Summary
Denne studien presenterer anvendelsen av levende bukspyttkjertelvev skiver til studiet av holme fysiologi og holme-immuncelle interaksjoner.
Abstract
Levende bukspyttkjertelvev skiver tillater studiet av holmefysiologi og funksjon i sammenheng med et intakt holmemikromiljø. Skiver fremstilles fra levende menneske- og muspankreasvev innebygd i agarose og kuttes ved hjelp av en vibratom. Denne metoden gjør det mulig for vevet å opprettholde levedyktighet og funksjon i tillegg til å bevare underliggende patologier som type 1 (T1D) og type 2 diabetes (T2D). Skivemetoden muliggjør nye retninger i studiet av bukspyttkjertelen gjennom vedlikehold av de komplekse strukturene og ulike intercellulære interaksjoner som utgjør bukspyttkjertelens endokrine og eksokrine vev. Denne protokollen demonstrerer hvordan man utfører farging og tidsforløpmikroskopi av levende endogene immunceller i bukspyttkjertelskiver sammen med vurderinger av holmefysiologi. Videre kan denne tilnærmingen raffineres for å skjelne immuncellepopulasjoner som er spesifikke for holmecelleantigener ved hjelp av store histokompatibilitetskompleks-multimer reagenser.
Introduction
Involvering av bukspyttkjertelen er patognomisk for sykdommer som pankreatitt, T1D og T2D1,2,3. Studiet av funksjon i isolerte holmer innebærer vanligvis fjerning av holmene fra deres omkringliggende miljø4. Den levende bukspyttkjertelvevsskivemetoden ble utviklet for å tillate studiet av bukspyttkjertelvev samtidig som intakte holmemikromiljøet opprettholdes og unngår bruk av stressende holmeisolasjonsprosedyrer5,6,7. Bukspyttkjertelvev skiver fra humant donorvev har blitt vellykket brukt til å studere T1D og har demonstrert prosesser for betacelletap og dysfunksjon i tillegg til immuncelleinfiltrasjon8,9,10,11,12,13. Den levende bukspyttkjertelvevsskivemetoden kan brukes på både mus og humant bukspyttkjertelvev5,6,8. Humane bukspyttkjertelvev skiver fra organ donor vev er oppnådd gjennom et samarbeid med Nettverket for bukspyttkjertelen organ donorer med diabetes (nPOD). Museskiver kan genereres fra en rekke forskjellige musestammer.
Denne protokollen vil fokusere på ikke-overvektig diabetisk-rekombinasjon som aktiverer gen-1-null (NOD. Rag1-/-) og T-cellereseptortransgene (AI4) (NOD. Rag1-/-. AI4 α/β) musestammer. NIKKE. Rag1-/- mus kan ikke utvikle T- og B-celler på grunn av forstyrrelser i det rekombinasjonsaktiverende genet 1 (Rag1)14. NIKKE. Rag1-/-. AI4 α/β mus brukes som modell for akselerert type 1 diabetes fordi de produserer en enkelt T-celle klone som retter seg mot en epitop av insulin, noe som resulterer i konsistent holmeinfiltrasjon og rask sykdomsutvikling15. Protokollen som er omtalt her beskriver prosedyrer for funksjonelle og immunologiske studier ved hjelp av levende bukspyttkjertelskiver for mennesker og mus gjennom bruk av konfiskeringsmikroskopitilnærminger. Teknikkene som er beskrevet her inkluderer levedyktighetsvurderinger, holmeidentifikasjon og plassering, cytosoliske Ca2 + opptak, samt farging og identifisering av immuncellepopulasjoner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
MERKNADER: Alle eksperimentelle protokoller ved hjelp av mus ble godkjent av University of Florida Animal Care and Use Committee (201808642). Humane bukspyttkjertelseksjoner fra vevsdonorer av begge kjønn ble oppnådd via Nettverket for bukspyttkjertelorgandonorer med diabetes (nPOD) vevsbank, University of Florida. Human pankreat ble høstet fra kadaveriske organdonorer av sertifiserte organinnkjøpsorganisasjoner som samarbeider med nPOD i samsvar med organdonasjonslover og -forskrifter og klassifisert som Ikke-menneskelige av University of Florida Institutional Review Board (IRB) (IRB nr. 392-2008), og frasier seg behovet for samtykke. nPOD vev spesielt brukt for dette prosjektet ble godkjent som ikke-menneskelige av University of Florida IRB (IRB20140093). Målene med seksjon 1-3 i denne protokollen er å forklare hvordan du vellykket dissekerer en mus, forbereder og behandler bukspyttkjertelen og genererer levende bukspyttkjertelvevskiver. Løsninger bør tilberedes på forhånd, og oppskriftene finnes i supplerende tabell 1. Tid er den mest kritiske faktoren i disse protokolltrinnene. Når musen er ofret, vil vevs levedyktigheten begynne å avta. Alle tre delene av denne protokollen må fullføres så raskt som mulig til alle nødvendige stykker genereres.
1. Forberedelse for generering av mus bukspyttkjertel skiver
- Klem bladet fast på vibratombladholderen, men ikke fest det til vibratomet ennå.
- Smelt 100 ml 1,25 % m/v lavt smeltepunkt i mikrobølgeovn. Bruk mikrobølgeovnen i intervaller på 1 min, og stopp mikrobølgeovnen i 10 s hvis agaroseoppløsningen begynner å koke. Gjenta denne prosessen til agarose smeltes, og en homogen løsning produseres. Plasser flasken i et vannbad på 37 °C.
MERK: Den lave agarosekonsentrasjonen er å ta hensyn til den lavere tettheten av musens bukspyttkjertel. - Fyll en 10 ml Luer låsesprøyte med 3 ml varm agarose. Monter en kanyle på 27 G 25 mm på sprøyten. Oppbevar sprøyten med den vedlagte kanylen i et 37 °C vannbad til oppløsningen skal injiseres.
MERK: En 27 G nål foretrekkes da den passer sikkert inn i den vanlige gallekanalen til mus mellom 10-25 g i kroppsvekt og gir mulighet for strømning av den svært viskøse agaroseoppløsningen. Mens større borenåler kan velges for bruk, anbefales ikke mindre (større gauge) nåler, da disse lettere kan tilstoppes med agaroseoppløsningen. - Tilsett 20 ml kjølt ekstracellulær oppløsning (ECS) til en 10 cm Petri-tallerken.
MERK: ECS trenger ikke å bobles på noe tidspunkt. - Fyll to 10 cm ubehandlede Petri-retter med 15 ml Krebs-Ringer bikarbonatbuffer (KRBH) som inneholder 3 mM D-glukose og soyabønne trypsinhemmer i en konsentrasjon på 0,1 mg/ml per tallerken.
MERK: Gjennom denne protokollen er det viktig at alle løsninger som brukes til å opprettholde skiver inneholder soyabønne trypsin inhibitor for å forhindre vevsskade forårsaket av bukspyttkjertelen fordøyelsesproteaser.
2. Mus bukspyttkjertel eksisjon og vev behandling
MERK: Protokollen for utskillelse av bukspyttkjertelen, behandling av vevet og generering av skiver er modifisert fra Marciniak et al5. For å sikre vevs levedyktighet, minimere tiden mellom fjerning av bukspyttkjertelen og skivegenerering. Alt nødvendig utstyr bør utarbeides på forhånd og innrettes på en måte som muliggjør rask progresjon gjennom trinnene nedenfor. Gallekanalkanulering og injeksjon samt bukspyttkjertel eksisjon utføres best under et stereoskop.
- Musen er dypt bedøvet med isofluran og ofret av cervical dislokasjon.
