Summary
يصف الإجراء عزل الزغب من ظهارة الفأر المعوية التي تخضع للتمايز لتحديد إمكانات تكوين الأعضاء.
Abstract
ويعزى كلونوجينيتي من organoids من ظهارة الأمعاء إلى وجود الخلايا الجذعية فيه. يتم تقسيم ظهارة الفأر المعوية الصغيرة إلى سرداب وزغب: تقتصر الخلايا الجذعية والمتكاثرة على السرداب ، في حين أن ظهارة الزغب تحتوي على خلايا مختلفة فقط. وبالتالي ، فإن سرداب الأمعاء العادية ، ولكن ليس الزغب ، يمكن أن تؤدي إلى الأجهزة العضوية في الثقافات ثلاثية الأبعاد. الإجراء الموصوف هنا ينطبق فقط على ظهارة villus التي تخضع للتمايز مما يؤدي إلى الجذعية. يستخدم الأسلوب الموصوف Smad4-loss-of-function:β-catenin كسب من وظيفة (Smad4 KO:β-cateninGOF) الماوس متحولة مشروطة. الطفرة يسبب الزغب المعوية لdedifferentiate وتوليد الخلايا الجذعية في الزغب. يتم كشط الزغب المعوي الذي يخضع للتمايز من الأمعاء باستخدام الشرائح الزجاجية ، ووضعها في مصفاة 70 ميكرومتر وغسلها عدة مرات لتصفية أي خلايا فضفاضة أو سرداب قبل الطلاء في مصفوفة BME-R1 لتحديد إمكاناتها لتشكيل الجهاز. تم استخدام معيارين رئيسيين لضمان تطوير الأجهزة العضوية الناتجة من مقصورة villus المتمايزة وليس من السراديب: 1) تقييم الزغب المعزول بشكل مجهري لضمان عدم وجود أي سرداب مربوطة ، قبل وبعد الطلاء في المصفوفة ثلاثية الأبعاد ، و 2) مراقبة المسار الزمني لتطور الجهازية من villi. بدء العضوية من الزغب يحدث بعد يومين إلى خمسة أيام فقط من الطلاء ويبدو على شكل غير منتظم، في حين أن organoids المستمدة من سرداب من ظهارة الأمعاء نفسها واضحة في غضون ستة عشر ساعة من الطلاء وتظهر كروية. الحد من هذه الطريقة، ومع ذلك، هو أن عدد organoids شكلت، والوقت اللازم لبدء organoid من الزغب تختلف تبعا لدرجة dedifferentiation. وبالتالي ، اعتمادا على خصوصية الطفرة أو الإهانة التي تسبب التمايز ، يجب تحديد المرحلة المثلى التي يمكن فيها حصاد الزغب لتقصي إمكانات تشكيل الأعضاء الخاصة بهم ، تجريبيا.
Introduction
السراديب المعوية ولكن ليس زغب، تشكل organoids عندما مثقف في مصفوفة Matrigel أو BME-R1. هذه organoids هي هياكل التنظيم الذاتي، وغالبا ما يشار إليها باسم "الأمعاء المصغرة" بسبب وجود مختلف الأنساب المختلفة، السلف، والخلايا الجذعية الموجودة في ظهارة الأمعاء في الجسم الحي. ويعزى احتمال تشكيل organoids من سرداب إلى وجود الخلايا الجذعية1. الزغب المعوي من ناحية أخرى تتكون فقط من خلايا مختلفة، وبالتالي لا يمكن تشكيل organoids. ومع ذلك، قد تؤدي الطفرات2 أو الشروط التي تسمح dedifferentiation من ظهارة villus إلى الخلايا الجذعية في زغب2،3. يمكن تأكيد هذا التغيير المصيري الناتج عن الجذعية في ظهارة السيلي عن طريق طلاء ظهارة villus المتمايزة في مصفوفة ثلاثية الأبعاد لتحديد إمكاناتها لتشكيل الجهاز كمؤشر على النبع من الدي نوفو في ظهارة villus. وبالتالي ، فإن الجانب الحاسم من هذا الإجراء هو ضمان عدم وجود تلوث سرداب.
