Summary
Mange kjennetegn ved insekt eusosialitet stole på innen-kolonien kommunikasjon og arbeidsdeling. Genetisk manipulering av viktige regulatoriske gener i maurembryoer via mikroinjeksjon og CRISPR-mediert mutagenese gir innsikt i arten av altruistisk oppførsel hos eusosiale insekter.
Abstract
De unike egenskapene til eusosiale insekter, som sosial atferd og reproduktiv arbeidsdeling, styres av deres genetiske system. For å adressere hvordan gener regulerer sosiale egenskaper, har vi utviklet mutante maur via levering av CRISPR-kompleks til unge embryoer i løpet av deres syncytiale stadium. Her gir vi en protokoll av CRISPR-mediert mutagenese i Harpegnathos saltator, en ponerinmyrart som viser slående fenotypisk plastisitet. H. saltatormyrer er lett oppdrettet i laboratorieinnstilling. Embryoer samles inn for mikroinjeksjon med Cas9-proteiner og in vitro syntetiserte små guide-RNA (sgRNA) ved bruk av hjemmelagde kvartsnåler. Embryoer etter injeksjon oppdrettes utenfor kolonien. Etter fremveksten av den første larven blir alle embryoer og larver transportert til en reirkasse med noen få pleiearbeidere for videre utvikling. Denne protokollen er egnet for å indusere mutagenese for analyse av kastespesifikk fysiologi og sosial atferd hos maur, men kan også brukes på et bredere spekter av hymenopteraner og andre insekter.
Introduction
Utviklingen av eusosialitet hos insekter, nemlig de av ordrene Hymenoptera og Blattodea (tidligere Isoptera), har resultert i unike og ofte sofistikerte atferdstrekk som manifesterer seg på både individ- og koloninivå. Reproduktiv arbeidsdeling, et trekk som karakteriserer de mest avanserte gruppene av sosiale insekter, involverer ofte kastesystemer sammensatt av flere atferdsmessig og ofte morfologisk særegne grupper. Slike atferdsmessige og morfologiske mangfold mellom kaster styres ikke bare av deres genetiske system, men også ofte av miljøet 1,2,3,4, noe som gjør eusosiale insekter attraktive for genetisk og epigenetisk forskning.
Evnen til å manipulere det genetiske systemet av eusosiale insekter har vist seg å være utfordrende, da mange arter ikke parrer seg og reproduserer i laboratorieinnstillinger. De fleste eusosiale insekter har også svært få reproduktive individer i en koloni, noe som begrenser antall avkom som kan produseres og dermed begrenser prøvestørrelsen for genetisk manipulasjon5. I tillegg har mange eusosiale insekter lange generasjonstider sammenlignet med insekter som vanligvis brukes til genetiske studier (som Drosophila), og legger til vanskeligheten med å etablere genetiske linjer5. Noen eusosiale arter kan imidlertid generere en stor andel reproduktivt aktive individer i en koloni, noe som lindrer utfordringene og gir muligheter til å etablere mutante eller transgene linjer.
Når det gjelder ponerine-maurarten, Harpegnathos saltator, kan alle kvinnelige arbeidere bli reproduktivt aktive ved dronningens død eller sosial isolasjon. Disse arbeiderne blir referert til som "gamergates" og kan brukes til å generere nye kolonier6. Videre kan det være mer enn en gamergate til stede i en koloni, og dermed øke avkomproduksjonen 5,7,8. Så langt har mutante og / eller transgene linjer blitt utviklet i den europeiske honningbien, Apis mellifera, og i maurarten, H. saltator, Ooceraea biroi og Solenopsis invicta 9,10,11,12,13,14,15 . Genetiske analyser i sosiale bier og maur har banet vei mot en bedre forståelse av eusosialitet, og gir en rekke muligheter til å studere gener og deres innvirkning på eusosial insektadferd og kastespesifikk fysiologi.
