Summary
Многие характеристики эусоциальности насекомых зависят от коммуникации внутри колонии и разделения труда. Генетическое манипулирование ключевыми регуляторными генами у эмбрионов муравьев с помощью микроинъекции и CRISPR-опосредованного мутагенеза дает представление о природе альтруистического поведения у эусоциальных насекомых.
Abstract
Уникальные черты эусоциальных насекомых, такие как социальное поведение и репродуктивное разделение труда, контролируются их генетической системой. Чтобы решить, как гены регулируют социальные черты, мы разработали мутантных муравьев путем доставки комплекса CRISPR в молодые эмбрионы во время их синцитиальной стадии. Здесь мы приводим протокол CRISPR-опосредованного мутагенеза у Harpegnathos saltator, вида понериновых муравьев, который демонстрирует поразительную фенотипическую пластичность. H. муравьи-солиторы легко выращиваются в лабораторных условиях. Эмбрионы собирают для микроинъекции с белками Cas9 и in vitro синтезируют малые направляющие РНК (sgRNAs) с помощью самодельных кварцевых игл. Эмбрионы после инъекции выращиваются вне колонии. После появления первой личинки все эмбрионы и личинки транспортируются в гнездовой ящик с несколькими кормящими работниками для дальнейшего развития. Этот протокол подходит для индуцирования мутагенеза для анализа кастовой физиологии и социального поведения у муравьев, но также может быть применен к более широкому спектру перепончатокрылых и других насекомых.
Introduction
Эволюция эусоциальности у насекомых, а именно у отрядов перепончатокрылых и Blattodea (ранее Isoptera), привела к уникальным и часто сложным поведенческим чертам, которые проявляются как на индивидуальном, так и на колониальном уровнях. Репродуктивное разделение труда, черта, характеризующая наиболее развитые группы общественных насекомых, часто включает кастовые системы, состоящие из нескольких поведенчески и часто морфологически отличительных групп. Такое поведенческое и морфологическое разнообразие между кастами контролируется не только их генетической системой, но и часто окружающей средой 1,2,3,4, что делает эусоциальных насекомых привлекательными объектами для генетических и эпигенетических исследований.
Способность манипулировать генетической системой эусоциальных насекомых оказалась сложной задачей, поскольку многие виды не спариваются и не размножаются в лабораторных условиях. Большинство эусоциальных насекомых также имеют очень мало репродуктивных особей в колонии, что ограничивает количество потомства, которое может быть произведено, и, следовательно, ограничивает размер выборки для генетических манипуляций5. Кроме того, многие эусоциальные насекомые имеют длительное время генерации по сравнению с насекомыми, обычно используемыми для генетических исследований (такими как дрозофила), что затрудняет установление генетических линий5. Некоторые эусоциальные виды, однако, могут генерировать большую долю репродуктивно активных особей в колонии, что облегчает проблемы и предоставляет возможности для установления мутантных или трансгенных линий.
В случае вида муравьев-понеринов, Harpegnathos saltator, все работницы могут стать репродуктивно активными после смерти королевы или социальной изоляции. Эти рабочие называются «гамергатами» и могут быть использованы для создания новых колоний6. Кроме того, в колонии может присутствовать более одного геймергейта, что увеличивает производство потомствана 5,7,8. До сих пор мутантные и/или трансгенные линии были разработаны у европейской медоносной пчелы, Apis mellifera, и у видов муравьев, H. saltator, Ooceraea biroi и Solenopsis invicta 9,10,11,12,13,14,15 . Генетический анализ у социальных пчел и муравьев проложил путь к лучшему пониманию эусоциальности, предоставляя множество возможностей для изучения генов и их влияния на эусоциальное поведение насекомых и кастовую физиологию.
Здесь мы предоставляем протокол генетической модификации через систему CRISPR/Cas9 в H. saltator. В частности, этот метод был использован для генерации мутации зародышевой линии в orco, гене, кодирующем облигатный корецептор всех рецепторов одоранта (ORs)10. Гены OR были замечательно расширены у перепончатокрылых эусоциальных насекомых16, и orco играет важную роль в обонянии насекомых; при его отсутствии операционные системы не собираются и не функционируют нормально. Таким образом, мутации гена orco нарушают обонятельные ощущения, нервное развитие и связанное с ними социальное поведение 9,10.