وSmad4KO:β-cateninGOF الطفرة الشرطية يسبب dedifferentiation في ظهارة الأمعاء تميزت التعبير عن الانتشار وعلامات الخلايا الجذعية في الزغب, وفي نهاية المطاف تشكيل هياكل مثل سرداب في زغب يشار إليها باسم سرداب خارج الرحم تم تحديد وجود هذه الخلايا الجذعية هذه villi dedifferentiated من خلال التعبير عن علامات الخلايا الجذعية في سرداب خارج الرحم(في الجسم الحي)وقدرة الزغب متحولة لتشكيل organoids wh en مطلي ماتريجل3. الإجراء المذكور أدناه يوضح المنهجية المستخدمة لتأكيد الجذعية من ظهارة الأمعاء المتمايزة في Smad4 KO:β-cateninGOF الفئران المتحولة. كانت إحدى السمات الرئيسية لهذه المنهجية لعزل الزغب هي استخدام كشط التجويف المعوي ، بدلا منطريقةEDTA 4. على عكس طريقة إزالة EDTA ، تحتفظ عزلة الزغب عن طريق كشط غالبية mesenchyme الأساسي وتسمح بضبط ضغط الكشط لتسفر عن زغب بدون سرداب مربوطة. ضغط كشط ذاتية للمشغل، وبالتالي، يجب تحديد الضغط الأمثل لتسفر عن زغب دون سرداب المربوطة تجريبيا من قبل المشغل. الجانب الحاسم من هذا الإجراء هو ضمان عدم وجود تلوث سرداب عن طريق الفحص المجهري للزغب قبل وبعد الطلاء في مصفوفة BME-R1.
يتم كشط زغب الأمعاء قبالة التجويف المعوي مع الشرائح الزجاجية ووضعها في مرشح 70 ميكرومتر وغسلها مع برنامج تلفزيوني للتخلص من الخلايا فضفاضة أو سرداب، إن وجدت، قبل الطلاء في مصفوفة BME-R1. وتشدد هذه الطريقة على المعايير التالية لتجنب التلوث سرداب: أ) حصر حصاد الزغب النصف القريب من الاثني عشر حيث الزغب هي الأطول، ب) التقليل من عدد الخدوش ذات العائد الزغب، ج) غسل المرشح الذي يحتوي على الزغب من خلال سلسلة من برنامج تلفزيوني في طبق من ستة آبار، و د) مما يؤكد عدم وجود تلوث سرداب عن طريق الفحص المجهري قبل وبعد الطلاء في مصفوفة BME-R1. عزل سيلي عن طريق كشط، بدلا من EDTA chelation، يمنع فقدان كامل من mesenchyme الكامنة التي قد توفر إشارات المتخصصة5،6،7،8، إذا لزم الأمر، لبدء organoid من ظهارة villus.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وقد حظيت جميع تجارب الماوس التي أجريت، بما في ذلك استخدام تاموكسيفين والقتل الرحيم عن طريق خلع عنق الرحم، بموافقة اللجنة المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها في معهد ستيفنز لعلم ال echnology.
1. الفئران
ملاحظة: جيل Smad4f/f; كاتنبlox(ex3)/+; وقد وصفت سابقا الفئران Villin-CreERT2 3. الفئران الإناث البالغات بين ثمانية إلى اثني عشر أسبوعا من agewere المستخدمة.
- حث Smad4KO:β-cateninGOF طفرة في Smad4f/f; كاتنبlox(ex3)/+; Villin-CreERT2 مع الحقن داخل الصفاق من تاموكسيفين في زيت الذرة لمدة أربعة أيام متتالية.
- التضحية miceby خلع عنق الرحم بعد عشرة أيام من حقن تاموكسيفين الأولى.
- رش البطن مع الإيثانول 70٪ لمنع فرو الماوس الدخول في تجويف الصفاق.
