Summary
Protokollen, der præsenteres her, har til formål at påvise forekomsten af heterologe interaktioner mellem Golgi-hjemmehørende type III-membranproteiner med cytoplasmatisk eksponerede N- og/eller C-termini i levende pattedyrceller ved anvendelse af den seneste variant af det splittede luciferasekomplementeringsassay.
Abstract
Målet med denne protokol er at undersøge anvendeligheden af den seneste variant af split luciferase-komplementering til påvisning af heterologe komplekser dannet af nukleotidsukkertransportører (NST'er). Disse ER- og Golgi-residente multitransmembranproteiner bærer de cytoplasmatisk syntetiserede nukleotidsukker over organelmembraner for at levere enzymer, der medierer glykosylering med deres substrater. NST'er findes som dimerer og/eller højere oligomerer. Heterologe interaktioner mellem forskellige NST'er er også blevet rapporteret. For at kontrollere, om teknikken er egnet til at studere fænomenet NST-heteromerisering, testede vi den mod en kombination af de to Golgi-residente NST'er, der tidligere har vist sig at associere på flere andre måder. Luciferase-komplementeringsassayet ser ud til at være særligt velegnet til at studere interaktioner mellem Golgi-residente membranproteiner, da det ikke kræver høje ekspressionsniveauer, hvilket ofte udløser proteinfejllokalisering og øger risikoen for falske positiver.
Introduction
Dette manuskript beskriver en trinvis protokol til kontrol af tilstedeværelsen af heterologe interaktioner mellem Golgi-resident type III-membranproteiner i forbigående transfekterede humane celler ved hjælp af den seneste variant af split luciferase-komplementeringsassayet. Proceduren er blevet grundigst testet mod nukleotidsukkertransportører (NST'er), men vi var også i stand til at opnå positive resultater for andre Golgi-hjemmehørende type III-membranproteiner, hvis N- og / eller C-termini står over for cytoplasmaet.
Vores forskningsgruppe undersøger NST'ernes rolle i glykosylering af makromolekyler. NST'er er Golgi- og/eller ER-resident type III-membranproteiner med N- og C-termini vendt mod den cytoplasmatiske side af den organellare membran1. NST'er menes at bære nukleotidaktiverede sukkerarter over organelmembraner for at levere glycosyltransferaser med deres substrater. NST'er danner dimerer og/eller højere oligomerer2,3,4,5,6,7,8,9,10. Desuden er heterologe interaktioner mellem forskellige NST'er også blevet rapporteret6,11. NST'er blev også påvist at danne komplekser med funktionelt beslægtede glykosyleringsenzymer12,13,14. Vi søgte efter et alternativ til den i øjeblikket anvendte teknik, fluorescens levetidsbilleddannelse (FLIM) -baseret FRET-tilgang, til at studere interaktioner mellem NST'er og funktionelt relaterede Golgi-residente proteiner, så vi besluttede at teste split luciferase-komplementeringsassay. Det gjorde det muligt for os at identificere en ny interaktion mellem en NST og et funktionelt relateret glykosyleringsenzym9.
Den seneste ændring af det opdelte luciferase-komplementeringsassay, NanoBiT, anvendes i den protokol, der præsenteres her15. Det er afhængig af rekonstitutionen af luciferaseenzymet (f.eks. NanoLuc) fra de to fragmenter - den store, betegnet som stor BiT eller LgBiT, et 17,6 kDa-protein, og den lille, der kun består af 11 aminosyrer, betegnet som lille BiT eller SmBiT. De to proteiner af interesse smeltes sammen med de komplementære fragmenter og udtrykkes forbigående i en menneskelig cellelinje. Hvis de to fusionsproteiner interagerer, produceres en luminescens in situ ved tilsætning af et cellegennemtrængeligt substrat. Disse to fragmenter er blevet optimeret, så de forbinder med minimal affinitet, medmindre de bringes sammen af en interaktion mellem de proteiner af interesse, de er smeltet sammen med.