В этом протоколе белки Cas9 и малые направляющие РНК (sgRNAs) вводятся в эмбрионы муравьев с использованием микроинъекции с целью индуцирования мутагенеза гена-мишени. Здесь мы подробно опишем процедуру микроинъекции вместе с указаниями по уходу за колониями и введенными эмбрионами. Эти методы подходят для индуцирования мутагенеза в различных генах у муравьев H. saltator и могут быть применены к более широкому спектру перепончатокрылых насекомых.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Регулярное обслуживание колоний сальтаторов Harpegnathos
- Поддерживайте колонии H. saltator дикого типа в прозрачных пластиковых коробках в комнате для выращивания муравьев при 22-25 ° C и фотопериоде 12 часов света: 12 часов темного (12L: 12D) графика освещения.
- Используйте небольшие ящики (9,5 х 9,5см2) для выращивания отдельных рабочих или небольших колоний. Используйте средние коробки (19 x 13,5см2) или большие коробки (27 x 19см2) для выращивания более крупных колоний (рисунок 1).
- Чтобы создать гнездовые ящики, используйте штукатурку, чтобы сделать полы для ящиков. Поскольку мокрая штукатурка высыхает в средних и больших ящиках, вдавите пеноблок в штукатурку на несколько сантиметров глубиной и на несколько сантиметров от задней части коробки, чтобы обозначить более низкую область гнезда. Как только штукатурка высохнет, накройте выделенную область гнезда квадратным куском стекла.
ПРИМЕЧАНИЕ: В небольших коробочках нет необходимости обозначать нижнюю область гнезда. Если муравьи пренебрегают использованием обозначенной нижней области гнезда, это может помочь покрыть стекло квадратным куском красного целлофана. Это создает впечатление темного подземного пространства, напоминающего гнезда, которые H. saltator использует в дикой природе, и может побудить их переместить свой выводок в назначенный регион.
- Кормите колонии живыми сверчками два раза в неделю.
ПРИМЕЧАНИЕ: Колонии должны быть накормлены достаточно, чтобы они потребляли всех сверчков до их следующего кормления. Кормите любых изолированных муравьев и колонии муравьев-мутантов сверчками, предварительно ужаленными работниками обычной колонии 2-3 раза в неделю. - Регулярно наносите воду на напольное покрытие гипсового гнезда с помощью бутылки для мытья.
ПРИМЕЧАНИЕ: Штукатурка должна быть достаточно влажной, чтобы она не чувствовала себя пыльной на ощупь, но она должна быть достаточно сухой, чтобы вся добавленная вода впитывалась штукатуркой. Важно, чтобы гнезда не поливали чрезмерно. В среднем, гнездовые ящики потребуют небольшого количества воды, добавляемой один раз в неделю. - Всякий раз, когда происходит кормление, удаляйте мусор и мертвых особей. Заморозьте все отходы и мертвых муравьев на ночь при -30 °C, прежде чем утилизировать эти материалы как обычный мусор.
- Периодически добавляйте в колонии щепотку высушенных опилок; это помогает личинкам, когда они подвергаются окукливанию, и помогает рабочим содержать гнездовой ящик в чистоте.
2. Приготовление микроинъекционных игл кварцевого стекла
- Используйте съемник микропипетки, чтобы вытащить стеклянные микроинъекционные иглы.
- Выберите стекло, которое нужно потянуть. Убедитесь, что используемое стекло хранилось в свободной от пыли и чистой среде.
ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь для производства микроинъекционных игл использовалось тонкостенное нитевидное кварцевое стекло с наружным диаметром 1,0 мм, внутренним диаметром 0,5 мм и длиной 7,5 см. При инъекции мягкотелого эмбриона также могут быть применимы боросиликатные иглы, но боросиликатные иглы не способны проникать в твердый хорион. - Задайте параметры съемника. Используйте двухэтапный процесс для вытягивания микроинъекционных игл для эмбрионов H. saltator : параметры для первой стадии включают теплоту 575, нить накала 3, скорость 35, задержку 145 и тягу 75; Параметры второй ступени включают теплоту 425, нить накала 0, скорость 15, задержку 128 и тягу 200. Следуя второму этапу, убедитесь, что полученная игла имеет конус 2 мм и наконечник 0,5 мкм (рисунок 2).
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот набор параметров, наряду с параметрами для других типов игл, можно найти в Руководстве по эксплуатации17. Руководства по изготовлению пипеток часто содержат рекомендуемые параметры для различных техник. Может потребоваться некоторое количество проб и ошибок, чтобы определить, какие параметры генерируют лучшие иглы для конкретных потребностей. Короткий конус идеально подходит для инъекций H. saltator , так как он может проникать в твердый хорион эмбрионов H. saltator . При введении мягкого эмбриона, такого как тот, который был дехорионирован (например, дрозофила), более длинный конус около 10 мм может дать лучшие результаты. Руководства по эксплуатации съемников пипеток обычно содержат конкретные параметры для вытягивания игл, подходящих для различных нужд. Важно, чтобы перчатки носились при работе со стеклянными нитями и вытягивании игл. Масла с голых рук могут переноситься на стекло, если перчатки не надеты. - После того, как параметры установлены, используйте съемник микропипетки, чтобы вытащить иглы для микроинъекции. Убедитесь, что иглы хранятся в свободной от пыли и чистой среде до использования.
ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется использовать свежевытянутые микроинъекционные иглы. Если используются предварительно вытащенные иглы, их следует правильно хранить в коробке, чтобы предотвратить повреждение кончиков игл и потенциальное загрязнение. Иглы, подвергшиеся длительному хранению, не рекомендуются для инъекций эмбриона.
3. Подготовка микроинъектора
- Используйте микроинъектор для инъекции желаемых материалов в эмбрионы муравьев.
- Готовят микроинъекционную смесь белков Cas9 и in vitro синтезируют малые направляющие РНК (sgRNAs)10. Держите смесь на льду до тех пор, пока не придет время загружать микроинъекционную иглу. Когда смесь микроинъекций не используется, храните при -80 °C.
ПРИМЕЧАНИЕ: Концентрации варьируются у разных видов. Высокая концентрация может привести к высокой смертности, тогда как низкая концентрация может снизить эффективность. Мы используем 0,2 мкг/мкл белков Cas9 и 0,2 мкг/мкл sgRNAs для инъекции эмбриона H. saltator. Проектирование наших sgRNAs осуществлялось в соответствии с ранее установленным протоколом18. Последовательности генов были получены из баз данных ДНК. Последовательность генома H. saltator также ранее сообщалось о19,20. - Отрегулируйте параметры инъекции для эмбрионов H. saltator : давление инъекции 140 гектопаскаль (гПа), постоянное давление 70 гПа и время 0,4 секунды. Отрегулируйте постоянное давление таким образом, чтобы материал тек только в одном направлении. Регулируйте давление и время инъекции только в том случае, если из иглы в эмбрион не течет материал.
ПРИМЕЧАНИЕ: При введении другого типа эмбриона основным параметром, который может измениться, является постоянное давление, которое отвечает за обеспечение того, чтобы жидкость из эмбриона не текла обратно в иглу. Громкость не контролируется в этом протоколе. Установка параметров микроинжектора достаточна для получения последовательных инъекций. - Загрузите микроинъекционную иглу 2 мкл смеси с помощью наконечников пипетки микрозагрузчика. Делайте это медленно, чтобы убедиться, что в смеси не образуются пузырьки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если образуются пузырьки, может быть трудно поддерживать последовательные микроинъекции. - Сломайте только кончик иглы, сломав вдоль края ленты так, чтобы узкая конус все еще сохранялась. Убедитесь, что игла сломана ровно настолько, чтобы наконечник был открыт, но не настолько, чтобы конус был сломан.
