Summary
We beschrijven een methode om primaire culturen van kegelfotoreceptoren te verkrijgen van het netvlies van kippenembryo's en het gebruik ervan voor screening met een hoog gehalte.
Abstract
Menselijk dagzicht is afhankelijk van de functie van kegelfotoreceptoren in het midden van het netvlies, de fovea. Patiënten die lijden aan de meest voorkomende vorm van erfelijke retinale degeneratie, retinitis pigmentosa, verliezen nachtzicht als gevolg van mutatie gedreven verlies van staaffotoreceptoren, een fenomeen gevolgd door een progressief verlies van functie en de dood van kegeltjes die leiden tot blindheid. Genetici hebben veel genen geïdentificeerd met mutaties die deze ziekte veroorzaken, maar de eerste geïdentificeerde mutaties zetten vraagtekens bij de mechanismen van secundaire kegeldegeneratie en hoe een dominante mutatie in het rhodopsine-gen dat codeert voor het visuele pigment dat uitsluitend in staafjes wordt uitgedrukt, kegeldegeneratie kan veroorzaken.
Dit resultaat van transplantaties in een genetisch model van de ziekte leidde tot het concept van celinteracties tussen staven en kegels en van niet-cel autonome degeneratie van kegels in alle genetische vormen van retinitis pigmentosa.
Kegels bestaan uit 5% van alle fotoreceptoren bij mensen en slechts 3% bij de muis, dus hun studie is moeilijk bij deze soorten, maar kegels overtreffen hengels in vogelsoorten. We hebben 96-put platen aangepast aan kweek retinale precursoren van het netvlies van kippenembryo's in stadium 29 van hun ontwikkeling. In deze primaire culturen vertegenwoordigen kegels 80% van de cellen na in vitro differentiatie. De cellen degenereren gedurende een periode van een week bij afwezigheid van serum. Hier beschrijven we de methoden en de standaardisatie ervan.
Dit met kegel verrijkte kweeksysteem werd gebruikt om de epitheel-afgeleide kegel levensvatbaarheidsfactor (EdCVF) te identificeren door middel van hoge inhoud screening van een rat retinaal gepigmenteerd epitheel genormaliseerde cDNA bibliotheek. Recombinant EdCVF voorkomt de degeneratie van de kegels.
Introduction
Het netvlies van gewervelde soorten is dubbel, met staaffotoreceptoren voor dimlichtzicht en kegelfotoreceptoren voor daglicht, kleur en scherptezicht. Primaten gezichtsscherpte is afhankelijk van een gebied in het midden van het netvlies, de fovea genoemd, dat is verrijkt met kegeltjes, maar over het algemeen vertegenwoordigen kegeltjes slechts 5% van alle fotoreceptoren. Bijgevolg is de analyse van de kegeltjes in het netvlies van primaten en vooral de cultuur van kegeltjes technisch moeilijk. Alle andere zoogdiersoorten hebben geen fovea en het percentage kegeltjes is laag voor knaagdieren die het meest worden gebruikt in retinaal onderzoek. Dit is niet het geval voor vogelsoorten, waarvoor kegeltjes het netvlies van deze goedziende vogelsoorten domineren. Dinosaurussen, die het ecosysteem domineerden toen de zoogdieren voor het eerst verschenen tijdens de evolutie, bevinden zich aan de fylogenetische oorsprong van vogels1. Als gevolg van dergelijke concurrentie tussen dinosaurussen en vroege zoogdieren, zijn de zoogdieren meestal nachtelijk met netvlies gedomineerd door staven. Pas later tijdens de evolutie werd de dagvisie van sommige zoogdiersoorten, waaronder primaten behoren, een evolutionair voordeel. Niettemin blijft de voorouderlijke periode een atavisme van het nachtelijke knelpunt in de evolutie van zoogdiervisie2,3.
Tijdens het bestuderen van retinale celdifferentiatie toonden Adler en Hatlee aan dat fotoreceptoren ongeveer 70% van de retinale gedifferentieerde cellen vertegenwoordigen in culturen die zijn afgeleid van kip op de embryonale dag (ED) 6 of stadium 294. Vanwege de prevalentie van kegeltjes in het netvlies van de kip, zijn culturen van netvliescellen van ED6-kippenembryo's ontwikkeld als kegelverrijkte culturen5.
Het belang van kegelgemedieerde gezichtsscherpte voor de mens is een truïsme. Mensen die getroffen zijn door genetische of verouderingsziekten die de kegelfunctie veranderen, zijn sterk gehandicapt. Dit heeft een zeer grote reeks studies naar erfelijke netvliesdegeneraties (IRD) bevorderd met als doel behandelingen voor deze verblindende ziekten te vinden6,7. Het eerste succes, verkregen met behulp van een recombinante adeno-geassocieerde vector (AAV) voor de therapie van een ernstige vorm van IRD Leber congenitale amaurosis (LCA), is een proof of concept voor gentherapie8. De identificatie van de genen waarvan de mutaties IRD veroorzaken, opent de mogelijkheid om deze ziekten te genezen met behulp van gentherapie. Niettemin zijn deze ziekten het gevolg van mutaties in meer dan 200 verschillende genen9. Zelfs in het geval van autosomaal recessieve vormen van IRD, wanneer de herintroductie van de normale kopie van het morbide gen de visuele functie zou kunnen herstellen, begunstigen de economische kosten van elke individuele ontwikkeling de meest voorkomende ten nadele van de minder voorkomende en ten nadele van degenen waarvoor de genetische oorsprong onbekend blijft. Dit feit bracht onderzoekers aan het denken over meer algemene therapieën. Apoptotische celdood verscheen als een gemeenschappelijk pad, en een therapeutisch doelwit van deze ziekten die vorderen door de degeneratie van fotoreceptoren, waaronder voor autosomaal dominante vormen10,11. De successen van een dergelijke aanpak ontbreken echter. Voor de meest voorkomende vorm van IRD, retinitis pigmentosa (RP), is de gemeenschappelijke route het secundaire functieverlies dat uiteindelijk wordt gevolgd door de degeneratie van kegels12,13. Het voorkomen van het verlies van kegelfunctie zal het centrale zicht van de fovea onafhankelijk van de oorzakelijke mutaties behouden14.