- افتح تجويف البطن بمقص تشريح لكشف الأمعاء. عزل الأمعاء بمساعدة مقص والمملقط.
ملاحظة: ما يصاحب ذلك من فقدان Smad4 جنبا إلى جنب مع كسب طفرة وظيفة من β-catenin (Smad4KO;β-cateninGOF) في ظهارة الأمعاء تم تحقيقه عن طريق حقنSmad4و / و; كاتنبlox(ex3)/+; فئران Villin-CreERT2 كل يوم لمدة أربعة أيام متتالية بوزن جسم 0.05 غرام تاموكسيفين/كجم في زيت الذرة. يتم حصاد هذه الفئران بعد عشرة أيام من حقن تاموكسيفين الأولى لضمان وجود خلايا تعبر عن علامات مرتبطة بالخلايا الجذعية في الزغب المتمايز.
2. العزلة الاثني عشر وإعداد
- تشريح النصف القريب من الاثني عشر.
- تدفق الاثني عشر مع 5 مل من الجليد الباردة PBS في حقنة 10 مل لمسح المحتوى الإنارة.
- فتح duodenum طوليا مع مقص الزاوية ووضع شقة الاثني عشر على لوحة بيتري 15 سم على الجليد مع تجويف الاثني عشر التي تواجه المشغل.
3. عزلة Villi عن طريق كشط
- قبل البدء في كشط، ضع مصفاة شبكة 70 ميكرومتر في واحدة من آبار لوحة زراعة الأنسجة 6-جيدا. ملء جميع الآبار مع 4 مل من برنامج تلفزيوني 1x ووضع لوحة زراعة الأنسجة 6-جيدا على الجليد (الشكل 1).
- كشط الزغب على النحو التالي باستخدام اثنين من الشرائح الزجاجية المجهرية: واحد لعقد الاثني عشر إلى أسفل والآخر لكشط (الشكل 1B1).
- كشط الجانب الإنارة من الاثني عشر سطحيا إلى جيئة وذهابا مرتين لإزالة المخاط. تطبيق الضغط بحيث هذه الخطوة يزيل طبقة المخاط، ولكن ليس الزغب.
- كشط duodenum مرة أخرى، إلى جيئة وذهابا مرتين تطبيق نفس الضغط كما هو الحال في 3.1، وخلال ذلك يمكن أن ينظر إلى زغب جمع على الشرائح(الشكل 1B2). هذا هو الضغط الأمثل (الذي يجب تحديده تجريبيا من قبل المشغل) لتحقيق الزغب دون ربط سرداب.
- استخدام أنبوب نقل 1 مل تحتوي على برنامج تلفزيوني لنقل زغب (التي يتم جمعها على الشريحة من الخطوة 3.2.2.) إلى 70 ميكرومتر شبكة مصفاة وضعت في طبق 6-جيدا. يتم جمع الزغب وبالتالي، بعد كل كشط(الشكل 1B2).
- غسل الزغب التي تم جمعها في مصفاة 70 ميكرومتر (من الخطوة 3.3) عن طريق نقل مصفاة (مع زغب) من خلال سلسلة من الآبار في طبق 6 آبار تحتوي على برنامج تلفزيوني الباردة (~ 4 مل / بئر). هذا هو لإزالة سرداب فضفاضة، إن وجدت.
- باستخدام أنبوب p1000، نقل تعليق زغب في برنامج تلفزيوني (~ 3 مل) من مصفاة 70 ميكرومتر إلى أنبوب جديد 15 مل على الجليد.
- استخدام 0.1٪ BSA المغلفة حادة انتهت P200 تلميح pipet إلى يستنشق حجم 50 ميكرولتر من تعليق زغب على شريحة زجاجية. عد عدد الزغب في قطرة 50 ميكرولتر تحت التكبير 4x لتحديد تركيز الزغب في تعليق برنامج تلفزيوني. على سبيل المثال، إذا كان هناك 10 زغب في تعليق 50 ميكرولتر فحص، ثم تركيز الزغب هو 0.2 زغب / ميكرولتر. هذا هو أيضا الوقت المناسب لتأكيد عدم وجود سرداب المربوطة.