MERK: Isofluran er den foretrukne bedøvelsesmetoden. En konsentrasjon på 5% isofluran bør brukes. For eksempel bør 0,26 ml brukes med et 1 L kammer16. En reduksjon i levedyktigheten i bukspyttkjertelen ble observert ved bruk av CO2 . - Spray musen med 70% v / v etanol liberalt for å redusere vevsforurensning med pels under disseksjon og eksisjon. Plasser musen i en dorsal ned, ventral opp orientering med den fremre siden til venstre.
- Bruk saks, åpne bukhinnen og fjern ribbeburet, pass på at du ikke punkterer hjertet eller tilstøtende kar. Bruk tang til å snu leveren inn i brysthulen, og for å flytte tarmene ut av kroppshulen for å eksponere den vanlige gallekanalen. Bruk en Johns Hopkins bulldog klemme for å okkludere ampulla av Vater.
- Hent en 10 ml Luer låsesprøyte forhåndslastet med 3 ml varm agaroseoppløsning fra vannbadet på 37 °C.
MERK: Når sprøyten med agarose er fjernet fra vannbadet, må bukspyttkjertelinjeksjonen utføres raskt før agarose avkjøles og settes i sprøyten. - Hold tangene i venstre hånd, bruk dem til å forsiktig støtte og stabilisere gallekanalen til injeksjonen.
- Hold sprøyten i høyre hånd, sett kanylen opp i gallekanalen. Injiser bukspyttkjertelen langsomt og jevnt. Når injeksjonen starter, kan strømmen ikke stoppes uten agaroseherding i sprøyten og i bukspyttkjertelen.
MERK: Volumet som brukes, avhenger av musens vekt. Basert på erfaring anbefales det at 1 ml agaroseoppløsning brukes per 10 g mus kroppsvekt med et maksimalt volum på 2 ml. Bukspyttkjertelen skal se litt oppblåst ut med en mer definitiv struktur, men ikke overeksponert. Overinjeksjon resulterer i holmer som blir skilt fra eksokrinevevet og som har et "blåst ut" utseende i skivene. - Sluk den agarosefylte bukspyttkjertelen fra musen. Bruk tang og saks, kutt bukspyttkjertelen bort, start i magen, flytt til tarmene og avslutt ved milten. Når du er kuttet bort, fjern forsiktig den injiserte bukspyttkjertelen med tang, og legg i en 10 cm Petri-tallerken fylt med kjølt ECS.
- Bruk saks til å fjerne fett, bindevev, fibrotisk vev og deler av bukspyttkjertelen som ikke injiseres med agarose.
MERK: Deler av vevet som skal fjernes vil ikke ha sterkt etablerte strukturer og vil virke noe gelatinøse. - Etter å ha trimmet vevet, bruk saks for å kutte det i mindre seksjoner som er ca. 5 mm i diameter mens du forlater det nedsenket under ECS. Klipp vevet forsiktig, pass på å ikke skyve agarose ut av vevet.
- Fjern vevsstykkene fra ECS, og legg dem på en to-lags visker (se materialtabellen). Rull dem forsiktig på viskeren ved hjelp av tang for å fjerne overflødig væske.
- Bruk tang, legg forsiktig vevsstykkene i en 35 mm Petri-tallerken med ikke mer enn 4 stykker per tallerken. Plasser den flateste siden av vevsblokken vendt nedover. Trykk forsiktig ned på vevet ved hjelp av tang.
MERK: Pass på at det er plass, minst noen få millimeter, mellom vevsstykkene, og at de ikke berører kanten av platen. - Hell langsomt 37 °C agarose i parabolen, pass på at du ikke heller den direkte på vevet. Hell nok slik at vevsstykkene er helt dekket. Pass på at det er et lag med agarose over vevsstykkene, da denne delen vil bli limt til prøveholderen.
- Overfør forsiktig parabolen med vevsstykkene til et kjøleskap for å la agarose sette. Pass på at vevsstykkene ikke skifter eller begynner å flyte. Hvis de gjør det, juster dem raskt ved hjelp av tang.
MERK: Innstilling av agarose bør bare ta noen få minutter. - Når agarose har satt, bruk en skalpell til å kutte rundt vevet i rette linjer for å lage agarose blokker som om du gjør et rutenett mellom biter av vev. Pass på å forlate noen få millimeter agarose rundt alle sider av vevet.
MERK: Det skal ikke være noe vev som stikker ut fra agarose. Hver blokk skal være en terning på ca. 5 mm x 5 mm x 5 mm volum. - Bruk skalpellen til å vippe ut de tomme delene av agarose som ble kuttet rundt kantene på platen. Fjern blokkene med vevet fra parabolen ved å løfte dem forsiktig med tang.
3. Generering av pankreasskiver for mus
- Bruk tang, ordne blokkene på prøveholderen; plasser dem sidelengs, husk at de vil bli vendt på superlimet. Ordne blokkene slik at de ikke strekker seg lenger enn bladbredden. Når vibratomet beveger seg sakte, ordner du blokkene slik at bladet må bevege seg fremover minst mulig avstand.
MERK: To rader med tre eller fire blokker hver med noen få millimeter mellom radene fungerer bra. Blokkene i samme rad kan berøre hverandre, men når begge radene berøres, kan det være vanskelig å hente stykker når de kommer ut av blokkene. - Påfør en linje med superlim på prøveholderen, og bruk enden av limdispenseren til å spre limet ut i et tynt lag. Vend vevsblokkene på limet slik at siden nærmest vevet vender oppover. Trykk forsiktig ned på blokkene, og la limet tørke i tre minutter.
- Fest bladholderen og platen til vibratomet, vanligvis med enten en skrue eller magnet, avhengig av vibratommodellen. Juster bladhøyden og tilbakelagt avstand slik at bladet beveger seg over lengden på blokkene og knapt over dem.
MERK: Tang kan være nyttige når du justerer bladhøyden. De kan plasseres på toppen av vevsblokken for å plassere bladet så nær toppen av blokken som mulig uten å berøre blokken. - Påse at limet har tørket ved å skyve blokkene forsiktig med tang, og fyll vibratombrettet med kjølt ECS til bladet er dekket. Still inn vibratomet til å lage 120 μm tykkelse skiver med en hastighet på 0,175 mm / s, en frekvens på 70 Hz og en amplitude på 1 mm.
MERK: Vibratomhastigheten kan justeres avhengig av hvor enkelt det er å kutte vevet. - Start vibratomet, og se etter når skiver begynner å komme ut av vevsblokkene. Bruk 10 cm Graefe tang eller en liten No. 4 pensel for å forsiktig fjerne skivene når de flyter av blokken, og legg dem i 10 cm plater med KRBH som inneholder 3 mM D-glukose og trypsinhemmer. Plukk opp skivene ved å plassere en pensel eller tang under dem og forsiktig løfte skivene. Ikke inkuber mer enn 15 skiver sammen i en enkelt plate.
MERK: Det er normalt at vibratomet har noen få passeringer over blokkene der det ikke lages skiver, men disse bør minimeres for tid. Ha saks klar i tilfelle skivene ikke helt skiller seg fra vevsblokkene. Hvis dette skjer, vil et hjørne eller en kant av stykket bli sittende fast i blokken etter at vibratombladet passerer. Ikke trekk av skiven eller blokken når du fjerner den fastlåste skiven. - Plasser platene med skivene på en rocker ved romtemperatur og ved 25 rpm. La skivene hvile ved romtemperatur i en time. Hvis de skal stå lenger, plasserer du skivene i 15 ml skivekulturmedium (se Supplerende tabell 1) i en inkubator. Inkuber skiver forberedt for samme dag studier ved 37 °C, og kulturskiver som dyrkes over natten ved 24 °C, og overfører dem til 37 °C minst 1 time før eksperimenter.
