Summary
Her presenterer vi en enkel og effektiv metode for å isolere levende meiotiske og postmeiotiske bakterieceller fra voksne musetestikler. Ved hjelp av en lav cytotoksisitet, fiolett-spent DNA bindende fargestoff og fluorescens-aktivert celle sortering, man kan isolere svært beriket spermatogene cellepopulasjoner for mange nedstrøms applikasjoner.
Abstract
Isolering av meiotiske spermatocytter er avgjørende for å undersøke molekylære mekanismer underliggende meiose og spermatogenese. Selv om det er etablert celleisolasjonsprotokoller ved hjelp av Hoechst 33342 farging i kombinasjon med fluorescens-aktivert cellesortering, krever det cellesortere utstyrt med en ultrafiolett laser. Her beskriver vi en celleisolasjonsprotokoll ved hjelp av DyeCycle Violet (DCV) flekken, en lav cytotoksisitet DNA bindende fargestoff strukturelt lik Hoechst 33342. DCV kan være begeistret av både ultrafiolette og fiolette lasere, noe som forbedrer fleksibiliteten til utstyrsvalg, inkludert en cellesorter som ikke er utstyrt med en ultrafiolett laser. Ved hjelp av denne protokollen kan man isolere tre live-celle subpopulasjoner i meiotiske prophase I, inkludert leptotene / zygotene, pachytene, og diplotene spermatocytter, samt post-meiotiske runde spermatids. Vi beskriver også en protokoll for å forberede encellede suspensjon fra musetestikler. Samlet sett krever prosedyren kort tid å fullføre (4-5 timer avhengig av antall nødvendige celler), noe som letter mange nedstrøms applikasjoner.
Introduction
Spermatogenese er en kompleks prosess hvor en liten populasjon av spermatogoniale stamceller opprettholder kontinuerlig produksjon av et stort antall sperm gjennom voksenlivet1,2. Under spermatogenese finner dynamisk kromatin remodeling sted når spermatogene celler gjennomgår meiose for å produsere haploid spermatids3,4,5. Isolering av meiotiske spermatocytter er avgjørende for molekylær undersøkelse, og flere forskjellige tilnærminger for å isolere meiotiske spermatocytter er etablert, inkludert sedimenteringsbasert separasjon6,7 og fluorescensaktivert cellesortering (FACS)8,9,10,11,12,13,14,15,16,17. Disse metodene har imidlertid tekniske begrensninger. Mens sedimenteringsbasert separasjon gir et stort antall celler5,6,7, er det arbeidskrevende. Den etablerte FACS-baserte metoden bruker Hoechst 33342 (Ho342) til å skille meiotiske spermatocytter basert på DNA-innhold og lysspøpende egenskaper og krever FACS cellesorterere utstyrt med en ultrafiolett (UV) laser8,9,10,11. Alternative FACS-baserte metoder krever transgene muselinjer som uttrykker blomstrende proteiner, synkronisering av spermatogenese12, eller cellefiksering og antistoffmerking som ikke er kompatibel med isolering av levendeceller 13. Mens det er en annen alternativ metode ved hjelp av en cellegjennomtrengelig DNA bindende fargestoff, DyeCycle Grønn flekk14,15,16,17, anbefales denne metoden for isolering av spermatogene celler fra juvenil testis. Derfor er det et kritisk behov for å utvikle en enkel og robust isolasjonsmetode for levende meiotiske spermatocytter som kan brukes på enhver musestamme i alle aldre, og som kan utføres ved hjelp av hvilken som helst FACS-cellesortering.
Her beskriver vi en så ettertraktet celleisolasjonsprotokoll ved hjelp av DyeCycle Violet (DCV) flekken. DCV er en lav cytotoksisitet, cellegjennomtrengelig DNA bindende fargestoff strukturelt lik Ho342, men med et eksitasjonsspektrum forskjøvet mot fiolettområde 18. I tillegg har DCV et bredere utslippsspektrum sammenlignet med DCG. Dermed kan det være begeistret av både UV og fiolette lasere, noe som forbedrer fleksibiliteten til utstyr, slik at bruk av en FACS cellesortering som ikke er utstyrt med en UV-laser. DCV-protokollen som presenteres her bruker todimensjonal separasjon med DCV blå og DCV rød, etterligne fordelen av Ho342-protokollen. Med denne fordelen tillater vår DCV-protokoll oss å isolere høyt berikede bakterieceller fra de voksne testiene. Vi tilbyr en detaljert gating protokoll for å isolere levende spermatogene celler fra voksne mus testiklene av en mus (fra to testiklene). Vi beskriver også en effektiv og rask protokoll for å forberede encellede suspensjon fra musetestiklene som kan brukes til denne celleisoleringen. Prosedyren krever kort tid å fullføre (utarbeidelse av enkeltcellesuspensjon - 1 time, fargestofffarging - 30 min og cellesortering - 2-3 timer: totalt - 4-5 timer avhengig av antall nødvendige celler; Figur 1). Etter celleisolasjon kan et bredt spekter av nedstrøms programmer, inkludert RNA-seq, ATAC-seq, ChIP-seq og cellekultur, fullføres.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne protokollen følger retningslinjene i Institutional Animal Care and Use Committee (protokollnr. IACUC2018-0040) ved Cincinnati Children's Hospital Medical Center.
