Summary
Krystallografisk fragmentscreening på Helmholtz-Zentrum Berlin udføres ved hjælp af en arbejdsgang med dedikerede sammensatte biblioteker, krystalhåndteringsværktøjer, hurtige dataindsamlingsfaciliteter og stort set automatiseret dataanalyse. Den fremlagte protokol har til formål at maksimere produktionen af sådanne eksperimenter for at give lovende udgangspunkter for downstream strukturbaseret ligand design.
Abstract
Fragment screening er en teknik, der hjælper med at identificere lovende udgangspunkter for ligand design. I betragtning af at krystaller af målproteinet er tilgængelige og viser reproducerbart røntgendiffraktionsegenskaber i høj opløsning, er krystallografi blandt de mest foretrukne metoder til fragmentscreening på grund af dets følsomhed. Derudover er det den eneste metode, der giver detaljerede 3D-oplysninger om fragmentets bindingsmåde, hvilket er afgørende for efterfølgende rationel sammensatte udvikling. Den rutinemæssige brug af metoden afhænger af tilgængeligheden af egnede fragmentbiblioteker, dedikerede midler til at håndtere et stort antal prøver, state-of-the-art synkrotronstrålelinjer til hurtige diffraktionsmålinger og stort set automatiserede løsninger til analyse af resultaterne.
Her præsenteres den komplette praktiske arbejdsgang og de medfølgende værktøjer til, hvordan man udfører krystallografisk fragmentscreening (CFS) på Helmholtz-Zentrum Berlin (HZB). Forud for denne arbejdsgang er krystalblødningsforhold samt dataindsamlingsstrategier optimeret til reproducerbare krystallografiske eksperimenter. Derefter, typisk i en en til to-dages procedure, anvendes et 96-medlem CFS-fokuseret bibliotek, der leveres som tørrede brugsklare plader, til at suge 192 krystaller, som derefter flashkøles individuelt. De endelige diffraktionseksperimenter kan udføres inden for en dag ved de robotmonteringsunderstøttede bjælkelinjer BL14.1 og BL14.2 ved BESSY II elektronopbevaringsringen, der drives af HZB i Berlin-Adlershof (Tyskland). Behandling af de krystallografiske data, raffinement af proteinstrukturerne og hitidentifikation er hurtig og stort set automatiseret ved hjælp af specialiserede softwarerørledninger på dedikerede servere, der kræver lidt brugerinput.
Brug af CFS-arbejdsgangen på HZB muliggør rutinemæssige screeningseksperimenter. Det øger chancerne for en vellykket identifikation af fragment hits som udgangspunkt for at udvikle mere potente bindemidler, nyttige for farmakologiske eller biokemiske applikationer.
Introduction
Det første skridt i udviklingen af lægemidler er screening af forbindelser mod et mål af interesse. Traditionelt anvendes store sammensatte biblioteker i størrelsesordenen 100.000-1.000.000 poster i biokemiske højoverførselsanalyser i den farmaceutiske industri. Denne strategi blev suppleret med fragment-baseret drug design (FBDD), en nyere metode, der tog en kraftig stigning i løbet af de sidste 20 år og blev en mainstream strategi for at generere høj kvalitet bly kandidater på grund af flere iboende fordele ved metoden1. Udtrykket "fragment" refererer til et lille organisk molekyle, der typisk indeholder mindre end 20 ikke-hydrogen eller tunge atomer (HAs). Således er et fragment betydeligt mindre end de lægemiddel- eller blylignende molekyler (normalt mindre end 30 HAs), der undersøges i konventionel højoverførselshastighedsscreening. Fragmenter er svage affinitetsbind. Sammenlignet med større molekyler er fragmenter imidlertid mere alsidige, da selv en lille samling af dem bedre kan repræsentere det respektive kemiske rum af molekyler af samme størrelse2. Også, udviklende fragment screening hits i bly molekyler er betydeligt mere effektiv end at optimere allerede større molekyler2,3,4,5. Det betyder, at screening af fragmenter, indtil påvisningen er tilstrækkelig følsom, kan anvendes effektivt og giver udgangspunkter af høj kvalitet for yderligere udvikling af forbindelser. Flere biofysiske metoder kan anvendes til fragmentscreening, den mest populære er nuklear magnetisk resonans, røntgenkrystallografi, overfladeplasmonresonans og termiske skiftanalyser. Disse metoder anvendes enten parallelt eller sekventielt med det formål at øge tilliden til hits og reducere antallet af falske positiver eller falske negativer. En nyligt gennemført sammenlignende undersøgelse6 tydede imidlertid på, at sekventielle screeningkaskader skal undgås på grund af den lave overlapning mellem de forskellige metoder.