MERK: På lang sikt har skivene bedre levedyktighet når de dyrkes ved 24 °C, selv om 37 °C er nærmere sitt opprinnelige fysiologiske miljø, sannsynligvis på grunn av den lavere aktiviteten til de utskilte protease enzymene ved lavere temperatur. Mus og humane bukspyttkjertelvev skiver er begge dyrket ved samme temperatur og med maksimalt 15 skiver per tallerken. Medieoppskriftene er imidlertid forskjellige for menneskelige og museskiver. Begge formuleringene er oppført i Supplerende tabell 1. I tillegg er prosedyren den samme for å generere mus og menneskelige skiver med unntak av musen bukspyttkjertelen som krever injeksjon med agarose for stabilisering. Menneskelige skiver er anskaffet gjennom nPOD Pancreas Slice Program. Både mus og menneskelige skiver er 120 μm tykke. En rekke eksperimenter kan utføres på stykkene; velg fargepaneler som fungerer best for planlagte eksperimenter.
4. Klargjøring av skiver for fargingsprosedyrer
- Kultur skivene ved 37 °C i minst 1 time før de planlagte eksperimentene. Varm KRBH som inneholder 3 mM D-glukose i et 37 °C vannbad. Overfør 2 ml KRBH som inneholder 3 mM D-glukose i en 35 mm tallerken, og bruk en pensel til å plassere skiven forsiktig i parabolen.
- Hvis skiven overføres fra medium, vask den to ganger med KRBH som inneholder 3 mM D-glukose. Aspirer KRBH forsiktig med 3 mM D-glukose ved hjelp av en overføringspipette eller Pasteur pipette, pass på at du ikke forstyrrer skiven. Oppbevar skiven i platen med KRBH som inneholder 3 mM D-glukose mens fargingspanelene er tilberedt.
5. Dithizone flekker
MERK: Selv om dithizone kan brukes til å flekke holmene røde, vil det drepe stykket som det har vist seg å være cytotoksisk for holmer17.
- Mål 12,5 mg dithizon, tilsett det til 1,25 ml dimetylsulfoksid, og ta denne blandingen opp i en 50 ml sprøyte. Fyll sprøyten til et volum på 25 ml ved hjelp av Hanks Balansert saltoppløsning, og fest et filter til enden av sprøyten. Aliquot 2 ml KRBH med 3 mM D-glukose, og tilsett 2 dråper filtrert dithizoneoppløsning fra 50 ml sprøyten i en 35 mm tallerken.
- Bruk en pensel, legg forsiktig en skive i en 35 mm petriskål. Bilde stykket med holmer indikert av rød dithizone farging ved hjelp av et stereomikroskop.
6. Farging av levedyktighet
MERK: Denne delen av protokollen beskriver hvordan man vurderer skivens levedyktighet ved hjelp av calcein-AM og blå-fluorescerende SYTOX Blue (se materialtabellen). Calcein-AM skal brukes i en konsentrasjon på 4 μM og SYTOX Blue ved 1 μM.
- Aliquot 2 ml KRBH som inneholder 3 mM D-glukose, og tilsett 2 μL calcein-AM fargestoff og SYTOX Blue for å skille aliquots. Virvel blandingene i 5 s.
- Tilsett 200 μL KRBH som inneholder 3 mM D-glukose og calcein-AM fargestoff til hver brønn av et 8-brønns kammeret dekselglass.
MERK: Andre plater og/eller bildekamre enn et 8-brønns kammerdekselglass kan brukes. - Bruk en pensel, legg forsiktig en skive i hver brønn på platen, og overfør platen med skivene til en 37 ° C inkubator i 20 minutter. Vask skivene to ganger med KRBH som inneholder 3 mM D-glukose. Aspirer KRBH forsiktig ved hjelp av en overføring eller Pasteur pipette, pass på at du ikke forstyrrer skiven.
- Legg skiven i en 35 mm coverglassbunn Petri-tallerken som inneholder 2 ml KRBH med 3 mM D-glukose og 2 μL SYTOX Blue i en konsentrasjon på 1 μL per 1 ml oppløsning. Dekk stykket med et stykkeanker, og sørg for at siden med harpen vender nedover. Ta bilder av stykket.
MERK: Hvis skjæreankeret fortsetter å flyte, fukter du det på begge sider med KRBH som inneholder 3 mM D-glukose for å senke det ned i oppløsningen. Det er viktig å alltid opprettholde skivene i løsninger som inneholder proteasehemmer, selv under fargebelastning. Levedyktighetsflekker som brukes kan tilpasses det spesifikke eksperimentet eller mikroskopoppsettet.
7. Skive Ca2+ indikatorfarging
MERK: Denne delen av protokollen beskriver hvordan du flekker skiver for Ca2+ opptak ved hjelp av Oregon Green 488 BAPTA-1, AM og SYTOX Blue i museskiver (se materialtabellen). Oregon Green 488 BAPTA-1, AM bør brukes i en konsentrasjon på 5,6 μM og SYTOX Blue ved 1 μM. I menneskelige skiver bør Fluo-4-AM brukes i en konsentrasjon på 6,4 μM.
- Aliquot 2 ml KRBH som inneholder 3 mM D-glukose, tilsett 7 μL oregongrønn 488 BAPTA-1, AM og virvelblandingen i 5 s.
MERK: For humane vevsskiver, bruk Fluo-4-AM i stedet for Oregon Green 488 BAPTA-1, AM. Fluo-4-AM er å foretrekke fordi den er lysere når den intracellulære Ca2 + konsentrasjonen øker; Det laster imidlertid ikke godt i pankreasvev hos musen. Protokollen er den samme som beskrevet ovenfor for Fluo-4-AM med unntak av at Fluo-4-AM bare trenger å inkuberes i 30 minutter. - Tilsett 200 μL KRBH som inneholder 3mM D-glukose og fargestoffet til hver brønn av et 8-brønns kammeret dekselglass. Bruk en pensel, legg forsiktig en skive i hver brønn av det kamrede dekselglasset. Overfør det kamrede dekselglasset med skivene til en 37 °C inkubator i 45 minutter.
- Vask skivene to ganger med KRBH som inneholder 3 mM D-glukose. Aspirer KRBH forsiktig med 3 mM D-glukose ved hjelp av en overføring eller Pasteur pipette, pass på at du ikke forstyrrer skiven.
- Legg en skive i en bildeplate eller et kammer med KRBH som inneholder 3 mM D-glukose og SYTOX Blå i en konsentrasjon på 1 μL per 1 ml, og dekk med et skiveanker, og sørg for at harpen vender nedover. Ta bilder av stykket.
MERK: I denne protokollen ble det brukt en 35 mm tallerken fylt med 2 ml KRBH som inneholder 3 mM D-glukose og 2 μL SYTOX Blue. Hvis skjæreankeret fortsetter å flyte, fukter du det på begge sider med KRBH som inneholder 3 mM D-glukose for å senke det ned i oppløsning.
8. Mus skive Ca2 + opptak
MERKNADER: Følgende avsnitt beskriver hvordan du utfører Ca2+ opptak på pankreasvevskiver for mus ved hjelp av Oregon Green 488 BAPTA-1, AM og SYTOX Blue. Avbildning ble utført på et konfokalt laserskanningsmikroskop (se materialtabellen for detaljer). Laserne som ble brukt var 405 nm for SYTOX Blue, 488 nm for Oregon Green 488 BAPTA-1, AM og 638 nm for refleks. En HyD-detektor ble brukt til Oregon Green 488 BAPTA-1, AM. Fotomultiplierrørdetektorer (PMT) ble brukt til refleks og SYTOX Blue. Ca2+ avbildningsprotokollen er den samme for humane bukspyttkjertelvevsskiver bortsett fra at Fluo-4-AM ble brukt som indikator. Lasereffektnivåer, forsterkning og pinhole-størrelse bør justeres basert på prøven og den bestemte holmen som er avbildet. Vanligvis er et hull på 1,5 luftige enheter og en lasereffekt på 1% gode utgangspunkt.
