Summary
Descrevemos um método para obter culturas primárias de fotorreceptores de cone a partir da retina de embriões de frango e seu uso para triagem de alto conteúdo.
Abstract
A visão diurna humana conta com a função de fotorreceptores de cone no centro da retina, a fovea. Pacientes que sofrem da forma mais prevalente de degeneração da retina herdada, retinite pigmentosa, perdem a visão noturna por causa da perda motivada por mutação de fotorreceptores de vara, um fenômeno seguido por uma perda progressiva de função e morte de cones que levam à cegueira. Geneticistas identificaram muitos genes com mutações causando essa doença, mas as primeiras mutações identificadas questionaram os mecanismos de degeneração do cone secundário e como uma mutação dominante na codificação do gene da rodopsina para o pigmento visual expressa exclusivamente em varas pode desencadear a degeneração do cone.
Esse resultado de transplantes em um modelo genético da doença levou ao conceito de interações celulares entre varas e cones e de degeneração autônoma não celular de cones em todas as formas genéticas de retinite pigmentosa.
Os cones compreendem 5% de todos os fotorreceptores em humanos e apenas 3% no camundongo, por isso seu estudo é difícil nessas espécies, mas os cones superam as hastes em espécies de aves. Adaptamos placas de 96 poços para a cultura de precursores da retina da retina de embriões de frango no estágio 29 de seu desenvolvimento. Nessas culturas primárias, os cones representam 80% das células após a diferenciação in vitro. As células degeneram durante um período de uma semana na ausência de soro. Aqui, descrevemos os métodos e sua padronização.
Este sistema de cultura enriquecido por cone foi usado para identificar o fator de viabilidade do cone derivado do epitélio (EdCVF) por meio de uma triagem de alto teor de um epitélio pigmentado de retina de rato. O EdCVF recombinante previne a degeneração dos cones.
Introduction
A retina das espécies de vertebrados é dupla, com fotorreceptores de vara para visão de luz fraca e fotorreceptores de cone para visão de luz, cor e acuidade. A acuidade visual de primatas conta com uma região no centro da retina, chamada fovea, que é enriquecida em cones, mas no geral, os cândes representam apenas 5% de todos os fotorreceptores. Consequentemente, a análise dos cones na retina primata e especialmente a cultura dos cones são tecnicamente difíceis. Todas as outras espécies de mamíferos não têm fovea e a porcentagem de cones é baixa para roedores que são mais comumente usados em pesquisas de retina. Este não é o caso para espécies aviárias, para as quais os cones dominam a retina dessas espécies de aves bem-ver. Os dinossauros, que dominaram o ecossistema quando os mamíferos apareceram pela primeira vez durante a evolução, estão na origem filogenética das aves1. Como consequência de tal competição entre dinossauros e mamíferos primitivos, os mamíferos são principalmente noturnos com retinas dominadas por varas. Só mais tarde, durante a evolução, a visão diurna de algumas espécies de mamíferos, entre as quais os primatas pertencem, tornou-se uma vantagem evolutiva. No entanto, o período ancestral permanece como um atavismo do gargalo noturno na evolução da visão mamífera2,3.
Ao estudar a diferenciação das células da retina, Adler e Hatlee mostraram que os fotorreceptores representam aproximadamente 70% das células diferenciadas da retina em culturas derivadas do frango no dia embrionário (ED) 6 ou estágio 294. Devido à prevalência de cones na retina do frango, culturas de células de retina de embriões de frango ED6 foram desenvolvidas como culturas enriquecidas com cone5.