- حساب حجم تعليق الزغب المطلوبة لوحة بتركيز 0.5 زغب / ميكرولتر من مصفوفة BME-R1. إضافة إضافية 100 ميكرولتر لحساب خطأ pipetting وحجم المطلوبة للفحص المجهري المطلوبة لضمان نقاء الزغب.
تنبيه: الضغط المستخدم في أول كشطين ، يزيل المخاط ولكن ليس الزغب ، يجب استخدامه في الخدوش اللاحقة التي سيتم خلالها إطلاق الزغب. الحد من عدد كشط جيئة وذهابا إلى اثنين بعد أن لوحظ لأول مرة الإفراج الزغب. هذا التدبير يتجنب الإفراج عن الزغب مع سرداب المربوطة. من الضروري تقييم الزغب بشكل مجهري لضمان عدم وجود سرداب مربوطة.
4. الطلاء من الزغب على مصفوفة BME-R1
- باستخدام 0.1٪ BSA المغلفة P200 طرف الأنابيب حادة النهاية، ونقل إلى أنبوب الطرد المركزي الدقيق حجم الزغب (من الخطوة 3.6) المطلوبة لوحة في كثافة ~ 6 سيلي لكل بئر في 12.5 ميكرولتر من مصفوفة BME-R1. استخدام طرف BSA المغلفة حادة انتهت في هذه المرحلة يضمن أن الزغب، والتي هي كبيرة جدا لطرف مدببة يستنشق دون أن يتم حظرها أو فقدت من أن تمسك إلى جانبي الطرف.
- تدور أسفل الزغب لمدة 2 دقيقة في 200 × ز في جهاز طرد مركزي المبردة (4 درجة مئوية) وإزالة supernatant.
- كرر الخطوة 4.2 لإزالة أي برنامج تلفزيوني المتبقية والمضي قدما إلى الخطوة التالية تحت غطاء محرك السيارة تدفق صفح.
- Resuspend بيليه الزغب بلطف في الكمية المطلوبة من BME-R1 الباردة إذابة على الجليد.
- باستخدام أنبوب P20، لوحة 12.5 ميكرولتر / بئر من الزغب في مصفوفة BME-R1 في 3D في لوحة U-bottom قبل الحرب 96 جيدا.
- احتضان اللوحة في حاضنة زراعة الأنسجة عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة للسماح بتقويم مصفوفة BME-R1.
- إضافة 125 ميكرولتر / بئر من ENR قبل الحارة (عامل نمو البشرة / Noggin / R-spondin1) وسائل الإعلام: متقدمة DMEM F-12 وسائل الإعلام, تكملها 1x البنسلين: ستريبتومايسين, 10 MM HEPES, الجلوتاماكس, 50 نانوغرام/ مل EGF, 100 نانوغرام/مل نوجين, 5٪ وسائط مكيفة من خلايا HEK293-T تعبر عن R-Spondin1, 1x N2, 1x B27, 1 mM N-أسيتيل سيستين, و0.05 ملغم/مل بريموسين.
- احتضان الزغب المطلي في حاضنة زراعة الأنسجة التي يتم الحفاظ عليها عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2، وتغيير الوسائط كل يومين.
- تجاهل أي بئر تظهر فيه الأجهزة العضوية قبل يومين من الطلاء ، حيث أن أقرب نقطة زمنية يتوقع فيها وجود عضويات مشتقة من الزغب هي بعد يومين.