- Minst 1 time før opptak, slå på mikroskopet og likevekte stage-top eller cage-stil inkubator til 37 °C. Plasser den 35 mm coverglassbunnen Petri-tallerkenen som inneholder skiven på scenen etter at lokket er fjernet. Fokuser ved å sette mikroskopet til 10x objektiv og brightfield-modus. Finn holmer ved hjelp av brightfield ved å se etter oransjebrune ovaler i stykket.
- Når en sannsynlig holme er plassert, bytter du mikroskopet til konfokal bildemodus. For å bekrefte holmer ved reflektiv, slå på 638 nm laseren, still inn lasereffekten mellom 1% og 2%, og slå av 638 nm hakkfilteret som normalt ville fjerne backscattered lys. Sett deteksjonsgrensene på PMT-detektoren til en båndbredde på ca. 20 nm sentrert rundt 638 nm.
MERK: Vær forsiktig da bruk av mikroskopet i refleksmodus kan skade detektoren. På grunn av den høye granulariteten til det endokrine vevet, kan reflektert lys nå brukes til å finne holmer. Holmene vil vises som grupper av sterkt backscattering granulære celler på denne reflekskanalen. - For å vise SYTOX Blue, slå på 405 nm laser- og PMT-detektoren, og still inn lasereffekten mellom 1% og 2%. Midtstille holmen av interesse for synsfeltet ved hjelp av X- og Y-knappene på trinnkontrolleren. Når en holmen av interesse er plassert og bekreftet av backscatter, bytt til 20x målet, og zoom inn slik at holmen tar opp det meste av rammen.
- Ta en z-stabel av holmen med en z-trinns størrelse på 1,5 μm. Finn den beste optiske delen av holmen der de fleste cellene er i live (negativt for SYTOX Blue) og godt lastet med Oregon Green 488 BAPTA-1, AM eller Fluo-4-AM.
MERK: Det er ikke uvanlig å se celler som er overbelastet med stor mengde fargestoff og som er veldig lyse. Disse kan være døende bukspyttkjertelceller der Ca2 + lagring i endoplasmic retikulum kan frigjøres, noe som resulterer i høye nivåer av lasting; Dette er ikke ideelle celler å registrere. Se etter celler som tydelig har lastet fargestoffet, men som ikke overmeter detektoren slik at en økning i lysstyrken som oppstår når cytosoliske Ca2+ nivåer svinger er synlig. Fargebelastning av holmer i skiver er variabel; Fargen laster imidlertid vanligvis godt gjennom ~ 10-15 μm av holmen. Fargebelastning kan imidlertid være vanskelig å visualisere hvis cellene er dype i vevet. - For å forhindre at fargestoffet falmer under opptaket, må du sørge for at laserstrømmen på 488 nm-kanalen ikke overstiger 2%. Øk pinhole til 2 luftige enheter for å samle mer signal med lavere eksitasjonskraft.
- Angi at mikroskopet skal ta opp i XYZT-modus. Optimaliser innstillingene for å redusere bildefrekvensen til 2 s eller mindre per bilde.
MERK: Innstillingsjusteringer som kan gjøres for å redusere bildefrekvensen, inkluderer å slå på toveis skanning, redusere eller slå av linjegjennomsnittet og øke skannehastigheten. - Når innstillingene er optimalisert, registrerer du flere minutter med basalaktivitet.
MERK: En annen god indikator på vevs levedyktighet er hvis cellene ser aktive ut og blinker synlig under denne registreringen av basalaktivitet. - Tilsett 100 μL 20x konsentrert glukose og KCl i KRBH til platen ved hjelp av en 200 μL mikropipette på de gitte tidspunktene for å oppnå en endelig konsentrasjon på 16,7 mM glukose eller 30 mM KCl.
MERKNADER: Legg til løsningene nøye, pass på at du ikke forstyrrer stykket under innspillingen. Pass på at du ikke støter platen med mikropipetten. Det er typisk å se vevet trekke seg sammen som svar på disse stimuleringene. Ca2+ flux-opptakene ble behandlet og kvantifisert i ImageJ18. Ved hjelp av ImageJ-programvaren, fargingsintensiteten til Oregon Green 488 BAPTA-1, ble AM målt i cellene ved å manuelt velge interesseområder (ROIer). Fluorescensintensiteten fra disse ROIene ble beregnet ved å dele fluorescensverdiene på senere tidspunkter med de første fluorescensverdiene til cellene (F / F0). Et perfusjonssystem kan brukes sammen med et spesialisert bildekammer for å administrere løsningene på skiver dynamisk i motsetning til å legge dem til manuelt. Perfusjonssystem og bildekammeranbefalinger finnes i materialtabellen.
9. Farging av mus T-celler i levende bukspyttkjertelskiver
MERK: Denne delen av protokollen beskriver hvordan du flekker immunceller i museskiver. Musestammen som brukes er NOD. Rag1-/-. AI4 α/β da denne modellen konsekvent utvikler sykdom med betydelig insulitt. CD8+ T-cellene i denne musen er alle rettet mot en epitop av insulin, slik at bruk av en fycoerythrin (PE)-merket insulin-Db tetramer15. CD8-antistoffet skal brukes i en konsentrasjon på 1:20 og insulintetrameren kl. 1:50.
- Aliquot 100 μL KRBH som inneholder 3 mM D-glukose, tilsett 2 μL PE insulin tetramer og 5 μL allophycocyanin (APC) CD8 antistoff, og virvel blandingen i 5 s.
- Tilsett 100 μL KRBH som inneholder 3 mM D-glukose og tetramer og antistoff til en brønn med et 8-brønns kammeret dekselglass. Bruk en pensel, legg forsiktig en skive i brønnen på det kamrede dekselglasset. Overfør det kamrede dekselglasset med skiven til en inkubator på 37 °C i 30 minutter.
- Vask skiven to ganger med 2 ml KRBH som inneholder 3 mM D-glukose. Aspirer KRBH forsiktig med 3 mM D-glukose ved hjelp av en overføring eller Pasteur pipette, pass på at du ikke forstyrrer skiven.
- Legg skiven i en 35 mm coverglassbunn Petri-tallerken som inneholder KRBH med 3 mM D-glukose og SYTOX Blue i en konsentrasjon på 1 μL per 1 ml, og dekk med et stykkeanker, plasser siden med harpen vendt nedover. Ta bilder av stykket.
MERK: Hvis skjæreankeret fortsetter å flyte, fukter du det på begge sider med KRBH som inneholder 3 mM D-glukose for å senke det ned i oppløsningen. Det fortynnede antistoffet og tetrameren kan gjenbrukes en gang. Etter farging av to skiver, bør det gjøres en frisk antistoffblanding.
10. Registrering av musens immunceller
MERK: Følgende avsnitt beskriver hvordan du utfører immuncelleopptak på pankreasvevskiver for mus ved hjelp av CD8-antistoff, PE-insulinterokromer og SYTOX Blue. Bildeoppsettet er som beskrevet i avsnitt 8. Innspillinger ble gjort med 800 × oppløsning på 800 piksler. Laserne som ble brukt var 405 nm for SYTOX Blue, 488 nm for insulin tetramer og 638 nm for CD8 antistoff og refleks. HyD-detektorer ble brukt til CD8 antistoff og PE insulin tetramer. PMT-detektorer ble brukt til refleks og SYTOX Blue. Immuncelleavbildningsprotokollen er den samme for humane bukspyttkjertelvevsskiver bortsett fra bruk av forskjellige antistoffer og antigenkomplekse HLA-multimere for humant vev. For både insulin tetramerfarging i musevev og HLA-multimerfarging i humant vev, bør en immuncelle co-flekk brukes til å verifisere tilstedeværelsen av de spesifikke antigenreaktive T-cellene. Her ble det brukt et anti-CD8 antistoff. Antistoffer, som anti-CD3 eller anti-CD4, kan også brukes avhengig av målcellepopulasjonen.
