Summary
O genoma mitocondrial da levedura de Baker codifica oito polipeptídeos. O objetivo do protocolo atual é rotular todos eles e, posteriormente, visualizá-los como bandas separadas.
Abstract
Mitocôndrias são organelas essenciais de células eucarióticas capazes de respiração aeróbica. Eles contêm genoma circular e aparelho de expressão genética. Um genoma mitocondrial da levedura do padeiro codifica oito proteínas: três subunidades do citocromome c oxidase (Cox1p, Cox2p, e Cox3p), três subunidades da ATP synthase (Atp6p, Atp8p e Atp9p), uma subunidade da enzima ubiquinol-citocromo c oxidoreductase, citocromo b (Cytb) e proteína ribossômica mitocondrial Var1p. O objetivo do método descrito aqui é rotular especificamente essas proteínas com methionina 35S, separá-las por eletroforese e visualizar os sinais como bandas discretas na tela. O procedimento envolve várias etapas. Primeiro, as células de levedura são cultivadas em um meio contendo galactose até chegarem ao estágio de crescimento logarítmico tardio. Em seguida, o tratamento de cicloheximida bloqueia a tradução citoplasmática e permite a incorporação de metionina 35S apenas em produtos de tradução mitocondrial. Em seguida, todas as proteínas são extraídas de células de levedura e separadas por eletroforese de gel de poliacrilamida. Finalmente, o gel é seco e incubado com a tela de fósforo de armazenamento. A tela é escaneada em um fosphorimager revelando as bandas. O método pode ser aplicado para comparar a taxa de biossíntese de um único polipeptídeo nas mitocôndrias de uma cepa de levedura mutante versus o tipo selvagem, o que é útil para estudar defeitos de expressão genética mitocondrial. Este protocolo fornece informações valiosas sobre a taxa de tradução de todas as mRNAs mitocondrial de leveduras. No entanto, requer vários controles e experimentos adicionais para tirar conclusões adequadas.
Introduction
Mitocôndrias são as organelas profundamente envolvidas no metabolismo de uma célula eucariótica. Sua cadeia de transferência de elétrons fornece a célula com ATP, a principal moeda energética usada em múltiplas vias bioquímicas. Além disso, estão envolvidos em apoptose, ácido graxo e síntese de heme, entre outros processos. A disfunção das mitocôndrias é uma fonte bem conhecida da doença humana1. Pode resultar de mutações em genes nucleares ou mitocondriais codificando componentes estruturais ou regulatórios das organelas2. O saccharomyces cerevisiae de baker é um excelente organismo modelo para estudar a expressão genética mitocondrial devido a várias razões. Primeiro, seu genoma é completamente sequenciado3, bem anotado, e uma grande soma de dados já está disponível na literatura graças à longa história de investigações realizadas com esse organismo. Em segundo lugar, as manipulações com seu genoma nuclear são relativamente rápidas e fáceis devido à sua taxa de crescimento rápido e sistema de recombinação homólogo altamente eficiente. Em terceiro lugar, a levedura de padeiro S. cerevisiae é um dos poucos organismos para os quais as manipulações com genomas mitocondriais são desenvolvidas. Finalmente, a levedura do padeiro é um organismo facultativo aerobe-anaerobe, que permite o isolamento e o estudo de mutantes com defeito respiratório, uma vez que eles podem crescer em mídia contendo fontes de carbono fermentáveis.