Generelt har bioluminescensbaserede metoder nogle fordele i forhold til dem, der er baseret på fluorescens. Bioluminescerende signaler har et højere signal-støj-forhold, fordi baggrundsluminescensen er ubetydelig sammenlignet med det luciferase-afledte signal16. I modsætning hertil lider fluorescensbaserede tilgange normalt af en relativt høj baggrund forårsaget af fænomenet autofluorescens. Desuden er bioluminescens mindre skadelig for de analyserede celler end fluorescens, da der i det førstnævnte tilfælde ikke er behov for at ophidse prøven. Af disse grunde udkonkurrerer bioluminescerende tilgange til undersøgelse af PPI in vivo de almindeligt anvendte fluorescerende metoder som Förster Resonance Energy Transfer (FRET) eller Bimolekylær fluorescenskomplementering (BiFC).
Vores protokol er afhængig af henvisende luminescens opnået for proteinkombinationen af interesse for luminescens opnået for kontrolkombinationen. Sidstnævnte omfatter et af de testede proteiner, der er smeltet sammen med et større fragment og et kontrolprotein (f.eks. HaloTag), smeltet sammen med et mindre fragment. Sidstnævnte er et protein af bakteriel oprindelse, der ikke forventes at interagere med nogen af pattedyrproteiner. Brug af dette protein som kontrol udgør begrænsninger for topologien af de Golgi-hjemmehørende par af proteiner, der skal analyseres. Da dette protein i pattedyrceller syntetiseres i cytoplasmaet, bør begge proteiner af interesse have mindst en cytoplasmatisk hale.
Denne tilgang kan være særlig nyttig til indledende screening af PPI. Det kan blive den valgte metode, når fusionsproteinerne af interesse udtrykkes på niveauer, der simpelthen er utilstrækkelige til, at andre tilgange kan anvendes. Tilsvarende kan split luciferase-komplementeringsassay være den bedste løsning, hvis proteinerne af interesse udtrykkes på høje niveauer, men dette påvirker deres subcellulære lokalisering negativt eller er kendt for at tvinge ikke-specifikke interaktioner. Da det mindre fragment kun har 11 aminosyrer, kan det splittede luciferasekomplementeringsassay anvendes, når det er umuligt at bruge større tags. Endelig kan det anvendes til yderligere at bekræfte data opnået ved hjælp af andre teknikker, som i det tilfælde, der præsenteres her.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Generering af ekspressionsplasmider
- Undersøg membrantopologi af de proteiner, der er af interesse, ved hjælp af et topologiforudsigelsesværktøj.
- Design kloningsstrategien, så de større og mindre fragmenter vil vende mod cytoplasmaet, når fusionsproteinerne er blevet indsat i Golgi-membraner. Hvis både N- og C-termini af de proteiner af interesse, som i det tilfælde, der præsenteres her, er cytoplasmatisk orienterede, mærke proteinerne på otte mulige måder (se figur 1B). Hvis N- eller C-terminus for et eller begge proteiner af interesse er lysende orienteret, skal du udelukke det fra mærkning.
- Subklon de gener, der er af interesse i passende ekspressionsvektorer (se tabel over materialer) ved at følge standardkloningsprotokoller.
BEMÆRK: Det anbefales at teste alle mulige retninger, da nogle mærkningsindstillinger muligvis ikke fungerer på grund af utilstrækkelig nærhed, suboptimal orientering eller rumlige begrænsninger.
2. Forbigående transfektion af ekspressionsplasmiderne i cellerne
- Høst den klæbende HEK293T-cellekultur ved trypsinisering og resuspend cellerne i et dedikeret komplet vækstmedium. Plade cellerne (2 x 104/100 μL/brønd) på en klar bund, hvid side 96-brønds plade. Juster det samlede antal brønde for at imødekomme alle testede kombinationer og kontroller, herunder replikater.
BEMÆRK: Forsøg kun at bruge de indre 60 brønde på pladen for at minimere termiske skift og undgå fordampning natten over. Brug af poly-D-lysinbelagte plader anbefales stærkt, såsom dem, der er angivet i materialetabellen, ellers kan celler løsne sig under de efterfølgende vasketrin. - Cellerne dyrkes natten over under standardbetingelser (37 °C, 5 % CO2).
- Den næste dag transfekterer cellerne med de ønskede kombinationer af ekspressionsplasmider opnået i punkt 1.1.
- Fortynd ekspressionsplasmider i et serumfrit medium (se materialetabellen) til 6,25 ng/μL for hver konstruktion.