In het vroege stadium van RP veroorzaakt het verlies van staven een vermindering van de expressie van staaf-afgeleide kegel levensvatbaarheidsfactor (RdCVF), gecodeerd door het nucleoredoxine-achtige 1 (NXNL1) gen, dat de metabolische en redox signalering tussen staven en kegelsonderbreekt 15. De toediening van een recombinant AAV die codeert voor de twee producten van het NXNL1-gen, de trofische factor RdCVF en het thioredoxine-enzym RdCVFL, zou theoretisch kegelzichtverlies in alle genetische vormen van RP16kunnen voorkomen . We hebben aangetoond dat het NXNL1-genproduct, RdCVFL, wordt uitgedrukt in met kippenkegel verrijkte culturen17 en waar het een beschermende rol speelt18. RdCVF en het NXNL1-gen werden geïdentificeerd door een hoog gehalte screening van een retinale cDNA-bibliotheek met behulp van de overleving van cellen uit een met kegels verrijkte cultuur als uitlezing19. We hebben het equivalent van 210.000 individuele klonen van de bibliotheek gescreend met behulp van 8 parallelle tests voor elke kloon. Dit vertegenwoordigt een zeer groot aantal tests die gemakkelijke toegang tot het biologische materiaal vereisen, het netvlies van kippenembryo's. We ontdekten dat het relatief eenvoudig was om wekelijks embryonale kippeneieren te verkrijgen, omdat ze op grote schaal worden geproduceerd voor de agro-industrie voor legkippen en vleesproducerende kippen. Na zorgvuldige standaardisatie van de met kegels verrijkte culturen biedt het systeem een eenvoudige, robuuste en reproduceerbare manier om duizenden moleculen te testen op hun vermogen om de levensvatbaarheid van de kegel te behouden. Deze cellen zijn ook vatbaar voor genetische manipulaties20 die baat hebben bij de studie van signaaltransductie en voor biochemische analyses21,22,23.
Retinale onderzoekers hebben alternatieve methoden ontwikkeld als het gebruik van de kegelcellijn 661W24,25,26. Niettemin blijft de identiteit van deze cellijn controversieel27,28. De 661W cellen werden gekloond uit retinale tumoren van een transgene muislijn die het SV40 grote T-antigeen uitdrukt onder controle van de menselijke interfotoreceptor retinol-bindende eiwitpromotor. SV40 groot T-antigeen bemiddelt cellulaire transformatie en onsterfelijkheid. Als gevolg hiervan moet de signaleringsroute die is geïdentificeerd met behulp van 661W-cellen worden gerapporteerd in de context van een getransformeerde en vereeuwigde cellijn die in veel opzichten verschilt van kegels in situ. In dat opzicht bestaat het met kegel verrijkte kweeksysteem uit primaire neuronen, de kegels die fysiologisch relevanter zijn.
Hoewel het mogelijk is om een zuivere cultuur van fotoreceptoren te verkrijgen met behulp van vibratoomsecties van het netvlies van de muis, maakt het zeer lage percentage kegeltjes in het buitenste netvlies van knaagdieren deze aanpak ongeschikt voor het produceren van kegelverrijkte culturen29. Het varkensvlies bevat geen fovea, maar heeft een gebied genaamd area centralis dat zeer verrijkt is met kegeltjes30. Het hoge percentage kegeltjes in het netvlies van knaagdieren, zoals Arvicanthis ansorgei en Psammomys obsesus31,32, biedt een mogelijke oplossing, maar vereist het fokken van dergelijke exotische soorten. Volwassen varkensogen, verzameld bij lokale slachthuizen, kunnen worden gebruikt om een gemengde cultuur van staven en kegels te produceren die zijn gebruikt om de overleving van fotoreceptor tebestuderen 33. Een elegante oplossing is om kegeltjes van het netvlies van het varken voor te zuiveren met behulp van panning met pinda agglutinine (PNA) lectine, die selectief bindt aan kegeltjes34. Toch is deze methode moeilijk op grote schaal te implementeren vanwege de complexiteit ervan.
Door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPS) biedt de meest veelbelovende aanpak om een kegelfotoreceptorcelpopulatie te verkrijgen die kan worden gebruikt voor retinaletransplantatie,maar die ook kan worden aangepast aan kegelverrijkte cultuur35,36. Aangezien de transcriptiefactor NRL vereist is voor staaf-fotoreceptoren37, heeft de Nrl-/- muis een netvlies dat wordt gedomineerd door korte golfkegels (S-kegeltjes). De inactivatie zou kunnen worden gebruikt om met S-kegel verrijkt preparaat te produceren door differentiatie van de mens van iPS38,39. Een andere mogelijke aanpak is het bevorderen van kegeldifferentiatie met behulp van schildklierhormoonsignalering40. Terwijl nieuwe methoden voor het produceren van kegelverrijkte culturen uit menselijke iPS in opkomst zijn, bieden kippenembryo's een huidige bewezen methode19.
De kegel-verrijkte cultuur was instrumenteel in de identificatie van RdCVF door uitdrukking het klonen19. Dit systeem werd ook met succes gebruikt om aan te tonen dat RdCVF de glucoseopname en het metabolisme ervan stimuleert door aerobe glycolyse22. Verder werd kegelverrijkte cultuur gebruikt om de beschermende rol van RdCVFL, het tweede product van het NXNL1-gen 23, te valideren. Meer recent werd dit systeem gebruikt om het bestaan aan te tonen van het beschermen van moleculen die worden afgescheiden door retinale gepigmenteerde epitheelcellen die worden getransduceerd met OTX241.