Descrevemos o método para estudar a expressão genética mitocondrial da levedura de padeiro S. cerevisiae no nível translacional4. Seu princípio principal vem de várias observações. Primeiro, o genoma mitocondrial da levedura codifica apenas oito proteínas: três subunidades do citocromo c oxidase (Cox1p, Cox2p, e Cox3p), três subunidades da ATP synthase (Atp6p, Atp8p e Atp9p), uma subunidade da enzima ubiquinol-citocromo c oxidoreductase, citocromo b (Cytb), e proteína ribossômica mitocondrial Var1p5. Este número é pequeno, e todos eles podem ser separados por eletroforese em um único gel nas condições apropriadas. Em segundo lugar, ribossomos mitocondriais pertencem à classe procariótica em vez de eucariótico6, e, portanto, a sensibilidade aos antibióticos é diferente para ribossmos citoplasmáticos e mitocondriais de levedura. Permite a inibição da tradução citoplasmática com cicloheximida, proporcionando as condições quando o aminoácido rotulado (35S-methionina) é incorporado apenas em produtos de tradução mitocondrial. Como resultado, o experimento fornece informações sobre a taxa de incorporação de aminoácidos em proteínas mitocondriais sintetizadas de novo, refletindo a eficiência global da tradução mitocondrial para cada um dos oito produtos
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Protocol
1. Preparação da cultura da levedura
- Leveduras de listras das culturas de estoque congelado em placas frescas com o meio apropriado. Coloque as placas em uma incubadora de cultura a 30 °C para 24-48 h.
NOTA: Deixe os mutantes sensíveis à temperatura crescerem na temperatura permissiva. - Culturas de levedura inoculada em 2 mL de meio YPGal (2% peptone, 1% extrato de levedura, 2% galactose) da raia fresca em tubos de 15 mL e incubar-as durante a noite agitando a 200 rpm a 30 °C.
- Meça a densidade óptica da cultura em um comprimento de onda de 600 nm (OD600).
- Pegue o volume correspondente a 0,2 unidades de absorção em tubos estéreis, células de levedura de pelotização a 9.000 x g para 30 s em temperatura ambiente e descarte o supernasce.
- Lave células com 0,5 mL de água estéril por vórtice para 5 s. Células de levedura de pelota a 9.000 x g por 30 s em temperatura ambiente e descartam o supernasce. Células diluís em 2 mL de meio YPGal fresco.
- Incubar agitação a 200 rpm e 30 °C até OD600 atingir 1,5-1,9 valores.
NOTA: As taxas de crescimento da levedura variam, por isso esteja preparado para esperar. É razoável fazer as etapas 1.3-1.6 no início da manhã. Geralmente leva de 4 a 5 h, mas pode demorar mais.
2. Incorporação de isótopos radioativos
- Transfira o volume de cultura equivalente a uma unidade óptica em um tubo de microcentrifuuagem. Gire os tubos a 3.000 x g por 1 min e descarte o supernaspe. Lave com 0,5 mL de água estéril por vórtice para 5 s.
- Células de levedura de pelota a 9.000 x g por 30 s em temperatura ambiente e descartam o supernasce. Células de levedura resuspend em 0,5 mL de tampão de tradução estéril. Coloque a suspensão em um tubo de 15 mL.
NOTA: O buffer de tradução é uma solução que contém 2% de galactose (c/v) e fosfato de potássio de 50 mM com pH 6.0.
- Células de levedura de pelota a 9.000 x g por 30 s em temperatura ambiente e descartam o supernasce. Células de levedura resuspend em 0,5 mL de tampão de tradução estéril. Coloque a suspensão em um tubo de 15 mL.
- Adicione cicloheximida à suspensão celular até uma concentração final de 0,2 mg/mL. Incubar por 5 min agitando a 200 rpm e 30 °C para inibir a tradução citosolica.
NOTA: A solução de cicloheximida (20 mg/mL, no etanol) deve ser preparada fresca antes do experimento. O clorofenicol pode ser substituído com sucesso por anisomicina na mesma concentração7. - Adicione 25-30 μCi de 35S-methionine à suspensão celular e incubar por 30 min agitando a 200 rpm e 30 °C.
NOTA: A mistura de 35S-methionine e 35S-cisteína também pode ser usada. Pure 35S-methionine resulta no sinal mais forte e na melhor relação sinal-ruído. Geralmente, a methionina é mais eficaz que a cisteína porque o conteúdo deste aminoácido em proteínas mitocondriais é maior. No entanto, a mistura EasyTag de 35S-methionina e cisteína é menos cara e dá resultados comparáveis7.