Her gir vi en protokoll for genmodifisering via CRISPR/Cas9-systemet i H. saltator. Spesielt ble denne teknikken brukt til å generere en kimlinjemutasjon i orco, genet som koder for den obligatoriske koreseptoren til alle odorantreseptorer (ORs)10. OR-gener har blitt bemerkelsesverdig utvidet i hymenopteran eusosiale insekter16, og orco spiller en viktig rolle i insektolfaction; i fravær monteres eller fungerer ikke ORs normalt. Mutasjoner av orco-genet forstyrrer derfor olfaktorisk sensasjon, nevral utvikling og tilhørende sosial atferd 9,10.
I denne protokollen blir Cas9-proteiner og små guide-RNA (sgRNA) introdusert i myrembryoer ved hjelp av mikroinjeksjon med det formål å indusere mutagenese av et målgen. Her vil vi beskrive mikroinjeksjonsprosedyren i detalj sammen med instruksjoner om omsorg for kolonier og injiserte embryoer. Disse metodene er egnet for å indusere mutagenese i en rekke forskjellige gener i H. saltatormyrer og kan brukes på et bredere spekter av hymenopteran insekter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Regelmessig vedlikehold av Harpegnathos saltatorkolonier
- Oppretthold villtypekolonier av H. saltator i gjennomsiktige plastbokser i et myroppdrettsrom ved 22-25 ° C og en fotoperiode på 12 timers lys: 12 timer mørk (12L: 12D) belysningsplan.
- Bruk små bokser (9,5 x 9,5 cm2) til å oppdra individuelle arbeidere eller små kolonier. Bruk mellomstore bokser (19 x 13,5 cm 2) eller store bokser (27 x 19 cm2) for å oppdra større kolonier (figur 1).
- For å lage reirkasser, bruk gips for å lage gulv til boksene. Når den våte gipsen tørker i mediet og de store boksene, trykker du en skumblokk inn i gipsen noen få centimeter dyp og noen få centimeter fra baksiden av esken for å betegne et nedre reirområde. Når gipset har tørket, dekk det angitte reirområdet med et firkantet stykke glass.
MERK: I små bokser er det ikke nødvendig å utpeke en nedre reirregion. Hvis maur forsømmer å bruke den utpekte nedre reirregionen, kan det bidra til å dekke glasset med et firkantet stykke rød cellofan. Dette gir inntrykk av et mørkt underjordisk rom som ligner reir som H. saltator bruker i naturen, og kan oppmuntre dem til å flytte sin brød til den angitte regionen.
- Fôr kolonier med levende crickets to ganger i uken.
MERK: Kolonier bør mates nok til at de spiser alle crickets før neste fôring. Fôr eventuelle isolerte maur og mutante maurkolonier med crickets forstukket av arbeidere i en vanlig koloni 2-3 ganger hver uke. - Påfør vann regelmessig på gipsboksgulvet ved hjelp av en vaskeflaske.
MERK: Gipsen skal være fuktig nok til at den ikke føles støvete å ta på, men den skal være tørr nok til at alt tilsatt vann absorberes av gipset. Det er viktig at reirene ikke blir vannet for mye. I gjennomsnitt vil reirkasser trenge en liten mengde vann tilsatt en gang per uke. - Når fôring skjer, fjern søppel og døde personer. Frys ned alt avfall og døde myrer over natten ved -30 °C før disse materialene kastes som vanlig søppel.
- Tilsett en klype tørket sagflis til kolonier med jevne mellomrom; Dette hjelper larver når de gjennomgår pupasjon og hjelper arbeidere med å holde reirkassen ren.
2. Tilberedning av kvartsglass mikroinjeksjonsnåler
- Bruk en mikropipettetrekker til å trekke mikroinjeksjonsnåler i glass.
- Velg glasset som skal trekkes. Sørg for at glasset som brukes har blitt oppbevart i et støvfritt og rent miljø.