ملاحظة: يتم احتساب أي زغب يحتوي على نصف أو أكثر من نصف طول الزغب ك villus واحد. على عكس الأجهزة العضوية المشتقة من سرداب، لا يتوقع الأجهزة المشتقة من الزغب في غضون 24 ساعة بعد الطلاء. يبدو أن الزغب الذي يبدأ بالعضوية يظلم ويتقلص قبل تكوين الأعضاء العضوية. وبالتالي ، ينبغي التخلص من أي آبار مع organoids النامية في غضون يوم من الطلاء لتجنب معقولية بعد أن اشتقت من التلوث سرداب معقول. المنهجية المستخدمة لإنتاج وسائل الإعلام مشروطة متاحة عند الطلب.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
العامل الحاسم لنجاح الإجراء هو منع تلوث سرداب. يتم ضمان تطور الجهاز من الزغب (وليس من أي سرداب ملوثة) من خلال تأكيد أربعة معايير رئيسية: 1) ضمان نقاء الزغب المحصود عن طريق الفحص المجهري قبل وبعد طلاء الزغب في BME-R1 ، 2) طلاء عدد محدود من الزغب لكل بئر للسماح بتصور جميع الزغب المطلي بشكل فردي ، 3) على زراعة تطوير الجهاز يوميا؛ صور من الدورة الزمنية تظهر تطور organoid من الزغب(الشكل 3)،و 4) onitoring الحركية والمظهر المورفولوجي من organoids الشروع من الزغب؛ الأجهزة التي تبدأ من الزغب تظهر على شكل غير منتظم في البداية وتأخذ يومين إلى خمسة أيام قبل أن يمكن رؤيتها تحت التكبير 4x بدلا من organoids المستمدة من سرداب (مثقف عن طريق عزل السراديب باستخدام طريقة EDTA / PBS chelation1،4)التي تظهر بين عشية وضحاها كهياكل كروية مع حدود محددة جيدا(الشكل 2).
الوقت الأمثل للتضحية الفئران لاختبار الإمكانات تشكيل الجهازية من الزغب هو بعد villi-epithelium dedifferentiating التعبير عن علامات الخلايا الجذعية والبدء في تطوير سرداب خارج الرحم في الزغب في الجسم الحي (حوالي 10 أيام بعد حقن تاموكسيفين من Smad4و / و; كاتنبlox(ex3)/+; فئران فيلين-كرERT2). هذه الفئران لديها تاموكسيفين غير قابل للانسياط cre-recombinase الذي يسبب فقدان Smad4 المصاحبة لتنشيط β كاتينين مع تاموكسيفين. تتطور سرداب ال ectopic بشكل كامل في غضون أسبوعين من تحريض الطفرة ، في حين تظهر الخلايا الجذعية في ظهارة villus في غضون أسبوع بعد تحريض الطفرة في الجسم الحي. عدد الزغب التي تشكل organoids عندما مطلي في Matrigel وقد أفيد أن تتراوح بين 2٪ إلى 12٪3. حصاد الماوس متحولة لطلاء الزغب في الوقت الذي تكون فيه الخلايا الجذعية موجودة (حوالي أسبوع بعد التعريفي cre-recombinase) سوف تطيل الوقت اللازم لظهور الأجهزة المشتقة من الزغب، في حين تأخير الحصاد إلى ما بعد عشرة أيام بعد التعريفي كر يزيد من سرداب خطر التلوث.