ATENÇÃO: 35S-methionina é radioativa. Siga as práticas habituais de segurança para o manuseio de materiais radioativos.
NOTA: É sabido que a incorporação da radioatividade atinge um limite devido ao qual o nível total de sinais se nivela ao longo do tempo. Uma vez alcançado esse limite, é quase impossível determinar as taxas pelas quais os diferentes produtos de tradução são sintetizados. Para analisar a taxa de tradução mitocondrial, é imprescindível estar em uma condição em que a intensidade do sinal aumenta com o tempo de incubação com 35S-metionina de forma linear. Para cepas de laboratório comuns, o sinal já está saturado para tempos de incubação muito mais curtos do que os 30 minutos. Mutantes translacionais podem se comportar de forma muito diferente. Um curso-período deve ser realizado para estabelecer a cinética da incorporação da radioatividade e, portanto, a taxa de tradução, pelo menos quando se trabalha com uma nova cepa. Para isso, sugerimos a coleta de amostras com um intervalo de vários minutos (por exemplo, 2,5, 5,0, 7,5, 10 e 20 min). - Adicione methionina "fria" sem rótulo (concentração final deve ser de 20 mM) e puromycine (concentração final deve ser de 1-10 μg/mL) para parar a rotulagem. Incubar por 10 min agitando a 200 rpm e 30 °C.
NOTA: Este passo é fundamental para dar tempo aos ribossomos para terminar a tradução dos peptídeos. Caso contrário, todos os polipeptídeos mais curtos do que o comprimento total serão detectados em um tamanho diferente. Um experimento de curso de tempo (pulse-chase) pode ser feito nesta etapa para determinar a estabilidade dos produtos de tradução mitocondrial. Para isso, continue a incubação coletando amostras com um intervalo de 30 minutos (por exemplo, 30, 60, 90 e 120 min).
3. Lise celular de levedura e extração de proteínas
- Coletar células de levedura por centrifugação a 9.000 x g para 30 s. Lave as células com 0,5 mL de água estéril por vórtice para 5 s. Células de levedura de pelota a 9.000 x g para 30 s em temperatura ambiente. Descarte o supernaspeso.
nota. O protocolo pode ser pausado aqui. Armazene as amostras a -20 °C. - Adicione 75 μL de tampão de lise à pelota e vórtice para 5-10 s.
NOTA: O tampão de lise é uma solução de 1,8 M NaOH, 1 M β-mercaptoetanol e 1 mM PMSF na água. Evite a incubação excessiva com tampão de lise levando à hidrólise alcalina das proteínas. Imediatamente prossiga para a etapa 3.3. - Adicione 500 μL de 0,5 M Tris-HCl buffer com pH 6.8. Vórtice brevemente.
4. Precipitação de proteínas
ATENÇÃO: Metanol e clorofórmio são solventes orgânicos. Siga as práticas habituais de segurança para o manuseio de substâncias orgânicas.
- Adicione 600 μL de metanol à amostra. Vórtice para 5 s.
- Adicione 150 μL de clorofórmio à amostra. Vórtice para 5 s.
- Centrifugar as amostras por 2 min a 12.000 x g. Descarte cuidadosamente a fase superior com um sampler.
- Adicione 600 μL de metanol à amostra. Misture cuidadosamente invertendo o tubo várias vezes.
- Centrifugar as amostras por 2 min a 12.000 x g. Descarte o supernaspeso.
- Seque a pelota por 2 min a 80 °C.
NOTA: Todo o líquido deve evaporar. Há o risco de ter uma separação aberrante de proteínas no gel se a pelota foi seca insuficientemente. No entanto, não é possível secar demais a pelota, por isso pode até ser armazenada durante a noite a 4 °C. - Dissolver proteínas precipitadas em 60 μL de 1x tampão amostral de Laemmli.
- Aqueça por 10 min a 40 °C.