MERK: Her har tynnvegget filamentøst kvartsglass med en ytre diameter på 1,0 mm, indre diameter på 0,5 mm og lengde på 7,5 cm blitt brukt til å produsere mikroinjeksjonsnåler. Hvis du injiserer et mykt embryo, kan borosilikatnåler også være aktuelt, men borosilikatnåler er ikke i stand til å trenge inn i hard chorion. - Still inn parameterinnstillingene til avtrekkeren. Bruk en to-trinns prosess for å trekke mikroinjeksjonsnåler for H. saltatorembryoer : parametere for det første trinnet inkluderer varme på 575, filament på 3, hastighet på 35, forsinkelse på 145 og et trekk på 75; Parametrene i det andre trinnet inkluderer varme på 425, filament på 0, hastighet på 15, forsinkelse på 128 og et trekk på 200. Etter det andre trinnet må du sørge for at den resulterende nålen har en 2 mm avsmalning og en spiss på 0,5 μm (figur 2).
MERK: Dette settet med parametere, sammen med parametere for andre kanyletyper, finner du i bruksanvisningen17. Håndbøker for pipettetrekkere gir ofte anbefalte parametere for en rekke teknikker. Noe prøving og feiling kan være nødvendig for å avgjøre hvilke parametere som genererer de beste nålene for spesifikke behov. En kort nedtrapping er ideell for H. saltatorinjeksjoner, da den kan trenge inn i hardkorionen av H. saltatorembryoer. Hvis du injiserer et mykt embryo, for eksempel et som har blitt dechorionert (f.eks. Drosophila), kan en lengre nedtrapping rundt 10 mm gi bedre resultater. Bruksanvisninger for pipettetrekkere gir vanligvis spesifikke parametere for trekking av nåler som passer for ulike behov. Det er viktig at hansker brukes mens du håndterer glassfilamenter og trekker nåler. Oljer fra bare hender kan overføres til glasset hvis hansker ikke brukes. - Når parametrene er angitt, bruk en mikropipettetrekker til å trekke kanyler til mikroinjeksjon. Sørg for at nålene holdes i et støvfritt og rent miljø til de brukes.
MERK: Det anbefales å bruke nytrukne mikroinjeksjonsnåler. Hvis det brukes forhåndstrukne nåler, bør de oppbevares riktig i en eske for å forhindre skade på nålespisser og potensiell forurensning. Nåler som har gjennomgått langvarig lagring anbefales ikke for embryoinjeksjoner.
3. Fremstilling av mikroinjektor
- Bruk en mikroinjektor til å injisere ønskede materialer i maurembryoer.
- Forbered mikroinjeksjonsblandingen av Cas9-proteiner og in vitro syntetiserte små guide-RNA (sgRNA)10. Hold blandingen på is til det er på tide å laste en mikroinjeksjonsnål. Når mikroinjeksjonsblandingen ikke er i bruk, skal den oppbevares ved -80 °C.
MERK: Konsentrasjonene varierer i forskjellige arter. Høy konsentrasjon kan gi høy dødelighet, mens lav konsentrasjon kan redusere effektiviteten. Vi bruker 0,2 μg/μL Cas9 proteiner og 0,2 μg/μL sgRNA for H. saltator embryo injeksjon. Design av våre sgRNA fulgte en tidligere etablert protokoll18. Gensekvenser ble hentet fra DNA-databaser. Genomsekvensen til H. saltator ble også tidligere rapportert19,20. - Juster injeksjonsparametrene for H. saltatorembryoer : et injeksjonstrykk på 140 hektopascal (hPa), et konstant trykk på 70 hPa og en tid på 0,4 sekunder. Juster konstant trykk slik at materialet bare strømmer i en retning. Juster injeksjonstrykket og -tiden bare hvis det ikke strømmer noe materiale fra nålen og inn i embryoet.
MERK: Hvis du injiserer en annen type embryo, er den primære parameteren som kan endres konstant trykk, som er ansvarlig for å sikre at væske fra embryoet ikke strømmer tilbake i nålen. Volumet kontrolleres ikke for i denne protokollen. Innstilling av parametrene til mikroinjektoren er tilstrekkelig for å oppnå konsistente injeksjoner. - Legg en mikroinjeksjonsnål med 2 μL av blandingen ved hjelp av mikroloaderpipettespisser. Gjør dette sakte for å sikre at det ikke dannes bobler i blandingen.
