Summary
Hier beschreiben wir einen Bioassay unter Verwendung von 3-(4′,5′-Dimethylthiazol-2′-yl)-2,5- diphenyltetrazoliumbromid (MTT), um zuvor synthetisierte spirocyclische Oxime zu testen.
Abstract
Spirozyklische Heterocyclen wurden kürzlich in der Literatur als potenzielle Medikamente für die Krebstherapie beschrieben. Die Synthese dieser neuartigen orthogonalen Ringsysteme ist eine Herausforderung. Eine effiziente Methodik zur Synthese dieser Verbindungen wurde kürzlich veröffentlicht, die die Festphasensynthese in vier Schritten anstelle der zuvor berichteten fünf Schritte beschreibt. Der Vorteil dieser kürzeren Synthese ist der Wegfall der Verwendung toxischer Reagenzien. Es erwies sich heraus, dass REM-Linkerharz (Low Loading) Regenerating Michael (REM) entscheidend für die Synthese war, da hochladende Versionen die Zugabe von Reagenzien mit sperrigem Phenyl und aromatischen Seitenketten verhinderten. Der kolorimetrische 3-(4′,5′-Dimethylthiazol-2′-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT)-Assay wurde verwendet, um die Zytotoxizität der mikromolaren Konzentrationen dieser neuartigen spirocyclischen Moleküle in vitro zu untersuchen. MTT ist kommerziell leicht erhältlich und liefert relativ schnelle, zuverlässige Ergebnisse, was diesen Assay ideal für diese spirocyclischen Heterocyclen macht. Orthogonale Ringstrukturen sowie Furfurylamin (eine Vorstufe der Synthesemethode, die ein ähnliches 5-gliedriges Ringmotiv enthält) wurden getestet.
Introduction
Es ist bekannt, dass die kleinmolekulare Hemmung der Interaktion von E3-Ubiquitin-Ligase-Maus-Doppelminuten-2-Homolog (MDM2) mit p53 die p53-vermittelte Induktion der Tumorzellapoptose 1,2,3 wiederherstellt. MDM2 ist ein negativer Regulator des p53-Signalwegs und wird in Krebszellenoft überexprimiert 4,5,6,7,8,9. Neuere kristallographische und biochemische Studien haben gezeigt, dass kleine Moleküle, die ein spirozyklisches Gerüst enthalten, MDM2-p53-Wechselwirkungen wirksam hemmen können10. Das spirozyklische Gerüst (Abbildung 1, blau schattiert) gilt als privilegiertes Motiv, da die Derivatisierung dieses starren orthogonalen Ringsystems zur Entdeckung neuartiger therapeutischer Medikamente geführt hat. Der Zugang zu dieser interessanten Architektur stellt eine Herausforderung dar, wenn traditionelle organische Synthesetechniken verwendet werden. Obwohl die therapeutischen Wirkungen spirozyklischer Moleküle in biologischen Systemen untersucht wurden, ist die Synthese dieser Moleküle immer noch ein umständlicher Prozess. Unerwünschte Nebenprodukte, raue Bedingungen und gefährliche Übergangsmetalle sind oft problematisch.
Die mögliche Verwendung des spirozyklischen Motivs in der Arzneimittelentwicklung führte zur Entwicklung eines Protokolls, das die Festphasensynthese verwendet, um eine Bibliothek von Molekülen mit dem Motiv zusätzlich zu anderen austauschbaren funktionellen Gruppen11,12 zu erzeugen. Die Trennung von Produkten und Reaktanten zwischen den Schritten könnte durch die einfache Verwendung eines REM-Linkers erreicht werden, der an einer Harzperle und einem Festphasenfilterbehälter befestigt ist. Dies würde die Stufen reduzieren und möglicherweise die Erträge erhöhen. Dieser synthetische Ansatz könnte eine Vielzahl potenzieller Arzneimittelkandidaten hervorbringen. Die Wirksamkeit dieser Moleküle in einem biologischen System würde jedoch weitere Untersuchungen erfordern.
