Summary
Miljø-DNA-analyser krever streng design, testing, optimalisering og validering før innsamling av feltdata kan begynne. Her presenterer vi en protokoll for å ta brukerne gjennom hvert trinn for å designe en artsspesifikk, sondebasert qPCR-analyse for deteksjon og kvantifisering av et målarts-DNA fra miljøprøver.
Abstract
Nye, ikke-invasive metoder for å oppdage og overvåke arters tilstedeværelse utvikles for å hjelpe til med fiskeri- og naturvernforvaltning. Bruk av miljø-DNA-prøver (eDNA) for å oppdage makrobiota er en slik gruppe metoder som raskt blir populære og implementeres i nasjonale ledelsesprogrammer. Her fokuserer vi på utvikling av artsspesifikke målrettede analyser for sondebaserte kvantitative PCR-applikasjoner (qPCR). Bruk av sondebasert qPCR gir større spesifisitet enn det som er mulig med primere alene. Videre kan evnen til å kvantifisere mengden DNA i en prøve være nyttig i vår forståelse av økologien til eDNA og tolkningen av eDNA-deteksjonsmønstre i feltet. Det er nødvendig med nøye hensyn i utviklingen og testingen av disse analysene for å sikre følsomheten og spesifisiteten ved å oppdage målartene fra en miljøprøve. I denne protokollen vil vi avgrense trinnene som trengs for å designe og teste sondebaserte analyser for påvisning av en målart; inkludert opprettelse av sekvensdatabaser, analyseutforming, analysevalg og optimalisering, testanalyseytelse og feltvalidering. Å følge disse trinnene vil bidra til å oppnå en effektiv, sensitiv og spesifikk analyse som kan brukes trygt. Vi demonstrerer denne prosessen med vår analyse designet for populasjoner av mucket (Actinonaias ligamentina), en ferskvannsmuslingart som finnes i Clinch-elven, USA.
Introduction
Forskere og ledere blir i økende grad interessert i bruk av miljø-DNA-analyser for artsdeteksjon. I tre tiår har kvantitativ eller sanntids PCR (qPCR/rtPCR) blitt brukt i mange felt for sekvensspesifikk deteksjon og kvantifisering av nukleinsyrer1,2. Innenfor det relativt nye feltet eDNA-forskning har bruk av disse analysene med en standardkurve for kvantifisering av kopier av mål-DNA per volum eller vekt av eDNA-prøve nå blitt rutinemessig praksis. Mitokondrie DNA-sekvenser er generelt målrettet i eDNA-analyser fordi mitokondriegenomet er til stede i tusenvis av kopier per celle, men analyser for kjernefysisk DNA eller RNA-sekvenser er også mulig. Det er viktig å forstå at publiserte analyser for eDNA-prøver ikke alltid er like i ytelse. En analyses pålitelighet i å oppdage bare DNA-et til en målart (dvs. spesifisitet) og påvisning av lave mengder mål-DNA (dvs. følsomhet) kan variere betydelig på grunn av forskjeller i hvordan analysen ble designet, valgt, optimalisert og testet. Rapportering av kvantitative mål på analyseytelse har tidligere i stor grad blitt oversett, men nylig er standarder for å forbedre åpenheten i analyseutviklingenfremvoksende 3,4,5,6,7,8.
Optimalisering og rapportering av analyseytelseshjelpemidler i studiedesign og tolkning av eDNA-undersøkelsesresultater. Analyser som kryssreagerer med ikke-målarter DNA kan føre til falske positive deteksjoner, mens analyser med dårlig følsomhet kan unnlate å oppdage målartens DNA selv når det er til stede i prøven (falske negativer). En forståelse av analysefølsomhet og selektivitet vil bidra til å informere prøvetakingsinnsatsen som trengs for å oppdage sjeldne arter. Fordi det er mange naturlige kilder til variasjon i eDNA, må studier begrense kontrollerbare variasjonskilder så mye som mulig, inkludert fullstendig optimalisering og karakterisering av eDNA-analysen3.
Forhold som direkte påvirker en analyses spesifisitet eller følsomhet, vil endre analysens ytelse. Dette kan skje under ulike laboratorieforhold (dvs. forskjellige reagenser, brukere, maskiner, etc.). Derfor bør denne protokollen revideres når du bruker en analyse under nye forhold. Selv analyser som er godt karakterisert i litteraturen, bør testes og optimaliseres når de tas i bruk av et nytt laboratorium eller ved bruk av forskjellige reagenser (f.eks. master-mix-løsning)5,9. Analysespesifikkitet kan endres når den brukes på en annen geografisk region, fordi analysen brukes på prøver fra et nytt biotisk samfunn som kan omfatte ikke-målrettede arter som analysen ikke er testet mot, og genetisk variasjon i målartene kan forekomme. Igjen bør analysen vurderes på nytt når den brukes på et nytt sted. Feltforholdene skiller seg fra laboratorieforholdene fordi PCR-hemmere i felt er mer sannsynlig å være til stede i prøver. PCR-hemmere påvirker direkte forsterkningsreaksjonen og påvirker dermed analyseytelsen. Derfor kreves det en intern positiv kontroll ved utvikling av en eDNA-analyse.
Til slutt kan miljøforholdene i felten påvirke målartens DNA-molekyler og deres fangst gjennom DNA-nedbrytning, transport og oppbevaring. Videre varierer ulike protokoller for DNA-innsamling og ekstraksjon i deres effektivitet og evne til å beholde DNA. Det er imidlertid viktig å merke seg at disse prosessene påvirker påvisbarheten til eDNA, men ikke en molekylær analyses ytelse. Dermed er detekterbarhet av DNA fra målartene i feltprøver en funksjon av både den tekniske ytelsen til qPCR-analysen, samt feltforhold og innsamlings-, lagrings- og utvinningsprotokoller. Når du bruker en godt karakterisert og høytytende analyse, kan brukerne føle seg trygge på analysens evner; la forskere nå fokusere på å forstå de eksterne analysefaktorene (dvs. miljøvariabler, forskjeller i fangst- eller utvinningsprotokoller) som påvirker eDNA-deteksjon.
Her fokuserer vi spesielt på analyseteknisk ytelse gjennom streng design og optimalisering. Vi demonstrerer protokollen ved hjelp av en sondebasert analyse utviklet for påvisning av en ferskvannsmusling, mucket (Actinonaias ligamentina), fra vann som er samplet i Clinch-elven, USA. Nylig presenterte Thalinger et al. (2020) retningslinjer for validering av målrettede eDNA-analyser. Analysedesign etter vår protokoll vil bringe en analyse til Thalinger et al.s nivå 4 pluss et ekstra skritt mot nivå 56. På dette tidspunktet vil en analyses tekniske ytelse bli optimalisert, og den vil være klar til regelmessig bruk i laboratorie- og feltapplikasjoner. Videre bruk av analysen i laboratorie-, mesocosm- og felteksperimenter kan deretter ta opp spørsmål om eDNA-deteksjon og faktorer som påvirker detekterbarheten, de siste trinnene for nivå 5 validering6.
Protocol
1. Generering av en sekvensdatabase med mitokondrie DNA-sekvenser fra mål- og ikke-målarter av interesse
- Definer spørsmålet, målene og systemet som skal behandles. Identifiser målartene for eDNA-deteksjon. Identifiser det geografiske systemet der analysen skal brukes. Lag en liste over arter av interesse, inkludert målarter, sympatric (co-occurring) arter innenfor samme taxa (vanligvis orden eller familienivå), og nært beslektede allopatriske arter, de som kanskje ikke er på samme geografiske sted som målet (Figur 1).