A importância da acuidade visual mediada por cone para o ser humano é um truísmo. As pessoas afetadas por doenças genéticas ou de envelhecimento que alteram a função do cone são muito deficientes. Isso tem promovido um grande conjunto de estudos sobre degenerações herdadas da retina (IRD) com o objetivo de encontrar tratamentos para essas doenças cegantes6,7. O primeiro sucesso, obtido utilizando um vetor adeno associado adeninante (AAV) para a terapia de uma forma grave de amaurose congênita ird leber (LCA), é uma prova de conceito para a terapia genética8. A identificação dos genes cujas mutações desencadeiam o IRD abre a possibilidade de curar essas doenças usando terapia genética. No entanto, essas doenças são resultantes de mutações em mais de 200 genes distintos9. Mesmo no caso das formas recessivas autossômicas de IRD, quando a reintrodução da cópia normal do gene mórbido poderia restaurar a função visual, o custo econômico de cada desenvolvimento individual favorece os mais prevalentes em detrimento dos menos comuns e àqueles para os quais a origem genética permanece desconhecida. Esse fato levou os pesquisadores a pensar em terapias mais gerais. A morte celular apoptótica apareceu como um caminho comum, e um alvo terapêutico dessas doenças que progride pela degeneração dos fotorreceptores, inclusive para as formas autossômicas dominantes10,11. No entanto, os sucessos de tal abordagem estão faltando. Para a forma mais comum de IRD, retinite pigmentosa (RP), o caminho comum é a perda secundária da função seguida pela degeneração dos cones12,13. Prevenir a perda da função do cone preservará a visão central da fovea independentemente das mutações causais14.
No estágio inicial da RP, a perda de hastes desencadeia uma redução na expressão do fator de viabilidade do cone derivado da haste (RdCVF), codificado pelo gene nucleoredoxin-like 1(NXNL1),que interrompe a sinalização metabólica e redox entre varas e cones15. A administração de um AAV recombinante codificando os dois produtos do gene NXNL1, o fator trófico RdCVF e a enzima de tiadoxioxina RdCVFL, poderia teoricamente prevenir a perda da visão do cone em todas as formas genéticas deRP 16. Mostramos que o produto genético NXNL1, RdCVFL, é expresso em culturas enriquecidas com cone de frango17 e onde desempenha um papel protetor18. RdCVF e o gene NXNL1 foram identificados pela triagem de alto teor de uma biblioteca de cDNA da retina usando a sobrevivência de células de uma cultura enriquecida com cone como leitura19. Examinamos o equivalente a 210.000 clones individuais da biblioteca usando 8 testes paralelos para cada clone. Isso representa um número muito grande de testes que requerem fácil acesso ao material biológico, as retinas dos embriões de frango. Descobrimos que era relativamente fácil obter ovos de galinha embrionados semanalmente porque são amplamente produzidos para a agroindústria para galinhas poedeiras de ovos e galinhas produtoras de carne. Após uma padronização cuidadosa das culturas enriquecidas com cone, o sistema fornece uma maneira fácil, robusta e reprodutível de testar milhares de moléculas para sua capacidade de preservar a viabilidade do cone. Essas células também são favoráveis às manipulações genéticas20 que se beneficiam ao estudo da transdução de sinais e às análises bioquímicas21,22,23.
Pesquisadores da retina desenvolveram métodos alternativos como o uso da linha de células cone 661W24,25,26. No entanto, a identidade desta linha celular permanece controversa27,28. As células de 661W foram clonadas de tumores de retina de uma linha de camundongos transgênicos que expressa o antígeno SV40 grande T sob controle do promotor de proteínas retinol-binding do interfotoceptor humano. O antígeno SV40 grande T media a transformação celular e a imortalização. Como consequência, a via de sinalização identificada usando células de 661W deve ser relatada no contexto de uma linha celular transformada e imortalizada que é distinta em muitos aspectos de cones in situ. A esse respeito, o sistema cultural enriquecido por cone é composto por neurônios primários, os cones que são mais fisiologicamente relevantes.
Embora seja possível obter uma cultura pura de fotorreceptores usando a seção vibratome da retina do rato, a porcentagem muito baixa de cones na retina externa dos roedores torna essa abordagem inadequada para a produção de culturas enriquecidas com cone29. A retina de porco não contém fovea, mas tem uma região chamada centralis de área que é muito enriquecida em cones30. A alta proporção de cones nos roedores diurais da retina, como Arvicanthis ansorgei e Psammomys obsesus31,32, oferece uma solução possível, mas requer a reprodução de tais espécies exóticas. Os olhos de porco adultos, coletados em matadouros locais, podem ser usados para produzir uma cultura mista de varas e cones que têm sido usados para estudar a sobrevivência do fotoreceptor33. Uma solução elegante é pré-purificar cones da retina de porco usando panorâmico com lectina de aglutina de amendoim (PNA), que se liga seletivamente aos cones34. No entanto, este método é difícil de implementar em larga escala devido à sua complexidade.