Um die Zytotoxizität dieser spirocyclischen Verbindungen zu bestimmen, wurde der MTT-Assay13,14 verwendet. Diese Methode misst die Zelllebensfähigkeit und kann zur indirekten Bestimmung der Zellzytotoxizität verwendet werden. Verschiedene Konzentrationen der Inhibitoren wurden kultivierten Zellen in einer 96-Well-Platte zugesetzt, und der Anteil lebender Zellen wurde durch kolorimetrische Analyse des Ausmaßes der Reduktion von gelbem MTT durch mitochondriale Dehydrogenasen zur violetten Formazanverbindung gemessen (Abbildung 2). Die Aktivität wird am häufigsten als IC 50-Wert angegeben - die Konzentration, bei der das Zellwachstum im Vergleich zu einer unbehandelten Kontrolle um50% gehemmt wird. Dieser Artikel beschreibt das Protokoll für den MTT-Test und die vorläufigen Ergebnisse dieser neuartigen spirocyclischen Moleküle.
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Protocol
HINWEIS: Mehrere Chemikalien und biologische Reagenzien, die in diesem Protokoll verwendet werden, sind giftig und krebserregend. Konsultieren Sie vor der Verwendung die relevanten Sicherheitsdatenblätter (MSDS). Verwenden Sie vor Beginn des Experiments geeignete persönliche Schutzausrüstung (von der Occupational Safety and Health Administration zugelassene Schutzbrille, geeignete Handschuhe, Laborkittel, durchgehende Hosen und geschlossene Schuhe). Darüber hinaus sollten Sie bei der Synthese und dem Umgang mit toxischen Chemikalien und Reagenzien (Abzug) geeignete Sicherheitspraktiken anwenden.
1. Festphasensynthese spirocyclischer Heterozyklen 6 und 7
ANMERKUNG: Die Synthese basiert auf der zuvor veröffentlichten Arbeit11,12. Das aktualisierte Protokoll zeigt, dass die Tetrabutylammoniumfluorid-katalysierte Ringöffnung des trizyklischen Heterozyklus nicht benötigt wurde, und somit verkürzt ihre Eliminierung das synthetische Verfahren.
- Michael fügt Furfurylamin zum REM-Linker hinzu (Dauer: 25 min Setup + 24 h Reaktionszeit).
- 1 g (1 Äquivalent [Äquiv.]) REM-Harz, 20 ml (20 Äquiv.) Dimethylformamid (DMF) und 2,4 ml Furfurylamin in ein 25 ml Festphasenreaktionsgefäß geben. Rühren Sie das Reaktionsgefäß bei Raumtemperatur für 24 h nach der Reaktionsinitiierung.
HINWEIS: Stellen Sie eine gründliche Mischung sicher, damit das Harz nicht am Boden des Behälters sitzt. - Waschen Sie das Harz mit DMF 1x, nachdem die Reaktion abgeschlossen ist. Dann 4x waschen, abwechselnd zwischen Dichlormethan (DCM) und Methanol. Trocknen Sie das Harz nach dem Waschen gründlich im Reaktionsgefäß.
- 1 g (1 Äquivalent [Äquiv.]) REM-Harz, 20 ml (20 Äquiv.) Dimethylformamid (DMF) und 2,4 ml Furfurylamin in ein 25 ml Festphasenreaktionsgefäß geben. Rühren Sie das Reaktionsgefäß bei Raumtemperatur für 24 h nach der Reaktionsinitiierung.
- Tandem-Michael-Addition/1,3-dipolare Cycloaddition durchführen (Dauer: 25 min Setup + 48 h Reaktionszeit).
- Dem Trockenharz werden 1,48 ml (5 Äquiv.) Triethylamin (TEA), 0,637 g (2 Äquiv.) Nitroolefin und 10 ml trockenes Toluol in das Reaktionsgefäß gegeben.