ПРИМЕЧАНИЕ: Важно отметить, что если отверстие иглы слишком широкое после разрыва, пользователь увидит, что жидкость вытекает из иглы при установке на микроинжектор под давлением до применения давления впрыска. Некоторые протоколы микроинъекции советуют ломать иглы, разрезая наконечник ножницами. Этот метод не рекомендуется, так как ножницы могут привести к разрушению кончика иглы. Инъекция эмбрионов с раздробленной иглой будет очень вредной. - Прикрепите иглу к микроманипулятору
4. Инъекция эмбрионов
- Отбираем эмбрионы для микроинъекции из синцитиальной стадии: время развития, в течение которого ядра делятся без цитокинеза.
ПРИМЕЧАНИЕ: Это идеальное время во время разработки для редактирования генома с помощью микроинъекции, как было обнаружено ранее в Drosophila21. Эмбрионы H. saltator проходят синцитиальную стадию и достигают клеточной обработки примерно через 36 ч после отложения яйцеклетки10. Более высокая эффективность достигается, если для инъекций используются более молодые эмбрионы. - Выровняйте эмбрионы на куске двусторонней ленты, приклеенной к стеклянному слайду микроскопа. Убедитесь, что эмбрионы хорошо прикреплены к ленте, чтобы предотвратить движение во время инъекции. Уложите эмбрионы в вертикальной ориентации, так, чтобы боковая сторона эмбриона находилась на краю ленты (рисунок 3). Поместите слайд и выровненные эмбрионы на сцену микроскопа на специально отведенном рабочем месте для микроинъекции.
ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется, чтобы эмбрионы были расположены таким образом, чтобы последовательные инъекции можно было выполнять, перемещая слайд на сцене вместо корректировки положения иглы с каждой инъекцией. Это позволяет выполнять последовательные инъекции более эффективно. - Выровняйте иглу с первым эмбрионом, который будет введен с помощью микроманипулятора (рисунок 4а).
- Латерально проколоть иглу в первый эмбрион вдоль его дорсальной/вентральной оси под микроскопом.
- Вводят микроинъекционную смесь. Следите за незначительным движением эмбриона, свидетельствующим о повышении внутреннего давления из-за введенной жидкости. Кроме того, следите за образованием небольшой капли, содержащей видимые следы ткани и/или липидов на внешней мембране эмбриона (рисунок 4b).
ПРИМЕЧАНИЕ: Наличие следа ткани и/или липида в капле указывает на то, что игла успешно проколола как хорион, так и вителлиновую мембрану эмбриона. Если следов этих материалов нет, инъекция не была выполнена успешно и должна быть повторена. Через несколько секунд капля будет реабсорбирована эмбрионом и больше не будет видна. - Осторожно немедленно извлеките иглу из эмбриона и приступайте к следующему, регулируя положение предметной области микроскопа. Повторяйте до тех пор, пока не будут введены все эмбрионы.
- После того, как все эмбрионы на слайде были успешно введены, перенесите слайд во влажную коробку на 1 час, чтобы дать эмбрионам время для восстановления после процесса инъекции до удаления с слайда.
5. Выращивание введенных эмбрионов
- После 1 часа инкубации во влажной коробке аккуратно извлеките введенные эмбрионы из ленты с помощью легких щипцов и перенесите их в трубку, заполненную небольшим количеством 70% этанола. Переверните трубку несколько раз, чтобы перенести эмбрионы на дно трубки. Повторите промывку этанолом один раз, а затем три промывки автоклавной водой.
- Используя небольшую и мягкую кисть, перенесите все введенные эмбрионы на 1% агаровые пластины с 2% антибиотиками-антимикотами. Нанесите антибиотик-антимикот после того, как налитые агаровы пластины остынут, распределив по поверхности пластины с помощью клеточного распределителя. Запечатайте агаровую пластину парапленкой, чтобы предотвратить высыхание агара.