Røntgenkrystallografi er en veletableret metode til strukturbestemmelse ved atomdetaljer , men er for nylig også blevet udviklet som et redskab til screeningsformål7,8. Da proteinkrystaller tolererer høje fragmentkoncentrationer (f.eks. 100 mM), kan krystallografisk fragmentscreening (CFS) konkurrere med andre biofysiske metoder til screening af fragmenter eller endda udkonkurrere dem som en førstetrinsscreeningsmetode6,9. En vigtig forudsætning for CFS er imidlertid et valideret krystalliseringssystem af målproteinet, der reproducerbart leverer krystaller med diffraktionsegenskaber til betydeligt høj opløsning, typisk bedre end 2 Å.
En eksklusiv fordel ved CFS sammenlignet med alle andre fragmenteringsscreeningsmetoder er tilvejebringelse af detaljerede 3D-oplysninger om bindingsmåden for de identificerede fragmenter. Disse strukturelle oplysninger er helt afgørende for den rationelle optimering af fragmentet hits til højere affinitet bindemidler. Etablerede udarbejdelsesstrategier vokser, fusionerer og forbinder fragment hits5. Derved leveres der relativt høj ligandeffektivitet fra starten, og indførelsen af unødvendige eller rumligt ikke egnede grupper kan undgås, hvilket reducerer omkostningerne ved kemisk syntese. Alt i alt har CFS uovertruffen fordele som en startstrategi for lægemiddeldesign.
I betragtning af at et bestemt biologisk mål opfylder de høje krav i CFS med hensyn til krystalkvalitet, er der nogle hovedfaktorer, der maksimerer chancerne for et vellykket resultat af sådanne screeningskampagner. Det afhænger af kvaliteten af det anvendte fragmentbibliotek, af en effektiv arbejdsgang til at udføre eksperimenterne før diffraktionseksperimentet, af synkrotronstrålelinjer med tilstrækkelig automatisering og dataindsamlingshastighed samt af måder og midler til stort set automatiseret databehandling og analyse. Her præsenteres den komplette arbejdsgang fra krystalblødningseksperimenter til hitidentifikationen på den måde, den med succes etableres på de makromolekylære krystallografistrålelinjer ved BESSY II (Figur 1). Faciliteten er åben for akademiske og industrielle brugere til samarbejde. Derudover kan akademiske brugere af EU-lande uden for Tyskland nemt ansøge om finansiering via iNEXT Discovery-projektet.