- Dann werden 1,085 ml (4 Äquiv.) Trimethylsilylchlorid (TMSCl) in das Reaktionsgefäß in einem gut belüfteten Abzug gegeben.
HINWEIS: Da bei dieser Reaktion HCl-Gas entsteht, verschließen Sie das Reaktionsgefäß erst, wenn das Gas unter einem Abzug freigesetzt wurde. - Verschließen Sie das Reaktionsgefäß sicher und rühren Sie es bei Raumtemperatur für 48 h.
HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass das Harz gründlich mit den Reagenzien gemischt wird. - Verwenden Sie 5 ml Methanol, um die Reaktion zu löschen.
- Entleeren Sie das Gefäß, um die Lösung zu entfernen, und waschen Sie dann 4x, abwechselnd zwischen DCM und Methanol. Trocknen Sie das Harz nach dem Waschen gründlich im Reaktionsgefäß.
- Durchführung einer N-Alkylierung des harzgebundenen Heterocyclus zur Bildung des quartären Amins (Dauer: 10 min Aufbau + 24 h Reaktionszeit).
- Zu dem trockenen Harz im Reaktionsgefäß werden 5 mL DMF und 10 Äquivalente Alkylhalogenid hinzugefügt und bei Raumtemperatur für 24 h gerührt.
HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Reagenzien gründlich mit dem Harz gemischt werden. - Waschen Sie das Harz mit DMF 1x, nachdem die Reaktion abgeschlossen ist. Verwenden Sie dann DCM und Methanol abwechselnd, um 4x zu waschen. Trocknen Sie das Harz nach dem Waschen im Reaktionsgefäß.
- Zu dem trockenen Harz im Reaktionsgefäß werden 5 mL DMF und 10 Äquivalente Alkylhalogenid hinzugefügt und bei Raumtemperatur für 24 h gerührt.
- Führen Sie β-Eliminierung des quartären Amins zur Spaltung aus dem Polymerträger durch (Dauer: 15 min Setup + 24 h Reaktionszeit).
- Zu dem trockenen Harz im Reaktionsgefäß werden 3 mL DCM und 1,49 mL (5 Äquiv.) TEA hinzugefügt, um den Heterozyklus vom Polymerträger zu trennen.
- Rühren Sie das Reaktionsgemisch für 24 Stunden, um eine gründliche Mischung des Harzes mit der Lösung zu gewährleisten. 4x waschen, abwechselnd zwischen DCM und Methanol. Sammeln Sie die Elution aus allen Waschgängen und konzentrieren Sie sich durch rotatorische Verdampfung.
- Triturate mit Methanol, um das spirocyclische Oxim zu reinigen. Trocknen Sie das Harz gründlich im Reaktionsgefäß nach dem Waschen zur Wiederverwendung in zukünftigen Experimenten.
2. Zytotoxizitätstest mit MTT 14
- Bereiten Sie 20 ml einer 5 mg/ml MTT-Lösung unter Verwendung steriler phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS, 0,9% NaCl in Wasser) als Verdünnungsmittel her. Filter und lagerung bei -20 °C. Anschließend wird eine 1:1-Verdünnung der MTT-Lösung aus Schritt 2.1 in serumfreiem Zellkulturmedium (DMEM) hergestellt.
- Bereiten Sie jeweils 1 ml Stammlösungen in 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen mit 100 mM, 10 mM, 1 mM, 100 μM, 10 μM, 1 μM, 0,1 μM und 0,01 μM Testverbindungen in Dimethylsulfoxid (DMSO) vor. Bei -20 °C lagern. 200 μl pro Dosis der Arbeitslösungen von Testverbindungen werden durch Verdünnen von Stammkonzentrationen 1:1000 in serumfreiem Medium in 1,5-ml-Röhrchen hergestellt.