الشكل 1: التجريبية انشاء وخفة كشط من ظهارة الأمعاء. أ)حقنة مليئة برنامج تلفزيوني (syrg) مع أنابيب ومرشح (Fltr) في برنامج تلفزيوني. ب)عزل Villi عن طريق كشط (B1) ونقل إلى مرشح (B2). يشير السهم إلى الزغبة التي تم جمعها على الشريحة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: التمييز في مظهر organoids الناشئة من سرداب مقابل ظهارة سيلي dedifferentiated من نفس الأمعاء الماوس: أ) الكرتون تظهر villus والسراديب. ب)جبل كامل (في برنامج تلفزيوني) من الزغب التي أعدتها كشط (لوحة أعلى) والسرد التي أعدتها EDTA-chelation (لوحة أقل). ج)الاعضاء المشتقة من Villi (اللوحة العليا) والمستمدة من سرداب (اللوحة السفلى) من نفس ظهارة الماوس المعوية في BME-R1 (أشرطة المقياس، 500 um). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: مسار الوقت لتشكيل organoid من زغب dedifferentiating. يظهر بدء العضوية من اثنين من زغب مختلفة (يتم توسيع المناطق محاصر في الألواح الوسطى والسفلية). يبدو الزغب مع إمكانية تشكيل الجهاز كثيفة، وربما يرجع ذلك إلى الاحتفاظ mesenchyme الكامنة. بدء organoid من villus هو واضح في اليوم الثاني (السهم الصلب) من واحدة من الزغب (مربع مع الحدود المكسورة)، بينما في villus أخرى (مربع مع الحدود الصلبة) يظهر organoid في اليوم الرابع (السهم). يظهر المربع العلوي في لوحة اليوم 6 عضوية مشتقة من الزغب. شريط المقياس، 100 ميكرومتر. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يمكن أن تؤكد هذه الطريقة قدرة التجديد الذاتي لظهارة السيلي المتمايزة التي تكتسب علامات الخلايا الجذعية في الجسم الحي. يمكن أن تؤدي ظهارة الأمعاء العادية إلى ظهور أعضاء من سرداب ولكن ليس مقصورة الزغب ، عندما تكون مثقفة في 3D بسبب وجود خلايا جذعية في سرداب1. وهكذا، فإن تكوين الجهاز من ظهارة السيلي المتمايزة المستزرعة في الثقافات ثلاثية الأبعاد يؤكد تكوين الخلايا الجذعية من انعكاس مصير الخلية. تقارير عن انعكاس مصير الخلية في ظهارة الأمعاء الناشئة عن الطفرات و / أو الإصابة تزداد2،3،9،10،11،12. ومن ثم، فإن هذه الطريقة قابلة للتطبيق في سيناريوهات مماثلة حيث يعبر ظهارة الظهارة المتمايزة عن علامات الخلايا الجذعية في الجسم الحي.
أكدنا تطور organoids من زغب منKOSmad4 : β كاتينينGOF متحولة من خلال مسار زمني يظهر تطور organoid من الزغب(الشكل 3). الجانب الأكثر أهمية هو اتخاذ تدابير وقائية ضد التلوث سرداب، والتي من شأنها أن تؤدي إلى إيجابيات كاذبة. تم اتخاذ التدابير التالية لضمان نقاء إعداد الزغب قبل وبعد الطلاء: أ) عزل الزغب عن النصف القريب من الاثني عشر حيث تكون الزغب هي الأطول ، ب) تقليل عدد الخدوش وضبط ضغط الكشط للتوصل إلى زغب دون سرداب مربوطة ، ج) غسل الزغب مع PBS بعد وضعها في مصفاة شبكة 70 ميكرومتر لاستبعاد أي سرداب فضفاضة أو خلايا الفحص المجهري للزغب المحصود قبل وبعد الطلاء ، و ه) تقليل عدد الزغب مطلي لكل بئر بحيث يمكن تصورها بشكل فردي في المصفوفة المطلية.
وقد اتخذت عدة اعتبارات لتحسين الإجراء. أولا، لقد حصدنا الزغب من الاثني عشر القريب حيث الزغب هي الأطول. يسمح لنا الترسيم المادي بين التمايز والمقصورات التكاثرية في الأمعاء الدقيقة باعتماد كشط لفصل الزغب ميكانيكيا عن السرداب. وبالتالي يمكن اعتماد هذه الطريقة فقط في الحالات التي يتم فيها تحديد التقسيم بين التمايز والمقصورة التكاثرية بدقة - كما هو الحال في الأمعاء الدقيقة ولكن ليس في القولون. ثانيا، قمنا بتحسين وقت عزل الزغب بعد تحريض الطفرة استنادا إلى درجة التمايز الملاحظة في الجسم الحي. Dedifferentiation في Smad4KOالشرطي : β كاتينينGOF متحولة يتميز ظهور في الجسم الحي من علامات الخلايا الجذعية وسردابات خارج الرحم في ظهارة villus في غضون سبعة وعشرة أيام على التوالي3. وهكذا ، فإن الوقت اللازم لبدء organoids من الزغب متحولة يقلل مع مرور الوقت بعد تحريض الطفرة يزيد. لذلك ، في حين تكييف هذه الطريقة لنماذج أخرى من الأمعاء dedifferentiation ، ينبغي تحديد الوقت الأمثل للتضحية الفئران لعزل الزغب تجريبيا اعتمادا على نوع من الطفرة أو الإصابة ودرجة dedifferentiation التي تلت ذلك في الجسم الحي. ثالثا، اخترنا عزل الزغب عن طريق كشط بدلا من طريق طريقة EDTA-chelation من أجل الاحتفاظ mesenchyme الكامنة، كما تورطت الظهارية-mesenchymal عبر المحادثات في وظيفة الخلايا الجذعية المعوية في الأمعاء5،6،7،8،13. سيلي التي تبدأ organoids تظهر أساسا الظلام ربما بسبب وجود mesenchyme الكامنة (الشكل 2B و 3). تحققنا من التعبير عن الخلايا الجذعية المرتبطة علامة CD4414,15, والأمعاء محددة معامل النسخ Cdx216,17,18,19,20 مما يؤكد الأصل الظهاري للأعضاء المشتقة من الزغب(الشكل S1).