Protocol
Het protocol werd goedgekeurd door de Commissie ethiek van dierproeven van de Universiteit Pierre en Marie Curie en het Franse ministerie van onderzoek (Vergunningsnummer: APAFIS#1028 2015070211275177). De dierproeven werden uitgevoerd onder de volgende vergunning: "Certificat d'autorisation d'expérimenter sur les animaux vertébrés A-75-1863. Préfecture de Police de Paris (9 november 2011-8 november 2016)".
1. Incubatie van bevruchte eieren
- Verzamel wekelijks bevruchte eieren (stam I 657, rood etiket), natuurlijk verkregen in een industriële broederij.
- Houd de bevruchte eieren op 17 °C (hun biologische nul) in het laboratorium nadat ze door de kip zijn "gelegd".
- Voor elke cultuur, incubeer zeven bevruchte eieren gedurende 24 uur bij 20 °C en vervolgens 136 uur bij 37 °C met intermitterende reversie van de helling (een progressieve beweging gedurende 2 uur van de ene kant naar de andere kant, een cyclus van 4 uur) van de eieren in een bevochtigde kamer.
2. Herstel van de kippenembryo's
- Was het oppervlak van de zeven eieren met ontsmettingsmiddel (bijv. Pursept A express).
- Om de eierschaal te breken, maak je een gat in de bovenkant van de schaal met een grote rechte tang. Snijd vervolgens de schaal om de hoed van het ei te verwijderen als een zachtgekookt ei.
- Haal elk embryo voorzichtig uit de eierschaal met gebogen tang en breng het vervolgens over naar een petrischaal met steriele fosfaatbufferzoutlijn (PBS) die eerder tot 37 °C is verwarmd. Verwijder voorzichtig de envelop die de embryo's omringt (het koraal of chorioallantoïsch membraan).
- Verifieer het ontwikkelingsstadium van elk embryo door visuele vergelijking met Hamburger en Hamilton42.
- Selecteer twee embryo's in de 29e ontwikkelingsfase (figuur 1). De vleugels buigen bij de ellebogen. De kraag valt zichtbaar op. De rekening is prominenter dan in de 28ste fase.
- Enucleate de ogen van deze geselecteerde embryo's en breng ze over in CO2-onafhankelijkmedium (Life-technologieën).
LET OP: Het is erg belangrijk dat het embryo zich in stadium 29 bevindt en niet in stadium 28 of 30 (figuur 1); daarom is het noodzakelijk om ten minste 7 eieren te incuberen, zelfs als er uiteindelijk slechts twee zullen worden gebruikt. Het koraal is erg dun, zo moeilijk te onderscheiden, maar het is heel dicht bij het embryo, dus het moet worden verwijderd zonder het embryo aan te raken.
3. Dissectie van het netvlies
- Onthoofd en enucleeer de geselecteerde embryo's met gebogen tang.
- Breng de vier ogen over in CO2-onafhankelijkmedium. Dit medium bevat 0,9 mM CaCl2 en 0,65 mM MgCl2.
- Plaats het oog met het hoornvlies naar beneden, de oogzenuw naar de experimenteerder. Boor een gat in de oogzenuw met twee rechte tangen.
- Plaats een tak van elke tang tussen het netvlies en het pigmentepitheel (figuur 2). Trek aan elke tang en draai het oog om het epitheel los te maken van het netvlies. Verwijder het hoornvlies gevolgd door de lens en het glasvocht.
- Breng de vier netvliezen over in een petrischaaltje met ringers medium bij een pH van 7,2.
LET OP: Zorg ervoor dat alleen het netvlies overblijft en verwijder eventuele sporen van glasvocht en het resterende netvlies gepigmenteerde epitheel.
4. Voorbereiding van de netvliescelsuspensie
- Snijd de vier netvliezen in zeer kleine stukjes met twee rechte tangen.
- Was de retinale stukken twee keer met Ringer's medium.
- Laat na de tweede wasbeurt met het medium van Ringer de stukjes netvlies op de onderkant van de buis vallen en verwijder het medium van de Ringer. Behandel de netvliesstukken gedurende 20 minuten bij 37 °C met een oplossing van trypsine (0,25% w/v).
- Verspreid de oplossing na 10 minuten door opeenvolgende zuigkracht. Ontlaad met een Pasteur pipet en controleer op dissociatie van de netvliesstukken. Stop de reactie door kweekmedia toe te voegen aangevuld met 10% inactief foetale kalfsserum.
- Incubeer de celsuspensie met 0,05 mg DNase I. Dissocieert de celclusters en het DNA door opeenvolgende zuiging en ontlading met behulp van een Pasteur pipet onmiddellijk na toevoeging van de DNase.
- Was de netvliescelsuspensie tweemaal met chemisch gedefinieerd kweekmedium (CDCM): een gelijk volume dulbecco's Modified Eagle Medium en M199-media aangevuld met 100 μg/ml linolzuur/BSA, 0,86 μM insuline, 0,07 μM transferrine, 2,0 μM progesteron, 0,28 μM prostaglandine,0,29μMNa 2 SeO 3 , 182 μM putrescine, 3 mM taurine, 4,7 μM cytidine 5′-difosfosfoline, 2,7 μM cytidine 5′-diphosphoethanolamine, 0,55 μM hydrocortison, 0,55 μM hydrocortison, 0,55 μM hydrocortison
5. Retinale cel zaaien
- Behandel twee zwarte 96-put kweekplaten met transparante bodem gedurende 2 uur bij 37 °C met poly-L-lysine bij 32,25 μg/cm2.
- Spoel deze platen twee keer af met M199 kweekmedium. Resuspendeer de celkorrel in 1 ml CDCM.
- Voeg aan een aliquot van 10 μL van de celsuspensie trypan blauw toe om de levende cellen te bevlekken. Voeg het celsuspensiemonster toe aan een hemocytometer (celtellingskamer van Malassez).