1. Utstyr og reagensoppsett for fremstilling av testikkelcellesuspensjon
- Forbered hver enzymlager i 1x Hanks' balanserte saltoppløsning (HBSS) og oppbevar ved -20 °C. (Tabell1).
MERK: Forbered når som helst før eksperimentet. - En dag før forsøket: Coat samlerør (1,5 ml rør) med føtal storfe serum (FBS) ved 4 °C over natten.
- På dagen for eksperimentet: Sett vannbadet til 37 °C.
- Forvarm Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) ved 37 °C og klargjør 2 ml 1x dissosiasjonsbuffer for hver prøve rett før bruk (tabell 1) i 15 ml sentrifugerør.
MERK: 2 ml dissosiasjonsbuffer er klargjort for to testiklene. For dissosiasjonsbufferoppskriften, se tabell 1.
2. Dyredeksjon og fremstilling av testikkelcellesuspensjon
- Ofre en åtte uker gammel hannmus ved å forlate i et karbondioksidkammer i minst 10 min.
- Fjern begge testiklene og legg på en 60 mm petriskål som inneholder 2 ml iskald fosfatbufret saltvann (PBS).
- Fjern tunikaalbuginea fra testiklene. Spre de seminiferøse tubuliene litt ved å forsiktig skille med tang.
- Overfør de seminiferøse tubuli til en 100 mm petriskål med en ny dråpe iskald PBS og untangle seminiferous tubules forsiktig med tang. Gjenta denne vasken 3 ganger for å fjerne interstitielle celler så mye som mulig.
- Inkuber untangled seminiferøse tubuli i et 15 ml rør som inneholder 2 ml dissosiasjonsbuffer ved 37 °C i 20 min.
- Pipette rørene forsiktig 20 ganger ved hjelp av en 1000 μL mikropipette.
- Inkuber i 6 min. Gjenta skånsom pipettering 20 ganger.
- Inkuber i 3 min. Gjenta skånsom pipettering 10 ganger til ingen synlige biter gjenstår.
- Legg til 10 ml FACS-buffer i suspensjonen. Sentrifuge ved 300 x g i 5 min ved romtemperatur og kast supernatanten.
- Gjenta trinn 2.9 to ganger for å fjerne spermatozoa og så mye rusk som mulig.
3. Cellefarging
- Bruk cellepelleten på nytt med 3 ml FACS-buffer (tabell 1) og filtrer cellefjæringen gjennom en 70 μm nyloncellesil i et 50 ml rør.
MERK: Forventet celleutbytte er ca. 100 millioner celler per to testikler (fra en 8 uker gammel B6 villtypemus). - Telle cellenummeret og dele 10% av cellene i et nytt rør som den uopphetede negative kontrollen og la på is.
- Tilsett 6 μL DCV-flekk (den opprinnelige konsentrasjonen er 5 mM) til gjenværende cellefjæring og bland godt. Den endelige konsentrasjonen er 10 μM, og kapasiteten er ca 100 millioner celler.
- Inkuber ved 37 °C i 30 min i mørket. Rist cellefjæringen forsiktig hver 10.
- Etter inkubasjon, uten vasketrinn, legg direkte til 5 μL DNase I (lagerkonsentrasjonen er 10 mg / ml) til cellefjæringen og filtrer cellene inn i et 5 ml FACS-rør gjennom 35 μm nylonnettinghette. Oppbevar prøvene på is til sortering.
4. Strømningscytometri og eksperimentelle porter
- Klargjør facs cellesortering. Kontroller at FACS cellesortering er utstyrt med excitation optikk: Violet (405-nm) laser; Deteksjonsoptikk: filterkombinasjon av 450/50 bandpass [samme filtersett med 4',6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) for DCV-blå deteksjon] og 665/30 bandpass [samme filtersett med Allophycocyanin (APC) for DCV-rød deteksjon]. Her bruker vi Sony SH800S cellesortering som et eksempel.
- Opprett et nytt eksperiment og sett opp følgende arbeidsplott som viser parametere som skal optimaliseres: Klikk "Ny tetthet" påmenylinjen" Worksheet Tools " for å lage en fremoverspitt - område (FSC-A) vs. tilbake scatter - område (BSC-A) tetthet tomt på en lineær skala. Klikk "Nytt Histogram" for å lage en DCV-blå histogrammet plott på logaritmisk skala.