- Tilsæt det lipidbaserede transfektionsreagens i et passende lipid-til-DNA-forhold og inkuber i henhold til producentens instruktion.
- Tilsæt 8 μL lipid:DNA-blanding til udpegede brønde. Bland indholdet af pladen ved blid rotation. Dette resulterer i transfektion af begge ekspressionskonstruktioner ved 50 ng / brønd.
- Cellerne dyrkes i 20-24 timer under standardbetingelser (37 °C, 5 % CO2).
BEMÆRK: Dyrkning af cellerne i længere tid kan resultere i højere niveauer af fusionsproteinekspression, hvilket kan fremme en ikke-specifik sammenhæng mellem fragmenterne.
3. Medium udveksling
- Den næste dag udskiftes det konditionerede medium med 100 μL af et serumfrit medium i hver brønd. Sørg for, at cellerne ikke har løsnet sig ved medium udveksling.
BEMÆRK: Dette trin skal udføres 2-3 timer før tilsætning af furimazinarbejdsløsningen. Serum tilbagetrækning minimerer baggrund forårsaget af autoluminescens af furimazin.
4. Fremstilling af furimazin arbejdsløsning
- Lige før målingen blandes 1 volumen furimazin med 19 volumener af en fortyndingsbuffer (en 20 gange fortynding).
BEMÆRK: Det samlede volumen af furimazinarbejdsløsningen, der skal fremstilles, afhænger af antallet af individuelle brønde, der skal analyseres (furimazinarbejdsløsningen tilsættes til cellekulturmediet i et forhold på 1:5, derfor skal der til hver brønd, der tidligere er fyldt med 100 μL af et serumfrit medium 25 μL af furimazinarbejdsløsningen, tilsættes). - Der tilsættes furimazinarbejdsløsningen til udpegede brønde (25 μL/brønd). Bland forsigtigt pladen manuelt eller ved hjælp af en orbital shaker (f.eks. 15 s ved 300-500 o / min).
5. Måling af luminescens
- Indsæt pladen i en luminescensmikropladelæser.
- For forsøg, der skal udføres ved 37 °C, ligestilles pladen i 10-15 minutter ved den angivne temperatur.
- Vælg de brønde, der skal analyseres.
- Læs luminescens med integrationstid på 0,3 s. Fortsæt med at overvåge luminescensen i op til 2 timer, når det er nødvendigt.
6. Analyse af data
- Beregn gennemsnitsværdier og standardafvigelser for alle de testede kombinationer og kontrolkombinationer.
- Analysér data ved hjælp af envejs ANOVA med flere sammenligninger.
- Værdierne for foldændringen beregnes ved at dividere en gennemsnitlig luminescens opnået for kombinationer af interesse med en gennemsnitlig luminescens opnået for de tilsvarende negative kontroller. Evaluer resultaterne.
BEMÆRK: Den tilgang til dataanalyse, der foreslås her, forudsætter, at interaktionen kan hævdes, hvis den luminescens, der opnås for den testede kombination, er statistisk signifikant højere end den luminescens, der er opnået for den tilsvarende kontrolkombination, og samtidig overstiger forholdet mellem disse to værdier 10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For at opnå de mest pålidelige data i denne tilgang bør alle mulige kombinationer testes (jf . figur 1). Parallelt hertil bør positive og negative kontroller medtages. Den positive kontrol skal bestå af de to proteiner, der vides at interagere, hvoraf det ene er smeltet sammen med det større fragment, og det andet er smeltet sammen med det mindre fragment. Den negative kontrol bør ideelt set bestå af de to ikke-interagerende type III-membranproteiner, der er mærket på samme måde. Det kan imidlertid være en udfordring at etablere en sådan kontrol, da den manglende interaktion mellem de to kontrolproteiner bør bekræftes grundigt ved hjælp af flere alternative tilgange. Derfor kan man anvende et cytosolisk protein af ikke-human oprindelse, der ikke forventes at interagere med noget humant protein (f.eks. HaloTag) som en negativ kontrol, hvis N- og/eller C-termini af proteinerne, hvis interaktion skal bestemmes, er cytoplasmatisk eksponeret som i det tilfælde, der præsenteres her. Vi anbefaler stærkt en yderligere verifikation af de opnåede resultater ved hjælp af denne type kontrol ved co-ekspression af de umærkede varianter af et af proteinerne af interesse kombineret med titrering af de tilsvarende plasmider. Hvis de to proteiner specifikt interagerer, bør en ekstra kopi af en af dem, der mangler luciferasefragmentet, resultere i et specifikt fald i luminescens.