MERK: Hvis det dannes bobler, kan det være vanskelig å opprettholde konsekvente mikroinjeksjoner. - Bryt bare spissen av nålen ved å bryte langs kanten av båndet slik at en smal taper fortsatt opprettholdes. Forsikre deg om at nålen er brukket akkurat nok til at spissen åpnes, men ikke så mye at avsmalningen er brukket av.
MERK: Det er viktig at hvis åpningen av nålen er for bred etter brudd, vil brukeren se væske renne ut av nålen når den er montert på den trykksatte mikroinjektoren før injeksjonstrykk påføres. Noen mikroinjeksjonsprotokoller anbefaler å bryte nåler ved å kutte spissen med saks. Denne metoden anbefales ikke, da saks kan føre til at spissen av nålen knuses. Injisering av embryoer med en knust nål vil være svært skadelig. - Monter nålen på mikromanipulatoren
4. Injeksjon av embryoer
- Velg embryoer for mikroinjeksjon fra syncytialt stadium: tiden under utviklingen der kjerner deler seg uten cytokinese.
MERK: Dette er den ideelle tiden under utvikling for genomredigering ved mikroinjeksjon, som oppdaget tidligere i Drosophila21. H. saltatorembryoer passerer syncytialstadiet og når cellularisering rundt 36 timer etter eggavsetning10. Høyere effektivitet oppnås hvis yngre embryoer brukes til injeksjoner. - Line embryoer på et stykke dobbeltsidig tape fast til et glass mikroskop lysbilde. Sørg for at embryoene er godt festet til båndet for å forhindre bevegelse under injeksjonen. Legg embryoene i vertikal retning, slik at sidesiden av embryoet er på kanten av båndet (figur 3). Plasser lysbildet og foret embryoer på scenen av mikroskopet på en utpekt mikroinjeksjon arbeidsstasjon.
MERK: Det anbefales at embryoene er ordnet slik at påfølgende injeksjoner kan utføres ved å flytte lysbildet på scenen i stedet for å justere kanyleposisjonen med hver injeksjon. Dette gjør det mulig å utføre påfølgende injeksjoner mer effektivt. - Juster nålen med det første embryoet som skal injiseres ved hjelp av mikromanipulatoren (figur 4a).
- Punkter nålen lateralt inn i det første embryoet langs sin dorsale / ventrale akse under et mikroskop.
- Injiser mikroinjeksjonsblandingen. Se etter liten bevegelse av embryoet, noe som indikerer en økning i internt trykk på grunn av den injiserte væsken. I tillegg må du se etter dannelsen av en liten dråpe som inneholder synlige spor av vev og/eller lipid på embryoets ytre membran (figur 4b).
MERK: Tilstedeværelse av spor av vev og/eller lipid i dråpen indikerer at nålen har punktert både korion og vitellinmembran i embryoet. Hvis spor av disse materialene ikke er tilstede, ble injeksjonen ikke utført vellykket og bør gjentas. Etter noen sekunder vil dråpen bli reabsorbert av embryoet og vil ikke lenger være synlig. - Fjern nålen forsiktig fra embryoet umiddelbart, og fortsett til neste ved å justere posisjonen til mikroskopglasset. Gjenta til alle embryoene er injisert.
- Når alle embryoene på lysbildet er injisert, overfører du lysbildet til en fuktig eske i 1 time for å gi embryoene tid til å komme seg etter injeksjonsprosessen før de fjernes fra lysbildet.
5. Oppdrett av injiserte embryoer
- Etter 1 times inkubasjon i en fuktig boks, fjern forsiktig de injiserte embryoene fra båndet ved hjelp av fjærvekttang, og overfør dem til et rør fylt med en liten mengde 70% etanol. Inverter røret flere ganger for å overføre embryoene til bunnen av røret. Gjenta etanolvasken en gang, etterfulgt av tre vasker med autoklavert vann.
- Bruk en liten og myk pensel, overfør alle injiserte embryoer til 1% agarplater med 2% antibiotika-antimykotisk. Påfør antibiotika-antimykotisk etter at helles agarplater er avkjølt ved å spre seg over overflaten av platen ved hjelp av en cellespreder. Forsegl agarplaten med parafilm for å forhindre uttørking av agar.