NOTA: Evite ferver as amostras a 95 °C, pois isso causa agregação. Se os agregados ainda se formarem, gire as amostras a 12.000 x g por 2 min e colete o supernaspeso. As amostras podem ser armazenadas a -20 °C. O protocolo pode ser pausado aqui.
5. SDS-PAGE
- Elenco o gel de 17,5% Laemmli SDS-poliacrilamida.
NOTA: 6 M de ureia pode ser adicionada ao gel para resolver melhor ATP8 e ATP9. Gradient 15%-20% géis também podem dar melhor resolução. - Carregar 15 μL (40-50 μg) de cada amostra nos bolsos.
NOTA: Não é necessário medir a concentração proteica se os valores de600 OD estavam próximos na etapa 1.6. Caso não, meça as concentrações proteicas utilizando o ensaio com reagentes compatíveis com detergente. - Execute o gel em uma sala fria até que o corante azul atinja aproximadamente 65% do comprimento do gel.
NOTA: Para o sistema utilizado (por exemplo, célula Protean II xi), usamos qualquer um dos dois modos: 16-17 h a 5 V/cm ou 5 h a 15 V/cm. Nenhuma proteína corre mais rápido que o corante azul bromofenol, mas longas corridas podem resultar em borrão de sinais atp8 e atp9. - Manche o gel com coomassie azul brilhante e faça uma varredura ou foto, que é necessária como um controle de carregamento.
NOTA: Uma maneira alternativa de fazer um controle de carregamento é a imunoblotação com um anticorpo para o gene mitocondrial "house-keeping", por exemplo, porin 1.
6. Autordiografia
- Seque o gel em uma secadora de gel. Mantenha-o no com uma tela de fósforo de armazenamento por 3-5 dias.
NOTA: Uma alternativa para a triagem do gel seco é a transferência de proteínas para uma membrana de nitrocelulose por eletro-mancha e triagem posteriormente. Resulta em sinais mais fortes e bandas mais nítidas. - Escaneie a tela em um fósforo.
NOTA: Como alternativa à imagem de fósforo, a película de raios-X também pode ser usada para revelar os sinais.
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Representative Results
Seguindo o protocolo descrito acima, atribuímos produtos de tradução mitocondrial de duas cepas de S. cerevisiae: o tipo selvagem(WT) e uma exclusão de rolamento mutante do gene AIM23 (AIM23Δ),codificando o fator de iniciação da tradução mitocondrial 3(Tabela 1)8. Os produtos de tradução mitocondrial foram rotulados radioativamente e separados em SDS-PAAG9. As amostras foram coletadas a cada 2,5 minutos antes da saturação para a construção de um curso de tempo(Figura 1A). O gel foi manchado, seco e exibido após a exposição de 5 dias(Figura 1A).
No caso de um experimento bem sucedido, a imagem demonstra oito bandas atribuídas de acordo com o padrãopadrão 4. No entanto, as intensidades das bandas individuais podem ser altamente variáveis dependendo da tensão e das condições experimentais. Cada banda corresponde a um produto de tradução. Os dados (Figura 1A) sugerem que a cepa AIM23Δ é capaz de síntese de proteína mitocondrial porque todos os produtos que aparecem no WT são visíveis neste mutante. No entanto, as intensidades das bandas são diferentes do WT, o que significa que a exclusão do AIM23 afeta a expressão genética mitocondrial8. A coloração da Coomassie Brilliant Blue serve como controle de carga.
Os dados resultantes podem ser quantificados (Figura 1B) para identificar diferenças entre cepas ou condições experimentais usando o software ImageJ10 ou ImageQuant. Para isso, as razões do sinal correspondente a cada produto ao sinal total são calculadas. Valores médios e desvios padrão são calculados em pelo menos três experimentos independentes.