MERK: Her ble Clinch-elvens populasjoner av artene A. ligamentina målrettet. - Søk etter og last ned sekvenser fra flere genregioner etter arter på listen fra trinn 1. Sekvensdatabaser som NCBI (National Center for Biotechnology Information), BOLD (Barcode of Life Database), EMBL (European Molecular Biology Laboratory) og DDBJ (DNA Data Bank of Japan) kan brukes. NCBI, EMBL og DDBJ deler alle sekvensinformasjon.
- Bruk NCBI's Nucleotide Database, søk etter målorganismen (f.eks. Actinonaias ligamentina) og genregionen (f.eks. cytokrom coksidase I (COI) eller NADH-dehydrogenase 1 (ND1); Eksempel på søkestreng: Actinonaias ligamentina OG ND1)
- Deretter velger du alle sekvenser som samsvarer med spesifikasjonene, og velger Send til. Velg Fullstendig post, Fil og nedlastingsformat som enten GenBank eller FASTA og deretter Opprett fil. Disse sekvensene lagres nå på datamaskinen.
- Gjenta disse trinnene for alle artene på listen som er definert i trinn 1. Hold sekvenser for hver genregion i en egen fil, da disse vil bli analysert separat.
- Last ned alle relevante sekvenser (eller en stor, representativ andel sekvenser) for målartene som er identifisert i trinn 1. Inkluder geografiske varianter hvis mulig.
- Gjenta søke- og nedlastingssekvensene for beslektede og sympatric ikke-målrettede arter av samme taksonomiske gruppe som ble identifisert i trinn 1 (f.eks. hvis målarten er mucket (A. ligamentina) nedlastingssekvenser for alle andre ferskvannsmuskjellearter i Family Unionidae som forekommer i interessesystemet).
- Gjenta søket og last ned for nært beslektede, men allopatriske (geografisk separate) arter som er oppført i trinn 1.1.
MERK: Ikke alle arter (mål og ikke-mål) vil være tilgjengelige i de offentlige databasene. Øk den lokale referansedatabasen ved å forsterke og sekvensere taksonomisk verifiserte prøver av arter av interesse internt. Hvis du arbeider med en art som har høyt genetisk mangfold blant arter eller arbeider i et geografisk stort område der geografiske varianter kan forventes, samle sekvenser fra hele området.
2. Analyse design
- Juster sekvenser fra hver genregion separat ved hjelp av justeringsprogramvare som finnes i ulike genetiske sekvensredigerings- og bioinformatiske programmer. Gjør denne justeringen for hver av de forskjellige genregionene.
- For eksempel, ved hjelp av Geneious Prime programvare (https://www.geneious.com) importere nedlastede sekvensfiler inn i programmet.
- Opprett separate mapper for hvert genområde.
- Velg alle sekvensene i en mappe som inneholder sekvenser fra ett genområde.
- Bruk justeringsverktøyet Flere til å opprette en nukleotidjustering av de valgte sekvensene. Det kan være flere alternativer for justeringstypen, ved hjelp av Geneious- eller MUSCLE-justeringene, og standardparametere fungerer bra.
- Velg lovende områder for analysedesign gjennom visualisering av justerte sekvensdata. En region som har mange sekvensdata tilgjengelig for arter av interesse, er svært divergerende blant arter, og viser lav variasjon i arter er en god kandidat. Dette vil øke sannsynligheten for at primere og sonder designet vil kunne diskriminere målet fra ikke-målrettede arter, samtidig som det sikrer intraspesifikke varianter vil forsterke med analysen.
- Design av analyseprimere og sonde.
- Bruk qPCR analyse design programvare og følg instruksjonene. IDTs PrimerQuest Tool (https://www.idtdna.com/) for å designe 5 sett med qPCR-analyser ble brukt her.
- Lim inn sekvensen som er valgt i trinn 2.2, i sekvensoppføringsboksen. Hvis justeringen opprettet mellomrom, sletter du dem fra sekvensen.
- Velg qPCR 2 Primers + Probe i alternativet Velg design.
- Last ned de anbefalte analysene.
- Kopier sekvensene fra fremoverprimeren for den første analysen, og søk etter denne primersekvensen i justeringen som ble opprettet i trinn 2.1.4. Hvis du bruker Geneious Prime, bruker du annotate- og prediksjonsverktøyet til å legge til primerområdet i justeringen. Gjør dette for alle primer- og sondekombinasjonene (figur 2).
- Inspiser disse områdene av justeringen for variasjon i målartene så vel som innenfor de ko-forekommende artene.
- Hvis det er intraspesifikk genetisk variasjon, søk etter analyser der primerne og sonden ikke faller innenfor disse regionene.
- For å forhindre forsterkning av ikke-målrettede arter, søk etter uoverensstemmelser med ikke-målarter. Velg analyser med flest uoverensstemmelser for videre validering. Currier et al. (2018) foreslår å velge sett med minst to av de tre regionene (de to primerne, eller en primer og en sonde) som har minst to uoverensstemmelser med alle ikke-målartene. Husk imidlertid at uoverensstemmelser ved sonden bidrar mindre til spesifisitet10.
MERK: Forskjeller innenfor 3 basispar av 3' enden av hver primer øker spesifisiteten bedre enn forskjeller i 5' enden av primerne10.
- Vurder følgende viktige parametere i analysedesign.
- Bestem smelte- og glødetemperaturene til primerne og sonden. Ideelt sett bør smeltetemperaturen (Tm) av primere være mellom 60-64 °C og innenfor 2 °C fra hverandre, og sondens Tm skal være 6-8 grader høyere enn primernes Tm. Still inn glødetemperaturen (Ta) på qPCR-reaksjonen 5 °C under smeltetemperaturen, rundt 55-60 °C11.
- Undersøk GC-innholdet. Velg mellom 35 – 65 % GC-innhold, og unngå regioner med 4 eller flere påfølgende G-er. Å ha 1 eller 2 G eller C i de 5 siste basene av 3' enden av primeren (GC-klemmen) kan øke spesifisiteten, da det vil hjelpe primeren til å lage en sterkere binding12.
- Søk etter hårnål og dimer strukturer. Test primere og sonde for predikerte hårnålstrukturer og dimmere ved hjelp av et oligonukleotidanalyseprogram (f.eks. OligoAnalyzer -IDT13; OligoCalculator14). Disse strukturene kan forårsake ikke-målforsterkning og lavere effektivitet. Unngå analyser som er spådd å danne disse strukturene.
- Bestem primerlengden. Sikt på primere mellom 18-25 baser i lengde og sondelengde mellom 20-25 baser. Lengre primere og sonder kan ha lavere forsterkningseffektivitet.
- Bestem amlikonlengden. Det skal være mellom ca. 100 og 250 basispar. Dette området er vanligvis kort nok til høy PCR-effektivitet, men lenge nok til enkel verifisering av Sanger-sekvensering4,15.
- Design sonder. Pass på at sondene ikke har en G-base i enden av 5' fordi den kan dempe signalet fra grønne og gule fargestoffer11. Vi designet doble slukkede sonder, med IDT 3IABkFQ og ZEN-slukkere og FAM- eller HEX-fluoroforer.
MERK: Bestem MGB-probene: TaqMan MGB-sonder (mindre groove-bindemiddel) brukes ofte til eDNA-studier. Men fordi disse sondene er svært korte, kan de binde seg til ikke-mål selv med en 2 eller 3 basisparkonflikt10. - Bestem sonden Tm. Smeltetemperaturen til sonden skal være 6-8 °C høyere enn primerne. Lavere temperaturer reduserer sondens bindingssuksess.