MERK: Ikke forsøk å returnere injiserte embryoer til en koloni etter injeksjoner, da arbeidere kan ødelegge de fleste injiserte embryoer. Overlevelse optimaliseres derfor ved å la embryoer utvikle seg på agarplater utenfor et normalt kolonimiljø. - Inkuber agarplatene ved 25 °C i ca. 4 uker. Sjekk regelmessig for klekking.
- Når det første embryoet har klekket ut i en larve, returner alle embryoer og larver til en reirkasse med noen få unge sykepleierarbeidere for å ta vare på hatchlings. Fôr ved hjelp av sirisser som er stukket av en større koloni av villtype, fjerner avfallsprodukter og tilsetter vann etter samme protokoll som er omtalt i avsnitt 1.
MERK: Små bokser (9,5 x 9,5 cm2) er ideelle for slike kolonier. H. saltator reproduserer godt i fangenskap. Derfor kan mutante embryoer heves til voksen alder. Isolering av mutante voksne(e) induserer overgang til det reproduktive gamergate-stadiet. Kontrollerte kryss brukes for å etablere mutante kolonier med heterozygote eller homozygote individer (figur 5).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ved hjelp av protokollen som er gitt her, ble genomredigering i Harpegnathos saltatorembryoer utført vellykket. Disse resultatene ble validert via polymerasekjedereaksjon og pGEM-kloning av DNA ekstrahert fra injiserte embryoer etterfulgt av DNA-sekvensering. Effektiviteten av somatisk mutagenese ved bruk av denne protokollen nådde omtrent 40%. F1 mutante hanner ble parret med ville hunner for å produsere heterozygote F2-hunner som, hvis de ikke var parret, produserte F3-hanner. Mutant F3 hanner ble parret med heterozygote hunner for å produsere F4 homozygote mutante hunner. Fravær av målpeptidet ble videre bekreftet via massespektrometri hos disse F4 homozygote hunnindividene. Vingene ble klippet fra hanner ved hjelp av mikrodisseksjonssaks og brukt til genotypingsformål. Siden arbeidere ikke har vinger, blir de normalt ofret og genotypet etter eksperimenter. Som et resultat av vellykket mutagenese ble det observert uvanlig oppførsel, som korrelerte med tap av målgenet. Tapet av orco resulterte i unormal atferd relatert til tap av feromon sensing, manglende evne til å oppdage byttedyr, nedsatt fruktbarhet, og vandrende fra kolonien. Videre viste orco mutante maur et redusert antall odorantreseptorneuroner og antennelapp glomeruli, noe som tyder på at nevroanatomi hos maur er avhengig av luktreseptorfunksjonalitet10.
Figur 1: Harpegnathos saltator reir. (A) Eksterne trekk ved en 19 x 13,5 cm2 reirkasse som inneholder en H. saltatorkoloni. (B) Interne trekk ved en 19 x 13,5 cm2 reirkasse som inneholder en H. saltatorkoloni. Legg merke til tilstedeværelsen av en nedre reirregion under et firkantet stykke glass. (C) Eksterne trekk ved en 9,5 x 9,5 cm2 reirkasse som inneholder en liten H. saltatorkoloni. En slik reirkasse er også egnet for isolerte arbeidere og mutantkolonier. (D) Interne trekk ved en 9,5 x 9,5 cm2 reirkasse som inneholder en liten H. saltatorkoloni. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Kanyle til Harpegnathos saltator embryo mikroinjeksjon. Legg merke til den tynne nedtrappingen av nålen (merket med en pil). Nålen kan åpnes ved å bryte spissen litt. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Justering av embryoer på dobbeltsidig tape. Embryoer skal justeres slik at lengden er parallell med båndets lange kant. Dette gjør det enkelt å utføre påfølgende injeksjoner ved å flytte lysbildet på scenen. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Embryo og kanyle sett under mikroinjeksjon . (A) Riktig justering av nålen med embryoet før injeksjon. Nålen hviler vinkelrett på midtpunktet på embryoets side, det typiske injeksjonsstedet. (B) Embryoet og nålen etter en vellykket injeksjon. En liten dråpe stikker ut fra embryoets side (merket med en pil). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Diagram over grunnleggende mutante kryss. CRISPR kan indusere mutasjoner på målgenet hos F0-kvinner, som deretter isoleres i voksen alder for å indusere gamergate-overgangen. Hvis mutasjoner oppstår i kimlinjeceller, kan umattede gamergater legge mutante mannlige egg. F1-mutante voksne hanner kan parres med villtypehunner for å generere heterozygote avkom, eller de kan parres med heterozygote hunner for å generere homozygote eller heterozygote avkom. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Utviklingen av eusosialitet blant insekter, inkludert maur, bier, veps og termitter, har resultert i utseendet på nye atferdsmessige og morfologiske egenskaper, hvorav mange forstås å være påvirket av en kombinasjon av miljømessige og genetiske faktorer 1,2,3,4. Dessverre har attraktiviteten og nytten av eusosiale insekter som forskningsmodeller innen genetikk blitt hindret av vanskelighetene forbundet med mutagenese i denne gruppen. Denne hindringen oppstår på grunn av reproduktiv arbeidsdeling, et sentralt trekk ved eusosiale insekter der bare noen få medlemmer av en koloni kan reprodusere. Denne egenskapen legger begrensninger på antall mutante avkom og gjør utviklingen av genetiske linjer utfordrende5. Ponerinemyrarten, Harpegnathos saltator, gir en løsning på dette dilemmaet, da alle hunner er i stand til å bli reproduktive gamergater når de er isolert5. Her tilbyr vi metoder for mutagenese i H. saltator ved hjelp av CRISPR/Cas9-systemet, levert via embryomikroinjeksjon.
Riktig kolonivedlikehold og utvelgelse av embryoer på riktig utviklingsstadium for mikroinjeksjon er avgjørende. Tidligere arbeid fastslått at syncytialt stadium i insektutvikling er det ideelle stadiet for genomredigering21, men tidspunktet for dette stadiet i H. saltator embryonal utvikling var tidligere ukjent. Via kjernefarging av tidlige embryoseksjoner kunne vi bestemme at syncytialstadiet i H. saltatorembryoer varer til 36 timer etter eggavsetning, slik at vi kan bestemme når vi skal velge nye embryoer for mikroinjeksjon10.
Valg av parametere for nåletrekking og mikroinjeksjon kan være utfordrende. Faktorer å vurdere når du velger parametere for nåletrekking inkluderer (1) typen glass som brukes, (2) ønsket formål med nålen, (3) ønsket spissstørrelse, (4) mengden motstand nålen vil oppleve under injeksjonen, (5) ønsket taperlengde og (6) typen celle eller organisme som skal injiseres. Forslag og retningslinjer for trekking av ulike kanyletyper finnes i ulike bruksanvisninger17. På samme måte er det faktorer å vurdere når du velger parametere for mikroinjeksjon, inkludert (1) størrelsen på nålen som brukes og (2) embryoene som skal injiseres22. Mens denne protokollen fokuserer på mikroinjeksjon i H. saltatorembryoer , kan teknikkene variere i andre insekter med modifikasjon av disse parametrene. Spesielt vil parametrene for nåletrekking og injeksjon variere hvis det aktuelle embryoet er mykt eller dechorionert. H. saltatorembryoer har en tøff korion, og injeksjonsresultatene er best når en nål med en kort nedtrapping brukes (ca. 2 mm). Embryoer som har mindre fast korion kan injiseres med nåler med lengre tapers (ca. 10 mm).