- Tel onder een microscoop de bevlekte cellen voor vier rijen van de hemocytometer (d.w.z. 40 vierkanten) en bereken vervolgens het gemiddelde celnummer voor één rij. Bereken de concentratie cellen van de suspensie door de volgende methode toe te passen: Aantal cellen/ml suspensie = gemiddeld aantal cellen op een rij (10 vierkanten) x 10 het totale aantal kwadraten van de hemocytometer x verdunning met trypan blauw x 1.000 (om het resultaat uit te drukken als cellen/ml).
- Breng de celsuspensie in twee concentraties (5,6 x 104 cellen/ml en 1,12 x 105 cellen/ml) die overeenkomen met de twee platingdichtheden (1 x 105 cellen/cm2 en 2 x 105 cellen/cm2)met behulp van CDCM.
- Zaad 50 μL van de twee celsuspensingen in de twee voorbehandelde zwarte 96-put kweekplaten. Verdeel de cellen in de platen met een meerkanaals pipet van rechts van de plaat naar links, homogeniserend tussen elke kolom, zodat de verdeling van de cellen homogeen is.
- Voeg 50 μL van de moleculenbibliotheek toe (bijv. de geconditioneerde media uit een cDNA-bibliotheek, zie hieronder) die moeten worden gescreend met behulp van een vooraf gedefinieerd patroon (Tabel 1).
- Incubeer de platen gedurende zeven dagen bij 37°C onder 5% CO2 zonder verandering van medium.
6. Levensvatbare cellen tellen
- Voeg aan elke put van de plaat 2,7 μM calceïne AM en 0,3 mM ethidium homodimeer toe.
OPMERKING: Calceïne dringt de cellen binnen die ondoordringbaar zijn voor grote moleculen als ethidium homodimeer. In het cytoplasma van levende cellen wordt calceïne gehydrolyseerd door endogene esterasen, wordt fluorescerend door uit te zenden bij 520 nm wanneer het wordt opgewekt bij 485 nm. Ethidium homodimeer bindt aan DNA op dode cellen. Ethidium DNA-homodimeerbinding zorgt ervoor dat rode fluorescentie wordt uitgestoten bij 635 nm na excitatie bij 520 nm. - Incubeer de platen gedurende 1 uur bij kamertemperatuur bij afwezigheid van licht.
- Lees de fluorescentie op een geautomatiseerde plaatlezer bestaande uit een omgekeerde microscoop uitgerust met een kwiklamp met twee excitatiefilters bij 485 en 520 nm, twee emissiefilters bij 520 en 635 nm, een objectief (x10), een gemotoriseerde fase bestuurd door een processor en een camera van een laadkoppel (CCD). Dit telplatform wordt bestuurd door de Metamorph software19. Het maakt het mogelijk om fluorescentiebeelden van levende cellen en dode cellen tegelijkertijd te verkrijgen in elke put van de 96-putplaat, beginnend bij putten A1 naar put A12, dan B12 naar B1, C1 naar C12 enzovoort (tabel I).
- Bereken het gemiddelde gebied A van een enkele cel met behulp van de 18 putten van de negatieve besturingselementen (tabel I).
- Tel de cellen in elke put van de plaat en pas de volgende empirische formule A x 29 / 20.7 toe om te voorkomen dat celdubbels (groepering van twee cellen) worden geteld. Scoor het beschermende effect van de kegels per moleculen als de verhouding tussen het gemiddelde celgetal in de 4 putten waar we het molecuul hebben getest versus het gemiddelde celgetal in de 18 putten van de negatieve controle (zie tabel 1 en aanvullende figuur 1).
- Combineer de resultaten van de plaat gezaaid op 1 x 105 cellen/cm2 met de plaat gezaaid op 2 x 105 cellen/cm2 om de potentiële bescherming (levensvatbaarheidsverhouding) door elk gescreend molecuul te evalueren.
Representative Results
We beschrijven hier hoe het met kegel verrijkte kweeksysteem kan worden gebruikt om nieuwe kegelbeschermende eiwitten te identificeren. We gebruikten dit protocol om een genormaliseerde cDNA-bibliotheek te screenen gemaakt van choroïde en retinaal gepigmenteerd epitheel van 400 ogen van 8 weken oude Long-Evans ratten43.
Deze bibliotheek bevat 6,0 x 106 onafhankelijke kolonies die eenheden (CFUs) vormen en heeft een gemiddelde gekloonde insertgrootte van 2,1 kilobase (kb), met meer dan 99% van de recombinante klonen. Pools van 100 klonen uit die bibliotheek werden tijdelijk getransfecteerd (0,1 μg plasmide-DNA) in COS-1-cellen en het geconditioneerde medium (CM) cos-1 werd geoogst na incubatie gedurende 48 uur in DMEM zonder serum. Membranen of exosomen werden niet verwijderd door ultracentrifugatie. Vijftig microliter van elke CM werden toegevoegd aan 4 putten van twee platen van 96 putten: één gezaaid op 2 x 105 cellen/cm2, de andere op 4 x 105 cellen/cm2. CM van COS-1 cellen getransfecteerd met de lege vector pcDNA3.1 gebruikt om de bibliotheek te construeren werd gebruikt als negatieve controle (Tabel 1). In totaal werden 2.112 sets van 100 klonen die overeenkomen met 211.200 individuele klonen geëvalueerd in vier kweekputten en voor twee zaaiomstandigheden van kegelverrijkte culturen. De twee voorwaarden komen overeen met twee enigszins verschillende inentingsdichtheden die het mogelijk maken om de beschermende activiteit nauwkeuriger te beoordelen, voor een totaal van 1.689.600 cultuurputten.