- Bestem probelengden og -plasseringen. Sonden skal være mellom 20 og 25 bp i lengde og ideelt plassert nær primerbindingsstedet på samme tråd uten å overlappe den.
3. Analysescreening og optimalisering
- I silico analyse utvikling og testing. Før du bestiller primer-sondesett, må du vurdere spesifisitet (potensiell ikke-målforsterkning) ved å teste primerforsterkning i silico.
- Test primere gjennom NCBI Primer-Blast16 eller lignende programmer som kan identifisere potensielle ikke-mål i NCBI nt/nr-databasen som kan forsterke analysen. Hvis du bruker Primer-Blast lim inn primere på Bruk min egen primer-boks under Primer-parametere. I alternativene Primer Pair Specificity Checking Parameters velger du nr som database og skriver inn rekkefølgen på interesseorganismen (f.eks.
- Fortsett å vurdere primer/sondesett visuelt på justerte sekvensdata.
- For å vurdere primere og sonder samtidig i silico, lag en tekststreng av den fremre primeren, 12 N-er, sonden, 12 N-er og det omvendte komplementet til den omvendte primeren. Hvis probesekvensen er innenfor 12 basispar fra en av primerne, bruker du antall N-er som tilsvarer antall basispar mellom primeren og sonden.
- Bruk NCBI's Nucleotide Blast-søk (Blastn) til å søke mot nr-databasen17. Bruk kategorien Taksonomi til å se etter ikke-målarter med få uoverensstemmelser. Disse bør testes i laboratoriet under analyseoptimalisering.
MERK: I silico testing bidrar til å utelukke ikke-spesifikke analyser, men potensielt spesifikke analyser må testes empirisk (in vitro), da ikke alle arter har sekvenser i genetiske databaser og primer og sonder kan fortsatt binde seg til ikke-mål selv om det anses usannsynlig av programvaren.
- Velg tre til fem primer/sondekombinasjoner som skal testes i laboratoriet.
- Bestill primere, sonder og en syntetisk DNA-standard samt ekstra M13-tailed primere for amplicon sekvensering.
- Bestill syntetiske oligonukleotidprimere og sonder fra et selskap som lager oligos. Sonder er merket med fluorescerende fargestoff og en quencher. Ulike fluoroforer bør velges for analyser som må multiplekses. Kontroller qPCR-instrumentet for en liste over hvilke fluoroforer instrumentet kan oppdage.
- Design og bestill M13-tailed primere for verifisering av qPCR-deteksjoner med Sanger-sekvensering ved å legge til M13 Forward (-20)-sekvensen, GTA AAA CGA CGG CCA GT, i 5' enden av den fremre primeren, og M13 Reverse (-27)-sekvensen, CAG GAA ACA GCT ATG AC, til 5' enden av den omvendte primeren.
- Den syntetiske DNA-standarden inneholder målsekvensen (inkludert primerområdene) ved en kjent konsentrasjon i kopier /μL. Kvantifisere ukjente prøver basert på en kurve laget av kjente konsentrasjoner av denne standarden (dvs. standardkurven). Skaff deg den syntetiske standarden fra samme selskap som produserer primere og sonde. Følg produsentens anbefalinger for resuspension og lagring. Fortynn standarder i TE-buffer med en tRNA-bærer som bruker plasttøy med lav oppbevaring for å redusere hydrolyse og binde til overflater.
MERK: Hvis standardkurven ikke fungerer bra (dårlig PCR-effektivitet, se trinn 3.4.2), kan du prøve å suspendere standarden på nytt i vann eller Tris-HCl. - Suspender primere og sonder i nukleasefritt vann, Tris-HCl eller TE-buffer ved praktiske konsentrasjoner for analysebruk. Generelt fortynner arbeidslagre 20 ganger i mesterblandingen for å oppnå den optimaliserte endelige analysekonsentrasjonen. Oppbevar suspendert oligos ved en konstant -20 °C når den ikke er i bruk.
- In vitro (i laboratoriet) analyseoptimalisering og testing. Avvise analyser som har dårlig effektivitet, kryssreagere med ko-forekommende arter, eller har dårlig følsomhet18. Inkluder bruk av en intern positiv kontroll (IPC) under analyseutvikling, så vel som når du kjører faktiske prøver.
- Finn først de optimale temperatur- og primer-/sondekonsentrasjonsverdiene for analysen. Når disse parameterne er optimalisert for PCR-effektivitet (trinn 3.4.2), kryssreaktivitet (trinn 3.4.3) og følsomhet (trinn 3.4.4), fortsett å teste analysen med en multiplekset IPC (trinn 3.4.5).
- Test optimal glødetemperatur (Ta) for primer og sonder ved hjelp av en PCR-temperaturgradient sentrert 5 ° C under den anslåtte gjennomsnittlige primer-Tm.
- Test optimal primer- og sondekonsentrasjon. Vanligvis testes 200 nM-, 400 nM- og 800 nM primerkonsentrasjoner og 75 nM, 125 nM og 200 nM sondekonsentrasjoner.
- Lag en standardkurve og bestem effektivitet og lineært område. Test minst seks 10 ganger fortynning av en syntetisk DNA-standard som inneholder målsekvensen, ved ca. 100 kopier/reaksjon på 105 kopier/reaksjoner (figur 3A).
- Bruk qPCR-programvaren til å tegne inn Cq-verdien (terskel for syklus ved kvantifisering) av hver standard på y-aksen og loggbasen 10 i den opprinnelige standardkonsentrasjonen i kopier/reaksjon på x-aksen. qPCR-programvaren skal automatisk kjøre en lineær regresjon (Figur 3B).
- Beregn effektiviteten fra stigningstallet for regresjonen, E = -1 + 10(-1/helling). Hvis for eksempel stigningstallet er -3,4, E= -1 + 10(0,29) = 0,97 eller 97 %. Kontroller også r2-verdiene som indikerer hvor godt standarden replikerer passer på kurven. QPCR-programvaren skal også automatisk beregne dette (Figur 3B). Mål for effektivitetsverdier på 100% (±10%) og r2 i ≥0,989,15,19,20,21,22.
- Inspiser standardkurven visuelt for skjevheter, det vilt avvik fra regresjonen i en konsekvent retning eller for dårlig standard kurveytelse målt ved effektivitet og r2-verdier (Figur 3C og 3D).
- Spesifisitet: Vurder kryssreaktivitet med ikke-målarter for å redusere sjansen for falske positiver. Der eDNA-deteksjoner kan resultere i kostbare administrasjonsbeslutninger, må du bekrefte positive deteksjoner ved amlikonsekvensering.
- Ikke-mål: Kjør analysen mot genomiske DNA-ekstraksjoner av taksonomisk verifiserte prøver av beslektede arter og av geografisk samtidige arter; med høyest prioritet å teste mot nært beslektede, samtidige arter. Bruk lignende totale DNA-konsentrasjoner for både mål- og ikke-målprøver. Den valgte konsentrasjonen bør gi forsterkning fra målartsprøver nær midten av det lineære området av standardkurven. Forsterkning bør bare observeres med målartene.
- Hvis det observeres ikke-målforsterkning, rengjør og sekvenserer du produktet for å bekrefte identiteten. Det er ikke uvanlig å observere forurensning fra målartene i vevsprøver av ikke-målarter, og dermed bør alle forsterkninger på dette stadiet verifiseres ved sekvensering. Reamplify rensede amlikoner fra spesifisitetstester ved hjelp av M13 tailed primere og sekvens med M13 primere.