ПРИМЕЧАНИЕ: Не пытайтесь вернуть введенные эмбрионы в колонию после инъекций, так как рабочие могут уничтожить большинство введенных эмбрионов. Таким образом, выживаемость оптимизируется, позволяя эмбрионам развиваться на агаровых пластинах за пределами нормальной среды колонии. - Инкубируйте агаровые пластины при 25 °C в течение примерно 4 недель. Регулярно проверяйте наличие штриховки.
- Как только первый эмбрион вылупится в личинку, верните все эмбрионы и личинки в гнездовой ящик с несколькими молодыми работниками-медсестрами для ухода за детенышами. Кормите с помощью сверчков, предварительно ужаленных более крупной колонией дикого типа, удаляйте отходы и добавляйте воду в соответствии с тем же протоколом, обсуждаемым в разделе 1.
ПРИМЕЧАНИЕ: Небольшие коробочки (9,5 х 9,5см2) идеально подходят для таких колоний. H. saltator хорошо размножается в неволе. Поэтому мутантные эмбрионы могут быть выращены до зрелого возраста. Изоляция мутантных взрослых (взрослых) вызывает переход в репродуктивную стадию геймергейта. Контролируемые скрещивания используются для создания мутантных колоний с гетерозиготными или гомозиготными особями (рисунок 5).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Используя протокол, представленный здесь, редактирование генома эмбрионов Harpegnathos saltator было успешно выполнено. Эти результаты были подтверждены с помощью полимеразной цепной реакции и pGEM-клонирования ДНК, извлеченной из введенных эмбрионов с последующим секвенированием ДНК. Эффективность соматического мутагенеза с использованием этого протокола достигала примерно 40%. Самцы-мутанты F1 были соединены с самками дикого типа, чтобы произвести гетерозиготных самок F2, которые, если не спаривались, производили самцов F3. Самцы мутантов F3 были соединены с гетерозиготными самками, чтобы произвести F4 гомозиготных самок-мутантов. Отсутствие целевого пептида было дополнительно подтверждено с помощью масс-спектрометрии этих F4 гомозиготных особей женского пола. Крылья были обрезаны у самцов с помощью микродиссекционных ножниц и использованы для целей генотипирования. Поскольку у рабочих нет крыльев, их обычно приносят в жертву и генотипируют после экспериментов. В результате успешного мутагенеза наблюдалось необычное поведение, которое коррелировало с потерей гена-мишени. Потеря орко приводила к аномальному поведению, связанному с потерей феромонного восприятия, неспособностью обнаруживать добычу, нарушением плодовитости и блужданием из колонии. Кроме того, муравьи-мутанты orco демонстрировали уменьшенное количество нейронов рецепторов одоранта и клубочков антеннальной доли, предполагая, что нейроанатомия у муравьев зависит от функциональности рецептора одоранта10.
Рисунок 1: Гнезда соляного завода Harpegnathos. (A) Внешние особенности гнездового ящика размером 19 x 13,5см2, содержащего колонию H. saltator. (B) Внутренние особенности гнездового ящика размером 19 x 13,5см2, содержащего колонию H. saltator. Обратите внимание на наличие нижней области гнезда под квадратным куском стекла. (C) Внешние особенности гнездового ящика размером 9,5 х 9,5см2, содержащего небольшую колонию H. saltator. Такой гнездовой ящик также подходит для изолированных рабочих и колоний мутантов. (D) Внутренние особенности гнездового ящика размером 9,5 х 9,5см2, содержащего небольшую колонию H. saltator. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Игла для микроинъекции эмбриона harpegnathos saltator. Обратите внимание на тонкий конус иглы (отмечен стрелкой). Иглу можно открыть, слегка сломав наконечник. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Выравнивание эмбрионов по двусторонней ленте. Эмбрионы следует выровнять так, чтобы их длина была параллельна длинному краю ленты. Это позволяет легко выполнять последовательные инъекции, перемещая слайд по сцене. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Эмбрион и игла, как видно во время микроинъекции. (А) Правильное выравнивание иглы с эмбрионом перед инъекцией. Игла покоится перпендикулярно средней точке бока эмбриона, типичному месту инъекции. (B) Эмбрион и игла после успешной инъекции. Маленькая капля выступает со стороны эмбриона (отмечена стрелкой). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Диаграмма основных мутантных скрещиваний. CRISPR может вызывать мутации в гене-мишени у женщин F0, которые впоследствии выделяются во взрослом возрасте, чтобы вызвать переход геймергейта. Если мутации происходят в клетках зародышевой линии, неспаренные гамергаты могут откладывать мутантные мужские яйца. Взрослые самцы-мутанты F1 могут быть соединены с самками дикого типа для получения гетерозиготного потомства, или они могут быть соединены с гетерозиготными самками для получения гомозиготного или гетерозиготного потомства. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Эволюция эусоциальности среди насекомых, включая муравьев, пчел, ос и термитов, привела к появлению новых поведенческих и морфологических признаков, многие из которых, как считается, находятся под влиянием комбинации экологических и генетических факторов 1,2,3,4. К сожалению, привлекательности и полезности эусоциальных насекомых в качестве исследовательских моделей в области генетики препятствовали трудности, связанные с мутагенезом в этой группе. Это препятствие возникает из-за репродуктивного разделения труда, ключевой черты эусоциальных насекомых, в которой могут размножаться только несколько членов колонии. Эта черта накладывает ограничения на количество мутантного потомства и делает развитие генетических линий сложным5. Вид понериновых муравьев, Harpegnathos saltator, обеспечивает решение этой дилеммы, так как все самки способны стать репродуктивными гамергатами при выделении5. Здесь мы предлагаем методы мутагенеза в H. saltator с использованием системы CRISPR/Cas9, доставляемой с помощью микроинъекции эмбриона.
Правильное поддержание колонии и отбор эмбрионов на соответствующей стадии развития для микроинъекции имеют решающее значение. Предыдущая работа установила, что синцитиальная стадия в развитии насекомых является идеальной стадией для редактирования генома21, но сроки этой стадии эмбрионального развития H. saltator ранее были неизвестны. С помощью ядерного окрашивания ранних эмбриональных срезов мы смогли определить, что синцитиальная стадия у эмбрионов H. saltator длится до 36 часов после отложения яйцеклеток, что позволяет нам определить, когда отбирать новые эмбрионы для микроинъекции10.
Выбор параметров для вытягивания иглы и для микроинъекции может быть сложной задачей. Факторы, которые следует учитывать при выборе параметров для вытягивания иглы, включают (1) тип используемого стекла, (2) желаемое назначение иглы, (3) желаемый размер наконечника, (4) величину сопротивления, которое игла будет испытывать во время инъекции, (5) желаемую длину конуса и (6) тип клетки или организма, который будет введен. Рекомендации и рекомендации по вытягиванию различных типов игл можно найти в различных руководствах по эксплуатации17. Аналогичным образом, существуют факторы, которые следует учитывать при выборе параметров для микроинъекции, включая (1) размер используемой иглы и (2) эмбрионы, подлежащие инъекции22. Хотя этот протокол фокусируется на микроинъекции у эмбрионов H. saltator , методы могут варьироваться у других насекомых с модификацией этих параметров. В частности, параметры для вытягивания иглы и инъекции будут отличаться, если рассматриваемый эмбрион мягкий или дехорионированный. Эмбрионы H. saltator имеют жесткий хорион, и результаты инъекций наилучши при использовании иглы с коротким конусом (примерно 2 мм). Эмбрионам, которые имеют менее твердый хорион, можно вводить иглы с более длинными конусами (примерно 10 мм).
В H. saltator введенные эмбрионы не могут быть немедленно возвращены в колонию, так как это может привести к их уничтожению работниками по уходу. Если применять этот протокол к другим видам общественных насекомых, это может быть не так. Определение наилучших методов выращивания после микроинъекции у других видов может потребовать некоторых проб и ошибок. В случае H. saltator эмбрионы необходимо выращивать на агаровых пластинах до вылупления. После вылупления они могут быть безопасно возвращены в небольшую колонию с несколькими рабочими для ухода за введенным расплодом10. Аналогичный метод ухода за эмбрионами используется у огненных муравьев (Solenopsis invicta) и клональных рейдерных муравьев (Ooceraea biroi) для увеличения выживаемости введенных эмбрионов 9,15. После взрослой эклозии зрелые самки-мутанты могут содержаться индивидуально или в небольших колониях, чтобы начать свой репродуктивный цикл. Указания по уходу за мутантами H. saltator предусмотрены в этом протоколе, но при использовании другого вида, направления по уходу за введенными эмбрионами и мутантными взрослыми особями должны быть изменены в соответствии с потребностями вида.