A cinética da rotatividade de proteínas sintetizadas é estudada em um experimento de perseguição de pulso(Figura 1C). As amostras são coletadas nos pontos de tempo indicados após a reação de rotulagem ser interrompida por methionina fria e puromycine na etapa 2.4. Esse controle é necessário para estimar a estabilidade dos produtos porque a intensidade do sinal é resultado de dois processos opostos: síntese de novas cadeias e degradação proteica. Imunostaining com anticorpos anti-porína 1 é um controle de carga.
Figura 1: Rotulagem radioativa representativa de produtos de tradução mitocondrial de leveduras. (A) Curso temporal de 35incorporações de S-metionina em proteínas mitocondrialmente sintetizadas em células de levedura viva das cepas WT e AIM23Δ. A coloração da Coomassie Brilliant Blue é um controle de carga. (B) Níveis de proteínas mitocondrialmente codificadas após 5 min de rotulagem com 35S-methionina. A expressão relativa é normalizada à expressão total de genes proteicos mitocondriais codificados. As barras de erro indicam o desvio padrão da média de pelo menos três experimentos independentes. (C) Rotatividade de proteínas mitocondrialmente sintetizadas em cepas de tipo selvagem e Aim23Δ. A rotulagem foi interrompida e as amostras foram coletadas nos pontos de tempo indicados. Imunostaining com anticorpo anti-porína 1 é um controle de carga. (D) Experimento sub-ideal com a antiga 35S-methionina, radioautografia. Figura 1A, B,C são adaptados a partir de8 com pequenas modificações. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| coar | genótipo |
| Wt | MATα mal |
| AIM23Δ | MATα mal, AIM23::KanMX4 |
Mesa 1. Genótipos de cepas de S. cerevisiae
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Discussion
Investigações de expressão genética ocupam uma parte central nas ciências da vida moderna. Inúmeros métodos que fornecem insights sobre esse processo complexo foram desenvolvidos. Aqui, descrevemos o método que permite acessar a biossíntese proteica na levedura s. cerevisiae mitocôndrias. Geralmente é aplicado para comparar a eficiência de tradução dos mRNAs em mitocôndrias de levedura mutante versus tipo selvagem para acessar as consequências da mutação estudada. Este é um dos experimentos básicos que os pesquisadores realizam quando estudam a função mitocondrial das células de levedura com a mutação sugerida para influenciar mitocôndrias8,11,12,13. É frequentemente combinado com as medidas da taxa de consumo de oxigênio e potencial de membrana mitocondrial. No entanto, as informações que fornece não são suficientes para distinguir qual estágio da expressão genética é afetada. Um conjunto de experimentos adicionais é necessário para descobri-lo. Em primeiro lugar, a avaliação da mancha norte ou RT-qPCR das mRNAs mitocondriais é necessária para avaliar a etapa transcricional. Em segundo lugar, uma mancha ocidental de extratos totais de proteínas com anticorpos específicos deve ser feita para avaliar o nível de proteína. Em terceiro lugar, o pulso de 35S-methionina (quente) deve ser continuado com a adição de methionina não rotulada (fria) e vários pontos de tempo devem ser coletados e analisados no gel para investigar a estabilidade das proteínas.
A análise precisa da expressão genética mitocondrial usando rotulagem de pulso 35S requer reações de controle, especialmente quando o pesquisador não tem experiência em manuseá-la ou trabalha com uma nova cepa de levedura ou um mutante. Nestes casos, um bom controle negativo é uma cepa rho0 desprovida de DNA mitocondrial. Mostra uma eficiente inibição de cicloheximida da tradução citosolica e confirma que o padrão de banda é específico de tradução mitocondrial. Se a cepa rho0 não estiver disponível, então sugerimos incluir clororamfenicol junto com ciclohiteximida para inibir toda a síntese proteica para confirmar a eficiência e especificidade do padrão de banda.