As células-tronco pluripotentes induzidas pelo homem (iPS) oferecem a abordagem mais promissora para obter uma população de células fotorreceptoras de cone que pode ser usada para transplante de retina, mas que também pode ser adaptada à cultura enriquecida com cone35,36. Uma vez que o fator de transcrição NRL é necessário para fotorreceptores de vara37, o mouse Nrl-/- tem uma retina dominada por cones de ondas curtas (S-cones). A inativação poderia ser usada para produzir preparação enriquecida com S-cone por diferenciação humana do iPS38,39. Outra abordagem possível é promover a diferenciação do cone usando a sinalização hormonal da tireoide40. Enquanto novos métodos para a produção de culturas enriquecidas por cone a partir de iPS humanos estão surgindo, os embriões de frango fornecem um método comprovado atual19.
A cultura enriquecida com cone foi fundamental na identificação do RdCVF por clonagem de expressão19. Este sistema também foi usado com sucesso para demonstrar que o RdCVF estimula a absorção de glicose e seu metabolismo por glicólise aeróbica22. Além disso, a cultura enriquecida com cone foi utilizada para validar o papel protetor do RdCVFL, o segundo produto do gene NXNL1 23. Mais recentemente, este sistema foi usado para demonstrar a existência de moléculas de proteção secretadas por células epiteliais pigmentadas retinárias transduzidas com OTX241.
Protocol
O protocolo foi aprovado pela Comissão de Ética em Experimentos Animais da Universidade Pierre e Marie Curie e pelo Ministério da Pesquisa francês (Número de Licença: APAFIS#1028 2015070211275177). Os experimentos em animais foram realizados sob a seguinte autorização: "Certificat d'autorisation d'expérimenter sur les animaux vertébrés A-75-1863. Préfecture de Police de Paris (9 de novembro de 2011 a 8 de novembro de 2016)".
1. Incubação de ovos fertilizados
- Recolher semanalmente ovos fertilizados (cepa I 657, rótulo vermelho), obtidos naturalmente, em um incubatório industrial.
- Mantenha os óvulos fertilizados a 17°C (seu zero biológico) em laboratório depois de "colocados" pela galinha.
- Para cada cultura, incubar sete ovos fertilizados durante 24 horas a 20 °C e depois 136 horas a 37 °C com reversão intermitente da inclinação (um movimento progressivo por 2 horas de um lado ao seu oposto, um ciclo de 4 horas) dos ovos em uma câmara umidificada.
2. Recuperação dos embriões de frango
- Lave a superfície dos sete ovos com desinfetante (por exemplo, Bolsado expresso).
- Para quebrar a casca de ovo, faça um buraco no topo da casca com grandes alicates retos. Em seguida, corte a casca para remover o chapéu do ovo como um ovo cozido macio.
- Extraia suavemente cada embrião da casca de ovo com fórceps curvos e, em seguida, transfira-o para uma placa de Petri contendo soro fisco tampão de fosfato estéril (PBS) previamente aquecido a 37 °C. Suavemente, remova o envelope que envolve os embriões (o acorde ou a membrana corioallantóica).
- Verifique o estágio de desenvolvimento de cada embrião por comparação visual com Hamburger e Hamilton42.
- Selecione dois embriões na 29ª etapa de desenvolvimento(Figura 1). As asas se dobram nos cotovelos. O colarinho se destaca visivelmente. O projeto de lei é mais proeminente do que na 28ª etapa.
- Enuclear os olhos desses embriões selecionados e transferi-los em meio independente de CO2(Tecnologias de vida).
ATENÇÃO: É muito importante que o embrião esteja no estágio 29, e não no estágio 28 ou 30 (Figura 1); é por isso que é necessário incubar pelo menos 7 ovos, mesmo que apenas dois sejam finalmente utilizados. O acorde é muito fino, tão difícil de distinguir, mas é muito perto do embrião, por isso tem que ser removido sem tocar no embrião.
3. Dissecção das retinas
- Decapitar e enuclear os embriões selecionados com fórceps curvas.
- Transfira os quatro olhos para o meio co2independente. Este meio contém 0,9 mM CaCl2 e 0,65 mM MgCl2.