- Minst 1 time før opptak, slå på mikroskopet og likevekte trinn-topp inkubatoren til 37 °C. Fest den 35 mm coverglassbunnen Petri-tallerkenen som inneholder skiven på scenen. Fokuser mikroskopet ved å sette 10x-målet i brightfield-modus. Finn holmene ved hjelp av brightfield-modusen ved å se etter oransjebrune fargede ovaler i stykket.
- Bytt mikroskopet til konfektavbildning ved å trykke på CS-knappen på mikroskopets berøringsskjermkontroller. Hvis du vil vise holmer etter refleks, slår du på 638 laser- og PMT-detektoren, stiller inn lasereffekten mellom 1 % og 2 %, og slår av hakkfiltrene.
MERK: På grunn av den økte granulariteten til det endokrine vevet, kan reflektert lys nå brukes til å finne holmer. Holmene vises som grupper av lyse granulære celler på denne kanalen. - For å se SYTOX Blue, CD8 antistoff og insulin tetramer, kontroller at lasereffekten er mellom 1% og 2%. Bruk følgende innstillinger for å vise hver av de tre: For SYTOX Blue, slå på 405 nm laser og PMT detektor; for CD8-antistoffet, slå på HyD-detektoren; og for å se insulin tetramer, slå på 488 nm laser og HyD detektor.
- Midtstille holmen av interesse for synsfeltet ved hjelp av X- og Y-knappene på trinnkontrolleren. Når en holmen av interesse er plassert, bytt til 20x målet, og zoom inn slik at holmen tar opp det meste av rammen. Ta en z-stabel av holmen med en z-trinns størrelse på 1,5 μm. Finn de beste optiske seksjonene (en serie på mellom 5 og 10 seksjoner) av holmen der de fleste cellene er i live (negative for SYTOX Blue) og eventuelle omkringliggende immunceller er i fokus.
MERK: Prøv å finne rammer der det er flere CD8-positive og insulin tetramer-positive celler rundt eller infiltrere holmen. - Angi at mikroskopet skal ta opp i XYZT-modus. Optimaliser innstillingene for å registrere en Z-stabel med de valgte trinnene hvert 20.
MERK: Hvis det er mulig, er det best å gjøre disse opptakene i et bildekammer der temperatur og CO2-nivåer kan kontrolleres, spesielt når du registrerer i over fire timer. Ved opptak over natten kan overflødig antistoff legges til media for å kompensere for T-cellereseptorsykling og fargestofffading. I tillegg kan forskjellige fluoroforer brukes til T-celleantistoffer. Basert på erfaring fungerer antistoffer i det fjerne røde området best for T-celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne protokollen vil gi levende bukspyttkjertelvev skiver egnet for både funksjonalitetsstudier og immuncelleopptak. Stykkeutseende i både brightfield og under reflektert lys vises i figur 1A,B. Som diskutert kan holmer bli funnet i skiver ved hjelp av reflektert lys på grunn av deres økte granularitet som oppstår på grunn av insulininnholdet (figur 1C) og observeres tydelig sammenlignet med bakgrunnsvevet når reflektert lys brukes. Levedyktighet bør vurderes etter stykkegenerering, og holmer bør ikke registreres hvis mer enn 20% av holmen ikke er levedyktig. En holme med høy levedyktighet er vist i figur 1D, mens et eksempel på et dårlig bearbeidet stykke er vist i supplerende figur 1. Holmer med lav levedyktighet vil ha tung SYTOX Blå farging, og vevet vil bli dekket med fargede kjerner av døde celler. I tillegg vil calcein-AM og Ca2 + indikatorer som Oregon Green 488 BAPTA-1, AM som brukes her og Fluo-4-AM ikke laste godt i døde celler. Holmer bør velges for Ca2+ opptak hvis de er levedyktige og hvis indikatoren lastes gjennom hele holmen. Ca2+ indikatorbelastning indikerer celle levedyktighet som begge Ca2 + indikatorer diskutert i denne protokollen (Oregon Green 488 BAPTA-1, AM og Fluo-4-AM) lastes i celler gjennom samme mekanisme som levedyktighetsfargen, calcein-AM.
For både Ca2+ indikatorfargestoffer og calcein-AM, når flekkene lastes inn i celler, hydrolyseres acetoksymetylsteren i cellen, og molekylet blir membran ugjennomtrengelig19. En annen positiv indikator for levedyktighet er observerbar basalaktivitet gjennom hele holmen med celler som blinker av og på. Basal aktivitet bør også være observerbar i eksokrinvevet i mindre grad. Selv om musevev har en tendens til å ha mindre synlig basalaktivitet enn menneskelig vev, er det fortsatt til stede. En holme fra en skive laget av en NOD. Rag1-/- pankreas for mus vises i figur 2A. Som nevnt ovenfor, Oregon Green 488 BAPTA-1, AM som brukes her har en lavere fluorescensintensitetsøkning ved binding Ca2 + (~ 14 ganger) enn Fluo-4 (~ 100 ganger). Imidlertid har Oregon Green 488 BAPTA-1, AM fordelen med en lavere kalsiumdissosiasjonskonstant (Kd = 170 nM) enn Fluo-4 (Kd = 335 nM), noe som resulterer i at Oregon Green 488 BAPTA-1, AM er mer følsom for lavere konsentrasjoner av cytosolisk Ca2 +. Svarene er imidlertid fortsatt kvantifiserbare, som vist i figur 2B. Eksempler på en holme i en kontroll menneskelig bukspyttkjertelvevsskive i ro og av en som viser en sterk høy glukoserespons er vist i figur 2C og supplerende video 1. Fluo-4-AM fargestoff er lastet godt og er synlig gjennom hele holmen ved lave glukosekonsentrasjoner. Som diskutert ovenfor, er en typisk forekomst for en prosentandel av cellene å laste store mengder fargestoff og virke veldig lyse. Videre er bildeparametrene satt for dette opptaket, slik at de fleste cellene i holmen ikke vises for lyse ved lave glukosekonsentrasjoner. Dette gjør det mulig for detektoren å plukke opp økningen i lysstyrken som oppstår under endringer i intracellulære Ca2 + konsentrasjoner som svar på høye glukosenivåer. Kvantifiseringen av fluorescensen av individuelle celler under denne responsen er vist i figur 2D, med forventet topp etter høy glukosestimulering. ImageJ programvare ble brukt til å beregne farging intensiteten av Fluo-4-AM og Oregon Green 488 BAPTA-1, AM ved å manuelt velge ROIer. Foldeøkningen i fluorescensintensiteten for hver avkastning ble beregnet ved å normalisere fluorescensverdiene på senere tidspunkter ved hjelp av de opprinnelige fluorescensverdiene til cellene (F / F0).
Dithizone flekker holmene røde og er synlige under et brightfield stereomikroskop. Intakte holmer og holmer som begynner å falle fra hverandre på grunn av T1D-utbrudd, kan begge observeres ved hjelp av dette fargestoffet (figur 3A, B). Holmer kan bli funnet ved hjelp av reflektert lys (figur 3C) og kan begynne å miste granularitet på grunn av immuncelleinfiltrasjon og celledød (figur 3D). Flere CD3-positive celler kan sees infiltrere holmen i figur 3D. Immuncellepopulasjoner kan identifiseres mer spesifikt ved hjelp av CD8-antistoff og insulin-tetramerfarging. Imaging kan deretter brukes til å identifisere celler som er co-flekk for begge markørene (figur 3E). Samtidig farging av immuncellene som infiltrerer holmen i figur 3D indikerer at cellene er effektor T-celler som spesifikt er rettet mot insulinantigenet. CD8-koflekken er avgjørende for å skille mellom at områdene som flekker positivt for tetramer er immunceller. Tetrameren bør ikke brukes alene uten en immuncelle co-flekk. En farging sammenligning av musen CD8 antistoff og isotype kontroll Rat IgG2a, κ finnes i Supplerende figur 2. En ekstra sammenligning av en kontrolltetramer for lymfocytisk choriomeningitis virus (LCMV) tetramer og insulin tetramer finnes i Supplemental Figur 3. Noen T-celler forblir stasjonære gjennom hele opptaket, mange beveger seg litt innenfor et lite område av holmen, og andre er veldig mobile og kan ses bevege seg gjennom holmen og eksokrinevevet. Det er ikke uvanlig å se T-celler som viser flere mobilitetstyper i samme opptak.