Der er uundværlige forudsætninger for at kunne starte en CFS-kampagne og gennemføre den protokol, der er skitseret i dette arbejde: veldrifferende krystaller af målproteinet er tilgængelige, der kan reproduceres i stort antal, der er stabile ved omgivelsestemperatur, og som blev dyrket ved hjælp af en krystalliseringscocktail uden meget flygtige ingredienser. En anden forudsætning er krystalgitterets egnethed til eksperimentet. I et passende gitter skal målproteinets interessante steder udsættes for opløsningsmiddelkanalerne og dermed tilgængelige. Et andet foregående trin, der er valgfrit, men ikke desto mindre stærkt anbefales for at sikre succes i arbejdsgangen i CFS-kampagnen, er optimeringen af blødgøringstilstanden for eksperimentet. Vitale benchmarkstatistikker her er krystallens diffraktionskraft og de relevante datakvalitetsindikatorer, som bestemmes under dataskaleringsproceduren. Typiske faktorer, der skal optimeres, er DMSO-tolerance, bufferkoncentration og kryobeskyttende. Selvom det ikke er en streng forudsætning som yderligere beskrevet nedenfor, kan DMSO som et co-solvent bidrage til at øge fragmentopløseligheden. Typiske test bør omfatte iblødsætning af 0, 3, 6 eller 10% (v/ v) DMSO natten over. En forøgelse af bufferkoncentrationen til 200 eller 300 mM bidrager til at forhindre tab af diffraktionskvalitet som følge af lejlighedsvise pH-skiftende virkninger som følge af de høje fragmentkoncentrationer, der skal anvendes. Endelig er det afgørende at finde ud af, om og hvilke yderligere kryobeskyttende middel der er behov for, og om det allerede kan indgå i blødgøringstilstanden. I mange tilfælde er der imidlertid ikke behov for en ekstra kryo-protectant, fordi DMSO selv kan fungere som kryobeskyttende middel. Hvis det er tilfældet, sparer dette et håndteringstrin i det endelige eksperiment. De fleste krystaller har brug for mindre kryo-protectant, hvis flash-afkølet på passende størrelse sløjfer, minimere eller undgå omkringliggende moderlud så meget som muligt. Men i sjældne tilfælde er et lag af moderluden faktisk nødvendigt for at forhindre skader på krystallen ved flashkøling.
Antallet af hits opnået i en CFS-kampagne afhænger ikke kun af målproteinets lægemiddelgabilitet og krystalgitterets egnethed (se ovenfor), men det afhænger også af bibliotekets kvalitet. Bibliotekets kvalitet omfatter to aspekter: udvælgelsen af forbindelser til biblioteket og konfekture af forbindelserne (dvs. i hvilken fysisk form de præsenteres for eksperimentet). For sammensat udvælgelse forskellige strategier kan anvendes. De fleste biblioteksdesign omfatter maksimering af fragmenternes kemiske mangfoldighed. Et strategisk fokus kunne være at inkludere den kemiske tractability af fragmenter til opfølgende design, som er blevet anvendt for eksempel i Diamond-SGC-iNEXT klar bibliotek10. Endnu et strategisk fokus for biblioteksdesign kunne være at maksimere repræsentationen af kommercielt tilgængelige kemiske rum af fragmenter ved form- og farmakophorebaseret klyngedannelse, som det er blevet eksemplificeret ved F2X-bibliotekerne udviklet på HZB11. Mere specifikt er det 1103-medlemmer F2X-Universal Library og repræsentative 96-sammensatte delmængde til indledende CFS-kampagner, der kaldes F2X-Entry Screen, blevet udviklet, og F2X-Entry Screen er blevet valideret med succes11. F2X-Entry Screen er det primære valg til CFS-kampagner på HZB. Derefter kan større kampagner derefter gennemføres ved hjælp af F2X-Universal Library eller det 1056-medlemmer EU-OPENSCREEN fragment bibliotek12, der også tilbydes på HZB. På nuværende tidspunkt er disse biblioteker gratis tilgængelige for brugere af de makromolekylære krystallografistrålelinjer i BESSY II-synkrotronen i Berlin på grundlag af en samarbejdskontrakt. Det gælder også for brugere via iNEXT Discovery forslag. Desuden er F2X-Entry Screen tilgængelig for alle interesserede forskere på grundlag af en materialeoverførselsaftale.
Med hensyn til den fysiske præsentation af et bibliotek er der almindeligt anvendt to fremgangsmåder: fragmenterne anvendes enten som DMSO-stamopløsninger, eller fragmenterne tørres og immobiliseres på brugsklare plader. På HZB, både F2X-Entry Screen og ikke-flygtige forbindelser af F2X-Universal Library præsenteres som tørrede-on forbindelser i en 3-linse 96-godt MRC lav profil krystallisering plade. Præsentationen af fragmenter immobiliseret i krystallisering plader har to vitale fordele: For det første, det giver mulighed for transport af screening plader til brugerens hjem lab. Derfor kan blødgørings- og krystalhåndteringstrinnene i den arbejdsgang, der præsenteres her (trin 1-3), udføres overalt. For det andet kan DMSO-fri løsning anvendes. DMSO-følsomme mål kan således let screenes , hvilket stort set bevarer de forventede hitrater11. DMSO øger imidlertid fragmentopløseligheden, og det er derfor værd at kontrollere DMSO-tolerancen for et krystalsystem efter eget valg på forhånd som skitseret ovenfor.