A modificação mais próxima do protocolo é a perseguição de pulso quando a cultura é incubada no shaker (passo 2.4) mais longo do que o sugerido no experimento de pulso(Figura 1C). É usado para estudar o volume de negócios e estabilidade dos produtos de tradução mitocondrial. Há outra modificação do método quando a rotulagem radioativa é feita em organello, não in vivo4. Sugere o isolamento das mitocôndrias das células de levedura. Esta modificação é mais rápida se mitocôndrias congeladas foram previamente estocadas em alíquotas. Outra vantagem é a ausência de tratamento cicloheximida, que afeta diferentes aspectos do metabolismo celular. No entanto, o isolamento das mitocôndrias e o congelamento podem perturbá-las dos complexos de tradução nas organelas que fornecem um quadro artificial. Outra modificação importante do protocolo pode ser feita após a separação de produtos de tradução mitocondrial em gel de poliacrilamida (passo 5). Em vez de Coomassie Brilliant Blue colorindo e secando o gel, a proteína pode ser transferida para a membrana de nitrocelulose por eletro-blotting. Isso resulta em sinais mais fortes e mais nítidos. A principal razão é que o 35S decai por emissão de partículas beta com penetração muito curta, de modo que o sinal é facilmente rastreado nesta abordagem. As condições eletroforéticas também podem ser modificadas para proporcionar uma melhor resolução. Um ponto é adicionar 6M de ureia no gel, o que melhora a separação de ATP8 e ATP914. Outra forma é usar géis gradientes de 15%a 20%.
O perfil translacional15 é o método usado para mergulhar mais fundo nas alterações da tradução mitocondrial. Em comparação com a rotulagem radioativa, permite estabelecer posições de ribossomos mitocondriais no mRNA, o que torna possível encontrar o passo exato (iniciação, alongamento ou término) sendo afetado. No entanto, o perfil é muito mais caro, complicado e demorado. Racionalmente, pode ser feito após o experimento de incorporação do rótulo, não vice-versa. Recentemente, uma nova abordagem para monitorar a tradução mitocondrial da levedura foi desenvolvida16. Evita o tratamento com cicloheximida, o que é vantajoso porque esse tratamento afeta o metabolismo celular e as vias de sinalização. Em vez de incorporação radioativamente rotulada de aminoácidos, utiliza a inserção de um gene recodificado para GFP super-dobrado (sfGFP) no genoma mitocondrial da levedura, que permite a medição direta da tradução mitocondrial usando citometria de fluxo. No entanto, a aplicação desta abordagem requer a cepa especial de levedura com DNA mitocondrial modificado contendo sequência de codificação sfGFP colocada entre sequências de flanqueamento de 5'- e 3'- de um determinado gene mitocondrial.
O experimento de incorporação do rótulo inclui várias etapas críticas, que não podem ser comprometidas em um experimento bem-sucedido. Em primeiro lugar, devem ser utilizadas culturas frescas de levedura (passo 1.1). Não é recomendável manter leveduras nas placas por mais de 1 mês; caso contrário, eles podem se comportar de forma imprevisível neste ensaio. Em segundo lugar, a solução de cicloheximida deve ser preparada fresca antes do experimento e armazenada congelada não mais do que 1 semana (etapa 2.1). A solução antiga perde sua capacidade de inibir a tradução citoplasmática resultando em um padrão de banda completamente aberrante na radioautografia. Em terceiro lugar, 35S-methionine deve ser fresco e ativo (passo 2.2), caso contrário, as intensidades das bandas serão fracas(Figura 1D). Não é recomendado usar o reagente que passou quatro meias-vidas (4 x 87,4 dias). Evite ferver as amostras de proteína a 95 °C como os guias de preparação da amostra padrão sugerem (passo 4.8) porque as proteínas mitocondriais são altamente hidrofóbicas e propensas à agregação.