- I post-PCR-laboratoriet overfører du qPCR-produktene som skal sekvenseres til friske rør. Fjern restprimere og reaksjonskomponenter med et oppryddingssett (f.eks. MinElute PCR Rensesett).
- Lag 1:100 fortynninger av elutionene og amplify 1 μL av hver for 30 sykluser i en 50 μL PCR reaksjon med M13 tailed primere og en high-fidelity polymerase (f.eks, Phusion High-Fidelity DNA Polymerase).
- Kjør 10 μL av hver reaksjon på en 1% agarose gel for å se etter et enkelt bånd av forventet størrelse. Hvis det ikke observeres noe bånd, øker du antall sykluser eller mengden prøve. Hvis flere bånd observeres, renser gel båndet av forventet størrelse.
- Fjern gjenværende primere og reaksjonskomponenter med et oppryddingssett som ovenfor og mål DNA-konsentrasjonene av elutionene.
- Sett opp sekvenseringsreaksjoner med M13-primerne i henhold til instruksjonene fra sekvenseringsanlegget.
MERK: Åpne aldri forsterkede prøver i qPCR-laboratoriet. Forbered prøver for sekvensering i et laboratorium dedikert til post-PCR-prøver.
- Følsomhet: Følsomhet påvirker sjansen for falske negativer, eller unnlatelse av å oppdage målartens DNA når den er til stede. Vurder deteksjonsgrensen (LOD) og kvantifiseringsgrensen (LOQ) for hver analyse. Til slutt inkluderer du en intern positiv kontroll (IPC) for å vurdere PCR-hemming av prøver. Multiplex og test denne IPC-analysen med den designede analysen for å sikre at de to analysene ikke forstyrrer hverandre.
- LOD: Lag seks 4 ganger serielle fortynninger av den syntetiske DNA-standarden, med 8-24 repliker per standard fortynning (figur 4). Beregn den laveste startkonsentrasjonen med 95% deteksjon. LOD- og LOQ-plott kan genereres med en LOD/LOQ kalkulator R script5.
MERK: Data under LOD skal ikke sensureres. På grunn av spesifisiteten til PCR er det ingen nedre grense for ekte positiver. LOD er den høyeste konsentrasjonen under hvilke falske negativer kan forventes å oppstå. - LOQ: Fra samme fortynningsserie beregner du den laveste innledende DNA-standardkonsentrasjonen kvantifiserbar med en variasjonskoeffisient (CV) under 35%.
MERK: LOD og LOQ skal rapporteres i kopier/reaksjoner. Ved bruk av en validert analyse og feltprøver forsterker under LOQ, bør resultatene rapporteres som % deteksjoner i stedet for eDNA-konsentrasjoner, fordi den nøyaktige konsentrasjonen ikke kan måles med tillit5.
- LOD: Lag seks 4 ganger serielle fortynninger av den syntetiske DNA-standarden, med 8-24 repliker per standard fortynning (figur 4). Beregn den laveste startkonsentrasjonen med 95% deteksjon. LOD- og LOQ-plott kan genereres med en LOD/LOQ kalkulator R script5.
- Bruk en intern positiv kontroll (IPC) for å teste for PCR-hemming. Hemming kan føre til en reduksjon i følsomhet og falske negativer. Test IPC-analysens evne til å bli multiplekset med målanalysen.
- En IPC-analyse kan multiplekses med målanalysen ved hjelp av en sonde med et annet reporterfargestoff enn målanalysen. Denne IPC-analysen består av en kort syntetisk DNA-sekvens fra en art som ikke er relatert til mål taxa, innlemmet i qPCR-mesterblandingen med en lav konsentrasjon på omtrent 102 kopier / reaksjon, sammen med primer og sonder som oppdager den. Denne lavere konsentrasjonen er nødvendig for å unngå konkurranse med målsekvensen for polymerase og nukleotider23.
- Sammenlign Cq-verdien for utvalgets IPC-mal med verdien for IPC-malen i kontrollen ingen mal. I denne ingen malkontrollen (NTC) er den eneste DNA-inngangen den for IPC-malen. IPC-malen i denne reaksjonen bør forsterkes som forventet. Hvis IPC-malen i et utvalg forsterker ved 2 eller flere sykluser som er forskjellige fra IPC-malen i NTC, hemmes eDNA-eksemplet. Prøver som viser hemming kan fortynnes 1:10 og testes på nytt. Hvis en prøve forblir hemmet, bør den prøven fjernes fra analysen.
- Finn først de optimale temperatur- og primer-/sondekonsentrasjonsverdiene for analysen. Når disse parameterne er optimalisert for PCR-effektivitet (trinn 3.4.2), kryssreaktivitet (trinn 3.4.3) og følsomhet (trinn 3.4.4), fortsett å teste analysen med en multiplekset IPC (trinn 3.4.5).
- In situ analyse utvikling og testing
- I laboratoriet: Hvis tilgang til organismen i laboratoriet så vel som sympatric arter er tilgjengelig; ta vannprøver fra innkapslinger med disse artene, behandle prøvene og teste analysen mot disse eDNA-prøvene. Sekvensprodukter som ovenfor for å verifisere forsterkning av det tiltenkte målet ved hjelp av M13 tailed primere.
- I -feltet:
- Identifiser steder der målorganismen er kjent for å forekomme og kjent for ikke å forekomme. Det er å foretrekke å ha et visst mål av overflod på hvert sted hvor målarten oppstår.
- Bestem hvilke utvalgsvolumer og prøveinnsamlingsmetoder (f.eks. filtrering, sentrifugering osv.) som skal brukes.
- Inkluder et felt som er tomt eller negativt på hvert sted, dette er rent vann som er brakt til feltstedet, og som deretter samles inn og klargjøres med samme feltutstyr og protokoller som brukes til eDNA-prøvetaking24. Formålet med feltet er å oppdage forurensning av prøvetakingsutstyret og feltutstyret som bringes til stedet. Ta feltet tomt før du behandler feltvannprøver.
- Ta flere vannprøver per sted, helst 3 prøver per sted.
- Tilbake i laboratoriet, behandle og trekke ut prøver.
- Kjør analysen ved hjelp av en plate satt opp som ligner på figur 5A og sammenlign eDNA konsentrasjon og deteksjonsfrekvens med kjente stedsforskjeller i forekomst og overflod. Bekreft alle gjenkjenninger ved å sekvensere24,25.
MERK: Ovennevnte vil validere en analyse gjennom nivå 4 av Thalinger et al.s (2020) skala6 (optimalisering av analysens tekniske ytelse) og begynne å samle inn data som støtter nivå 5 analysevalidering. Nivå 5 omfatter sannsynlighetsmodellering og bruk av analysen for eDNA-økologistudier. Vi føler at dette er utenfor omfanget av grunnleggende analyseutvikling, men vi oppfordrer disse anvendelsene av laboratorie- og feltkontrollerte analyser til å forbedre analysedesign og datatolkning.