Van de 42 pools van klonen met een verhouding groter dan 2, hebben pools 0080 en 0073 een levensvatbaarheidsratio die 16 en 14 keer hoger is na 7 dagen cultuur dan de negatieve controle, pcDNA3.1 (Aanvullend figuur 1). Deze analyse is essentieel om de belangenpools te identificeren. Elke geselecteerde pool van 100 klonen werd onderverdeeld in 16 sets van 10 klonen uit hun glycerolvoorraad. Deze subpools werden volgens dezelfde methode voorbereid en getest in een tweede screeningsronde (d.w.z. in totaal 3.200 kweekputten). De subpool 0073-09 gaf de sterkste levensvatbaarheidsratio (aanvullend figuur 2A) en werd onderverdeeld in 16 individuele klonen die werden getest in een derde screeningronde op met kegels verrijkte culturen. De kloon 0073-09-37 kloon onderscheidt zich duidelijk van de andere met een levensvatbaarheidsratio gelijk aan 2,5 (Aanvullend Figuur 2B). De y-as heeft een andere schaal, zelfs als de zaaidichtheid gelijk was dan in aanvullend figuur 2A. We hebben dit vaak gezien wanneer de assays maandenlang wekelijks worden herhaald. Na analyse bevestigen deze resultaten dat kloon 0073-09-37 een robuust en reproduceerbaar effect heeft op de overleving van kegels. De test werd onafhankelijk herhaald (figuur 3A) en de insert van 1,8 kb werd gesequenced (figuur 3B).
Een bioinformatische analyse toonde aan dat de kloon 0073-09-37, die we epitheel-afgeleide kegel levensvatbaarheidsfactor (EdCVF) noemden, drie open leesframes (ORF's) bevat, degene die het meest stroomopwaarts (ORF1) codeert voor 84 residuen van het C-terminale deel van het rateiwit zinkvingereiwit-180 (ZFP180, NP_653358) van 727 aminozuren44. De andere twee ORF's (ORF2 en ORF3) zijn veel minder goed geconserveerd bij muizen en afwezig bij andere zoogdieren. Bij onafhankelijke tests oefent alleen ORF1 een beschermend effect uit op de kegels (Aanvullend figuur 3). ORF1 werd geproduceerd als een glutathion S-transferase (GST) fusie-eiwit (Figuur 4A). Het EdCVF-eiwit werd gezuiverd en de GST-tag werd verwijderd (figuur 4B). EdCVF kan kegeldegeneratie in het met kegels verrijkte kweeksysteem voorkomen (figuur 4C).
Figuur 1: Kippenembryo's in stadia28 e,29e en 30e van ontwikkeling. Pijlen W: vleugel, C: kraag en B: rekening. Schaalbalk 1 cm. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 2: Dissectie van het netvlies van het kippenembryo Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Epitheel-afgeleide kegel levensvatbaarheidsfactor (EdCVF), kloon 0073-09-37. A. Verhoogde levensvatbaarheid op kegel-verrijkte cultuur. B. De opeenvolging van de cDNA kloon 0073-09-37. De onderstreepte reeks GAATTC is de EcoRI-beperkingssite die wordt gebruikt om de bibliotheek te bouwen. De twee vetgedrukte codons GTG zijn ongewone vertaalinitiatiesites voor EdCVF afkomstig van de vector. Statistische analyse door de test van de Student. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 4: Recombinante EdCVF-activiteit. A. Opeenvolging van EdCVF in de fusie met glutathion S-transferase (GST). B. Het gezuiverde recombinant EdCVF eiwit. C. Trofische activiteit van GST-EdCVF op kegel in cultuur. Statistische analyse met tukey's test. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Aanvullend figuur 1: Verhouding van het gemiddelde celgetal voor een cDNA-pool en de negatieve controle, het geconditioneerde medium van COS-1-cellen getransfecteerd met de lege vector pcDNA3.1 tijdens de eerste screeningsronde. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullend Figuur 2: Aantal cellen levend. A. De tweede screeningsronde met subpools van 0073 pool. B. De derde ronde van screening met geïsoleerde klonen. CN: het geconditioneerde medium van COS-1 cellen getransfecteerd met de lege vector, pcDNA3.1. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullend figuur 3: Trofische activiteit van de drie open leeskaders van de geïsoleerde kloon 0073-09-37. Statistische analyse met dunnett's test. Klik hier om dit bestand te downloaden.
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | |
| een | 1 | 1 | 1 | 1 | 2 | Nc | 2 | 2 | 2 | 3 | 3 | Nc |
| B | Nc | 3 | 3 | 4 | 4 | 4 | Nc | 4 | 5 | 5 | 5 | 5 |
| C | 6 | Nc | 6 | 6 | 6 | 7 | 7 | Nc | 7 | 7 | 8 | 8 |
| D | 8 | 8 | Nc | 9 | 9 | 9 | 9 | 10 | Nc | 10 | 10 | 10 |
| E | 11 | 11 | 11 | Nc | 11 | 12 | 12 | 12 | 12 | Nc | 13 | 13 |
| F | 13 | 13 | 14 | 14 | Nc | 14 | 14 | 15 | 15 | 15 | Nc | 15 |
| G | 16 | 16 | 16 | 16 | 17 | Nc | 17 | 17 | 17 | 18 | 18 | Nc |
| H | 18 | 18 | 19 | 19 | 19 | 19 | Nc | 20 | 20 | 20 | Nc | 20 |
| NC negatieve controles | ||||||||||||
| 1-20 posities van de zwembaden getest in viervoudige | ||||||||||||
Tabel 1: Plan van de 96-putplaat voor screening met hoge inhoud
Discussion
Onder de vele parameters die de productie van een met kegels verrijkte cultuur uit kippenembryo's kunnen beperken, is de eerste kritieke stap om het stadium van ontwikkeling van de embryo's in de uitgebroede eieren nauwkeurig te identificeren. Er is waargenomen dat de cultuur van cellen uit het netvlies van embryo's in ED8 (34e stadium) slechts 35% fotoreceptoren produceert, terwijl de resterende 65% zijn gemaakt van andere neuronen4. Wat de logistiek ook is om de uitgebroede eieren te krijgen, het is noodzakelijk om de temperatuur en de incubatietijd te verfijnen en de embryo's zorgvuldig te onderzoeken in vergelijking met de referentiefoto's van alle stadia van ontwikkeling42,45.