- Posicione o olho com a córnea virada para baixo, o nervo óptico voltado para o experimentador. Faça um furo no nervo óptico usando dois fórceps retos.
- Insira um ramo de cada fórceps entre a retina e o pigmento epitélio(Figura 2). Puxe cada fórceps e gire o olho para desprender o epitélio da retina. Remova a córnea seguida pela lente e pelo vítreo.
- Transfira as quatro retinas em uma placa de Petri contendo o meio de Ringer em pH 7.2.
ATENÇÃO: Certifique-se de que apenas a retina permanece e remova quaisquer traços de epitélio pigmentado de retina e vítreo.
4. Preparando a suspensão da célula de retina
- Corte as quatro retinas em pedaços muito pequenos usando dois alicates retos.
- Lave as peças de retina duas vezes com o meio de Ringer.
- Após a segunda lavagem com o meio de Ringer, deixe os pedaços de retina caírem na parte inferior do tubo e remova o meio do Ringer. Trate as peças de retina por 20 minutos a 37 °C com uma solução de trippsina (0,25% w/v).
- Disperse a solução após 10 minutos por sucção sucessiva. Descarreta usando uma pipeta Pasteur e verifique se há dissociação das peças da retina. Pare a reação adicionando mídia cultural complementada com soro de bezerro fetal inativado de 10%.
- Incubar a suspensão celular com 0,05 mg de DNase I. Dissociar os aglomerados celulares e o DNA por sucção sucessiva e descarga usando uma pipeta Pasteur imediatamente após a adição do DNase.
- Lave a suspensão das células da retina duas vezes com meio de cultura definida química (CDCM): um volume igual das mídias De Águia Modificada de Dulbecco e M199 complementadas com ácido linoleico/BSA de 100 μg/mL, 0,86 μM insulina, 0,07 μM transferrin, 2.0 μM progesterona, 0,28 μM prostaglandina, 0,29 μM Na2SeO3, 182 μM putrescina, 3 mM taurina, 4.7 μM cytidine 5'-diphosphocholin, 2.7 μM cytidine 5'-diphosphoethanolamine, 0,55 μM hidrocortisona, 0,03 μM triiodothyronine, 1 mM piruvato de sódio e 20 μM de gentamicina.
5. Semeadura de células retinais
- Trate duas placas pretas de cultura de 96 poços com fundo transparente por 2 horas a 37 °C com poli-L-lysine a 32,25 μg/cm2.
- Enxágüe essas placas duas vezes com meio de cultura M199. Resuspense a pelota de célula em 1 mL de CDCM.
- Adicione a uma alíquota de 10 μL da suspensão celular azul para manchar as células vivas. Adicione a amostra de suspensão das células a um hemoocítômetro (câmara de contagem de células de Malassez).
- Sob um microscópio, conte as células manchadas por quatro fileiras do hemoocítômetro (ou seja, 40 quadrados), e então calcule o número médio da célula para uma linha. Calcule a concentração das células da suspensão aplicando o seguinte método: Número de células/mL de suspensão = número médio de células seguidas (10 quadrados) x 10 o número total de quadrados do hemoocímetro x diluição com azul trypan x 1.000 (para expressar o resultado como células/mL).
- Leve a suspensão celular a duas concentrações (5,6 x 104 células/mL e 1,12 x 105 células/mL) correspondentes às duas densidades de revestimento (1 x 105 células/cm2 e 2 x 105 células/cm2) usando CDCM.
- Semente 50 μL das duas suspensões celulares nas duas placas de cultura pretas pré-tratadas de 96 poços. Distribua as células nas placas com uma pipeta multicanal da direita da placa para a esquerda, homogeneizando-se entre cada coluna, de modo que a distribuição das células seja homogênea.
- Adicione 50 μL da biblioteca de moléculas (por exemplo, a mídia condicionada de uma biblioteca cDNA, veja abaixo) a ser rastreada usando um padrão predefinido(Tabela 1).
- Incubar as placas por sete dias a 37°C abaixo de 5% de CO2 sem alteração de mídia.
6. Contando células viáveis
- A cada poço da placa, adicione 2,7 μM de calcein AM e 0,3 mM de homodimer de ethidium.