Representative Results
Ved utforming av en artsspesifikk qPCR-analyse for mucket (A. ligamentina), ble tilgjengelige sekvenser av alle Unionidae-arter i Clinch-elven lastet ned. Nært beslektede arter som Lampsilis siliquoidea ble også inkludert i referansedatabasen selv om de ikke finnes i samme elv. Ikke alle arter i elvesystemet av interesse ble funnet i GenBank, så flere arter ble sekvensert i huset. Sekvenser ble justert ved hjelp av Geneious programvare og Primer Quest (IDT) programvare ble brukt til å designe flere analyser. Fem sett med primere og sonder ble lagt til justeringen for visuell vurdering (figur 2). De ble deretter testet i silico ved hjelp av Primer-Blast, hvoretter de ble bestilt for videre testing in vitro. I laboratoriet ble alle analysene testet ved hjelp av DNA-ekstraksjoner av 27 tilgjengelige arter for å verifisere spesifisitet. En analyse (A.lig.1) forsterket bare målartene (Tabell 1; Tabell 2). Denne analysen gikk videre for videre testing av analyseeffektivitet, LOD og LOQ. Den har en amplikonlengde på 121 basepar. Tabell 3 viser sekvensen som brukes for den syntetiske DNA-standarden A. ligamentina. Figur 3A og figur 3B viser resultatene av en vellykket analyse med god effektivitet og r2-verdier. Figur 3C og figur 3D viser en analyse der standardkurven har dårlig effektivitet. denne analysen ble forkastet. LOD og LOQ for den valgte analysen (A.lig.1) ble begge funnet å være 5,00 kopier/reaksjoner ved hjelp av den diskrete metoden beskrevet i Klymus et al5. IPC-en som ble multiplekset med analysen (Tabell 3-6) påvirket ikke A. ligamentina-analysens standardkurve. IPC vi bruker er et fragment av musen HemT transkripsjon. Denne analysen ble forhåndsutformet av IDT for et annet program, men vi endret bruken som en IPC for laboratoriets eDNA-applikasjoner.
En vellykket qPCR-kjøring bør oppfylle visse kriterier for hvert mål på ytelse (dvs. standard kurveforsterkning, genomisk DNA-positiv kontroll, ingen malkontroll og intern positiv kontroll). Målanalysestandardene bør ha eksponentielle forsterkningskurver. Disse kurvene bør nå et sluttpunktplatå hvis de får lov til å kjøre nok sykluser. Dette indikerer at fluorescerende sonde blir fullstendig konsumert under reaksjonen, og fluorescensnivåene når en maksimal grense. Senere forsterkende standarder kan ikke nå et platå i 40 sykluser. De positive kontrollene (genomisk DNA og IPC) skal ha samme mønster. Ukjente elementer kan forsterkes eller ikke, men forsterkning i ukjente elementer bør også ha et eksponentielt mønster og et endepunktplatå (figur 5).
I en qPCR av høy kvalitet forsterker standard fortynning ved jevnt fordelt Cq på omtrent hver 3,3 syklus for hver 10 ganger forskjell i konsentrasjon. Hver replikering av en standard fortynning forsterker på en tett gruppert måte å ha nesten samme Cq (representert av r2-verdiene). Alle standard fortynninger skal utvise forsterkning (Figur 3A). I en dårlig qPCR kan standarder vise ikke-eksponentiell form, ujevn variasjon i Cq-verdier mellom fortynninger, ikke komme til et endepunktplatå, eller noen fortynninger kan ikke forsterkes i det hele tatt (Figur 3D).
De viktige parameterne for en standardkurve er effektivitet, r2, stigningstallet og y-skjæringspunktet. Effektiviteten bør falle mellom 90%-110% med ideelle verdier nær 100% og r2 verdier bør være over 0,98 med ideelle resultater nærmer seg 1,015,22. Stigningsverdier bør være mellom -3,2 og -3,5 med ideelle resultater nær -3,322. Verdiene for y-intercept bør falle mellom en Cq på 34-41 med ideelle resultater som har en Cq på 37,0. Y-intercept er den predikerte Cq av en reaksjon med 1 kopi av målsekvensen, den minste enheten som kan måles i en enkelt qPCR. Ukjente med Cqs større enn y-intercept vil sannsynligvis bli hemmet. Å kjøre mer enn 40 sykluser av PCR kan være nødvendig for å oppdage målet i tilfelle hemming eller et ineffektivt primersett, men kvantifisering er ikke mulig under disse omstendighetene og ytterligere negative kontroller uten målsekvensen, men som inneholder totalt DNA som ligner på ukjente, bør kjøres for å utelukke forsterkning fra ikke-spesifikke kilder.
Den interne positive kontrollen (IPC) forsterkning i ukjente prøver bør sammenlignes med resultatene av den negative malkontrollen IPC, da det ikke er konkurranse om reagenser og ingen hemmere er til stede. Ukjente personer med en IPC som har en CQ på 2 sykluser eller større enn den gjennomsnittlige CQ-verdien for NTC, eller som ikke forsterker, bør betraktes som hemmet. Hvis det ikke finnes noen hemmere i prøvene, bør all IPC-forsterkning ha en tett gruppering i plottet med Cq-verdier nær det samme som NTC (figur 6).
Til slutt skjedde in situ-testing av analysen. 20 vannprøver fra Clinch-elven og tre felt blanke prøver ble filtrert mellom 25-26 september 2019 innen 500 meter fra en blåskjell seng kjent for å ha A. ligamentina. Omtrent fire 1 L prøver av vann ble filtrert per prøvetakingssted. Plasseringssteder inkludert på bunnen av blåskjellsengen i bekk, bunnen av blåskjellsengen nær kysten, 100 m nedstrøms sengen i bekk, 500 m nedstrøms sengen i bekk og 500 m nedstrøms sengen nær kysten (Figur 7). Tilbake i laboratoriet ble hvert filter kuttet i halvparten og DNA ble ekstrahert fra bare halvparten av et filter. Den gjenværende filterhalvdelen for hver prøve ble lagret i en -80 °C fryser. Eksempler ble deretter kjørt ved hjelp av A.lig.1-analysen multiplekset med IPC. Av de 23 prøvene ble fem funnet å være hemmet. Disse prøvene ble fortynnet 1:10 og fortynning ble kjørt på nytt. Nitten av de 20 feltprøvene forsterket ved hjelp av den utformede analysen. Av disse 19 prøvene var fem over analysens LOD og LOQ på 5 kopier/reaksjoner; det vil si at de fleste prøvene hadde en eDNA-deteksjon, men på et nivå der falske negative resultater sannsynligvis vil forekomme, og at analysen ikke trygt kunne kvantifisere kopinummeret for de 14 prøvene. Likevel replikerer 75 til 100% av de fire biologiske anleggene forsterket på hvert prøvested. To av de tre feltblankene var negative, mens ett felt tomt viste forsterkning, og understreket viktigheten av ren teknikk i feltet.