بالمقارنة مع نهج الجسم الحي ، فإن الأعضاء أكثر قابلية للتلاعب الجيني والفحص. منذ نلاحظ الاختلافات phenotypic بين organoids الناشئة من سرداب والسخافة من نفسKOSmad4 : β كاتينينGOF ظهارة معوية (الشكل 2B)، ونحن التكهن الاختلافات الجزيئية بين البلدين ، والتي يجري التحقيق فيها حاليا. وبالتالي، فإن هذه الطريقة مفيدة في التحقيق في الآثار المترتبة على الطفرات المسببة للتمايز وآثارها التفاضلية في مقصورة السلف مقابل التمايز.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ولا يعلن صاحبا البلاغ عن وجود تضارب في المصالح.
Acknowledgments
تم دعم هذا المنشور من قبل جائزة رقم K22 CA218462-03 من المعهد الوطني للسرطان NIH. كانت خلايا HEK293-T التي تعبر عن R-Spondin1 هدية سخية من الدكتور مايكل ب. فيرزي.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Advanced DMEM F-12 media | Gibco | 12634010 | |
| 3,3-diaminobenzidine | Vector Labs | SK-4105 | |
| 96 well U-bottom plate | Fisher Scientific | FB012932 | |
| ABC kit | Vector Labs | PK4001 | |
| Angled scissor | Fisher Scientific | 11-999 | |
| Animal-Free Recombinant Human EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| B-27 Supplement (50X), minus vitamin A | Gibco | 12587010 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) Protease-free Powder | Fisher Scientific | BP9703100 | |
| CD44 antibody | BioLegend | 1030001 | |
| Cdx2 antibody | Cell Signaling | 12306 | |
| Corn oil | Sigma-Aldrich | C8267-500ML | |
| Corning 70-micron cell strainer | Life Sciences | 431751 | |
| Cultrex Reduced Growth Factor Basement Membrane Extract, Type R1 | R&D | 3433-005-R1 | |
| Dissection scissors | Fisher Scientific | 22-079-747 | |
| Forceps | Fisher Scientific | 17-456-209 | |
| Glutamax (100X) | Gibco | 35050-061 | |
| HEK 293-T cells expressing RSPO-1 | Gift from Dr. Michael Verzi | ||
| HEPES (1M) | Gibco | 15630-080 | |
| Histogel | Thermoscientific | HG-4000-012 | |
| Mesh filter | Fisher Scientific | 07-201-431 | |
| Micrscope glass slide | VWR | 89218-844 | |
| N-2 Supplement (100X) | Gibco | 17502048 | |
| N-acetyl cysteine | Sigma-Aldrich | A9165 | |
| p200 Blunt tips | VWR | 46620-642 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140-122 | |
| Primocin (50mg/mL) | Invivogen | ant-pm-1 | |
| Quality Biological Inc PBS (10X) | Fisher Scientific | 50-146-770 | |
| Recombinant Murine Noggin | Peprotech | 250-38 | |
| Signal diluent | Cell Signaling | 8112L | |
| Tamoxifen | Sigma-Aldrich | T5648-1G | |
| 6-well tissue culture plate | Fisher Scientific | 50-146-770 |
References
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Schwitalla, S., et al. Intestinal tumorigenesis initiated by dedifferentiation and acquisition of stem-cell-like properties. Cell. 152 (1-2), 25-38 (2013).