Oorspronkelijk werd het met kegel verrijkte kweeksysteem ontwikkeld met behulp van de White Leghorn-stam4. De witte kleur van de eieren van die soort wordt niet bijzonder gewaardeerd in Frankrijk, dus gebruikten we een soort kip die bruine eieren produceert. We maakten gebruik van de I 657 stam, die wordt gemaakt door het kruisen van I 66 hanen met JA57 kippen5. We waren in staat om de kenmerken van de oorspronkelijke culturen te reproduceren. Dit toont aan dat de genetische achtergrond van de kip niet cruciaal is om kegelverrijkte culturen te verkrijgen.
We hebben het effect van individuele verwijdering van de supplementen in het kweekmedium niet getest, maar hebben waargenomen dat insuline een cruciale rol speelt in overeenstemming met het effect van insuline op de overleving van kegeltjes in de rd1-muis, een model van autosomaal recessieve RP46. Triiodothyronine (T3) kan ook deelnemen aan de differentiatie van retinale precursorcellen van het kippenembryo in kegeltjes volgens de rol van schildklierhormoonreceptor in het lot van netvliescellen tijdens ontwikkeling40. Bijgevolg kan het met kegels verrijkte kweeksysteem niet worden gebruikt om insuline te identificeren door middel van expressiekloon46.
Het met kegels verrijkte kweeksysteem is gebaseerd op de cultuur van primaire neuronen en is veel geschikter dan methoden die gebaseerd zijn op het gebruik van vereeuwigde cellen als de cellijn 661W24,25,26.
De hier beschreven methode kan worden gewijzigd door een voorafgaande elektroporatie uit te voeren met plasmide DNA20. Voordat de netvliescelsuspensie wordt voorbereid, wordt het hele netvlies in de kamer van een op maat gemaakte elektroporator geplaatst met 120 μL van 0,5 μg/μL plasmide-DNA in 10 mM Tris-HCl pH 8,0, 1 mM EDTA. Vijf pulsen van 15 V voor elk 50 ms worden toegepast, gescheiden door 950 ms interval22. Pogingen om storend RNA (RNAi) te leveren met behulp van de replicatie competente aviaire splice (RCAS) retrovirussen in met kegels verrijkte culturen waren niet succesvol47. Dit is zeker te wijten aan het feit dat bij afwezigheid van serum en in culturen met een lage dichtheid, retinale precursorcellen niet repliceerbaar zijn, een vereiste voor de voortplanting van retrovirussen.
We ontwikkelden het met kegels verrijkte kweeksysteem om trofische factoren te identificeren die de overleving van kegels bevorderen met behulp van expressiekloon19. Om het haalbaar te maken, hebben we een eerste stap van screening met hoge inhoud uitgevoerd met behulp van geconditioneerd medium uit pools van 100 klonen. Zelfs als de cDNA's uit de bibliotheek worden uitgedrukt onder de controle van een sterke CMV-promotor na transfectie van COS-1-cellen, biedt het geen garantie dat alle eiwitten gecodeerd door individuele cDNA's een concentratie bereiken die voldoende is om positief te worden gescoord door de levensvatbaarheidstest. Dit is een belangrijke beperking. In die zin is elke screening niet echt uitputtend. Bovendien, zelfs als vliezeneiwitten niet uit het geconditioneerde medium werden verwijderd, is de configuratie van de test ongunstig voor de identificatie van niet-diffusieve factoren. Een alternatief zou zijn om individuele klonen te screenen nadat ze de volgorde van de cDNA's hebben verkregen om duplicaties bij het analyseren van vele malen hetzelfde kandidaat-eiwit te voorkomen. Dit werd geïnitieerd door de retinale cDNA-bibliotheken te sequentiëren die we43gebruikten. Hoewel rationeel, heeft deze aanpak ook zijn beperkingen. De bioinformatische analyse van de cDNA-sequenties zal onweerstaanbaar, naast de vermindering van de redundantie, de prioritering van het screenen van bepaalde klonen op basis van kennis opleggen. Dit zal niet nadelig zijn als uiteindelijk de hele bibliotheek zou worden gescreend, zelfs als de tijd die nodig is om dit te doen aanzienlijk wordt verlengd. Maar steevast zal de identiteit van de reeks onze manier van kijken naar de resultaten beïnvloeden. Dit zal niet neutraal zijn, aangezien de interpretatie van de reeks uiteraard in concurrentie zal staan met de experimentele gegevens.
De identificatie van EdCVF toont ook aan dat screening met een hoog gehalte technische beperkingen met zich meebrengt. Uit de eerste screeningsronde hebben we twee pools met een hoge activiteit geïdentificeerd (aanvullend figuur 1). De pool 0073 leidde tot de succesvolle identificatie van EdCVF, terwijl pool 0080 zich niet aan een dergelijke bevinding gedraagt. We hebben het probleem dat kan voortvloeien uit het verlies van de actieve kloon tijdens de voorbereiding van subpools niet opgelost. Als alternatief is het niet uitgesloten, zelfs als het niet statistisch gunstig is, dat van de cDNA's van pool 0080 twee eiwitten synergetisch handelden en hun activiteit niet kon worden waargenomen als individuele klonen.
De identificatie van moleculen die kegels beschermen door kleine moleculen te screenen, is een toekomstige toepassing van het met kegel verrijkte kweeksysteem. Dergelijke moleculen zullen van onschatbare waarde zijn voor de behandeling van retinale pathologieën waarvoor gentherapie niet de meest geschikte aanpak is als leeftijdsgebonden maculadegeneratie.
Disclosures
TL, J-AS en VF hebben een octrooi op het gebruik van EdCVF voor de behandeling van netvliesdegeneraties [WO2009071659 (A1). 12 juni 2007].