- In der Gewebekulturhaube Samen von COS-7-Zellen (Afrikanische grüne Affennierenzellen, Cercopithecus aethiops Niere) in vollständigem Medium [DMEM mit 10% fetalem Rinderserum (FBS)] auf flache, gewebekulturbehandelte 96-Well-Platten in einer Konzentration von 4 × 103 Zellen/200 μL pro Vertiefung unter Verwendung eines Mehrkanalpipettors. COS-7-Zellen wurden ausgewählt, weil (1) dies häufig verwendete Zellen für Zytotoxizitätstests sind und (2) diese bereits in der Einrichtung verfügbar waren.
- COS-7-Zellen für 24 h bei 37 °C in einer Atmosphäre mit 5%CO2 inkubieren.
- Saugen Sie den Überstand aus den Vertiefungen mit einer Pasteur-Glaspipette ab, die an einer Vakuumpumpe befestigt ist. Die Zellen werden mit den Prüfsubstanzen unter Verwendung der in Schritt 2.2 hergestellten Arbeitslösungen dreifach dosiert (siehe Tabelle 1). Inkubieren Sie Zellen wie in Schritt 2.4 beschrieben.
- Asspirieren Sie den Überstand aus den Brunnen. Fügen Sie 200 μL MTT-Lösung in jede Vertiefung hinzu. Bei 37 °C in einer Atmosphäre mit 5%CO2 für 4 h inkubieren.
- Saugen Sie den Überstand vorsichtig aus den Vertiefungen ab, ohne die violetten Formazan-Kristalle zu stören. Fügen Sie 200 μL DMSO in jede Vertiefung hinzu, um die violetten Formazankristalle aufzulösen. Bei Raumtemperatur 15 min inkubieren.
- Messen Sie die Absorption bei 590 nm14 oder 600 nm für jede Vertiefung mit einem 96-Well-Plattenleser. Verwenden Sie Vertiefungen ohne Zellen als Hintergrund und mitteln Sie den Absorptionswert. Subtrahieren Sie den gemittelten Extinktionshintergrundwert vom Absorptionswert jeder behandelten Bohrung. Normalisieren Sie die Daten als Prozentsatz des durchschnittlichen Nulldosiswerts (Mittelwert der drei Nulldosiswerte). Diagrammdaten auf der y-Achse: linear (% relative Zelllebensfähigkeit); X-Achse: log (Konzentration). Zeichnen Sie jede Reihe als einzelne Kurve (z. B. sollten dreifache Daten 3 Kurven haben)
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Representative Results
Die spirozyklischen Oxime 6 und 7 wurden unter Verwendung eines modifizierten Protokolls synthetisiert (Abbildung 1). Michaels Zusatz von Furfurylamin zu einem REM-Linker 1b ergab polymergebundenes Harz 2. Der Verlauf der Reaktion wurde mittels Infrarotspektroskopie (IR) überwacht, indem das Verschwinden des α,β-ungesättigten Esters bei 1722 cm-1 nachgewiesen wurde (Abbildung 3). Spirozyklisch gebundenes Harz 4 wurde aus 2 über ein transientes Zwischenprodukt 3 gebildet. Die methanolische Hydrolyse von 4 erzeugte 3-[(3E)-(2S,4R)-2-phenyl-3-hydroxyimino-4-hydroxymethyl-pyrrolidin-1-yl]-propionsäuremethylester 7, während die Alkylierung gefolgt von β-Eliminierung (3E)-(2S,4R)-4-Hydroxymethyl-1-methyl-2-phenyl-3-pyrrolidinoxim6 ergab. Die Identität der spirocyclischen Oxime wurde durch 1H und 13C Kernspinresonanzspektroskopanalyse und die Reinheit durch Massenspektroskopie basierend auf unseren bisherigen Ergebnissenbestimmt 11.