- Perekatt, A. O., et al. SMAD4 Suppresses WNT-Driven Dedifferentiation and Oncogenesis in the Differentiated Gut Epithelium. Cancer Research. 78 (17), 4878-4890 (2018).
- Roche, J. K. Isolation of a purified epithelial cell population from human colon. Methods in Molecular Medicine. 50, 15-20 (2001).
- Aoki, R., et al. Foxl1-expressing mesenchymal cells constitute the intestinal stem cell niche. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 2 (2), 175-188 (2016).
- Seiler, K. M., et al. Tissue underlying the intestinal epithelium elicits proliferation of intestinal stem cells following cytotoxic damage. Cell and Tissue Research. 361 (2), 427-438 (2015).
- Stzepourginski, I., et al. CD34+ mesenchymal cells are a major component of the intestinal stem cells niche at homeostasis and after injury. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (4), 506-513 (2017).
- Roulis, M., et al. Paracrine orchestration of intestinal tumorigenesis by a mesenchymal niche. Nature. 580 (7804), 524-529 (2020).
- Haramis, A. P., et al. De novo crypt formation and juvenile polyposis on BMP inhibition in mouse intestine. Science. 303 (5664), 1684-1686 (2004).
- Madison, B. B., et al. Epithelial hedgehog signals pattern the intestinal crypt-villus axis. Development. 132 (2), 279-289 (2005).
- van Es, J. H., et al. Dll1+ secretory progenitor cells revert to stem cells upon crypt damage. Nature Cell Biology. 14 (10), 1099-1104 (2012).
- Tetteh, P. W., et al. Replacement of Lost Lgr5-Positive Stem Cells through Plasticity of Their Enterocyte-Lineage Daughters. Cell Stem Cell. 18 (2), 203-213 (2016).
- Baulies, A., et al. The Transcription Co-Repressors MTG8 and MTG16 Regulate Exit of Intestinal Stem Cells From Their Niche and Differentiation Into Enterocyte vs Secretory Lineages. Gastroenterology. 159 (4), 1328-1341 (2020).
- Zeilstra, J., et al. Stem cell CD44v isoforms promote intestinal cancer formation in Apc(min) mice downstream of Wnt signaling. Oncogene. 33 (5), 665-670 (2014).
- Gracz, A. D., et al. Brief report: CD24 and CD44 mark human intestinal epithelial cell populations with characteristics of active and facultative stem cells. Stem Cells. 31 (9), 2024-2030 (2013).
- Gao, N., White, P., Kaestner, K. H. Establishment of intestinal identity and epithelial-mesenchymal signaling by Cdx2. Developmental Cell. 16 (4), 588-599 (2009).
- Verzi, M. P., Shin, H., Ho, L. L., Liu, X. S., Shivdasani, R. A. Essential and redundant functions of caudal family proteins in activating adult intestinal genes. Molecular and Cellular Biology. 31 (10), 2026-2039 (2011).
- Verzi, M. P., Shin, H., San Roman, A. K., Liu, X. S., Shivdasani, R. A. Intestinal master transcription factor CDX2 controls chromatin access for partner transcription factor binding. Molecular and Cellular Biology. 33 (2), 281-292 (2013).
- Grainger, S., Hryniuk, A., Lohnes, D. Cdx1 and Cdx2 exhibit transcriptional specificity in the intestine. PLoS One. 8 (1), 54757 (2013).
- Stringer, E. J., et al. Cdx2 determines the fate of postnatal intestinal endoderm. Development. 139 (3), 465-474 (2012).