Den protokol, der er skitseret nedenfor, vil beskrive et typisk eksperiment med en 96-sammensat skærm, såsom F2X-Entry Screen. Til det skal ca. 250 krystaller fremstilles i tide til at blive brugt frisk. Det er meget tilrådeligt at forberede opsuger til alle 96 forbindelser i to eksemplarer. Det anbefales, men valgfrit, at forberede yderligere mock-soaks, der senere vil hjælpe med dataanalyse ved hjælp af PanDDA-tilgangen (pan-data density analysis) til hitidentifikation13. Mock-soaks defineres som iblødsætningseksperimenter på proteinkrystaller ved hjælp af den samme blødgøringsopløsning som fragmentet opsuger i samme inkubationstid, men der er ingen fragmenter til stede. Hvis blødgøringsopløsningen er lig med krystalliseringstilstanden, kan krystallerne høstes direkte fra krystalliseringspladen.
Afhængigt af robotprøveskifterens egenskaber kan det være nødt til at bruge forskellige puckformater. I øjeblikket skal prøver til den HZB-opererede strålelinje BL14.1 fremstilles i Unipuck-format, prøver til den HZB-opererede strålelinje BL14.2 skal fremstilles i SPINE puck-format. I denne protokol antages forberedelse i Unipuck-format.
Protocol
1.Iblødsætning krystaller
- Tag screeningspladen (her en F2X-Entry Screen-plade, figur 2) fra fryseren -20 °C og læg den på bænken/bordet i ca. 30 minutter for at forvarme den til stuetemperatur, så man undgår kondensfugtighed.
- Arranger arbejdspladsen med to tæt arrangerede mikroskoper og alle nødvendige værktøjer(Figur 3A). Materialerne er angivet i materialeoversigten.
- Vælg 3-4 sløjfer af passende størrelse til overførsel af krystallerne, der skal gennemblødes og læg dem tæt på mikroskoperne.
- Fyld glaspletpladens hulrum med de-ioniseret eller destilleret vand.
- Forbered 5 ml blødgøringsopløsning.
- Skær posen på screeningspladen op, forvarmet til stuetemperatur.
- Fjern låget og folien fra afskærmningspladen, mens pladen er placeret på bænken/bordet.
- Dekantere 5 ml blødgøringsopløsning i reagensbeholderen.
- Fyld hvert af de 96 reservoirer med 40 μL blødgøringsopløsning ved hjælp af 12-kanals pipetten.
- Placer EasyAccess-rammen oven på screeningspladen, og fastgør den med de medfølgende klemmer ved at skubbe dem på venstre og højre side af enheden.
BEMÆRK: EasyAccess Frame er en speciel enhed til håndtering af flere krystaller, som blev udviklet ved HZB14. Det giver nem adgang til hver brønd ved at flytte de bevægelige fliser og samtidig beskytte de andre brønde mod fordampning. - Placer screeningspladen (inkl. EasyAccess Frame) under det første mikroskop og krystalliseringspladen, herunder de krystaller, der skal gennemblødes under det andet mikroskop.
- Skub let og åben A1 på screeningspladen ved at flytte easyaccessrammens respektive akrylglasflise enten med en finger eller det medfølgende penværktøj.
- Der tilsættes 0,4 μL blødgøringsopløsning fra reservoiret til det fragment, der indeholder godt (øverste venstre linse) ved hjælp af en frisk pipettespids. Kontroller gennem mikroskopet, at dråben dækker det tørrede fragment, så det kan opløses.