Der MTT-Assay ist ein bekannter kolorimetrischer Assay zur Bestimmung der Zelllebensfähigkeit12. Wie in Abbildung 2 zu sehen ist, wandeln mitochondriale Reduktasen in lebenden Zellen das gelbe Tetrazolium von MTT in einen unlöslichen violetten Formazan-Feststoff um. Mit einem Spektralphotometer wird die Formazan-Formation quantifiziert, indem die Absorption bei 600 nm gemessen wird. Cisplatin, von dem bekannt ist, dass es bei hohen Konzentrationen den Zelltod induziert, wurde als Positivkontrolle verwendet (Abbildung 4). Wie erwartet, je höher die Konzentration von Cisplatin, desto geringer die Zelllebensfähigkeit. Als nächstes wurde der MTT-Assay verwendet, um die spirocyclischen Verbindungen 6 und 7 und Furfurylamin zu testen. Furfurylamin wurde verwendet, um die Wirkung des Furanrings allein im Vergleich zum spirozyklischen Gerüst zu bestimmen. Wie in Abbildung 5 dargestellt, zeigten Furfurylamin und spirozyklisches Oxim 6 eine ähnliche Zytotoxizität. Die Toxizität der spirocyclischen Verbindung 7 war jedoch deutlich größer als die von Furfurylamin und 6. Eine Bibliothek von spirozyklischen Oximen wird synthetisiert, um die Zytotoxizität sowie die anderen Antikrebswirkungen dieser Heterozyklen vollständig zu untersuchen.
Abbildung 1: Aufbau spirocyclischer Verbindungen unter Verwendung einer aktualisierten Festphasensynthese. Das orthogonale spirozykische Gerüst ist blau schattiert. Beachten Sie, dass Schritt (c) nicht erforderlich ist, wodurch die Verwendung des toxischen Reagenzes TBAF vermieden wird. Die Reaktionsbedingungen sind wie folgt: (a) Furfurylamin, DMF, (b) β-Nitrostyrol, TMSCl, TEA, Toluol, (c) TBAF, (d) Alkylhalogenid, DMF und (e) TEA, DCM. Abkürzungen: TBAF = Tetrabutylammoniumfluorid; DMF = Dimethylformamid; TMSCl = Trimethylsilylchlorid; TEA = Triethylamin; DCM = Dichlormethan; ISOC = intramolekulare Silyoxyolefin-Cycloaddition. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Mechanismus des MTT-Assays. Sichtbar gelbes Tetrazoliumsalz von MTT wird durch mitochondriale Reduktasen in lebenden COS-7-Zellen zu violettem unlöslichem Formazan reduziert. Abkürzung: MTT = 3-(4′,5′-Dimethylthiazol-2′-yl)-2,5- diphenyltetrazoliumbromid. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Überwachung des Fortschritts jedes Festphasenreaktionsschritts mittels Infrarotspektroskopie. Die Streckfrequenz bei 1717 cm-1 zeigte das Vorhandensein eines ungesättigten Esters an, 1733 cm-1 zeigte einen gesättigten Ester und das Signal um 3300-3500 cm-1 zeigte das Vorhandensein einer Hydroxylgruppe an. Detektierbare Dehnungsfrequenzen für Polystyrol werden ebenfalls gezeigt. Abkürzungen: REM = Regenerierender Michael; ISOC = intramolekulare Silyoxyolefin-Cycloaddition. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 4: Wirkungen von Cisplatin auf die Lebensfähigkeit von COS-7-Zellen in einem modifizierten MTT-Assay. Die Konzentrationen von Cisplatin reichten von 0 μM bis 60 μM. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 5: Wirkungen von Testverbindungen auf die Lebensfähigkeit von COS-7-Zellen in einem modifizierten MTT-Assay. Die Konzentrationen reichten von 0 μM bis 100 μM und wurden auf einer logarithmischen Skala dargestellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Tabelle 1: Layout der 96-Well-Platte. Alle Testdatenzeilen waren in dreifacher Ausfertigung. Als Kontrollen wurden Wells verwendet, die nur COS-7-Zellen und -Medium enthielten. Um sicherzustellen, dass DMSO nicht die Ursache für Zytotoxizität in den Cisplatin-dosierten Zellen war, wurden Wells, die nur DMSO enthielten, als Lösungsmittelkontrollen verwendet. Vertiefungen, die COS-7-Zellen enthalten, sind hervorgehoben. Abkürzungen: DMSO = Dimethylsulfoxid; PBS = phosphatgepufferte Kochsalzlösung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