Acknowledgments
De auteurs danken Jacques Bellalou, Lorelei Fournier, Emmanuelle Clérin, Frédéric Blond en de entreprise agricole à responsabilité limitée (EARL Morizeau Dangers, Frankrijk) voor hun onschatbare hulp. Dit werk werd ondersteund door Inserm, Sorbonne University, de Agence Nationale pour la Recherche (ANR, Labex Lifesenses), Foundation Fighting Blindness (USA) en IHU FOReSIGHT [ANR-18-IAHU-0001] ondersteund door Franse staatsfondsen beheerd door de ANR binnen het Investissements d'Avenir-programma.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96 black plates (Clear Button with lid Tissue culture treated) | Corning | 3603 | |
| Calcein AM | Thermo-Fisher scientific | C1430 | |
| CCD Camera | Photometrics | CoolSnap FX HQ | |
| CDPC (Cytidine 5′-diphosphocholine sodium salt dihydrate) | Sigma-Aldrich | C0256 | |
| CO2 Independant | Thermo-Fisher scientific | 18045-054 | |
| Curved forceps | Dutscher | 005093 | |
| DMEM Media | Thermo-Fisher scientific | 41966-029 | |
| DNAse | Sigma-Aldrich | D4263 | |
| Eggs incubator | FarmLine | M08 01 3100 | |
| Ethidium Homodimer | Thermo-Fisher scientific | E1169 | |
| Fœtal bovine serum | Thermo-Fisher scientific | 10270-098 | |
| Gentamycin | Thermo-Fisher scientific | 15710-049 | |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H0880 | |
| ITS (insulin Transferine selenium) | Sigma-Aldrich | I1884 | |
| large straight pliers | Dutscher | 005074 | |
| Linoleic acid | Sigma-Aldrich | L8384 | |
| M199 medium | Thermo-Fisher scientific | 31150-022 | |
| Metamorph software | Metamorph | ||
| Microscope | NIKON | Eclipse TE2000 | |
| Motorized stage | Martzauzer | Mutlicontrol 2000 | |
| Optical filter switch | Shutter Instrument company | Lambda 10-2 | |
| PBS 1X | Thermo-Fisher scientific | 14190-086 | |
| Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P6282 | |
| Progesterone | Sigma-Aldrich | P7556 | |
| Pursept A express | Fisher scientific | 11814110 | |
| Putriscine | Sigma-Aldrich | P5780 | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | S8636 | |
| straight forceps | Dutscher | 005092 | |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T8691 | |
| Triiodothyronine | Sigma-Aldrich | T6397 | |
| Trypan blue | Thermo-Fisher scientific | 15250-061 | |
| Trypsine 0.25 % | Thermo-Fisher scientific | 25200-056 |
References
- Brownstein, C. D. The Implicit Mind. , Oxford University Press. (2019).
- Heesy, C. P., Hall, M. I. The nocturnal bottleneck and the evolution of mammalian vision. Brain, Behavior and Evolution. 75 (3), 195-203 (2010).
- Borges, R., et al. Adaptive genomic evolution of opsins reveals that early mammals flourished in nocturnal environments. BMC Genomics. 19 (1), 121 (2018).
- Adler, R., Hatlee, M. Plasticity and differentiation of embryonic retinal cells after terminal mitosis. Science. 243 (4889), 391-393 (1989).
- Fintz, A. C., et al. Partial characterization of retina-derived cone neuroprotection in two culture models of photoreceptor degeneration. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 44 (2), 818-825 (2003).
- Roska, B., Sahel, J. A.
- Duncan, J. L., et al. Inherited Retinal Degenerations: Current Landscape and Knowledge Gaps. Translational Vision Science & Technology. 7 (4), 6 (2018).
- Russell, S., et al. Efficacy and safety of voretigene neparvovec (AAV2-hRPE65v2) in patients with RPE65-mediated inherited retinal dystrophy: a randomised, controlled, open-label, phase 3 trial. Lancet. 390 (10097), 849-860 (2017).
- RetNet. Retinal Information Network. , (2020).
- Doonan, F., Donovan, M., Cotter, T. G. Activation of multiple pathways during photoreceptor apoptosis in the rd mouse. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 46 (10), 3530-3538 (2005).
- Comitato, A., et al. Dominant and recessive mutations in rhodopsin activate different cell death pathways. Human Molecular Genetics. 25 (13), 2801-2812 (2016).
- Cronin, T., Leveillard, T., Sahel, J. A. Retinal degenerations: from cell signaling to cell therapy; pre-clinical and clinical issues. Current Gene Therapy. 7 (2), 121-129 (2007).
- Baumgartner, W. A., Baumgartner, A. M. Accounting for disagreements on average cone loss rates in retinitis pigmentosa with a new kinetic model: Its relevance for clinical trials. Medical Hypotheses. 89, 107-114 (2016).
- Leveillard, T., Sahel, J. A. Rod-derived cone viability factor for treating blinding diseases: from clinic to redox signaling. Science Translational Medicine. 2 (26), (2010).
- Leveillard, T., Sahel, J. A. Metabolic and redox signaling in the retina. Cellular and Molecular Life Sciences. 74 (20), 3649-3665 (2017).
- Clerin, E., Marussig, M., Sahel, J. A., Leveillard, T. Metabolic and Redox Signaling of the Nucleoredoxin-Like-1 Gene for the Treatment of Genetic Retinal Diseases. International Journal of Molecular Sciences. 21 (5), (2020).
- Fridlich, R., et al. The Thioredoxin-like Protein Rod-derived Cone Viability Factor (RdCVFL) Interacts with TAU and Inhibits Its Phosphorylation in the Retina. Molecular & Cellular Proteomics. 8 (6), 1206-1218 (2009).