Værdier for relative luminescensenheder (RLU), der er typiske for positive og negative kombinationer, er anført i tabel 1. Resultaterne blev opnået for de to NST'er, SLC35A2 og SLC35A3, der viste sig at associere ved co-immunoprecipitation og FLIM-FRET6 samt in situ nærhedsligationsassay11. Både SLC35A2 og SLC35A3 er Golgi-hjemmehørende type III membranproteiner med N- og C-termini vendt mod cytoplasmaet (figur 1A). Derfor er der otte mulige mærkningsmuligheder, og de resulterende fusionsproteiner kan også sættes sammen på otte mulige måder (figur 1B). Gennemsnitlige RLU-værdier svarende til alle de testede kombinationer og kontrolkombinationer er afbildet i figur 2A. Den positive kontrol er også inkluderet. Et indledende krav for, at et udvalgt resultat kan betragtes som vejledende for en interaktion, er, at den RLU-værdi, der opnås for kombinationen af interesse, statistisk set er signifikant højere end den RLU-værdi, der er opnået for den tilsvarende kontrolkombination. I figur 2A ses tre sådanne kombinationer (LgBiT-SLC35A2 + SLC35A3-SmBiT, SmBiT-SLC35A2 + LgBiT-SLC35A3 og SLC35A2-SmBiT + LgBiT-SLC35A3). Det næste trin i analysen af resultater indebærer opnåelse af forholdsværdier for kombinationerne af interesse ved at dividere de tilsvarende RLU-værdier med RLU-værdier opnået for de respektive kontroller. Resultaterne af en sådan analyse er vist i figur 2B. Ifølge producentens forslag er forholdet mellem 10 og 1000 meget vejledende for specifikke interaktioner. Der er to kombinationer, der opfylder disse kriterier (SmBiT-SLC35A2 + LgBiT-SLC35A3 og SLC35A2-SmBiT + LgBiT-SLC35A3) og understøtter ideen om, at SLC35A2 og SLC35A3 interagerer. Det faktum, at de øvrige seks kombinationer er negative, betyder imidlertid ikke, at der slet ikke er nogen interaktioner mellem de respektive fusionsproteiner, men antyder snarere, at mærkningsstrategien ikke var optimal i disse tilfælde. Dette eksempel viser, hvor vigtigt det er at teste alle mulige kombinationer.
Data præsenteret i figur 2 blev desuden bekræftet ved co-ekspression af HA-mærket SLC35A2 eller SLC35A3 med den kombination, der resulterede i den højeste relative luminescens, nemlig SLC35A2-LgBiT + SmBiT-SLC35A3. Varierende mængder af plasmiderne, der koder for HA-mærkede NST-varianter, blev anvendt til co-transfektion. Dette resulterede i et statistisk signifikant, dosisafhængigt fald i RLU-værdier (figur 3). Specifik og dosisafhængig forstyrrelse af interaktionen mellem SLC35A2-LgBiT og SmBiT-SLC35A3 ved samtidig co-ekspression af HA-mærkede NST-varianter er vist i tabel 2.
Det mest almindelige problem forbundet med den metode, der præsenteres her, er den dårlige effektivitet af transfektion. For at kontrollere, om dette er årsagen til suboptimale resultater, skal du inkludere positiv kontrol i alle eksperimenter. Den positive kontrol, vi anvendte for at opnå de data, der præsenteres her, består af de to interagerende fusionsproteiner: cAPM-afhængig proteinkinasekatalytisk underenhed alfa (PRKACA) smeltet sammen med det mindre fragment og cAPM-afhængig proteinkinase type II-alfa-regulatorisk underenhed (PRKAR2A) smeltet sammen med det større fragment. I vores hænder nåede den tilsvarende RLU-værdi ~ 6 x 105. Et signifikant fald (2-3 størrelsesordener) i dette tal kan være tegn på den suboptimale effektivitet af den udførte transfektion. I et sådant tilfælde anbefaler vi at kontrollere de dyrkede cellers trivsel og sørge for, at det passende antal celler bliver belagt til transfektion.