- Virvle kort den uopphetede negative kontrollen (fra trinn 3.2) og last prøven.
- Klikk på" Start" og "Record" for å begynne å behandle den uopphetede prøven. Mens prøven kjører, klikker du på "Detector & Threshold Settings" for å optimalisere FSC- og BSC-spenninger ved å justere både photomultiplier tube (PMT) spenninger opp eller ned for å plassere de ustained cellene på omfanget av FSC / BSC-plottet.
- Juster PMT-spenningen opp og ned på "FL1: DAPI" mens prøven kjører for å finne posisjonen til den DCV-negative befolkningen i det første tiåret av DCV-blå histogrammet logaritmisk plott (figur 2A). Når du har fullført PMT-spenningsjusteringen, klikker du på "Stop" for å fjerne den uopphetede prøven.
- Virvle prøven kort (fra trinn 3.5) og last prøven.
- Klikk "Next Tube" for å opprette et nytt regneark for DCV-farget prøve; og klikk "Start" og "Record" for å skaffe DCV-farget prøve, ≥ 1 x 106 hendelser. Legg til følgende arbeidsplott: Klikk "Ny tetthet" på menylinjen "Regnearkverktøy" for å opprette en FSC-H (høyde) vs. FSC-W (bredde) tetthetsplott på en lineær skala; Klikk "Ny tetthet" for å opprette en DCV-blå vs. DCV-rød tetthet plott på en lineær skala. Etter opptak ≥ 1 x 106 hendelser, klikk "Stopp" og losse prøven.
- På FSC-A vs. BSC-A tetthet plottet, klikk "Polygon" på "Plot Tools" menylinjen for å tegne en stor port "Celler" for å inkludere de fleste celler og utelukke små rusk (Figur 2B). Påfør porten "Celler" til FSC-H vs. FSC-W tetthet plot. Klikk "Rektangel" for å tegne en "Enkeltceller" gate for å utelukke ikke-enkle celler (Figur 2C).
- Påfør "Enkeltceller" gate til DCV-blå vs. DCV-rød tetthet plot og justere skalaen for å fange en utvidet profil som vist i Figur 2D. Klikk "Polygon" påmenylinjen" Plot Tools " for å tegne en "DCV" gate for å utelukke de uopphetede cellene og sidepopulasjonen (Figur 2D).
- Påfør "DCV" gate til DCV-blå histogrammet plott på en lineær skala. De tre store toppene refererer til forskjellig DNA-innhold: 1C, 2C og 4C (figur 2E).
- Klikk "Ny tetthet" for å opprette en DCV-blå vs. DCV-rød tetthet plott på en lineær skala og bruke "DCV" gate for å utføre tilbake gating fra figur 2E for å finne 1C og 4C populasjoner (Figur 2F). Klikk "Ellipse" for å tegne en port på 1C befolkningen, som er innenfor et kondensert område (gate 1C). Klikk "Polygon" for å tegne en port på 4C befolkningen som er en kontinuerlig kurve (gate 4C).
- Klikk "Ny tetthet" for å opprette en DCV-blå vs. DCV-rød tetthet plott på en lineær skala og bruke "4C" gate; justere skalaen for å zoome inn og klikk "Polygon" for å tegne en "4C_1" gate for mer presist valg (Figur 2G).
- Klikk "Ny tetthet" for å opprette en ny FSC-A vs. BSC-A tetthet plott på en lineær skala og bruke "4C_1" gate; det vil være tre berikede populasjoner atskilt etter størrelse tilsvarende leptotene (L) /zygotene (Z), pachytene (P) og diplotene (D) spermatocytter. Klikk "Polygon" eller "Ellipse" for å tegne 3 porter: "L / Z", "P" og "D" basert på den økende størrelsen (figur 2H).
- Klikk "New Dot Plot" for å opprette en DCV-blå vs. DCV-rød farge prikk plott på en lineær skala for å bruke gate og sikre at de tre populasjonene er i kontinuerlig rekkefølge innenfor "4C_1" gate ( Figur2I).
- Tilsvarende, for 1C befolkningen, klikk"Ny tetthet"for å opprette en ny FSC-A vs. BSC-A tetthet plott på en lineær skala og bruke "1C" gate, velg den enhetlige størrelsen på celler som ren rund spermatid befolkning, og klikk "Ellipse" for å tegne en "RS" gate (Figur 2J).
5. Sorter mannlige bakteriecelleunderpopulasjoner
- Forbered 1,5 ml rør som inneholder 500 μL 50% FBS for celleinnsamling og last oppsamlingsrøret inn i samleren og klikk "Load Collection".
