够将高度丰富的生殖细胞从成人睾丸中分离。DCG 协议不采用二维分离，建议从幼鼠中分离生殖细胞。二维分离可以有更好的分辨率来分离精子细胞的子阶段。然而，我们的方法仍然不能单独隔离钩端和酶精细胞，以及"2C"细胞类型，包括精子、前细胞精子细胞和继发精子细胞。
由于 DCV 污渍的宽发射光谱会导致泄漏到其他通道，因此大多数细胞活力染料（如 PI 和 7AAD）由于误报信号而无法组合。其他在远红色或近红外通道中发射细胞的维鲜染料将来可能值得尝试。但根据我们的经验，排序的细胞通常≥2小时的FACS排序后显示95%的生存能力（图S1），这足以进行下游分析。
从我们程序获得的分离细胞可用于各种下游实验，包括下一代测序分析（RNA-seq、ATAC-seq 和 ChIP-seq）。在这里获得的细胞也可用于短期培养27。总之，我们提供了一个简单而高效的方案，包括一个小时的单细胞悬浮制备程序以及基于DCV染料染色的FACS的详细浇注策略，该策略适用于小规模精子生成细胞分离，可被许多研究者，甚至流式细胞学初学者迅速采用。
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Disclosures
提交人声明，他们没有相互竞争的利益。
Acknowledgments
我们感谢 Namekawa 、Yoshida 和 Maezawa 实验室的成员的帮助;凯蒂·格哈特编辑手稿;Mary Ann Handel 用于共享 H1T 抗体，辛辛那提儿童医院医疗中心 （CCHMC） 研究流细胞学核心，用于共享由 NIH S10OD023410 支持的 FACS 设备;科学研究资助（KAKENHI;17K07424）给T.N.;拉洛尔基金会博士后奖学金给美国;AMED-CREST （JP17gm1110005h0001） 到 S.Y.;阿扎布大学研究服务部资助研究项目， 教育、文化、体育、科学和技术部（MEXT）支持的私立大学研究品牌项目（2016-2019年）、研究活动启动资助计划（19K21196）、武田科学基金会（2019年）和Uhara纪念基金会研究奖励基金（2018年）对S.M;国家卫生研究院 R01 GM122776 至 S.H.N.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 ml tube | Watson | 131-7155C | |
| 100 mm Petri dish | Corning, Falcon | 351029 | |
| 15 mL Centrifuge tube | Watson | 1332-015S | |
| 5 ml polystyrene tube with cell strainer snap cap (35 µm nylon mesh) | Corning, Falcon | 352235 | |
| 50 mL Centrifuge tube | Watson | 1342-050S | |
| 60 mm Petri dish | Corning, Falcon | 351007 | |
| 70 µm nylon mesh | Corning, Falcon | 352350 | |
| Cell sorter | Sony | SH800S | |
| Centrifuge | |||
| Collagenase, recombinant, Animal-derived-free | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 036-23141 | |
| Collagenase, Type 1 | Worthington | LS004196 | |
| Cover glass | Fisher | 12-544-G | |
| Cytospin 3 | Shandon | ||
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Fisher | D1306 | working concentration: 0.1 μg/mL |
| Dnase I | Sigma | D5025-150KU | |
| Donkey serum | Sigma | S30-M | |
| Dulbecco’s phosphate-buffered saline (DPBS) | Gibco | 14190144 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 11885076 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 16000044 | |
| Histone H1t antibody | gift from Mary Ann Handel | 1/2000 diluted | |
| Hank’s balanced salt solution (HBSS) | Gibco | 14175095 | |
| Hyaluronidase from bovine testes | Sigma | H3506-1G | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma | P5493-4L | |
| Pipettemen | |||
| ProLong Gold Antifade Mountant | Fisher | P36930 | |
| rH2AX antibody | Millipore | 05-635 | working concentration: 2 μg/mL |
| Sperm Fertilization Protein 56 (Sp56) antibody | QED Bioscience | 55101 | working concentration: 0.5 μg/mL |
| Sterilized forceps and scissors | |||
| Superfrost /Plus Microscope Slides | Fisher | 12-550-15 | |
| SYCP3 antibody | Abcam | ab205846 | working concentration: 5 μg/mL |
| TWEEN 20 (Polysorbate 20) | Sigma | P9416 | |
| Vybrant DyeCycle Violet Stain (DCV) | Invitrogen | V35003 | |
| Water bath |
References
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