NOTA: Calcein penetra as células impermeáveis a moléculas grandes como homodimero de ethidium. No citoplasma das células vivas, o calcein é hidrolisado por esterases endógenas, torna-se fluorescente ao emitir a 520 nm quando excitado a 485 nm. Homodimer de ethidium se liga ao DNA em células mortas. A ligação ethidium DNA-homodimer faz com que a fluorescência vermelha seja emitida a 635 nm após excitação a 520 nm. - Incubar as placas por 1 hora em temperatura ambiente na ausência de luz.
- Leia a fluorescência em um leitor de placas automatizada composto por um microscópio invertido equipado com uma lâmpada de mercúrio com dois filtros de excitação a 485 e 520 nm, dois filtros de emissão a 520 e 635 nm, um objetivo (x10), um estágio motorizado controlado por um processador e uma câmera de dispositivo acoplada a carga (CCD). Esta plataforma de contagem é controlada pelo software Metamorph19. Permite adquirir imagens de fluorescência de células vivas e células mortas simultaneamente em cada poço da placa de 96 poços, começando dos poços A1 para bem A12, depois B12 em direção a B1, C1 para C12 e assim por diante (Tabela I).
- Calcule a área média A de uma única célula utilizando os 18 poços dos controles negativos(Tabela I).
- Conte as células em cada poço da placa e aplique a seguinte fórmula empírica A x 29 / 20.7 para evitar que os dobramentos celulares (agrupamento de duas células) sejam contados. Ecore o efeito protetor dos cones por moléculas como a razão entre o número médio de células nos 4 poços onde testamos a molécula versus o número celular médio nos 18 poços do controle negativo (ver Tabela 1 e Figura Suplementar 1).
- Combine os resultados da placa semeada em 1 x 105 células/cm2 com a semeada em 2 x 105 células/cm2 para avaliar a proteção potencial (razão de viabilidade) por cada molécula rastreada.
Representative Results
Descrevemos aqui como o sistema de cultura enriquecido por cone pode ser usado para identificar novos cones que protegem proteínas. Usamos este protocolo para tela de uma biblioteca cDNA normalizada feita de epitélio pigmentado coroide e retina de 400 olhos de ratos Long-Evans de 8 semanas de idade43.
Esta biblioteca contém 6,0 x 106 colônias independentes formando unidades (UFC) e tem um tamanho médio de inserção clonada de 2,1 quilobase (kb), com mais de 99% de clones recombinantes. Piscinas de 100 clones daquela biblioteca foram transitoriamente transfectadas (0,1 μg de DNA plasmídeo) em células COS-1 e o meio condicionado (CM) de COS-1 foi colhido após a incubação por 48 horas em DMEM sem soro. Membranas ou exossomos não foram removidos por ultracentrifugação. Cinquenta microliters de cada CM foram adicionados a 4 poços de duas placas de 96 poços: uma semeada em 2 x 105 células/cm2,a outra em 4 x 105 células/cm2. CM de células COS-1 transfeinadas com o vetor vazio pcDNA3.1 utilizado para a construção da biblioteca foi usado como controle negativo(Tabela 1). Um total de 2.112 conjuntos de 100 clones correspondentes a 211.200 clones individuais foram avaliados em quatro poços culturais e para duas condições de semeadura de culturas enriquecidas com cone. As duas condições correspondem a duas densidades de inoculação ligeiramente diferentes, o que possibilita avaliar a atividade protetora com mais precisão, totalizando 1.689.600 poços culturais.
Entre as 42 piscinas de clones com razão superior a 2, as piscinas 0080 e 0073 têm razão de viabilidade 16 e 14 vezes maior após 7 dias de cultura do que o controle negativo, pcDNA3.1 (Figura Suplementar 1). Essa análise é essencial para identificar as piscinas de interesse. Cada grupo selecionado de 100 clones foi subdividido em 16 conjuntos de 10 clones de seu estoque de glicerol. Essas subgruções foram preparadas e testadas de acordo com o mesmo método em uma segunda rodada de triagem (ou seja, um total de 3.200 poços culturais). O subceleto 0073-09 deu a razão de viabilidade mais forte (Figura Suplementar 2A) e foi subdividido para produzir 16 clones individuais que foram testados em uma terceira rodada de triagem em culturas enriquecidas com cone. O clone 0073-09-37 se destaca claramente dos demais com uma razão de viabilidade igual a 2,5 (Figura Suplementar 2B). O eixo y tem uma escala diferente, mesmo que a densidade de semeadura fosse a mesma do que na figura suplementar 2A. Temos visto isso comumente quando os ensaios são repetidos semanalmente por meses. Após análise, esses resultados confirmam que o clone 0073-09-37 tem um efeito robusto e reprodutível na sobrevivência do cone. O teste foi repetido independentemente(Figura 3A), e a inserção de 1,8 kb foi sequenciada(Figura 3B).