- Klikk "Neste Tube", "Start", "Record" og "Sorter Start". For å bruke et toveissystem som gjør at to populasjoner av interesse kan sorteres samtidig inn i innsamlingsenheten, følg parvis kombinasjoner: leptotene (L) / zygotene (Z) og pachytene (P) spermatocytter basert på L / Z og P back-gates; Runde spermaater (RS) og diplotene (D) spermatocytter basert på RS og D back-gates.
- Mens prøven kjører, justerer du strømningshastigheten til ~3000 hendelser/s for å få den mest effektive sorteringen.
6. Renhet analyse av sorterte celler
- Samle ≥ 10.000 celler / hver populasjon. Utfør celleimmunostaining for å bekrefte underscenen.
- Sentrifuge ved 300 x g i 5 min ved 4 °C og kast forsiktig overnatanten, og hold rundt 110 μL av væsken i bunnen av røret.
- Ta en 10 μL dråpe cellesuspensjon for å observere under mikroskopet og evaluere oversiktscellemorfologien og nummeret.
- Påfør 100 μL cellesuspensjon på hvert av prøvekammerlysbildene (se Materialtabell), og legg kamrene til Cytospin.
- Spinn prøvene på 30 x g i 5 min ved romtemperatur. Tegn en sirkel rundt cellen med en hydrofob penn. Tørre lysbilder på laboratoriebenken i noen minutter ved romtemperatur.
- Slipp 50 μL PBS i sirkelen på lysbildet og trykk av.
- Tilsett primær antistoffløsning (Fortynn primære antistoffer med 5 % eselserum i PBS med 0,02 % polysorbat 20) i lysbildesirkelen og inkuber ved 4 °C over natten.
MERK: For å dømme underscenen av meiotiske spermatocytter ble SYCP3 oppdaget, som er en markør for meiotisk kromosomakser, og γH2AX, som er en markør for DNA-skaderespons. (For antistoffarbeidskonsentrasjonen, se Materials tabell). - Trykk av den primære antistoffløsningen fra lysbildene.
- Slipp 50 μL PBS i sirkelen på lysbildet og trykk av. Gjenta en gang.
- Tilsett sekundær antistoffløsning (fortynne sekundære antistoffer i PBS med 0,02 % polysorbat 20) i sirkelen på lysbildet og inkuber ved romtemperatur i 1 time i mørket.
- Slipp 50 μL PBS i sirkelen på lysbildet og trykk av. Gjenta en gang.
- Tilsett 50 μL DAPI (lagerkonsentrasjon er 0,1 μg/ml) flekk i 5 min og trykk av.
- Tilsett 1-2 dråper monteringsmedier på lysbildene. Dekk forsiktig monteringsmediet med et dekkglass og trykk forsiktig på dekkglasset for å fjerne ekstra monteringsmedier og luftboble. Lysbildene er klare for mikroskopievaluering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Et representativt resultat av denne sorteringsprotokollen vises i figur 3. Den totale sorteringstiden for to testiklene (en mus) er vanligvis rundt 3 timer, som er avhengig av konsentrasjonen av cellesuspensjon og sorteringshastigheten. Etter sortering er renheten av spermatocytter bekreftet ved immunstaining av SYCP3 og γH2AX (figur 3A). Den representative renheten av sorterte L / Z, P, D spermatocytt fraksjoner er rundt 80,4%, 90,6% og 87,6%, henholdsvis (figur 3C). Vi har bestemt underscenene basert på kriteriene vi publiserte tidligere19. Kort sagt, i leptoten- og zygotenestadiet, er synapsis mellom homologe kromosomer ufullstendig, noe som indikeres av tynne tråder av SYCP3-farging. Brede γH2AX-domener observeres gjennom hele atomkromatin på grunn av programmerte DNA-dobbelttrådpauser. I pachytenestadiet har homologe kromosomer helt synapsert, og γH2AX akkumuleres spesifikt på kjønnskromosomene. I diplotenestadiet gjennomgår homologe kromosomer gradvis desynapsis. RS's renhet bekreftes av kjernefarging med DCV (figur 3B). RS kan nettopp dømmes med DNA-farging: et unikt DAPI-intenst kromosenter omgitt av euchromatin; eller kombinere med spesifikke markører, for eksempel Sp56 som uttrykkes innenfor den utviklende akrosomale granulaten av spermatid og histone variant H1T som er høyt uttrykt i kjernen etter mid-pachytene scenen (Figur 3B).