Figur 1: Arbeidsflyt for mitokondriell DNA-sekvensdatabasekonstruksjon. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Sekvensjusteringer for Clinch-elvens blåskjellarter med prospektive primere og sonder for Actinonaias ligamentina ND1-analysen. Fremoverprimere i mørkegrønn, sonde i rødt og omvendt primer i lysegrønn. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Eksempler på standardkurve og lineær regresjon. A. Eksempel på en akseptabel standardkurve avledet fra forsterkning av tre replikerer hver av seks standard fortynninger. En 10 ganger standard fortynningsserie med den høyeste konsentrasjonen av standarden til venstre, med avtagende konsentrasjoner som beveger seg til høyre. Den vannrette linjen som krysser alle sporene, er terskelen for syklus ved kvantasjon (Cq). Der hver sporing krysser denne terskelen, er det der Cq bestemmes. B. Lineær regresjon laget av standard replikerer figur 3A. Replikeringer av standard fortynning er plottet inn i sirkler og ukjente (prøver) er plottet med x's. Effektiviteten er 98,9%, r2 nærmer seg 1,0, og helling på -3,349. C. Eksempel på en dårlig standardkurve avledet fra forsterkning av tre replikerer hver av seks standard fortynninger. D. En lineær regresjon som danner standardkurven for standarden, replikerer forsterket i eksempel 3C. Legg merke til de dårlige effektivitets- og r2-verdiene. Vær også oppmerksom på at bare 4 av de 6 standardene forsterket. Hvis standardkurven ikke forbedres etter gjentatte løp, kan problemet være med et dårlig primer / sondesett som ikke forsterker mål-DNA som forventet, i så fall bør denne analysen ikke vurderes. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Eksempler på plateoppsett for LOD- og LOQ-standard qPCR-kjøringer. Standarder som brukes i kurven er i blått, standard konsentrasjon reduseres fra mørk til lyseblå. DNA-positiv kontroll i grønt og ingen malkontroll (NTC) i gult. Eksperimentelle standardkonsentrasjoner i grått som viser 24 replikerer for hver standard fortynning. Fortynningsserien ble belagt over to plater (A, B), hver med en standardkurve, positiv kontroll og NTC. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Plateoppsett og forsterkningsspor fra en qPCR-kjøring. A. Plateoppsett, standarder vist i blå, mørkere farge som indikerer den høyeste konsentrasjonen av standarden. DNA-positiv kontroll i grønt, ingen malkontroller i gult (NTC), prøvemål i grått. B. Forsterkningsspor fra en qPCR-kjøring. Standarder vist i blå, DNA-positiv kontroll i grønt, ingen malkontroller i gult og ukjente i rødt. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6: Forsterkningsspor for intern positiv kontroll (IPC). IPC-spor for alle ukjente prøver i magenta og IPC fra no template controls (NTCs) vist i oransje med trekanter. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 7: Kart som viser eDNA-samlingsstedene til en blåskjellseng i Clinch-elven langs grensen mellom Virginia og Tennessee. Prøver ble samlet inn på Wallens Bend på bunnen av sengen, 100 m nedstrøms sengen og 500 m nedstrøms sengen. Anleggene ble enten samlet inn midt i bekken (i bekk) eller omtrent 1 – 2 meter fra strandlinjen (land). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| komponent | navn | Sekvens 5' – 3' | Fluorescerende etikett | |
| Fremre primer | A.lig.1-f | CCCTCATCACGTACCTCTTAATC | ||
| Omvendt primer | A.lig.1-r | GGAATGCCCATAATTCCAACTTTA | ||
| sonde | A.lig.1-sonde | TTCTTGAACGTAAAGCCCTCGGGT | Fam | |
Tabell 1: Den utformede Actinonaias ligamentina qPCR-analysen (A.lig.1) inkludert sekvenser for fremre og omvendte primere og sonden.
| art | Forsterket | I Clinch-elven |
| 1. Actinonaias ligamentina | Ja | Ja |
| 2. Actinonaias pectorosa | Nei | Ja |
| 3. Amblema plicata | Nei | Ja |
| 4. Corbicula spp. | Nei | Ja |
| 5. Cumberlandia monodonta | Nei | Ja |
| 6. Cyclonaias tuberculata | Nei | Ja |
| 7. Cyprogenia stegaria | Nei | Ja |
| 8. Elliptio dilatata | Nei | Ja |
| 9. Epioblasma brevidens | Nei | Ja |
| 10. Epioblasma capsaeformis | Nei | Ja |
| 11. Epioblasma florentina aureola | Nei | Ja |
| 12. Epioblasma triquetra | Nei | Ja |
| 13. Fusconaia cor | Nei | Ja |
| 14. Fusconaia subrotunda | Nei | Ja |
| 15. Lampilis ovata | Nei | Ja |
| 16. Lampilis siliquoidea | Nei | Nei |
| 17. Lasmigona costata | Nei | Ja |
| 18. Lemiox rimosus | Nei | Ja |
| 19. Lexingtonia dolabelloides | Nei | Ja |
| 20. Medionidus conradicus | Nei | Ja |
| 21. Plethobasus cyfyus | Nei | Ja |
| 22. Plenum i Pleurobema | Nei | Ja |
| 23. Ptychobranchus fasciolaris | Nei | Ja |
| 24. Ptychobranchus subtentus | Nei | Ja |
| 25. Quadrula pustulosa | Nei | Ja |
| 26. Strophitus undulatus | Nei | Ja |
| 27. Villosa iris | Nei | Ja |
Tabell 2: En liste over arter som brukes til in vitro-spesifisitetstesting av A.lig.1-analysen. Analysen forsterket genomisk DNA av målet (Actinonaias ligamentina) og forsterket ikke noen av de ikke-målrettede artene.
| komponent | Sekvens 5'-3' | ||||
| Actinonaias ligementina standard | CCCTCATCACGTAC CTCTTAATCCTATTAGGTGTCGCATTTTTCACTCTTCTTGAACGTA | ||||
| AAGCCCTCGGGT ACTTTCAAATCCGAAAAGGCCCAAATAAAGTTGGAATTATGGGCATTC | |||||
| CCCAACCATTAGCAGATGCTAAAGCTCTTCGTAAAAGAATGAGTAACACCAACCTCCT | |||||
| CAAACTACCTACCCTTCATCTTAACCCCAACCACTATGTTAATTTTAGCACTTAGACTTT | |||||
| GACAATTATTTCCATCCTTTATANTATCATCCCAAATANTTTTGGTATGCTCCTATTCT | |||||
| TGTGTATCTCCTCCCTAGCTGTTTATACAACACTTATAACAGGCTGAGCCTCAAACTCCA | |||||
| AATATGCCCTTTTAGGAGCTATTCGAGCCATAGCCCAAACCATTTCTTATGAGGTTACAA | |||||
| TAAC | |||||
| IPC-mal (Hem-T) | CTACATAAGTAACACCTTCTCATGTCCAAAGCTCTCTGAGTGTCCCTCGAATCTCAGACGCT | ||||
| GTATGACAGTCTCCTTTCGTGTGAACATTCGGCTGCTCTATGTTCTCAAGGACTGCAC | |||||
Tabell 3: Sekvens (5'-3') av Actinonaias ligamentina-standarden og IPC-malen (Hem-T) som brukes til denne analysen. Sekvensen for fremre og omvendte primere er i fet og kursiv, og sondens.
| komponent | navn | Sekvens 5' – 3' | Fluorescerende etikett | |
| Fremre primer | HemT-F | TCTGAGTGTCCCTCGAATCT | ||
| Omvendt primer | HemT-R | GCAGTCCTTGAGAACATAGAGC | ||
| sonde | HemT-P | TGACAGTCTCCTTTCGTGTGAACATTCG | Ky5 | |
Tabell 4: IPC-analysen (Internal Positive Control), inkludert sekvenser for forover- og reversprimere og sonden.
| Volum per prøve (μL) | komponent |
| 10 | Miljø Master Mix |
| 1 | 20uM A. lig.1 F/R-blanding |
| 1 | 2,5uM A. lig.1-sonde |
| 1 | 5uM IPC primer blanding (HemT-F / R) |
| 0.75 | 2,5uM IPC-sonde (HemT-P) |
| 1.5 | 1 X 103 konsentrasjon av IPC-malen |
| 2.75 | H20 |
| 2 | eksempel |
| 20 | Totalt volum |
Tabell 5: PCR-blandingen som brukes til A.lig.1-analysen multiplekset med IPC-analysen.
| skritt | Temperatur (°C ) | Tid | |
| 1 | Første protese | 95 | 10 min |
| 2 | Denatur | 95 | 15 sek |
| 3 | Annealing | 60 | 1 min |
| 4 | Gå til trinn 2, gjenta 39X |
Tabell 6: Reaksjonsbetingelser for A.lig.1-analysen.