Протокол, представленный здесь, оптимизирован для мутагенеза, в котором нацелены специфически несущественные гены. В этом случае ген орко был нацелен, и мутации в орко не влияли на выживание муравьев до зрелого возраста. Аналогичным образом, этот протокол может быть использован для нацеливания на другие несущественные гены, включая те, которые связаны с другими сенсорными рецепторами. Если ген-мишень необходим, трансгенные муравьи должны быть сгенерированы либо с помощью CRISPR, либо с помощью транспозона. Транспозон-опосредованный трансгенез был использован у медоносных пчел13 и может применяться к муравьям. Если желаемым результатом являются трансгенные организмы, вводимые материалы должны быть другими. Тем не менее, процессы после инъекции будут аналогичными, и поэтому некоторые аспекты этого протокола будут полезны, несмотря на разницу в желаемом результате.
В целом, H. saltator идеально подходит для использования в качестве модельного организма и для выполнения генетических скрещиваний благодаря своей пластичной репродуктивной системе, в которой рабочие начинают размножаться после выделения10. Это отличает этот вид муравьев от других муравьев, в которых была установлена технология CRISPR / Cas9, например, O. biroi, вида, у которого все самки размножаются клонально. H. saltator представляет уникальные исследовательские возможности среди организмов такого рода, поскольку генетические линии могут быть установлены, а мутации могут поддерживаться на протяжении поколений у этого вида. Новизна этой системы позволяет исследователям не только генерировать муравьев-мутантов, но и разрабатывать трансгенные линии в будущем. Это дает возможности для новых исследований по изучению генетического контроля продвинутой эусоциальности.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Авторы благодарят лаборатории Дэнни Рейнберга и Клода Деплана в Нью-Йоркском университете и лабораторию Юргена Либиха в Университете штата Аризона за их поддержку генетики муравьев. Хуа Янь признает поддержку со стороны Национального научного фонда I/UCRC, Центра технологий управления членистоногими в рамках гранта No IIP-1821914 и отраслевых партнеров. Майя Саар была поддержана Соединенными Штатами - Израильским двусторонним фондом сельскохозяйственных исследований и разработок, Vaadia-BARD Postdoctoral Fellowship No. FI-595-19.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | ThermoFisher | 15240-062 | |
| Cas9 protein with NLS, high concentration | PNA Bio | CP02 | |
| Cellophane Roll 20 inch X 5 feet | Hypogloss Products | B00254CNJA | The product has many color variations. Purchase it in red for use in making ant nests. |
| Eclipse Ci-S upright microscope | Nikon | Ci-S | |
| Featherweight forceps, narrow tip | BioQuip | 4748 | |
| FemtoJet ll microinjector | Eppendorf | 920010504 | This product is no longer sold or supported by Eppendorf. A comparable microinjector may be used instead. |
| Microloader pipette tips | Eppendorf | 930001007 | |
| NCBI database | National Center for Biotechnology Information | Gene ID: 105183395 | |
| P-2000 Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-2000/G | |
| Plastic boxes (19 X 13.5 cm2) | Pioneer Plastics | 079C | |
| Plastic boxes (27 X 19 cm2) | Pioneer Plastics | 195C | |
| Plastic boxes (9.5 X 9.5 cm2) | Pioneer Plastics | 028C | |
| Quartz glass without filament | Sutter Instruments | Q100-50-7.5 | |
| Vannas scissors, 8.5 cm | World Precision Instruments | 500086 | |
| Winsor & Newton Cotman Water Colour Series 111 Short Handle Synthetic Brush - Round #000 | Winsor and Newton | 5301030 |
References
- Evans, J. D., Wheeler, D. E. Expression profiles during honeybee caste determination. Genome Biology. 2 (1), 1-6 (2000).