RS renhet er rundt 90,1% etter sortering (Figur 3C). Utvalgsstørrelsen på renhetsanalyse er over 1000 celler for hvert eksperiment; renheten av L / P og D populasjoner er gjennomsnitt fra 6 uavhengige eksperimenter; renheten av P- og RS-populasjoner er i gjennomsnitt fra 3 uavhengige eksperimenter. Levedyktigheten til disse isolerte cellene er vanligvis over 95% (Figur S1). Det totale utbyttet av hver brøkdel fra en enkelt voksen mus er estimert og oppført i Fig 3C, som gir tilstrekkelige celler for ulike nedstrøms analyser. Nylig har vi brukt denne protokollen til å isolere villtype pachytene spermatocytter for ChIP-seq analyse20,21.
| Reagent | Ingrediensen | Lagerkonsentrasjon | Volum |
| (HBSS-base) | |||
| Dissosiasjonsbuffer | Dmem | - | 2 ml (andre) |
| (DMEM-base) | FBS Inn | - | 40 μl |
| Hyaluronidase | 100 mg/ml | 30 μl | |
| DNase Jeg | 10 mg/ml | 50 μl | |
| Kollagenase Type I | 100 mg/ml | 40 μl | |
| Rekombinant Kollagenase | 14000 enhet/ml | 100 μl | |
| FACS-buffer | Pbs | - | 980 ml |
| (PBS-base) | FBS Inn | - | 20 ml |
Tabell 1: Reagensoppskrift. Dissosiasjonsbufferen må klargjøres rett før bruk. Prewarm DMEM før du starter disseksjon. Enzymlagrene kan tilberedes når som helst før forsøket og lagres ved -20 °C. FACS-bufferen må støvsuges og lagres ved 4 °C; før krigen til romtemperatur før bruk.
Figur 1: Arbeidsflyt av murine spermatogene celler isolasjon på DCV-basert sortering. Dette bildet illustrerer den generelle prosedyren, fra vevdissosiasjon til FACS-sortering, til høsting av isolerte spermatogene celler innen en dag. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: FACS analyse av voksne murine testikkelceller basert på DCV fluorescens og lysspprering. (A) Kjøpte uoppained celler i det første tiåret av en DCV-blå histogrammet plott (venstre side av den røde linjen). (B) (C) Rusk og ikke-enkeltcelle ekskludert ved lysspp. (D)Uopphetet celle- og sidepopulasjonsekskludering basert på DCV-fluorescens. (E) DNA-innholdsbestemmelse basert på DCV-blå fluorescens. Venstre topp (grønn) og høyre topp (rosa) tilsvarer 1C og 4C populasjoner. (F)Gating på 1C og 4C testicular populasjoner basert på DCV-blå / DCV-rød fluorescens. (G)Presis gating på 4C testikkelpopulasjoner. (H)Back-gating av Gate 4C fra DCV tomten på en FSC / BSC tomt. Basert på områder med minimal overlapping på FSC / BSC-plottet, er L / Z, P og D-portene opprettet for å berike sine respektive spermatocyttpopulasjoner. (I)Color dot plot som viser L / Z, P og D populasjoner er i kontinuerlig rekkefølge innenfor Gate 4C. (J) Back-gating av Gate 1C fra DCV tomten på en FSC / BSC tomt. RS gate ble opprettet for å berike rund spermatid befolkning med ensartet størrelse, noe som resulterer i større renhet av populasjoner under sortering. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Representative resultatbilder og statistikk over spermatogene celler hentet fra sortering. (A)Immunofluorescence karakterisering av sorterte spermatocytter. Øvre panel: DCV farging viser kjernen mønster av levende spermatocytter rett etter sortering; L/Z (leptotene/zygotene), P (pachytene) og D (diplotene). Nedre panel: Bekreftelse av meiotiske undertrinn for hver populasjon ved å immunstaining for SYCP3 (grønn) og γH2AX (rød). (B)Representativt DCV-bilde som viser kjernemønster av retten. Vektstenger: 50 μm (øvre paneler) og 10 μm (nedre forstørrede paneler). Høyre paneler: Immunofluorescence bekreftelse av runde spermatids farget med Sp56 og H1T. (C) Renheten av L / Z, P og D ble bekreftet ved immunstaining, prøvestørrelse var over 1000 celler for hvert uavhengige eksperiment, totalt 6 uavhengige eksperimenter. RS renhet ble bekreftet av kjernen flekker med totalt 3 uavhengige eksperimenter. Det totale cellenummeret til testikkelcellesuspensjonen fra en 8 uker gammel WT B6-mus var rundt 100 millioner celler før sortering. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur S1: Levedyktigheten til isolerte pachytene spermatocytter. Et representativt bilde viser celle levedyktigheten til isolerte pachytene spermatocytter (Rød: PI; Blå: DCV). PI kunne ikke kombineres med DCV under sortering. Men under mikroskop var DCV-rødt signal ganske lavt; Derfor ble PI-positive døde celler lett skilles fra andre levende celler. Levedyktigheten er vanligvis over 95%. Vektstenger: 10 μm. Vennligst klikk her for å laste ned dette tallet.