Discussion
Som med enhver studie er det første trinnet å definere spørsmålet som skal behandles, og utformingen av eDNA-analysen avhenger av omfanget av studien.26. For eksempel, hvis målet med forskningen eller undersøkelsen er å oppdage en eller noen få arter, er en målrettet sondebasert analyse best. Hvis målet imidlertid er å vurdere en større suite eller montering av arter, er høy gjennomstrømningssekvensering av metabarkodingsanalyser bedre egnet. Når det er bestemt hvilken tilnærming du skal ta, anbefales en pilotstudie med analysedesign, testing og optimalisering24. Analysedesign starter med en liste over arter som beskrevet i Figur 1. Denne listen vil være grunnlaget for å forstå hvor godt en analyse presterer når det gjelder spesifisitet og det geografiske området den kan brukes på6,10. Det oppfordres til å designe analysen for et bestemt geografisk område, slik at designeren bedre kan teste en analyse for kryssreaktivitet mot andre arter i det området, og å være klar over begrensningene dette har for å utvide en analyse til andre områder der en målart kan oppstå.24. Når listen er fullført, kan sekvenser lastes ned fra offentlige genetiske databaser. Siden disse databasene er ufullstendige27, bør man sekvensere så mange arter på listen som mulig internt for å fullføre den lokale referansedatabasen for sekvenser som skal brukes i analysedesign. Prioriter samtidige nært beslektede arter, da dette er de mest sannsynlige ikke-målene som vil forsterke. Å fokusere på alle arter i samme slekt eller familie som målarten er et godt sted å starte. Sammenligninger med nært beslektede arter vil bidra til å identifisere sekvensregioner som er unike for målartene. Dette kan bidra til å informere om hvordan analysen kan fungere i andre systemer eller steder. Mitokondrieregioner er det vanlige valget for analyseutvikling, fordi mer sekvensinformasjon fra et bredere utvalg av arter er tilgjengelig ved mitokondriegener som har blitt brukt i strekkode for livsprosjekter, og fordi mitokondrie-DNA er til stede ved mye større konsentrasjon i kopier / celle enn kjernefysisk DNA24,28,29. Flere genregioner bør vurderes for videre analyseutvikling ettersom sekvensdekningen varierer mellom taxa i de genetiske depotdatabasene. Når denne lokale databasen med referansesekvenser er opprettet, brukes en kombinasjon av manuell visualisering av justerte sekvensdata og dataprogrammer til å designe primer/sondeanalysene. Man bør ikke stole strengt på programvare for å bestemme hvilke analyser som skal testes. Det er viktig å verifisere visuelt på justeringer der primerne og sondene sitter på målene og ikke-målene for å få en bedre forståelse av hvordan de kan fungere i en PCR. Endelig analyse screening og optimalisering inkluderer tre nivåer (i silico, in vitro og in situ)6,7,24,25. I silico design og testing er viktig for å produsere en kort liste over analyser med en god sjanse for suksess, men empirisk (in vitro) testing er avgjørende for å velge analysen med den beste faktiske ytelsen. In vitro optimalisering og testing av analyser inkluderer måling av reaksjonseffektivitet og definering av analysens følsomhet og spesifisitet. Grenser for deteksjon og kvantifisering er to parametere som ofte overses i analyseutvikling, men viktig for datatolkning. Ved å kjøre flere replikeringer av standardkurvene for en analyse, kan LOD og LOQ enkelt måles1,5,30. Få studier diskuterer resultater med hensyn til analysens LOD eller LOQ, men Sengupta et al. (2019) innlemmer analysens LOD og LOQ i deres datatolkning og grafikk for en klarere forståelse av resultatene.31. Interne positive kontroller bør også multiplekses inn i den utformede analysen. Uten testing for PCR-hemming i prøvene kan det oppstå falske negativer24,32. Vi foreslår bruk av en multiplekset IPC-analyse med målanalysen som den enkleste metoden for PCR-hemmingstesting23. Til slutt er in situ-testing av analysen fra felt- og laboratorieoppsamlede prøver nødvendig for å sikre at målforsterkning skjer i miljøprøver24.
Det finnes begrensninger for bruk av artsspesifikke, sondebaserte qPCR-analyser med eDNA-prøver. For eksempel kan utformingen av flere analyser for testing være begrenset av sekvenstilgjengelighet, og kompromiss kan være nødvendig på aspekter av analyseytelse. Disse valgene må styres av studiens mål og skal rapporteres med resultatene26. For eksempel, hvis målet er påvisning av en sjelden art og få positive er forventet, kan en analyse med ufullkommen spesifisitet (dvs. forsterkning av ikke-målarter) brukes hvis alle deteksjoner vil bli verifisert ved sekvensering. Hvis målet er å overvåke det geografiske spekteret av en art og eDNA-konsentrasjonsdata ikke er nødvendig, kan en analyse med ufullkommen effektivitet bare brukes og data rapporteres som prosentdeteksjon. Videre, med mindre alle potensielle konsifikter testes i laboratoriet, noe som sjelden er mulig, kan man ikke med absolutt sikkerhet vite den sanne spesifisiteten til en analyse. Analysen ble for eksempel designet og testet mot flere ferskvannsmuslinger i Clinch-elven. For å bruke denne analysen i et annet elvesystem, må vi teste den mot en rekke arter på det nye stedet. Genetisk variasjon i arten eller populasjonen som ikke testes under analyseutvikling, kan også påvirke spesifisiteten. Til slutt, selv om en analyse er verifisert til å ha høy teknisk ytelse; endres når du arbeider i -feltet. Ikke-analyserelaterte forhold som vannstrøm, pH og dyreatferd kan endre eDNA-påvisbarhet som kan bruke forskjellige eDNA-innsamlings- og ekstraksjonsprotokoller. Bruk av analyser som er optimalisert og godt beskrevet, vil bidra til å lette forståelsen av påvirkning slike parametere har på eDNA-deteksjon.
Feltet eDNA modnes utover utforskende analyse for å øke standardiseringen av metoder og teknikker. Denne utviklingen vil forbedre vår forståelse av eDNA-teknikker, evner og begrensninger. Optimaliseringsprosessen vi skisserer ovenfor forbedrer en analyses følsomhet, spesifisitet og reproduserbarhet. Det endelige målet med denne forbedringen og standardiseringen av eDNA-metoder er å forbedre forskernes evner til å gjøre slutninger basert på eDNA-data, samt øke sluttbruker- og stavsholderens tillit til resultatene.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen interessekonflikt. Finansieringssponsorene hadde ingen rolle i utformingen av studien; i innsamling, analyser eller tolkning av data; i skrivingen av manuskriptet; eller i beslutningen om å publisere resultatene.