Figur 1: Skemaer over membrantopologi og mærkning. A) Membrantopologi af SLC35A2- og SLC35A3-proteiner. B) Mulighederne for at mærke SLC35A2- og SLC35A3-proteiner med de opdelte luciferasekomplementeringsassayfragmenter og kombinere de resulterende fusionsproteiner til analysen. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Resultater af det opdelte luciferasekomplementeringsassay udført i HEK293T-celler for de udvalgte proteinkombinationer og de tilsvarende negative kontroller (behandlede data). A) RLU-værdier opnået for de udvalgte proteinkombinationer og de tilsvarende negative kontroller. Negativ, HaloTag mærket med SmBiT; PRKAR2A, cAPM-afhængig proteinkinase type II-alfa-regulatorisk underenhed; PRKACA, cAPM-afhængig proteinkinase katalytisk underenhed alfa. Data blev analyseret ved hjælp af envejs ANOVA med flere sammenligninger og præsenteres som et gennemsnit ± standardafvigelse (SD) fra tre tekniske replikater. p < 0,1 *, p < 0,05 **, p < 0,01 ***. (B) Foldændringer beregnet ved at dividere en gennemsnitlig luminescens opnået for den testede kombination (RLU SAMPLE) med en gennemsnitlig luminescens opnået for den tilsvarende negative kontrol (RLU CONTROL). Tærskelværdien, der anses for at indikere en interaktion, blev fastsat til 10. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Specifik og dosisafhængig forstyrrelse af interaktionen mellem SLC35A2-LgBiT og SmBiT-SLC35A3 ved samtidig co-ekspression af HA-mærkede NST-varianter. HEK293T-celler blev transfekterede med plasmider, der koder for SLC35A2-LgBiT og SmBiT-SLC35A3 og desuden enten med et tomt pSelect-plasmid (mock) eller med stigende mængder pSelect-plasmider, der koder for HA-mærket SLC35A2 (venstre panel) og SLC35A3 (højre panel). Data blev analyseret ved hjælp af envejs ANOVA med flere sammenligninger og præsenteres som et gennemsnit ± standardafvigelse (SD) fra tre tekniske replikater. p < 0,05 **, p < 0,001 ****. Klik her for at se en større version af denne figur.
Tabel 1: Resultater af assay udført i HEK293T-celler for de udvalgte proteinkombinationer og de tilsvarende negative kontroller (rådata). Uforarbejdede RLU-værdier opnået for de udvalgte proteinkombinationer og de tilsvarende negative kontroller vises. Negativ, HaloTag mærket med SmBiT; PRKAR2A, cAPM-afhængig proteinkinase type II-alfa-regulatorisk underenhed; PRKACA, cAPM-afhængig proteinkinase katalytisk underenhed alfa, TR, teknisk replikat. Klik her for at downloade denne tabel.
Tabel 2: Specifik og dosisafhængig forstyrrelse af interaktionen mellem SLC35A2-LgBiT og SmBiT-SLC35A3 ved samtidig samekspression af HA-mærkede NST-varianter (rådata). Uforarbejdede RLU-værdier opnået for de udvalgte proteinkombinationer vises. Mock, celler, der udtrykker SLC35A2-LgBiT og SmBiT-SLC35A3, co-transfekterede med en tom pSelect-vektor; HA-SLC35A2, celler, der udtrykker SLC35A2-LgBiT og SmBiT-SLC35A3, der transfekteres sammen med de angivne mængder af et pSelect-plasmid, der koder for SLC35A2, mærket med HA-epitopen ved N-endestationen; HA-SLC35A3, celler, der udtrykker SLC35A2-LgBiT og SmBiT-SLC35A3, der transfekteres sammen med de angivne mængder af et pSelect-plasmid, der koder for SLC35A3, mærket med HA-epitopen ved N-endestationen; TR, teknisk replikat. Klik her for at downloade denne tabel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her giver vi en detaljeret protokol, der muliggør demonstration af heterologe komplekser dannet mellem Golgi-residente type III-membranproteiner, såsom NST'er, ved hjælp af det delte luciferase-komplementeringsassay. Den foreslåede tilgang til dataanalyse og -fortolkning indebærer at relatere den luminescens, der er opnået for proteinkombinationen af interesse, til den luminescens, der er opnået for den tilsvarende kontrolkombination, som består af et af de proteiner af interesse, der er smeltet sammen med det større fragment, og kontrolproteinet af bakteriel oprindelse smeltet sammen med det mindre fragment. Sidstnævnte udtrykkes i cytoplasmaet af pattedyrceller; Brug af det derfor som reference kræver, at N- og / eller C-termini af proteinerne, hvis interaktion skal analyseres, er på den cytoplasmatiske side af Golgi-membranen.