- Mei, X., et al. The Thioredoxin Encoded by the Rod-Derived Cone Viability Factor Gene Protects Cone Photoreceptors Against Oxidative Stress. Antioxidants, Redox Signaling. 24 (16), 909-923 (2016).
- Leveillard, T., et al. Identification and characterization of rod-derived cone viability factor. Nature Genetics. 36 (7), 755-759 (2004).
- Vergara, M. N., Gutierrez, C., Canto-Soler, M. V. Efficient Gene Transfer in Chick Retinas for Primary Cell Culture Studies: An Ex-ovo Electroporation Approach. Journal of Visualized Experiments. (105), e52002 (2015).
- Fridlich, R., et al. The thioredoxin-like protein rod-derived cone viability factor (RdCVFL) interacts with TAU and inhibits its phosphorylation in the retina. Molecular & Cellular Proteomics. 8 (6), 1206-1218 (2009).
- Ait-Ali, N., et al. Rod-derived cone viability factor promotes cone survival by stimulating aerobic glycolysis. Cell. 161 (4), 817-832 (2015).
- Mei, X., et al. The Thioredoxin Encoded by the Rod-Derived Cone Viability Factor Gene Protects Cone Photoreceptors Against Oxidative Stress. Antioxidants & Redox Signaling. 24 (16), 909-923 (2016).
- Tan, E., et al. Expression of cone-photoreceptor-specific antigens in a cell line derived from retinal tumors in transgenic mice. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 45 (3), 764-768 (2004).
- Wang, X. W., Tan, B. Z., Sun, M., Ho, B., Ding, J. L. Thioredoxin-like 6 protects retinal cell line from photooxidative damage by upregulating NF-kappaB activity. Free Radical Biology and Medicine. 45 (3), 336-344 (2008).
- Perron, N. R., Beeson, C., Rohrer, B. Early alterations in mitochondrial reserve capacity; a means to predict subsequent photoreceptor cell death. Journal of Bioenergetics and Biomembranes. 45 (1-2), 101-109 (2013).
- Krishnamoorthy, R. R., Clark, A. F., Daudt, D., Vishwanatha, J. K., Yorio, T. A forensic path to RGC-5 cell line identification: lessons learned. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (8), 5712-5719 (2013).
- Al-Ubaidi, M. R. RGC-5: are they really 661W? The saga continues. Experimental Eye Research. 119, 115 (2014).
- Clerin, E., et al. Vibratome sectioning mouse retina to prepare photoreceptor cultures. Journal of Visualized Experiments. (94), (2014).
- Hendrickson, A., Hicks, D. Distribution and density of medium- and short-wavelength selective cones in the domestic pig retina. Experimental Eye Research. 74 (4), 435-444 (2002).
- Bobu, C., Craft, C. M., Masson-Pevet, M., Hicks, D. Photoreceptor organization and rhythmic phagocytosis in the nile rat Arvicanthis ansorgei: a novel diurnal rodent model for the study of cone pathophysiology. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47 (7), 3109-3118 (2006).
- Saidi, T., Mbarek, S., Chaouacha-Chekir, R. B., Hicks, D. Diurnal rodents as animal models of human central vision: characterisation of the retina of the sand rat Psammomys obsesus. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 249 (7), 1029-1037 (2011).
- Traverso, V., Kinkl, N., Grimm, L., Sahel, J., Hicks, D. Basic fibroblast and epidermal growth factors stimulate survival in adult porcine photoreceptor cell cultures. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 44 (10), 4550-4558 (2003).
- Balse, E., et al. Purification of mammalian cone photoreceptors by lectin panning and the enhancement of their survival in glia-conditioned medium. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 46 (1), 367-374 (2005).
- Gagliardi, G., et al. Characterization and Transplantation of CD73-Positive Photoreceptors Isolated from Human iPSC-Derived Retinal Organoids. Stem Cell Reports. 11 (3), 665-680 (2018).
- Gagliardi, G., Ben M'Barek, K., Goureau, O. Photoreceptor cell replacement in macular degeneration and retinitis pigmentosa: A pluripotent stem cell-based approach. Progress in Retinal and Eye Research. 71, 1-25 (2019).
- Mears, A. J., et al. Nrl is required for rod photoreceptor development. Nature Genetics. 29 (4), 447-452 (2001).
- Swaroop, A., Kim, D., Forrest, D. Transcriptional regulation of photoreceptor development and homeostasis in the mammalian retina. Nature Reviews Neuroscience. 11 (8), 563-576 (2010).
- Kallman, A., et al. Investigating cone photoreceptor development using patient-derived NRL null retinal organoids. Nature Communications. 3 (1), 82 (2020).
- Eldred, K. C., et al. Thyroid hormone signaling specifies cone subtypes in human retinal organoids. Science. 362 (6411), (2018).
- Kole, C., et al. Otx2-Genetically Modified Retinal Pigment Epithelial Cells Rescue Photoreceptors after Transplantation. Molecular Therapy. 26 (1), 219-237 (2018).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology. 88 (1), 49-92 (1951).
- Kole, C., et al. Identification of an Alternative Splicing Product of the Otx2 Gene Expressed in the Neural Retina and Retinal Pigmented Epithelial Cells. PLoS One. 11 (3), 0150758 (2016).
- Shannon, M., Hamilton, A. T., Gordon, L., Branscomb, E., Stubbs, L. Differential expansion of zinc-finger transcription factor loci in homologous human and mouse gene clusters. Genome Research. 13 (6), 1097-1110 (2003).
- Stern, C. D., Holland, P. W. Essential developmental biology: a practical approach. , (1993).
- Punzo, C., Kornacker, K., Cepko, C. L. Stimulation of the insulin/mTOR pathway delays cone death in a mouse model of retinitis pigmentosa. Nature Neuroscience. 12 (1), 44-52 (2009).
- Harpavat, S., Cepko, C. L. RCAS-RNAi: a loss-of-function method for the developing chick retina. BMC Developmental Biology. 6, 2 (2006).