Existem várias questões comuns que se pode experimentar ao lidar com esse método. A primeira é a intensidade fraca das bandas na radioautografia. Para consertá-lo, certifique-se de que o fresco 35S-methionine é usado, uma quantidade suficiente de células de levedura é tomada, e as proteínas não se agregam nos bolsos do gel, que podem ser controlados pela coloração coomassie. Mantenha o gel seco com a tela por nada menos que 3 dias. O segundo problema é o padrão de banda incorreto. Se for encontrado, certifique-se de que são utilizadas placas de levedura fresca e cicloheximida recém-preparada. Tenha em mente que as intensidades relativas das bandas podem variar muito em diferentes cepas de leveduras e condições de eletroforese. Faz pouco sentido carregar a escada de peso molecular da proteína no gel, uma vez que os produtos de tradução mitocondrial nunca são separados de acordo com suas massas moleculares neste procedimento porque são altamente hidrofóbicos. Assim, Cox I (58 kDa) migra mais rápido que Var 1 (47 kDa). Dependendo das condições do tampão, as proteínas podem até mudar de posição com um dos vizinhos. A terceira questão comum é a imagem borrada sem faixas afiadas observadas após a coloração de Coomassie. Indica os erros na fundição do gel, composição tampão incorreta ou degradação de proteínas nas amostras. Recomenda-se preparar novos tampões de gel e tampão de execução verificando cuidadosamente a composição e os valores de pH.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Esta pesquisa foi financiada pela Fundação Russa de Pesquisa Básica, bolsa número 18-29-07002. P.K. foi apoiado pela Atribuição Estadual do Ministério da Ciência e Educação Superior da Federação Russa, número de subvenção AAAA-A16-116021660073-5. M.V.P. foi apoiado pelo Ministério da Ciência e Educação Superior da Federação Russa, bolsa número 075-15-2019-1659 (Programa do Centro Kurchatov de Pesquisa de Genoma). O trabalho foi parcialmente feito no equipamento adquirido no quadro do Programa de Desenvolvimento da Universidade Estadual de Moscou. I.C., S.L., e M.V.B. foram apoiados adicionalmente pela bolsa da Universidade Estadual de Moscou "Leading Scientific School Noah's Ark".
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
| Acrylamide | Sigma-Aldrich | A9099 | |
| Ammonium persulfate | Sigma-Aldrich | A3678 | |
| Bacteriological agar | Sigma-Aldrich | A5306 | |
| Biowave Cell Density Meter CO8000 | BIOCHROM US BE | 80-3000-45 | |
| BRAND standard disposable cuvettes | Sigma-Aldrich | Z330361 | |
| chloroform | Sigma-Aldrich | 288306 | |
| cycloheximide | Sigma-Aldrich | C1988 | |
| D-(+)-Galactose | Sigma-Aldrich | G5388 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| digital block heater | Thermo Scientific | 88870001 | |
| EasyTag L-[35S]-Methionine, 500µCi (18.5MBq), Stabilized Aqueous Solution | Perkin Elmer | NEG709A500UC | |
| Eppendorf Centrifuge 5425 | Thermo Scientific | 13-864-457 | |
| GE Storage Phosphor Screens | Sigma-Aldrich | GE29-0171-33 | |
| L-methionine | Sigma-Aldrich | M9625 | |
| methanol | Sigma-Aldrich | 34860 | |
| N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine | Sigma-Aldrich | T9281 | |
| N,N′-Methylenebisacrylamide | Sigma-Aldrich | M7279 | |
| New Brunswick Innova 44/44R Shaker Incubator | New Brunswick Scientific | ||
| Peptone from meat, bacteriological | Millipore | 91249 | |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride | Sigma-Aldrich | P7626 | |
| Pierce 660nm Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 22662 | |
| PowerPac Basic Power Supply | Bio-Rad | 1645050 | |
| Protean II xi cell | Bio-Rad | 1651802 | |
| Puromycin dihydrochloride from Streptomyces alboniger | Sigma-Aldrich | P8833 | |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 221465 | |
| Storm 865 phosphor imager | GE Healthcare | ||
| Trizma base | Sigma-Aldrich | 93352 | |
| Vacuum Heated Gel Dryer | Cleaver Scientific | CSL-GDVH | |
| Yeast extract | Sigma-Aldrich | Y1625 |
References
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