Figur S2: Ufullstendig dissosiasjon eller rusk forstyrrer gating. A-populasjonen (rød sirkel) inneholder rusk og polymer av spermakler (indikert med pil). Jo større En befolkning vil krysse med B-populasjonen (gul sirkel) og til slutt forurense 4C-befolkningen. Vektstenger: 200 μm. Vennligst klikk her for å laste ned dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her presenterer vi en praktisk og enkel protokoll for å isolere underpopulasjoner av spermatocytter og spermatider fra en enkelt voksen mannlig mus. For å sikre reproduserbarheten til denne protokollen, er det noen kritiske skritt som trenger oppmerksomhet. Før enzymfordøyelse tar vasketrinnet sikte på å fjerne interstitielle celler; etter fordøyelsen bidrar dette trinnet til å fjerne spermatozoer og rusk. Vasking/sentrifugering 3 ganger er viktig. I vår dissosiasjonsbufferoppskrift letter kombinasjonen av flere forskjellige enzymer dissosiasjonen av testiklene i encellede suspensjon uten overdreven celleskade. Pipettering forsiktig for å unngå å forårsake luftbobler bidrar også til å beskytte celleintegriteten. Kontroller cellesuspensjonen under et mikroskop etter dissosiasjon for å sikre at suspensjonen oppnår encellenivå. Ufullstendig dissosiasjon eller rusk forurensning fra overdreven fordøyelse vil påvirke renheten av sorterte celler; som vist i figur S2, inneholder den oppreist populasjonen rusk og tetramer av spermatider. DCV farging krever inkubasjon i mørket og ingen vask etterpå.
For å feilsøke potensielle vanskeligheter med gating og back-gating av spermatocytt subpopulasjoner, som et alternativ for optimalisering, anbefaler vi å bruke en synkronisert vill type mus for å finne et bestemt stadium av spermatocytter22,23,24. Det er også verdt å legge til at noen knockout mus stammer med spermatogenese arrest fenotyper kan ha uvanlige DCV-profiler fordi de mangler noen underpopulasjoner. Riktig wildtype kontroll anbefales sterkt i dette tilfellet. I tillegg kan denne protokollen potensielt brukes på voksne mus i alle aldre. Imidlertid kan alderen på den eksperimentelle musen være en forvirrende faktor på grunn av den variable andelen av bakterieceller.
Gjennom årene har flere protokoller for å rense bakterieceller blitt utviklet. Som en av de mest populære metodene skiller STA-PUT hastighetssedimentering bakterieceller ved BSA-gradienten og gir et godt utbytte av intakte bakterieceller6,7. Sta-PUT krever imidlertid ikke bare spesielle enheter som kanskje ikke er lett tilgjengelige for mange laboratorier, men som også er tidkrevende og arbeidsintensiv å gjennomføre i et kaldt rom ved 4 °C. I motsetning til STA-PUT, som er egnet for storskala separasjon, kan denne FACS-baserte metoden gi høy renhet og presis brøkdel for et lite eksperiment. En storskala sortering ved hjelp av protokollen vår er mulig, men vil forlenge sorteringstiden betydelig og kan kompromittere cellevariabilitet. Derfor er STA-PUT fortsatt et praktisk alternativ når et stort antall celler er nødvendig5,25,26.
Sammenlignet med den forrige FACS-metoden basert på Ho342 fargestofffarging8,9,10,11,benytter vår protokoll DCV, som har et bredere eksitasjonsspektrum og kan brukes på de fleste nåværende FACS-sorteringer utstyrt med en UV eller 405 nm fiolett laser18. Selv om det er en annen protokoll ved hjelp av DCG14,15,16,17,er forskjellen mellom vår protokoll og DCG-protokollen at vår DCV-protokoll bruker todimensjonal separasjon med DCV blå og DCV rød, etterligne fordelen av Ho342-protokollen. Med denne fordelen tillater vår DCV-protokoll oss å isolere høyt berikede bakterieceller fra voksne testis. DCG-protokollen bruker ikke todimensjonal separasjon og anbefales for isolering av bakterieceller fra juvenile mus. Den todimensjonale separasjonen kan ha bedre oppløsning for å skille underscenene til spermatocytter. Imidlertid er vår metode fortsatt ute av stand til å isolere leptotene og zygotene spermatocytter separat, samt "2C" celletyper, inkludert spermatotogoni, preleptotene spermatocytter og sekundære spermatocytter.