- Keller, L. Adaptation and the genetics of social behaviour. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 364 (1533), 3209-3216 (2009).
- Cahan, S. H., et al. Extreme genetic differences between queens and workers in hybridizing Pogonomyrmex harvester ants. Proceedings. Biological Sciences. 269 (1503), 1871-1877 (2002).
- Volny, V. P., Gordon, D. M. Genetic basis for queen-worker dimorphism in a social insect. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (9), 6108-6111 (2002).
- Yan, H., et al. Eusocial insects as emerging models for behavioural epigenetics. Nature Reviews Genetics. 15 (10), 677-688 (2014).
- Liebig, J., Hölldobler, B., Peeters, C. Are ant workers capable of colony foundation. Naturwissenschaften. 85 (3), 133-135 (1998).
- Bonasio, R. Emerging topics in epigenetics: ants, brains, and noncoding RNAs. Annals of the New York Academy of Sciences. 1260 (1), 14-23 (2012).
- Peeters, C., Liebig, J., Hölldobler, B. Sexual reproduction by both queens and workers in the ponerine ant Harpegnathos saltator. Insectes Sociaux. 47 (4), 325-332 (2000).
- Trible, W., et al. orco mutagenesis causes loss of antennal lobe glomeruli and impaired social behavior in ants. Cell. 170 (4), 727-735 (2017).
- Yan, H., et al. An engineered orco mutation produces aberrant social behavior and defective neural development in ants. Cell. 170 (4), 736-747 (2017).
- Kohno, H., Suenami, S., Takeuchi, H., Sasaki, T., Kubo, T. Production of knockout mutants by CRISPR/Cas9 in the European honeybee, Apis mellifera L. Zoological Science. 33 (5), 505-512 (2016).
- Kohno, H., Kubo, T. mKast is dispensable for normal development and sexual maturation of the male European honeybee. Scientific Reports. 8 (1), 1-10 (2018).
- Schulte, C., Theilenberg, E., Müller-Borg, M., Gempe, T., Beye, M. Highly efficient integration and expression of piggyBac-derived cassettes in the honeybee (Apis mellifera). Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (24), 9003-9008 (2014).
- Hu, X. F., Zhang, B., Liao, C. H., Zeng, Z. J. High-efficiency CRISPR/Cas9-mediated gene editing in honeybee (Apis mellifera) embryos. G3: Genes, Genomes, Genetics. 9 (5), 1759-1766 (2019).
- Chiu, Y. K., Hsu, J. C., Chang, T., Huang, Y. C., Wang, J. Mutagenesis mediated by CRISPR/Cas9 in the red imported fire ant, Solenopsis invicta. Insectes Sociaux. 67 (2), 317-326 (2020).
- Zhou, X., et al. Phylogenetic and transcriptomic analysis of chemosensory receptors in a pair of divergent ant species reveals sex-specific signatures of odor coding. PLoS Genetics. 8 (8), 1002930 (2012).
- Sutter, P-2000 Laser Based Micropipette Puller System Operation Manual. 2.2 edn. Sutter Instrument Company. , (2012).
- Perry, M., et al. Expanded color vision in butterflies: molecular logic behind three way stochastic choices. Nature. 535 (7611), 280-284 (2016).
- Bonasio, R., et al. Genomic comparison of the ants Camponotus floridanus and Harpegnathos saltator. Science. 329 (5995), 1068-1071 (2010).
- Shields, E. J., Sheng, L., Weiner, A. K., Garcia, B. A., Bonasio, R. High-quality genome assemblies reveal long non-coding RNAs expressed in ant brains. Cell Reports. 23 (10), 3078-3090 (2018).
- Henderson, D. S. Drosophila Cytogenetics Protocols. , Humana Press. (2004).
- Kern, R., Stobrawa, S. Step-by-Step Guide: Microinjection of Adherent Cells with the Eppendorf Injectman® 4 and Femtojet® 4. , (2019).