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Discussion
Die Synthese der spirocyclischen Verbindungen basierte auf früheren Forschungen dieses Labors, jedoch mit einigen Modifikationen (Abbildung 1)11,12. Der Fortschritt jedes Reaktionsschrittes wurde mittels IR-Spektroskopie überwacht. Michael Zusatz des REM-Linkers 1 mit Furfurylamin ergab polymergebundenes 2 (IR 1722 cm-1 → 1731 cm-1). Aus dem vorherigen Bericht ergab ISOC von 2 die tricyclische heterocyclische Verbindung 3, wie durch den Nachweis der TMS-Gruppe (IR 1214 cm-1) bestätigt wurde. Dies ist ein kritischer Schritt der Synthese, da ISOC die notwendige Regio- und Stereoselektivität der Produkte liefert. Anstelle der Frequenz der funktionellen TMS-Gruppe wurde eine Hydroxylgruppendehnungsfrequenz von 3500 cm-1 beobachtet. Dies kann daran liegen, dass die tricyclische Verbindung ein vorübergehendes Zwischenprodukt ist, das zum spirocyclischen System führt.
Es wurde festgestellt, dass verschiedene Arten von REM-Harz die Synthese einschränken. Hochladendes Polymer (1,00 mmol/g) verhinderte die Synthese von spirocyclischen Verbindungen, die sperrigeR2-Seitenketten enthielten. Aufgrund der Ähnlichkeiten in den funktionellen Gruppen in den Harzen 4 und 5 waren die Ergebnisse der IR nicht eindeutig. Der Erfolg dieses Schrittes konnte nur durch den Versuch bestimmt werden, den REM-Linker neu zu generieren (5 → 1). Die Regeneration fand nicht in Fällen statt, in denen eine sperrigeR2-Gruppe hinzugefügt wurde. Niedrig ladende Harze (0,5 mmol/g oder weniger) werden für eine erfolgreiche Synthese empfohlen. Diese Synthesemethode steht im Einklang mit den in der Literatur beschriebenen Verfahren.
Als vorläufiger Test wurde ein Protokoll für einen Zytotoxizitätstest mit MTT entwickelt. Im Laufe mehrerer Studien wurden kritische Schritte und Einschränkungen entdeckt. Damit die Ergebnisse über alle Vertiefungen hinweg normalisiert werden konnten, mussten die Zellen gleichmäßig über die Vertiefungen verteilt werden, was die Messung der Zellkonzentration vor der Aussaat erforderlich machte. Der Assay erforderte Platten mit Vertiefungen mit flachem Boden, da die Absorption aus Bohrlöchern mit rundem Boden nicht genau abgelesen werden konnte. Zusätzlich musste überschüssiges MTT, das nach der Inkubation verblieben war, entfernt werden, um Störungen in den Messwerten zu vermeiden, ohne das unlösliche Formazan zu stören.
Die Absorption des gelösten Formazans sollte bei 590 nm abgelesen werden. Die aktuelle Instrumentierung im Labor erforderte jedoch stattdessen Messungen bei 600 nm. Die Lagerung bei 0 °C erwies sich als wichtig für die im Assay verwendeten Chemikalien (Cisplatin, spirocyclische Moleküle, Furfurylamin). DMSO - eine Chemikalie mit bekannter Zytotoxizität - wurde als Lösungsmittel für die Testverbindungen verwendet und zur Herstellung von Verdünnungen für den Assay verwendet. Das MTT-Reagenz selbst musste hergestellt werden, da es als Pulver gelagert wurde, das gelöst und gefiltert werden musste, da unlösliche Partikel die Messwerte störten.