Figur 1: Oversikt over skiver og individuelle holmer. (A) Darkfield stereomikroskopibilde av en levende menneskelig bukspyttkjertelvevskive med holmer indikert med røde piler. (B) Reflektert lysbilde av en levende menneskelig bukspyttkjertelvevskive med holmer indikert med hvite piler. (C) Reflektert lys bilde av en holme (skissert i magenta) i en levende menneskelig bukspyttkjertel vev skive. (D) Levedyktighetsfarging av en høy levedyktighets holme (skissert i magenta) i en levende menneskelig bukspyttkjertelvevskive. Levende celler er angitt i grønne og døde celler i blått. Skalastenger (A, B) = 1 mm; skalastenger (C, D) = 50 μm. Forkortelse: AM = acetoksymetyl ester. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Registreringer av endringer i intracellulære Ca2+- konsentrasjoner og respons på høy glukosekonsentrasjon av en levende NOD. Rag1-/- mus bukspyttkjertel vev skive og menneskelig bukspyttkjertel vev skiver fra en donor uten diabetes. (A) Bilder av en holme i en levende NOD. Rag1-/- pankreasskive for mus lastet med en Oregon Green 488 BAPTA-1, AM (se materialtabellen) som gjennomgår glukosestimulering. Fra venstre til høyre, et reflektert lysbilde av holmen, holmen i lav glukose og holmen i høy glukose. (B) Fluorescensspor av Ca2+ responsen til en holme i en levende NOD. Rag1-/- vevsskive med forventet respons på høy glukosekonsentrasjon [KRBH med 16,7 mM D-glukose (16,7 G)] og KCl [KRBH med 30 mM KCl og 3 mM D-glukose]. (C) Bilder av en holme i en levende menneskelig bukspyttkjertelskive lastet med Fluo-4-AM gjennomgår glukosestimulering. Fra venstre til høyre, et reflektert lysbilde av holmen, holmen i lav glukose og holmen i høy glukose. (D) Fluorescensspor av Ca2+ responsen til en holme i en levende human bukspyttkjertelvevskive med forventet respons på KRBH med 16,7 mM D-glukose (16,7 G). Skalastenger (A) = 100 μm; skalastenger (C) = 50 μm. Forkortelser: KRBH = Krebs-Ringer bikarbonatbuffer; KCl = kaliumklorid; NIKKE. Rag1-/- = ikke-overvektig diabetisk-rekombinasjon aktiverende gen-1-null; NIKKE. Rag1-/-. AI4 α/β = T cellereseptor transgen (AI4) musestamme. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Identifisering av holmer og immuncellepopulasjoner i NOD. Rag1-/- og NOD. Rag1-/-. AI4 α/β museskiver. (A) Dithizone farging av holmer i en NOD. Rag1-/- musskive med holmene angitt i rødt. (B) Dithizone farging av holmer i en NOD. Rag1-/-. AI4 α/β museskive med holmene angitt i rødt. Holmer mister sin form på grunn av sykdomsde begynnelse. (C) Reflektert lysbilde av en holme i en NOD. Rag1-/- museskive. (D) Reflektert lysbilde av en holme i en NOD. Rag1-/-. AI4 α/β museskive med CD3 antistofffarging (grønn). (E) Levedyktighetsfarging av døde celler (blå) og immuncellefarging (CD8 i grønt og insulintetramer i rødt) i en NOD. Rag1-/-. AI4 α/β museskive. Skalastenger (A) = 500 μm; skalastenger (B) = 50 μm; skalastenger (C) = 100 μm. Forkortelser: NOD. Rag1-/- = ikke-overvektig diabetisk-rekombinasjon aktiverende gen-1-null; NIKKE. Rag1-/-. AI4 α/β = T cellereseptor transgen (AI4) musestamme; CD = differensieringsklynge; insulin-tet = insulin tetramer. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Supplerende figur 1: NOD. Rag1-/- mus bukspyttkjertel stykke etter feil forberedelse uten trypsin inhibitor og en overnatting inkubasjon ved 37 °C. (A) Darkfield stereomikrokopi bilde av en levende NOD. Rag1-/- mus bukspyttkjertel vev skive; skala bar = 1 mm. (B) Reflektert lys bilde av en levende mus bukspyttkjertelen vev stykke; skala bar = 50 μm. (C) Levedyktighet farging av lav levedyktighet vev. Døde celler er angitt i blått; skala bar = 50 μm. Forkortelse: NOD. Rag1-/- = ikke-overvektig diabetisk-rekombinasjon som aktiverer gen-1-null. Klikk her for å laste ned denne filen.
Supplerende figur 2: Rotte IgG2a, κ isotype control antistoff (venstre) og rotte antimus CD8 antistoff (høyre) farging sammenligning i NOD. Rag1-/-. AI4 α/β museskiver. (A) Reflekterte lysbilder av live NOD. Rag1-/-. AI4 α/β pankreasvevskiver med mus som viser en holme (venstre) og blodkar (høyre). (B) Antistofffarging av levende NOD. Rag1-/-. AI4 α/β pankreasvevskiver i bukspyttkjertelen. (C) Overlegg av de reflekterte lys- og antistoffkanalene. Skalastenger for kontrollantistoff (venstre paneler) = 20 μm; skalastenger for CD8 antistoff (høyre paneler) = 50 μm. Forkortelser: NOD. Rag1-/- = ikke-overvektig diabetisk-rekombinasjon aktiverende gen-1-null; NIKKE. Rag1-/-. AI4 α/β = T cellereseptor transgen (AI4) musestamme; CD = differensieringsklynge; IgG = immunoglobulin G. Klikk her for å laste ned denne filen.
Supplerende figur 3: Lymfocytisk choriomeningitis virus tetramer (venstre) og insulin tetramer (høyre) farging sammenligning i NOD. Rag1-/-. AI4 α/β museskiver. (A) Reflekterte lysbilder av levende NOD. Rag1-/-. AI4 α/β musepankreas vev skiver som viser et blodkar i eksokrine vev (venstre) og holmer (høyre). (B) Tetramer farging av en levende NOD. Rag1-/-. AI4 α/β musevevskiver. (C) Overlegg av reflekterte lys- og tetramerkanaler. Forkortelser: NOD. Rag1-/- = ikke-overvektig diabetisk-rekombinasjon aktiverende gen-1-null; NIKKE. Rag1-/-. AI4 α/β = T cellereseptor transgen (AI4) musestamme; LCMV = lymfocytisk choriomeningitis virus; insulin-tet = insulin tetramer. Klikk her for å laste ned denne filen.
Supplerende video 1: Opptak av cytosolisk Ca2+ oppdaget med Fluo-4 som svar på høy glukosestimulering i en menneskelig bukspyttkjertelvevskive fra en kontrolldonor uten diabetes. Celler i vevet kan observeres for å vise basal Fluo-4 aktivitet i en lav glukoseoppløsning (3,0 mM), etterfulgt av en økning i Fluo-4 fluorescensintensitet som respons på stimulering med høy glukose (16,7 mM). Videoen tilsvarer stillbildene og sporene som vises i figur 2C,D. Klikk her for å laste ned denne videoen.