Siden det brede utslippsspekteret av DCV-flekk forårsaker lekkasje til andre kanaler, kan de fleste celle levedyktighetsfargestoffer som PI og 7AAD ikke kombineres på grunn av falske positive signaler. Andre celle levedyktighet fargestoffer med utslipp i fjernrøde eller nær-infrarøde kanaler kan være verdt å prøve i fremtiden. Men etter vår erfaring viser sorterte celler vanligvis ≥ 95% levedyktighet etter 2 timer med FACS sortering (Figur S1), som er tilstrekkelig for nedstrøms analyse.
Sorterte celler hentet fra vår prosedyre kan brukes til ulike nedstrøms eksperimenter, inkludert neste generasjons sekvenseringsanalyse (RNA-seq, ATAC-seq og ChIP-seq). Celler innhentet her kan også brukes til kortsiktig kultur27. Til slutt gir vi en enkel, men effektiv protokoll, inkludert en en-times encellede suspensjonsforberedelsesprosedyre og den detaljerte gatingstrategien for FACS basert på DCV-fargestofffarging, som er egnet for småskala spermatogent celleisolering og kan raskt vedtas av mange etterforskere, til og med flytcytometrinytere.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer at de ikke har noen konkurrerende interesser.
Acknowledgments
Vi takker medlemmer av Namekawa, Yoshida og Maezawa laboratorier for deres hjelp; Katie Gerhardt for redigering av manuskriptet; Mary Ann Handel for å dele H1T-antistoffet, Cincinnati Children's Hospital Medical Center (CCHMC) Research Flow Cytometry Core for deling av FACS-utstyret støttet av NIH S10OD023410; Stipend-in-Aid for Scientific Research (KAKENHI; 17K07424) til T.N.; Lalor Foundation postdoktorstipend til A.S.; AMED-CREST (JP17gm1110005h0001) til S.Y.; forskningsprosjektstipendet fra Azabu University Research Services Division, Kunnskapsdepartementet, kultur, sport, vitenskap og teknologi (MEXT)-støttet program for Private University Research Branding Project (2016–2019), Grant-in-Aid for Research Activity Oppstart (19K21196), Takeda Science Foundation (2019) og Uehara Memorial Foundation Research Incentive Grant (2018) til S.M.; National Institute of Health R01 GM122776 til S.H.N.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 ml tube | Watson | 131-7155C | |
| 100 mm Petri dish | Corning, Falcon | 351029 | |
| 15 mL Centrifuge tube | Watson | 1332-015S | |
| 5 ml polystyrene tube with cell strainer snap cap (35 µm nylon mesh) | Corning, Falcon | 352235 | |
| 50 mL Centrifuge tube | Watson | 1342-050S | |
| 60 mm Petri dish | Corning, Falcon | 351007 | |
| 70 µm nylon mesh | Corning, Falcon | 352350 | |
| Cell sorter | Sony | SH800S | |
| Centrifuge | |||
| Collagenase, recombinant, Animal-derived-free | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 036-23141 | |
| Collagenase, Type 1 | Worthington | LS004196 | |
| Cover glass | Fisher | 12-544-G | |
| Cytospin 3 | Shandon | ||
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Fisher | D1306 | working concentration: 0.1 μg/mL |
| Dnase I | Sigma | D5025-150KU | |
| Donkey serum | Sigma | S30-M | |
| Dulbecco’s phosphate-buffered saline (DPBS) | Gibco | 14190144 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 11885076 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 16000044 | |
| Histone H1t antibody | gift from Mary Ann Handel | 1/2000 diluted | |
| Hank’s balanced salt solution (HBSS) | Gibco | 14175095 | |
| Hyaluronidase from bovine testes | Sigma | H3506-1G | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma | P5493-4L | |
| Pipettemen | |||
| ProLong Gold Antifade Mountant | Fisher | P36930 | |
| rH2AX antibody | Millipore | 05-635 | working concentration: 2 μg/mL |
| Sperm Fertilization Protein 56 (Sp56) antibody | QED Bioscience | 55101 | working concentration: 0.5 μg/mL |
| Sterilized forceps and scissors | |||
| Superfrost /Plus Microscope Slides | Fisher | 12-550-15 | |
| SYCP3 antibody | Abcam | ab205846 | working concentration: 5 μg/mL |
| TWEEN 20 (Polysorbate 20) | Sigma | P9416 | |
| Vybrant DyeCycle Violet Stain (DCV) | Invitrogen | V35003 | |
| Water bath |
References
- Griswold, M. D. Spermatogenesis: The Commitment to Meiosis. Physiological Reviews. 96 (1), 1-17 (2016).
- Yoshida, S. Mouse Spermatogenesis Reflects the Unity and Diversity of Tissue Stem Cell Niche Systems. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. , 036186 (2020).
- Rathke, C., Baarends, W. M., Awe, S., Renkawitz-Pohl, R.
- Maezawa, S., et al. SCML2 promotes heterochromatin organization in late spermatogenesis. Journal of Cell Science. 131 (17), 217125 (2018).