De kritiske trin i protokollen er plasmiddesign, plettering af cellerne, der skal transfekteres, selve transfektionen, mediumudvekslingen, forberedelse af furimazinarbejdsløsningen og tilsætning af den til cellerne. Plasmiddesignet skal laves på en sådan måde, at begge luciferasefragmenter vender mod cytoplasmaet, ellers fungerer kontrolkombinationer ikke, og reference-RLU-værdierne mangler. Celler, der skal transfekteres, skal belægges som specificeret i protokollen, ellers kan transfektionseffektiviteten være suboptimal. Vi anbefaler at bruge multiwell plader med den poly-L-lysinbelagte overflade til at understøtte cellefastgørelse, mens mediet udveksles. Endelig skal furimazinarbejdsløsningen friskfremføres og straks tilsættes til cellerne. Når det er tilføjet, skal udlæsningen udføres så hurtigt som muligt.
For at undgå ufattelige resultater bør positive og negative kontroller altid medtages. Den positive kontrol bør altid anvendes, således at transfektionseffektiviteten overvåges. Det er meget vigtigt, at alle mulige fusionsproteiner, der er topologisk kompatible med hinanden såvel som med den HaloTag-baserede negative kontrol, genereres og kombineres. Hvis det er muligt, bør den negative kontrol, der består af et membranprotein, der ikke interagerer med nogen af de proteiner, der er af interesse, anvendes. Her anvendte vi ikke en sådan kontrol, da dens udvikling stadig er på vej. I stedet tvang vi en specifik demontering af de komplekser af interesse ved at co-udtrykke en ekstra, umærket kopi af et af de analyserede proteiner. De ekspressionsvektorer, vi brugte, bærer den relativt svage herpes simplex virus-thymidinkinase (HSV-TK) promotor, som sikrer lave ekspressionsniveauer, der er optimale til at opnå specifikt resultat. I tilfælde af suboptimale resultater kan det imidlertid være en fordel at anvende de CMV-baserede vektorer eller alternativt optimere mængden af plasmider, der anvendes til transfektion.
Den præsenterede metode, selvom den er kraftfuld og praktisk, har nogle begrænsninger. For det første tillader denne metode ikke at konkludere, om de identificerede komplekser svarer til dimerer eller højere ordens oligomerer. Desuden kan den subcellulære lokalisering af de interagerende proteiner ikke overvåges. Dette er dog muligt ved udvidelsen af den grundlæggende protokol med bioluminescerende billeddannelse, selv om den rumlige opløsning af sådanne billeder ville være signifikant lavere sammenlignet med fluorescensbaserede tilgange.
Den præsenterede metode er meget hurtig og effektiv (målingen tager op til flere minutter, og dataene opnås fra tusindvis af celler). Databehandling og -fortolkning er også relativt ligetil. Lidt eller ingen optimering af den grundlæggende protokol er nødvendig. Det eneste specifikke udstyr, der kræves, er et luminometer. Det opdelte luciferase-komplementeringsassay og BiFC arbejder på det samme væsentlige princip, dvs. rekonstitution af et funktionelt protein fra dets ikke-funktionelle fragmenter. Generelle fordele ved bioluminescensbaserede tilgange i forhold til dem, der er baseret på fluorescens, var allerede opført i indledningen. En specifik fordel ved split luciferase-komplementeringsassayet i forhold til BiFC er, at førstnævnte er fuldt reversibel15. I BiFC vil et fluorescerende protein, når det er rekonstitueret, ikke dissociere tilbage i de tilsvarende ikke-fluorescerende fragmenter17. I modsætning hertil er samlingen af NanoLuc-underenhederne reversibel, hvilket skaber en unik mulighed for at studere dynamikken i PPI'er. Endelig tillader den ekstraordinære følsomhed af den præsenterede metode at antage, at denne tilgang skal fungere selv med de cellelinjer, der er vanskelige at transfektere.