Acknowledgments
Vi takker Alvi Wadud og Trudi Frost som hjalp til med å utvikle og teste primere. Støtten til analysedesignet som ble rapportert i denne studien, ble gitt av Institutt for forsvarsstrategisk miljøforskning og utvikling (RC19-1156). All bruk av handels-, produkt- eller firmanavn er kun til beskrivende formål og innebærer ikke godkjenning fra amerikanske myndigheter. Data generert i løpet av denne studien er tilgjengelige som en USGS-datautgivelse https://doi.org/10.5066/P9BIGOS5.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96 Place Reversible Racks with Covers | Globe Scientific | 456355AST | |
| Clean gloves (ie. latex, nitrile, etc.) | Kimberly-Clark | 43431, 55090 | |
| CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System | Bio-Rad | 1855196 | |
| Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 1.5mL | Fisher Scientific | 5408129 | |
| Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 2.0mL | Fisher Scientific | 2681332 | |
| Hard-Shell 96-Well PCR Plates, low profile, thin wall, skirted, white/clear | Bio-Rad | #HSP9601 | |
| IPC forward and reverse primers | Integrated DNA Technologies, Inc. | none | custom product |
| IPC PrimeTime qPCR Probes | Integrated DNA Technologies, Inc. | none | custom product |
| IPC Ultramer DNA Oligo synthetic template | Integrated DNA Technologies, Inc. | none | custom product |
| Labnet MPS 1000 Compact Mini Plate Spinner Centrifuge for PCR Plates | Labnet | C1000 | |
| Microcentrifuge machine | Various | - | Any microcentrifuge machine that hold 1.5mL and 2.0mL tubes is typically okay. |
| Microseal 'B' PCR Plate Sealing Film, adhesive, optical | Bio-Rad | MSB1001 | |
| Nuclease-Free Water (not DEPC-Treated) | Invitrogen | AM9932 | |
| Pipette Tips GP LTS 1000 µL F 768A/8 | Rainin | 30389272 | |
| Pipette Tips GP LTS 20 µL F 960A/10 | Rainin | 30389274 | |
| Pipette Tips GP LTS 200 µL F 960A/10 | Rainin | 30389276 | |
| Pipettes | Rainin | Various | Depending on lab preference, manual or electronic pipettes can be used at various maximum volumes. |
| TaqMan Environmental Master Mix 2.0 | Thermo Fisher Scientific | 4396838 | |
| Target forward and reverse primers | Integrated DNA Technologies, Inc. | none | custom product |
| Target PrimeTime qPCR Probes | Integrated DNA Technologies, Inc. | none | custom product |
| Target synthetic gBlock gene fragment | Integrated DNA Technologies, Inc. | none | custom product. used for qPCR standard dilution series |
| TE Buffer | Invitrogen | AM9849 | |
| VORTEX-GENIE 2 VORTEX MIXER | Fisher Scientific | 50728002 |
References
- Kubista, M., et al.
- Higuchi, R. D., Walsh, P. S., Griffith, R. Simultaneous amplification and detection of specific DNA sequences. Biotechnology. 10, 5 (1992).
- Mauvisseau, Q., et al. Influence of accuracy, repeatability and detection probability in the reliability of species-specific eDNA based approaches. Scientific Reports. 9 (1), 580 (2019).
- Hernandez, C., et al. 60 specific eDNA qPCR assays to detect invasive, threatened, and exploited freshwater vertebrates and invertebrates in Eastern Canada. Environmental DNA. , (2020).
- Klymus, K. E., et al. Reporting the limits of detection and quantification for environmental DNA assays. Environmental DNA. , (2019).
- Thalinger, B., et al. A validation scale to determine the readiness of environmental DNA assays for routine species monitoring. bioRxiv. , (2020).
- Helbing, C. C., Hobbs, J. Environmental DNA Standardization Needs for Fish and Wildlife Population Assessments and Monitoring. CSA Group. , (2019).
- Sepulveda, A. J., Nelson, N. M., Jerde, C. L., Luikart, G. Are Environmental DNA Methods Ready for Aquatic Invasive Species Management. Trends in Ecology & Evolution. , (2020).
- Svec, D., Tichopad, A., Novosadova, V., Pfaffl, M. W., Kubista, M. How good is a PCR efficiency estimate: Recommendations for precise and robust qPCR efficiency assessments. Biomolecular Detection and Quantification. 3, 9-16 (2015).
- Wilcox, T. M., et al. Robust detection of rare species using environmental DNA: the importance of primer specificity. PLoS One. 8 (3), 59520 (2013).
- Prediger, E. How to design primers and probes for PCR and qPCR. IDT. , Available from: http://www.idtdna.cco/pages/education/decoded/article/designing-pcr-primers-and-probes (2020).
- Thornton, B., Basu, C. Real-time PCR (qPCR) primer design using free online software. Biochemistry and Molecular Biology Education. 39, 145-154 (2011).
- Owczarzy, R., et al. IDT SciTools: a suite for analysis and design of nucleic acid oligomers. Nucleic Acids Research. 36, Web Server issue 163-169 (2008).
- Kibbe, W. A. OligoCalc: an online oligonucleotide properties calculator. Nucleic Acids Research. 35, Web Server issue 43-46 (2007).
- Taylor, S. C., et al. The Ultimate qPCR Experiment: Producing Publication Quality, Reproducible Data the First Time. Trends in Biotechnology. 37 (7), 761-774 (2019).
- Ye, J., et al. Primer-BLAST: A tool to design target-specific primers for polymerase chain reaction. BMC Bioinformatics. 13 (134), 11 (2012).
- Altschul, S. F., Gish, W., Miller, W., Myers, E. W., Lipman, D. J. Basic Local Alignment Search Tool. Journal of Molecular Biology. 215, 403-410 (1990).
- Bustin, S. A., et al. The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments. Clinical Chemistry. 55 (4), 611-622 (2009).
- Bio-Rad. Bio-Rad Vol. 5279. , ed Bio-Rad (2020).
- Bio-Rad. Bio-Rad Vol. 6894. , Bio-Rad (2020).
- Eurogentec. Eurogentec. Vol. 0708-V2. , ed Eurogentec (2020).
- Bustin, S., Huggett, J.
- Hoorfar, J., et al. Practical considerations in design of internal amplification controls for diagnostic PCR assays. Journal of Clinical Microbiology. 42 (5), 1863-1868 (2004).
- Goldberg, C. S., et al. Critical considerations for the application of environmental DNA methods to detect aquatic species. Methods in Ecology and Evolution. 7 (11), 1299-1307 (2016).
- Guan, X., et al. Environmental DNA (eDNA) Assays for Invasive Populations of Black Carp in North America. Transactions of the American Fisheries Society. 148 (6), 1043-1055 (2019).
- Mosher, B. A., et al. Successful molecular detection studies require clear communication among diverse research partners. Frontiers in Ecology and the Environment. 18 (1), 43-51 (2019).
- Kwonga, S., Srivathsana, A., Meier, R. An update on DNA barcoding: low species coverage and numerous unidentified sequences. Cladistics. 28, 6 (2012).
- Rees, H. C., et al. REVIEW: The detection of aquatic animal species using environmental DNA - a review of eDNA as a survey tool in ecology. Journal of Applied Ecology. 51 (5), 1450-1459 (2014).
- Evans, N. T., Lamberti, G. A. Freshwater fisheries assessment using environmental DNA: A primer on the method, its potential, and shortcomings as a conservation tool. Fisheries Research. 197, 60-66 (2018).
- Forootan, A., et al. Methods to determine limit of detection and limit of quantification in quantitative real-time PCR (qPCR). Biomolecular Detection and Quantification. 12, 1-6 (2017).
- Sengupta, M. E., et al. Environmental DNA for improved detection and environmental surveillance of schistosomiasis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (18), 8931-8940 (2019).
- Klymus, K. E., Richter, C. A., Chapman, D. C., Paukert, C. Quantification of eDNA shedding rates from invasive bighead carp Hypophthalmichthys nobilis and silver carp Hypophthalmichthys molitrix. Biological Conservation. 183, 77-84 (2015).