Uma análise bioinformática revelou que o clone 0073-09-37, que chamamos de fator de viabilidade do cone derivado do epitélio (EdCVF), contém três quadros de leitura aberto (ORFs), o que mais upstream (ORF1) codifica para 84 resíduos da parte terminal C da proteína de dedo de zinco de proteína de rato-180 (ZFP180, NP_653358) de 727 aminoácidos44. Os outros dois ORFs (ORF2 e ORF3) são muito menos bem conservados em camundongos e ausentes em outros mamíferos. Quando testado de forma independente, apenas o ORF1 exerce um efeito protetor sobre os cones(Figura Suplementar 3). ORF1 foi produzido como uma proteína de fusão glutathione S-transferase (GST)(Figura 4A). A proteína EdCVF foi purificada e a tag GST removida(Figura 4B). O EdCVF é capaz de prevenir a degeneração do cone no sistema de cultura enriquecido por cone(Figura 4C).
Figura 1: Embriões defrango nos estágios 28,29e 30de desenvolvimento. Setas W: asa, C: colarinho e B: conta. Barra de escala 1 cm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Dissecção da retina do embrião de frango Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Fator de viabilidade do cone derivado do epitélio (EdCVF), clone 0073-09-37. A. Maior viabilidade na cultura enriquecida por cone. B. A sequência do clone cDNA 0073-09-37. A sequência sublinhada GAATTC é o site de restrição EcoRI usado para construir a biblioteca. Os dois códons GTG em negrito são locais de iniciação de tradução incomum para EdCVF originários do vetor. Análise estatística pelo teste do Aluno. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Atividade edcvf recombinante. A. Sequência de EdCVF na fusão com glutationa S-transferase (GST). B. A proteína EdCVF recombinante purificada. C. Atividade trófica de GST-EdCVF no cone na cultura. Análise estatística usando o teste de Tukey. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura suplementar 1: Razão do número médio da célula para um pool de CDNA e o controle negativo, o meio condicionado das células COS-1 transfeinados com o vetor vazio pcDNA3.1 durante a primeira rodada de triagem. Clique aqui para baixar este arquivo.
Suplementar Figura 2: Número de células vivas. A. A segunda rodada de triagem com sub-piscinas de 0073 pool. B. A terceira rodada de triagem com clones isolados. CN: o meio condicionado das células COS-1 transfeinadas com o vetor vazio, pcDNA3.1. Clique aqui para baixar este arquivo.
Figura suplementar 3: Atividade trófica dos três quadros de leitura abertos do clone isolado 0073-09-37. Análise estatística usando o teste de Dunnett. Clique aqui para baixar este arquivo.
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | |
| um | 1 | 1 | 1 | 1 | 2 | Nc | 2 | 2 | 2 | 3 | 3 | Nc |
| B | Nc | 3 | 3 | 4 | 4 | 4 | Nc | 4 | 5 | 5 | 5 | 5 |
| C | 6 | Nc | 6 | 6 | 6 | 7 | 7 | Nc | 7 | 7 | 8 | 8 |
| D | 8 | 8 | Nc | 9 | 9 | 9 | 9 | 10 | Nc | 10 | 10 | 10 |
| ecstasy | 11 | 11 | 11 | Nc | 11 | 12 | 12 | 12 | 12 | Nc | 13 | 13 |
| fá | 13 | 13 | 14 | 14 | Nc | 14 | 14 | 15 | 15 | 15 | Nc | 15 |
| G | 16 | 16 | 16 | 16 | 17 | Nc | 17 | 17 | 17 | 18 | 18 | Nc |
| H | 18 | 18 | 19 | 19 | 19 | 19 | Nc | 20 | 20 | 20 | Nc | 20 |
| Controles negativos nc | ||||||||||||
| 1-20 posições das piscinas testadas em quadruplica | ||||||||||||
Tabela 1: Plano da placa de 96 poços para triagem de alto conteúdo
Discussion
Entre os muitos parâmetros que podem limitar a produção de uma cultura enriquecida com cone a partir de embriões de frango, o primeiro passo crítico é identificar com precisão o estágio de desenvolvimento dos embriões nos ovos eclodidos. Observou-se que a cultura das células das retinas dos embriões em ED8 (34º estágio) produz apenas 35% fotorreceptores, sendo que os 65% restantes são feitos de outros neurônios4. Seja qual for a logística aplicada para obter os ovos eclodidos, é necessário ajustar a temperatura e o tempo de incubação, e examinar cuidadosamente os embriões em comparação com as imagens de referência de todas as etapas de desenvolvimento42,45.