Insgesamt sollen die Ergebnisse für diesen Assay vorläufig sein, da nur eine kleine Anzahl von Molekülen getestet wurde. Ein ausführlicher Test mit einer Batterie von Molekülen ist geplant, und ein vollständiges Manuskript wird in Kürze erscheinen. Darüber hinaus könnte die Synthese für Amine anwendbar sein, die von Pyrrol-2-carbaldehyd abgeleitet sind. In diesem Fall können spirozyklische Pyrrolidine synthetisiert und auf zytotoxische Wirkungen auf Krebszelllinien getestet werden.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts offenzulegen.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde durch ein Stipendium des Faculty Research Council an K.S.H. (Office of Research and Grants, Azusa Pacific University-USA) finanziert. A.N.G. und J.F.M. sind Empfänger des Scholarly Undergraduate Research Experience (SURE) Fellowship. S.K.M. und B.M.R. sind Empfänger der STEM Research Fellowship Grants (Center for Research in Science, Azusa Pacific University-USA). Wir danken Dr. Matthew Berezuk und Dr. Philip Cox für die Beratung zu den Bioassays.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CELLS | |||
| COS-7 cells (ATCC CRL-1651) | ATCC | CRL-1651 | African green monkey kidney cells |
| CHEMICALS | |||
| 1-Bromooctane | Sigma-Aldrich | 152951 | Alkyl-halide |
| Allylbromide | Sigma-Aldrich | 337528 | Alkyl-halide |
| Benzylbromide | Sigma-Aldrich | B17905 | Alkyl-halide |
| Cisplatin | Cayman Chemical | 13119 | Cytotoxicity control |
| Dichloromethane (DCM) | Sigma-Aldrich | 270997 | Solvent |
| Dimethylformamide (DMF) | Sigma-Aldrich | 227056 | Solvent |
| Dimethylsulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | 276855 | Solvent |
| DMEM, high glucose, with L-glutamine | Genesee Scientific | 25-500 | Cell culture media |
| FBS (Fetal bovine serum) | Sigma-Aldrich | F4135 | Cell culture media |
| Furfurylamine | Acros Organics | 119800050 | reagent |
| Iodomethane | Sigma-Aldrich | 289566 | Alkyl-halide |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 34860 | Solvent |
| MTT ((3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-Diphenyltetrazolium Bromide) | EMD Millipore | Calbiochem 475989-1GM | Reagent |
| Phosphate-buffered Saline (PBS) | Genesee Scientific | 25-507 | Cell culture media |
| REM Resin | Nova Biochem | 8551010005 | Polymer support; 0.500 mmol/g loading |
| trans-β-nitrostyrene | Sigma-Aldrich | N26806 | Nitro-olefin reagent |
| Toluene | Sigma-Aldrich | 244511 | Solvent |
| Triethylamine (TEA) | Sigma-Aldrich | T0886 | Reagent for beta-elimination |
| Trimethylsilyl chloride (TMSCl) | Sigma-Aldrich | 386529 | Reagent; CAUTION - highly volatile; creates HCl gas |
| GLASSWARE/INSTRUMENTATION | |||
| 25 mL solid-phase reaction vessel | Chemglass | CG-1861-02 | Glassware with filter |
| 96 Well plate reader | Promega (Turner Biosystems) | 9310-011 | Instrument |
| AVANCE III NMR Spectrometer | Bruker | N/A | Instrument; 300 MHz; Solvents: CDCl3 and CD3OH |
| Thermo Scientific Nicole iS5 | Thermo Scientific | IQLAADGAAGFAHDMAZA | Instrument |
| Wrist-Action Shaker | Burrell Scientific | 757950819 | Instrument |
References
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