I H. saltator kan injiserte embryoer ikke returneres umiddelbart til en koloni, da dette vil risikere at de blir ødelagt av sykepleiere. Hvis du bruker denne protokollen på andre sosiale insektarter, kan dette ikke være tilfelle. Å bestemme de beste oppdrettsmetodene etter mikroinjeksjon hos andre arter kan kreve litt prøving og feiling. Når det gjelder H. saltator, må embryoer oppdrettes på agarplater til klekking. Når de er klekket, kan de returneres trygt til en liten koloni med noen få arbeidere for å ta vare på den injiserte brød10. En lignende metode for embryopleie brukes i brannmyrer (Solenopsis invicta) og klonale raidermyrer (Ooceraea biroi) for å øke overlevelsesraten for injiserte embryoer 9,15. Ved voksen eclosion kan modne mutante hunner holdes individuelt eller i små kolonier for å starte sin reproduktive syklus. Instruksjoner for omsorg for H. saltatormutanter er gitt i denne protokollen, men hvis du bruker en annen art, bør retninger for omsorg for injiserte embryoer og mutante voksne endres for å passe til artens behov.
Protokollen som er gitt her er optimalisert for mutagenese, der spesifikt ikke-essensielle gener er målrettet. I dette tilfellet ble orco-genet målrettet, og mutasjoner i orco påvirket ikke mauroverlevelse til voksen alder. På samme måte kan denne protokollen brukes til å målrette mot andre ikke-essensielle gener, inkludert de som er forbundet med andre sensoriske reseptorer. Hvis målgenet er essensielt, må transgene maur genereres i stedet, enten via CRISPR eller transposon. Transposonmediert transgenese har blitt brukt i honningbier13 og kan gjelde maur. Hvis det ønskede resultatet er transgene organismer, må de injiserte materialene være forskjellige. Imidlertid vil prosesser etter injeksjon være like, og derfor vil noen aspekter av denne protokollen være fordelaktige til tross for forskjellen i ønsket resultat.
Samlet sett er H. saltator ideell for bruk som modellorganisme og for ytelse av genetiske kryss på grunn av dets plastiske reproduktive system der arbeidstakere begynner å reprodusere etter isolasjon10. Dette skiller denne maurarten fra andre maur der CRISPR/Cas9-teknologi er etablert, for eksempel O. biroi, en art der alle hunnene reproduserer klonalt. H. saltator presenterer unike forskningsmuligheter blant organismer av sitt slag som genetiske avstamninger kan etableres og mutasjoner kan opprettholdes på tvers av generasjoner i denne arten. Nyheten i dette systemet tillater forskere ikke bare å generere mutante maur, men også å utvikle transgene linjer i fremtiden. Dette gir muligheter for ny forskning for å studere genetisk kontroll av avansert eusosialitet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne takker Danny Reinbergs og Claude Desplans laboratorier ved New York University og Jürgen Liebigs laboratorium ved Arizona State University for deres støtte til maurgenetikk. Hua Yan anerkjenner støtte fra National Science Foundation I / UCRC, Center for Arthropod Management Technologies under Grant No. IIP-1821914 og av industripartnere. Maya Saar ble støttet av USA - Israel Binational Agricultural Research and Development Fund, Vaadia-BARD Postdoctoral Fellowship No. FI-595-19.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | ThermoFisher | 15240-062 | |
| Cas9 protein with NLS, high concentration | PNA Bio | CP02 | |
| Cellophane Roll 20 inch X 5 feet | Hypogloss Products | B00254CNJA | The product has many color variations. Purchase it in red for use in making ant nests. |
| Eclipse Ci-S upright microscope | Nikon | Ci-S | |
| Featherweight forceps, narrow tip | BioQuip | 4748 | |
| FemtoJet ll microinjector | Eppendorf | 920010504 | This product is no longer sold or supported by Eppendorf. A comparable microinjector may be used instead. |
| Microloader pipette tips | Eppendorf | 930001007 | |
| NCBI database | National Center for Biotechnology Information | Gene ID: 105183395 | |
| P-2000 Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-2000/G | |
| Plastic boxes (19 X 13.5 cm2) | Pioneer Plastics | 079C | |
| Plastic boxes (27 X 19 cm2) | Pioneer Plastics | 195C | |
| Plastic boxes (9.5 X 9.5 cm2) | Pioneer Plastics | 028C | |
| Quartz glass without filament | Sutter Instruments | Q100-50-7.5 | |
| Vannas scissors, 8.5 cm | World Precision Instruments | 500086 | |
| Winsor & Newton Cotman Water Colour Series 111 Short Handle Synthetic Brush - Round #000 | Winsor and Newton | 5301030 |
References
- Evans, J. D., Wheeler, D. E. Expression profiles during honeybee caste determination. Genome Biology. 2 (1), 1-6 (2000).