Protokollen, der præsenteres her, gør det muligt at bestemme, om de to Golgi-residente type III-membranproteiner interagerer. Som allerede nævnt kan den grundlæggende opsætning af metoden kombineres med bioluminescensbilleddannelse for at bekræfte den subcellulære lokalisering af PPI af interesse. Reversibiliteten af dette opdelte luciferase-komplementeringsassay gør det muligt at studere dynamikken i PPI i realtid. Det selvlysende signal afledt af furimazin opretholdes i ca. 2 timer. Imidlertid er substrater til det delte luciferase-komplementeringsassay, der sikrer en væsentligt længere (timer til dage) varighed af det resulterende signal, også tilgængelige. Denne metode gør det muligt at identificere de faktorer, der udløser eller forhindrer PPI af interesse. Nogle af de seneste eksempler på dets anvendelse omfatter undersøgelser af interaktioner mellem G-proteiner og G-proteinkoblede receptorer18, proteinkonformationsændringer19, proteinubiquitination20, internalisering af celleoverfladereceptorer21 og identifikation af faktorer, der modulerer PPI22,23. Derfor ser denne metode ud til at være et alsidigt værktøj med et stort potentiale til at opfylde selv meget udfordrende eksperimentelle mål.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af bevilling nr. 2016/23/D/NZ3/01314 fra National Science Centre (NCN), Krakow, Polen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% trypsin-EDTA solution | |||
| Adherent mammalian cell line | |||
| BioCoat Poly-D-Lysine 96-well White/Clear Flat Bottom TC-treated Microplate, with Lid | Corning | 356651 | |
| Cell culture centrifuge | |||
| Cell culture supplements (heat-inactivated fetal bovine serum, L-glutamine, penicillin, streptamycin) | |||
| CO2 incubator | |||
| Expression plasmids encoding protein(s) of interest not tagged with NanoBiT fragments | |||
| FuGENE HD Transfection Reagent | Promega | E2311 | |
| GloMax Discover Microplate Reader (or a different luminescence microplate reader) | Promega | GM3000 | |
| Growth medium dedicated to the cell line used | |||
| Materials and reagents for standard molecular cloning (bacteria, thermostable polymerase, restriction enzymes, DNA ligase, materials and reagents for nucleic acid purification) | |||
| NanoBiT MCS Starter System | Promega | N2014 | This kit contains vectors enabling tagging of the proteins of interest with NanoBiT fragments at different orientations as well as the control plasmid encoding HaloTag protein fused with SmBiT and a positive control plasmid pair. |
| Nano-Glo Live Cell Assay System | Promega | N2011 | This kit contains furimazine, which is a substrate enabling detection of the NanoLuc activity in living cells, and a dedicated dilution buffer. |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium, no phenol red | Gibco | 11058021 | |
| Oribital shaker | |||
| Software for data analysis (e.g. GraphPad Prism) | |||
| Thermocycler |
References
- Hadley, B., et al. Structure and function of nucleotide sugar transporters: Current progress. Computational and Structural Biotechnology Journal. 10 (16), 23-32 (2014).
- Puglielli, L., Hirschberg, C. B. Reconstitution, identification, and purification of the rat liver Golgi membrane GDP-fucose transporter. Journal of Biological Chemistry. 274 (50), 35596-35600 (1999).
- Puglielli, L., Mandon, E. C., Rancour, D. M., Menon, A. K., Hirschberg, C. B. Identification and purification of the rat liver Golgi membrane UDP-N-acetylgalactosamine transporter. Journal of Biological Chemistry. 274 (7), 4474-4479 (1999).
- Gao, X., Dean, N. Distinct protein domains of the yeast Golgi GDP-mannose transporter mediate oligomer assembly and export from the endoplasmic reticulum. Journal of Biological Chemistry. 275 (23), 17718-17727 (2000).
- Olczak, M., Guillen, E. Characterization of a mutation and an alternative splicing of UDP-galactose transporter in MDCK-RCAr cell line. Biochimica et Biophysica Acta. 1763 (1), 82-92 (2006).