Supplerende tabell 1: Klikk her for å laste ned denne tabellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Målet med denne protokollen er å utvise generering av bukspyttkjertelskiver og prosedyrene som trengs for å bruke skivene i funksjonelle og immunologiske studier. Det er mange fordeler med å bruke levende bukspyttkjertelskiver. Det er imidlertid flere kritiske trinn som er avgjørende for at vevet skal forbli levedyktig og nyttig under de beskrevne eksperimentprotokollene. Det er viktig å jobbe raskt. Tiden mellom å injisere bukspyttkjertelen og generere skivene på vibratomet bør minimeres for å opprettholde vevs levedyktigheten. Levedyktigheten forbedres også ved å holde bukspyttkjertelen i kaldt ECS før kutting i motsetning til romtemperatur ECS. Det er viktig at skiver aldri skal være i medium uten proteasehemmer. Når skiver inkuberes uten proteasehemmeren, er det store reduksjoner i levedyktighet.
Når skivene ble kortvarig igjen uten hemmer under fargebelastning, kunne ca2 + fluxer som svar på høy glukose og KCl ikke lenger registreres til tross for at basalaktivitet fortsatt er synlig i stykket. Alle løsninger som brukes med levende skiver, inkludert KRBH med 3 mM D-glukose hvileoppløsning, antistoffinkubasjonsløsningen og eventuelle kulturmedier, må alle inneholde proteasehemmer i en konsentrasjon på 0,1 mg per ml. Indikatorpanelene som brukes til skiveavbildning kan endres avhengig av målet med eksperimentet og tilgjengeligheten av mikroskoplasere. Det er mange celle levedyktighet fargestoffer i forskjellige farger som kan brukes i stedet for SYTOX Blue som brukes her (se tabellen over materialer). For Ca2+ eksperimenter fungerer Fluo-4-AM bra i menneskelig vev. Noen forskere har suksess med å bruke Oregon Green 488 BAPTA-1, AM som brukes her (se materialtabellen) for museskiver, mens andre oppnår gode resultater med Fluo-4-AM20,21,22.
I tillegg kan mus som er utviklet for å uttrykke den genetisk kodede Ca2+-indikatoren, GCaMP, i holmene, brukes til å omgå behovet for å laste skivene med et Ca2+-indikatorfargestoff. Selv om Oregon Green 488 BAPTA-1, AM som brukes her ikke er så lyst som Fluo-4-AM, er Ca2 + svarene fortsatt observerbare og kvantifiserbare. Dette fremgår av økningen i fluorescerende topper vist i NOD. Rag1-/- skiveopptak etter høy glukose og KCl stimulering. Andre stoffer, som sulfonylureas og arginin, kan brukes som positive kontroller på slutten av Ca2+-protokollen, men de har ennå ikke blitt brukt med skiver23,24,25. Selv om det er mange fordeler med den levende pankreasvevsskivemetoden, er det også noen begrensninger. Selv om skivene kan forbli levedyktige i flere dager, er det bratte nedganger i levedyktighet og funksjonalitet hvis de dyrkes lenger, med mindre spesielle kulturforhold brukes11,26. I tillegg, ettersom skivene inneholder levende bukspyttkjerteleksokrinvev, vil acinarceller i skivene fortsette å produsere og frigjøre fordøyelsesenzymer som må hemmes ved hjelp av proteasehemmer. Derfor, når du bruker denne protokollen for menneskelige eller musestudier, må du alltid opprettholde skiver i løsninger med proteasehemmer.
Den levende pankreasvevsskivemetoden unngår å plassere bukspyttkjertelvevet under kjemisk stress ved bare å utsette vevet for mekanisk kraft under skivegenerering i motsetning til kjemikalier som brukes under holmeisolasjonsprosedyrer5. Videre opprettholdes intakt bukspyttkjertelvev, noe som gir et mer helhetlig syn på patologiene og fysiologien som forekommer naturlig i organet5. Ved hjelp av den levende pankreasvevsskivemetoden kan immuncelleaktivitet observeres in situ og sanntid sammen med vevsfunksjon. Ytterligere in vitro-avbildningsteknikker, for eksempel tofotonmikroskopi, har allerede blitt brukt på vevsskiver avledet fra tymus og kan brukes til levende bukspyttkjertelvev skiver27. Identifisering av immuncellepopulasjoner som er til stede i vevet sammen med deres aktiviteter og påvirkninger, vil tillate ny kunnskap på patogenesen av sykdommer som T1D og T2D.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen konkurrerende interesser.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble finansiert av NIH-tilskudd R01 DK123292, T32 DK108736, UC4 DK104194, UG3 DK122638 og P01 AI042288. Denne forskningen ble utført med støtte fra Network for Pancreatic Organ donorer med diabetes (nPOD; RRID:SCR_014641), et samarbeidsprosjekt av type 1 diabetes sponset av JDRF (nPOD: 5-SRA-2018-557-Q-R) og The Leona M. & Harry B. Helmsley Charitable Trust (Grant #2018PG-T1D053). Innholdet og synspunktene som uttrykkes er forfatternes ansvar og gjenspeiler ikke nødvendigvis det offisielle synet på nPOD. Organ Procurement Organizations (OPO) i samarbeid med nPOD for å gi forskningsressurser er oppført på http://www.jdrfnpod.org/for-partners/npod-partners/. Takk til Dr. Kevin Otto, University of Florida, for å gi vibratomet som brukes til å generere museskiver.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| #3 Style Scalpel Handle | Fisherbrand | 12-000-163 | |
| 1 M HEPES | Fisher Scientific | BP299-100 | HEPES Buffer, 1M Solution |
| 10 cm Untreated Culture Dish | Corning | 430591 | |
| 10 mL Luer-Lok Syringe | BD | 301029 | BD Syringe with Luer-Lok Tips |
| 27 G Needle | BD | BD 305109 | BD General Use and PrecisionGlide Hypodermic Needles |
| 35 mm coverglass-bottom Petri dish | Ibidi | 81156 | µ-Dish 35 mm, high |
| 50 mL syringe | BD | 309653 | |
| 8-well chambered coverglass | Ibidi | 80826 | µ-Slide 8 Well |
| APC anti-mouse CD8a antibody | Biolegend | 100712 | |
| BSA | Fisher Scientific | 199898 | |
| Calcium chloride | Sigma | C5670 | CaCl2 |
| Calcium chloride dihydrate | Sigma | C7902 | CaCl2 (dihydrate) |
| Compact Digital Rocker | Thermo Fisher Scientific | 88880020 | |
| Confocal laser-scanning microscope | Leica | SP8 | Pinhole = 1.5-2 airy units; acquired with 10x/0.40 numerical aperture HC PL APO CS2 dry and 20x/0.75 numerical aperture HC PL APO CS2 dry objectives at 512 × 512 pixel resolution |
| D-(+)-Glucose | Sigma | G7021 | C6H12O6 |
| ddiH2O | |||
| Dithizone | Sigma-Aldrich | D5130-10G | |
| DMSO | Invitrogen | D12345 | Dimethyl sulfoxide |
| Ethanol | Decon Laboratories | 2805 | |
| Falcon 35 mm tissue culture dish | Corning | 353001 | Falcon Easy-Grip Tissue Culture Dishes |
| FBS | Gibco | 10082147 | |
| Feather No. 10 Surgical Blade | Electron Microscopy Sciences | 7204410 | |
| fluo-4-AM | Invitrogen | F14201 | cell-permeable Ca2+ indicator |
| Gel Control Super Glue | Loctite | 45198 | |
| Graefe Forceps | Fine Science Tools | 11049-10 | |
| Hardened Fine Scissors | Fine Science Tools | 14090-09 | |
| HBSS | Gibco | 14025092 | Hanks Balanced Salt Solution |
| HEPES | Sigma | H4034 | C8H18N2O4S |
| Ice bucket | Fisherbrand | 03-395-150 | |
| Isoflurane | Patterson Veterinary | NDC 14043-704-05 | |