Originalmente, o sistema de cultura enriquecido por cone foi desenvolvido usando a cepa White Leghorn4. A cor branca dos ovos dessa cepa não é particularmente apreciada na França, por isso usamos uma variedade de frango que produz ovos marrons. Utilizamos a cepa I 657, que é feita cruzando I 66 galos com galinhas JA575. Conseguimos reproduzir as características das culturas originais. Isso mostra que o fundo genético do frango não é fundamental para obter culturas enriquecidas com cone.
Não testamos o efeito da remoção individual dos suplementos no meio da cultura, mas observamos que a insulina desempenha um papel crítico de acordo com o efeito da insulina na sobrevivência dos cones no camundongo rd1, um modelo de RP recessivo autossômico46. Triiodotironina (T3) também pode participar da diferenciação das células precursoras da retina do embrião de frango em cones de acordo com o papel do receptor hormonal da tireoide no destino das células da retina durante o desenvolvimento40. Consequentemente, o sistema de cultura enriquecido por cone não pode ser usado para identificar insulina por clonagem de expressão46.
O sistema cultural enriquecido por cone conta com a cultura dos neurônios primários e é muito mais apropriado contar com os métodos que dependem do uso de células imortalizadas como a linha celular 661W24,25,26.
O método descrito aqui pode ser modificado realizando uma eletroporação prévia com DNA plasmídeo20. Antes de preparar a suspensão da célula retinária, toda a retina é colocada na câmara de um eletroporador personalizado com 120 μL de 0,5 μg/μL de DNA plasmídeo em 10 mM Tris-HCl pH 8.0, 1 mM EDTA. Cinco pulsos de 15 V para 50 ms cada são aplicados separados pelo intervalo de 950 ms22. As tentativas de fornecer RNA interferente (RNAi) usando os retrovírus de emenda aviária competente (RCAS) em culturas enriquecidas com cone foram mal sucedidas47. Isso certamente se deve ao fato de que na ausência de soro e em culturas de baixa densidade, as células precursoras da retina não são replicativas, um requisito para a propagação de retrovírus.
Desenvolvemos o sistema de cultura enriquecido por cone para identificar fatores tróficos que promovem a sobrevivência do cone usando clonagem de expressão19. Para viabilizar, realizamos um primeiro passo de triagem de alto teor usando meio condicionado a partir de piscinas de 100 clones. Mesmo que os cDNAs da biblioteca sejam expressos sob o controle de um forte promotor de CMV após a transfecção de células COS-1, não oferece uma garantia de que todas as proteínas codificadas por cDNAs individuais atinjam uma concentração suficiente para serem pontuadas positivamente pela viabilidade. Esta é uma grande limitação. Nesse sentido, qualquer triagem não é realmente exaustiva. Além disso, mesmo que as proteínas membranous não tenham sido removidas do meio condicionado, a configuração do ensaio é desfavorável à identificação de fatores não difusivos. Uma alternativa seria selecionar clones individuais depois de ter obtido a sequência dos cDNAs, a fim de evitar duplicações em ensaios muitas vezes a mesma proteína candidata. Isso foi iniciado pelo sequenciamento das bibliotecas de cDNA da retina que usamos43. Embora racional, essa abordagem também tem suas limitações. A análise bioinformática das sequências de CDNA vai impor irresistivelmente, além da redução da redundância, a priorização da triagem de certos clones com base no conhecimento. Isso não será prejudicial se, finalmente, toda a biblioteca seria exibida mesmo que o tempo necessário para fazê-lo seja significativamente alongado. Mas, invariavelmente, a identidade da sequência influenciará nossa maneira de ver os resultados. Isso não será neutro, pois a interpretação da sequência será naturalmente em concorrência com os dados experimentais.