- Maszczak-Seneczko, D., Sosicka, P., Majkowski, M., Olczak, T., Olczak, M. UDP-N-acetylglucosamine transporter and UDP-galactose transporter form heterologous complexes in the Golgi membrane. FEBS Letters. 586 (23), 4082-4087 (2012).
- Nji, E., Gulati, A., Qureshi, A. A., Coincon, M., Drew, D. Structural basis for the delivery of activated sialic acid into Golgi for sialyation. Nature Structural and Molecular Biology. 26 (6), 415-423 (2019).
- Parker, J. L., Corey, R. A., Stansfeld, P. J., Newstead, S. Structural basis for substrate specificity and regulation of nucleotide sugar transporters in the lipid bilayer. Nature Communications. 10 (1), 4657 (2019).
- Wiertelak, W., Sosicka, P., Olczak, M., Maszczak-Seneczko, D. Analysis of homologous and heterologous interactions between UDP-galactose transporter and beta-1,4-galactosyltransferase 1 using NanoBiT. Analytical Biochemistry. 593, 113599 (2020).
- Hong, K., Ma, D., Beverley, S. M., Turco, S. J. The Leishmania GDP-mannose transporter is an autonomous, multi-specific, hexameric complex of LPG2 subunits. Biochemistry. 39 (8), 2013-2022 (2000).
- Sosicka, P., et al. An insight into the orphan nucleotide sugar transporter SLC35A4. Biochimica et Biophysica Acta. Molecular Cell Research. 1864 (5), 825-838 (2017).
- Sprong, H., et al. Association of the Golgi UDP-galactose transporter with UDP-galactose:ceramide galactosyltransferase allows UDP-galactose import in the endoplasmic reticulum. Molecular Biology of the Cell. 14 (8), 3482-3493 (2003).
- Maszczak-Seneczko, D., et al. UDP-galactose (SLC35A2) and UDP-N-acetylglucosamine (SLC35A3) Transporters Form Glycosylation-related Complexes with Mannoside Acetylglucosaminyltransferases (Mgats). Journal of Biological Chemistry. 290 (25), 15475-15486 (2015).
- Khoder-Agha, F., et al. N-acetylglucosaminyltransferases and nucleotide sugar transporters form multi-enzyme-multi-transporter assemblies in golgi membranes in vivo. Cellular and Molecular Life Sciences. 76 (9), 1821-1832 (2019).
- Dixon, A. S., et al. NanoLuc Complementation Reporter Optimized for Accurate Measurement of Protein Interactions in Cells. ACS Chemical Biology. 11 (2), 400-408 (2016).
- Tung, J. K., Berglund, K., Gutekunst, C. -A., Hochgeschwender, U., Gross, R. E. Bioluminescence imaging in live cells and animals. Neurophotonics. 3 (2), 025001 (2016).
- Hu, C. D., Chinenov, Y., Kerppola, T. K. Visualization of interactions among bZIP and Rel family proteins in living cells using bimolecular fluorescence complementation. Molecular Cell. 9 (4), 789-798 (2002).
- Inoue, A., et al.
- White, C. W., Caspar, B., Vanyai, H. K., Pfleger, K. D. G., Hill, S. J. CRISPR-Mediated Protein Tagging with Nanoluciferase to Investigate Native Chemokine Receptor Function and Conformational Changes. Cell Chemical Biology. 27, 499-510 (2020).
- Akinjiyan, F. A., et al. A Novel Luminescence-Based High-Throuput Approach for Cellular Resolution of Protein Ubiquitination using Tandem Ubiquitin Binding Entities (TUBEs). SLAS Discovery. 25 (4), 350-360 (2020).
- Soave, M., Kellam, B., Woolard, J., Briddson, S. J., Hill, S. J. NanoBiT Complemetation to Monitor Agonist-Induced Adenosine A1 Receptor Internalization. SLAS Discovery. 25 (2), 186-194 (2020).
- Crowley, E., Leung, E., Reynisson, J., Richardson, A. Rapid changes in the ATG5-ATG16L1 complex following nutrient deprivation measured using NanoLuc Binary Technlology (NanoBiT). FEBS Journal. , 15275 (2020).
- Shetty, S. K., Walzem, R. L., Davies, B. S. J. A novel NanoBiT-based assay monitors the interaction between lipoprotein lipase and GPIHBP1 in real time. Journal of Lipid Research. 61 (4), 546-559 (2020).