| Johns Hopkins Bulldog Clamp | Roboz Surgical Store | RS-7440 | Straight; 500-900 Grams Pressure; 1.5" Length |
| Kimwipes | Kimberly-Clark Professional | 34705 | Kimtech Science™ Kimwipes™ Delicate Task Wipers, 2-Ply |
| LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit | Invitrogen | L3224 | This kit contains the calcein-AM live cell dye. |
| Low glucose DMEM | Corning | 10-014-CV | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Sigma | M9272 | MgCl2 (hexahydrate) |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Sigma | M2773 | MgSO4 (heptahydrate) |
| Magnetic Heated Platform | Warner Instruments | PM-1 | Platform for imaging chamber for dynamic stimulation recordings |
| Microwave | GE | JES1460DSWW | |
| Nalgene Syringe Filter | Thermo Fisher Scientific | 726-2520 | |
| No.4 Paintbrush | Michaels | 10269140 | |
| Open Diamond Bath Imaging Chamber | Warner Instruments | RC-26 | Imaging chamber for dynamic stimulation recordings |
| Oregon Green 488 BAPTA-1-AM | Invitrogen | O6807 | cell-permeable Ca2+ indicator |
| Overnight imaging chamber | Okolab | H201-LG | |
| PBS | Thermo Fisher Scientific | 20012050 | To make agarose for slice generation |
| PE-labeled insulin tetramer | Emory Tetramer Research Core | sequence YAIENYLEL | |
| Penicillin Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Potassium chloride | Sigma | P5405 | KCl |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma | P5655 | KH2PO4 |
| Razor Blades | Electron Microscopy Sciences | 71998 | For Vibratome; Double Edge Stainless Steel, uncoated |
| RPMI 1640 | Gibco | 11875093 | |
| SeaPlaque low melting-point agarose | Lonza | 50101 | To make agarose for slice generation |
| Slice anchor | Warner Instruments | 64-1421 | |
| Slice anchor (dynamic imaging) | Warner Instruments | 640253 | Slice anchor for dynamic imaging chamber |
| Sodium bicarbonate | Sigma | S5761 | NaHCO3 |
| Sodium chloride | Sigma | S5886 | NaCl |
| Sodium phosphate monohydrate | Sigma | S9638 | NaH2PO4 (monohydrate) |
| Soybean Trypsin Inhibitor | Sigma | T6522-1G | Trypsin inhibitor from Glycine max (soybean) |
| Stage Adapter | Warner Instruments | SA-20MW-AL | To fit imaging chamber for dynamic stimulation recordings on the microscope stage |
| Stage-top incubator | Okolab | H201 | |
| Stereoscope | Leica | IC90 E MSV266 | |
| SYTOX Blue Dead Cell Stain | Invitrogen | S34857 | blue-fluorescent nucleic acid stain |
| Transfer Pipet | Falcon | 357575 | Falcon™ Plastic Disposable Transfer Pipets |
| Valve Control System | Warner Instruments | VCS-8 | System for dynamic stimulation recordings |
| Vibratome VT1000 S | Leica | VT1000 S | |
| Water bath | Fisher Scientific | FSGPD02 | Fisherbrand Isotemp General Purpose Deluxe Water Bath GPD 02 |
References
- Uc, A., Fishman, D. S.
- Bluestone, J. A., Herold, K., Eisenbarth, G. Genetics, pathogenesis and clinical interventions in type 1 diabetes. Nature. 464 (7293), 1293-1300 (2010).
- Taylor, R. Type 2 diabetes: etiology and reversibility. Diabetes Care. 36 (4), 1047-1055 (2013).
- Meier, R. P., et al. Islet of Langerhans isolation from pediatric and juvenile donor pancreases. Transplant International. 27 (9), 949-955 (2014).
- Marciniak, A., et al. Using pancreas tissue slices for in situ studies of islet of Langerhans and acinar cell biology. Nature Protocols. 9 (12), 2809-2822 (2014).
- Panzer, J. K., Cohrs, C. M., Speier, S. Using pancreas tissue slices for the study of islet physiology. Methods in Molecular Biology. 2128, 301-312 (2020).
- Speier, S., Rupnik, M. A novel approach to in situ characterization of pancreatic beta-cells. Pflugers Archive. 446 (5), 553-558 (2003).
- Panzer, J. K., et al. Pancreas tissue slices from organ donors enable in situ analysis of type 1 diabetes pathogenesis. JCI Insight. 5 (8), 134525 (2020).
- Dolai, S., et al. Pancreatitis-induced depletion of syntaxin 2 promotes autophagy and increases basolateral exocytosis. Gastroenterology. 154 (6), 1805-1821 (2018).
- Dolai, S., et al. Pancreas-specific SNAP23 depletion prevents pancreatitis by attenuating pathological basolateral exocytosis and formation of trypsin-activating autolysosomes. Autophagy. , 1-14 (2020).
- Qadir, M. M. F., et al. Long-term culture of human pancreatic slices as a model to study real-time islet regeneration. Nature Communications. 11 (1), 3265 (2020).
- Cohrs, C. M., et al. Dysfunction of persisting β cells is a key feature of early type 2 diabetes pathogenesis. Cell Reports. 31 (1), 107469 (2020).
- Liang, T., et al. Ex vivo human pancreatic slice preparations offer a valuable model for studying pancreatic exocrine biology. Journal of Biological Chemistry. 292 (14), 5957-5969 (2017).
- Shultz, L. D., Ishikawa, F., Greiner, D. L. Humanized mice in translational biomedical research. Nat Reviews. Immunology. 7 (2), 118-130 (2007).
- Lamont, D., et al. Compensatory mechanisms allow undersized anchor-deficient class I MHC ligands to mediate pathogenic autoreactive T cell responses. Journal of Immunology. 193 (5), 2135-2146 (2014).
- Anesthesia and analgesia in laboratory animals. Fish, R., Danneman, P. J., Brown, M., Karas, A. , Academic Press. (2011).
- Clark, S. A., Borland, K. M., Sherman, S. D., Rusack, T. C., Chick, W. L. Staining and in vitro toxicity of dithizone with canine, porcine, and bovine islets. Cell Transplantation. 3 (4), 299-306 (1994).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Monette, R., Small, D. L., Mealing, G., Morley, P. A fluorescence confocal assay to assess neuronal viability in brain slices. Brain Research Protocols. 2 (2), 99-108 (1998).
- Gál, E., et al. A novel in situ approach to studying pancreatic ducts in mice. Frontiers in Physiology. 10, 938 (2019).
- Stožer, A., Dolenšek, J., Rupnik, M. S. Glucose-stimulated calcium dynamics in islets of Langerhans in acute mouse pancreas tissue slices. PloS One. 8 (1), 54638 (2013).
- Stožer, A., et al. Functional connectivity in islets of Langerhans from mouse pancreas tissue slices. PLoS Computational Biology. 9 (2), 1002923 (2013).
- Früh, E., Elgert, C., Eggert, F., Scherneck, S., Rustenbeck, I. Glucagonotropic and glucagonostatic effects of KATP channel closure and potassium depolarization. Endocrinology. 162 (1), 136 (2021).
- Satin, L. S. New mechanisms for sulfonylurea control of insulin secretion. Endocrine. 4 (3), 191-198 (1996).
- Ren, J., et al. Slow oscillations of KATP conductance in mouse pancreatic islets provide support for electrical bursting driven by metabolic oscillations. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 305 (7), 805-817 (2013).
- Marciniak, A., Selck, C., Friedrich, B., Speier, S. Mouse pancreas tissue slice culture facilitates long-term studies of exocrine and endocrine cell physiology in situ. PLoS One. 8 (11), 78706 (2013).
- Dzhagalov, I. L., Melichar, H. J., Ross, J. O., Herzmark, P., Robey, E. A.