A identificação do EdCVF também mostra que a triagem de alto conteúdo implica limitações técnicas. Desde a primeira rodada de triagem, foram identificadas duas piscinas com alta atividade (Figura Suplementar 1). A piscina 0073 levou à identificação bem sucedida do EdCVF, enquanto a piscina 0080 não conduziu a tal achado. Não resolvemos o problema que poderia resultar da perda do clone ativo durante a preparação de subgrues. Alternativamente, não está excluído, mesmo que não estatisticamente favorável, que entre os cDNAs da piscina 0080, duas proteínas estavam agindo sinergicamente e sua atividade não poderia ser observada como clones individuais.
A identificação de moléculas protegendo cones rastreando pequenas moléculas é uma aplicação futura do sistema cultural enriquecido por cone. Tais moléculas serão inestimáveis para o tratamento de patologias da retina para as quais a terapia genética não é a abordagem mais apropriada como degeneração macular relacionada à idade.
Disclosures
TL, J-AS e VF possuem uma patente sobre o uso de EdCVF para tratar degenerações da retina [WO2009071659 (A1). 12 de junho de 2007].
Acknowledgments
Os autores agradecem a Jacques Bellalou, Lorelei Fournier, Emmanuelle Clérin, Frédéric Blond e ao entreprise agricole à responsabilité limitée (EARL Morizeau Dangers, França) por sua ajuda inestimável. Este trabalho foi apoiado pela Inserm, Sorbonne University, Agence Nationale pour la Recherche (ANR, Labex Lifesenses), Foundation Fighting Blindness (EUA) e IHU FOReSIGHT [ANR-18-IAHU-0001] apoiados por fundos estatais franceses administrados pela ANR dentro do programa Investissements d'Avenir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96 black plates (Clear Button with lid Tissue culture treated) | Corning | 3603 | |
| Calcein AM | Thermo-Fisher scientific | C1430 | |
| CCD Camera | Photometrics | CoolSnap FX HQ | |
| CDPC (Cytidine 5′-diphosphocholine sodium salt dihydrate) | Sigma-Aldrich | C0256 | |
| CO2 Independant | Thermo-Fisher scientific | 18045-054 | |
| Curved forceps | Dutscher | 005093 | |
| DMEM Media | Thermo-Fisher scientific | 41966-029 | |
| DNAse | Sigma-Aldrich | D4263 | |
| Eggs incubator | FarmLine | M08 01 3100 | |
| Ethidium Homodimer | Thermo-Fisher scientific | E1169 | |
| Fœtal bovine serum | Thermo-Fisher scientific | 10270-098 | |
| Gentamycin | Thermo-Fisher scientific | 15710-049 | |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H0880 | |
| ITS (insulin Transferine selenium) | Sigma-Aldrich | I1884 | |
| large straight pliers | Dutscher | 005074 | |
| Linoleic acid | Sigma-Aldrich | L8384 | |
| M199 medium | Thermo-Fisher scientific | 31150-022 | |
| Metamorph software | Metamorph | ||
| Microscope | NIKON | Eclipse TE2000 | |
| Motorized stage | Martzauzer | Mutlicontrol 2000 | |
| Optical filter switch | Shutter Instrument company | Lambda 10-2 | |
| PBS 1X | Thermo-Fisher scientific | 14190-086 | |
| Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P6282 | |
| Progesterone | Sigma-Aldrich | P7556 | |
| Pursept A express | Fisher scientific | 11814110 | |
| Putriscine | Sigma-Aldrich | P5780 | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | S8636 | |
| straight forceps | Dutscher | 005092 | |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T8691 | |
| Triiodothyronine | Sigma-Aldrich | T6397 | |
| Trypan blue | Thermo-Fisher scientific | 15250-061 | |
| Trypsine 0.25 % | Thermo-Fisher scientific | 25200-056 |
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