- Maezawa, S., Yukawa, M., Alavattam, K. G., Barski, A., Namekawa, S. H. Dynamic reorganization of open chromatin underlies diverse transcriptomes during spermatogenesis. Nucleic Acids Research. 46 (2), 593-608 (2018).
- Bellve, A. R. Purification, culture, and fractionation of spermatogenic cells. Methods in Enzymology. 225, 84-113 (1993).
- Bryant, J. M., Meyer-Ficca, M. L., Dang, V. M., Berger, S. L., Meyer, R. G. Separation of spermatogenic cell types using STA-PUT velocity sedimentation. Journal of Visualized Experiments. (80), e50648 (2013).
- Gaysinskaya, V., Bortvin, A.
- Bastos, H., et al. Flow cytometric characterization of viable meiotic and postmeiotic cells by Hoechst 33342 in mouse spermatogenesis. Cytometry Part A. 65 (1), 40-49 (2005).
- Getun, I. V., Torres, B., Bois, P. R. Flow cytometry purification of mouse meiotic cells. Journal of Visualized Experimments. (50), e2602 (2011).
- Gaysinskaya, V., Soh, I. Y., van der Heijden, G. W., Bortvin, A. Optimized flow cytometry isolation of murine spermatocytes. Cytometry Part A. 85 (6), 556-565 (2014).
- Romer, K. A., de Rooiji, D. G., Kojima, M. L., Page, D. C. Isolating mitotic and meiotic germ cells from male mice by developmental synchronization, staging, and sorting. Developmental Biology. 443 (1), 19-34 (2018).
- Lam, K. G., Brick, K., Cheng, G., Pratto, F., Camerini-Otero, R. D. Cell-type-specific genomics reveals histone modification dynamics in mammalian meiosis. Nature Communications. 10 (1), 3821 (2019).
- Geisinger, A., Rodriguez-Casuriaga, R. Flow Cytometry for the Isolation and Characterization of Rodent Meiocytes. Methods in Molecular Biology. 1471, 217-230 (2017).
- da Cruz, I., et al. Transcriptome analysis of highly purified mouse spermatogenic cell populations: gene expression signatures switch from meiotic-to postmeiotic-related processes at pachytene stage. BMC Genomics. 17, 294 (2016).
- Rodriguez-Casuriaga, R., et al. Rapid preparation of rodent testicular cell suspensions and spermatogenic stages purification by flow cytometry using a novel blue-laser-excitable vital dye. MethodsX. 1, 239-243 (2014).
- Trovero, M. F., et al. Revealing stage-specific expression patterns of long noncoding RNAs along mouse spermatogenesis. RNA Biology. 17 (3), 350-365 (2020).
- Telford, W. G., Bradford, J., Godfrey, W., Robey, R. W., Bates, S. E. Side population analysis using a violet-excited cell-permeable DNA binding dye. Stem Cells. 25 (4), 1029-1036 (2007).
- Alavattam, K. G., Abe, H., Sakashita, A., Namekawa, S. H. Chromosome Spread Analyses of Meiotic Sex Chromosome Inactivation. Methods in Molecular Biology. 1861, 113-129 (2018).
- Maezawa, S., et al. Super-enhancer switching drives a burst in gene expression at the mitosis-to-meiosis transition. Nature Structural & Molecular Biology. , (2020).
- Sakashita, A., et al. Endogenous retroviruses drive species-specific germline transcriptomes in mammals. Nature Structural & Molecular Biology. , (2020).
- Agrimson, K. S., et al. Characterizing the Spermatogonial Response to Retinoic Acid During the Onset of Spermatogenesis and Following Synchronization in the Neonatal Mouse Testis. Biology of Reproduction. 95 (4), 81 (2016).
- Hogarth, C. A., et al. Turning a spermatogenic wave into a tsunami: synchronizing murine spermatogenesis using WIN 18,446. Biology of Reproduction. 88 (2), 40 (2013).
- Patel, L., et al. Dynamic reorganization of the genome shapes the recombination landscape in meiotic prophase. Nature Structural & Molecular Biology. 26 (3), 164-174 (2019).
- Alavattam, K. G., et al. Attenuated chromatin compartmentalization in meiosis and its maturation in sperm development. Nature Structural & Molecular Biology. 26 (3), 175-184 (2019).
- Adams, S. R., et al. RNF8 and SCML2 cooperate to regulate ubiquitination and H3K27 acetylation for escape gene activation on the sex chromosomes. PLoS Genetics. 14 (2), 1007233 (2018).
- Wiltshire, T., Park, C., Caldwell, K. A., Handel, M. A. Induced premature G2/M-phase transition in pachytene spermatocytes includes events unique to meiosis. Developmental Biology. 169 (2), 557-567 (1995).