- Keller, L. Adaptation and the genetics of social behaviour. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 364 (1533), 3209-3216 (2009).
- Cahan, S. H., et al. Extreme genetic differences between queens and workers in hybridizing Pogonomyrmex harvester ants. Proceedings. Biological Sciences. 269 (1503), 1871-1877 (2002).
- Volny, V. P., Gordon, D. M. Genetic basis for queen-worker dimorphism in a social insect. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (9), 6108-6111 (2002).
- Yan, H., et al. Eusocial insects as emerging models for behavioural epigenetics. Nature Reviews Genetics. 15 (10), 677-688 (2014).
- Liebig, J., Hölldobler, B., Peeters, C. Are ant workers capable of colony foundation. Naturwissenschaften. 85 (3), 133-135 (1998).
- Bonasio, R. Emerging topics in epigenetics: ants, brains, and noncoding RNAs. Annals of the New York Academy of Sciences. 1260 (1), 14-23 (2012).
- Peeters, C., Liebig, J., Hölldobler, B. Sexual reproduction by both queens and workers in the ponerine ant Harpegnathos saltator. Insectes Sociaux. 47 (4), 325-332 (2000).
- Trible, W., et al. orco mutagenesis causes loss of antennal lobe glomeruli and impaired social behavior in ants. Cell. 170 (4), 727-735 (2017).
- Yan, H., et al. An engineered orco mutation produces aberrant social behavior and defective neural development in ants. Cell. 170 (4), 736-747 (2017).
- Kohno, H., Suenami, S., Takeuchi, H., Sasaki, T., Kubo, T. Production of knockout mutants by CRISPR/Cas9 in the European honeybee, Apis mellifera L. Zoological Science. 33 (5), 505-512 (2016).
- Kohno, H., Kubo, T. mKast is dispensable for normal development and sexual maturation of the male European honeybee. Scientific Reports. 8 (1), 1-10 (2018).
- Schulte, C., Theilenberg, E., Müller-Borg, M., Gempe, T., Beye, M. Highly efficient integration and expression of piggyBac-derived cassettes in the honeybee (Apis mellifera). Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (24), 9003-9008 (2014).
- Hu, X. F., Zhang, B., Liao, C. H., Zeng, Z. J. High-efficiency CRISPR/Cas9-mediated gene editing in honeybee (Apis mellifera) embryos. G3: Genes, Genomes, Genetics. 9 (5), 1759-1766 (2019).
- Chiu, Y. K., Hsu, J. C., Chang, T., Huang, Y. C., Wang, J. Mutagenesis mediated by CRISPR/Cas9 in the red imported fire ant, Solenopsis invicta. Insectes Sociaux. 67 (2), 317-326 (2020).
- Zhou, X., et al. Phylogenetic and transcriptomic analysis of chemosensory receptors in a pair of divergent ant species reveals sex-specific signatures of odor coding. PLoS Genetics. 8 (8), 1002930 (2012).
- Sutter, P-2000 Laser Based Micropipette Puller System Operation Manual. 2.2 edn. Sutter Instrument Company. , (2012).
- Perry, M., et al. Expanded color vision in butterflies: molecular logic behind three way stochastic choices. Nature. 535 (7611), 280-284 (2016).
- Bonasio, R., et al. Genomic comparison of the ants Camponotus floridanus and Harpegnathos saltator. Science. 329 (5995), 1068-1071 (2010).
- Shields, E. J., Sheng, L., Weiner, A. K., Garcia, B. A., Bonasio, R. High-quality genome assemblies reveal long non-coding RNAs expressed in ant brains. Cell Reports. 23 (10), 3078-3090 (2018).
- Henderson, D. S. Drosophila Cytogenetics Protocols. , Humana Press. (2004).
- Kern, R., Stobrawa, S. Step-by-Step Guide: Microinjection of Adherent Cells with the Eppendorf Injectman® 4 and Femtojet® 4. , (2019).