BEMÆRK: Alternativt kan dette trin udføres ved hjælp af en pipetterobot før montering af EasyAccess Frame. På denne måde iblødsætning dråber af alle brønde kunne placeres i en automatisk procedure. Forfatterne anbefaler dog at tilføje blødgøringsopløsningen direkte før blødgøringstrinnet som beskrevet for at sikre, at fragmentet opløses langsomt og i nærvær af krystallen. Dermed undgår man, at krystallen oplever et pludseligt chok ved overførsel til et fald med en høj fragmentkoncentration. - Under det andet mikroskop skæres tætningsfolie af krystalliseringspladen på en af de brønde, der indeholder målkrystallerne.
- Overfør to krystaller ved hjælp af en passende størrelse sløjfe monteret på krystalstaven til brønden A1 af screeningspladen under det første mikroskop.
- Vask løkken i den forberedte glaspletplade og tør den ved forsigtigt at røre ved vævet. Gør dette efter hver overførsel for at undgå krydskontaminering med fragmenter, der indeholder blødgøringsopløsninger.
- Brug mikroskopet til at kontrollere, at krystallerne er korrekt placeret.
- Gå videre til den næste brønd (f.eks.
- Gentag trin 1.13-1.18 med alle 96 brønde på screeningspladen, indtil hver blødgøringsdråbe indeholder to krystaller.
- Fjern screeningspladen (inkl. EasyAccess Frame) under mikroskopet og læg den på bænken/bordet.
- Fjern EasyAccess-rammen fra screeningspladen.
- Forsegl screeningspladen med tætningsfolie og læg den i henholdsvis krystalliseringsinkubatoren eller skabet, hvor krystallerne blev dyrket.
- Inkuber for den optimerede blødgøringstid. Natten over er normalt praktisk.
- (valgfrit) Fremstilling af ca. 40 apokrystaller (dvs. mock iblødsætning)
- Tag en MRC 3-linse 96-godt lav profil krystallisering plade og fylde to kolonner med 40 μL blødgøring løsning pr godt ved hjælp af 12-kanals pipette.
- Placer EasyAccess-rammen oven på krystalliseringspladen, og fastgør den med de medfølgende klemmer ved at skubbe dem på venstre og højre side af enheden.
- Skub åbne akryl glas flise af godt A1.
- 0,4 μL blødgøringsopløsning anbringes i hver af brøndens to venstre linser.
- Overfør 2-3 krystaller til hver dråbe. Efter hver overførsel vaskes løkken i den forberedte glaspletplade og tørres ved forsigtigt at røre ved vævet.
- Flyt til den næste brønd (f.eks.
- Gentag trin 1.24.4-1.24.6, indtil ca. 40 krystaller er klar til inkubation.
- Fjern krystalliseringspladen (inkl. EasyAccess Frame) fra under mikroskopet på bænken/bordet, og fjern EasyAccess Frame.
- Forsegl krystalliseringspladen med tætningsfolie og læg den i ovennævnte krystalliseringsinkubator eller skab.
- Inkuber for samme tid som screeningspladen.
2.Høst af krystaller
- Tag henholdsvis inkubatoren eller skabet ud af inkubatoren eller skabet.
- Arbejdstedet med ét mikroskop og alt nødvendigt værktøj(Figur 3B). Materialerne er angivet i materialeoversigten.
- Forbered en Unipuck skum dewar med 3 Unipuck låg (dvs. prøve kabinetter) og fyld det med flydende nitrogen (LN2).
BEMÆRK: Vær opmærksom på de relevante sikkerhedsforanstaltninger for at arbejde med LN2 (dvs. bære sikkerhedsbriller og bruge passende beskyttelsesudstyr). Det er bedst at få frisk LN2 flere gange i løbet af sessionen for at undgå vand kondens i LN2 opbevaringsdåse. Gennem hele følgende procedure skal du sørge for, at LN2-niveauet i skumafvarslen altid når den øverste kant af dewaren. Sørg også for, at LN2 er isfri; udskifte LN2 (f.eks. en gang hvert 45. minut) eller senest, hvis isen begynder at ophobes. Fyld derefter den anden skum dewar og overfør Unipucks til den. Tøm det iskolde skum dewar og fjern resterende is og fugt med føntørreren. - Fjern folien fra screeningspladen, og placer EasyAccess-rammen ovenpå.
- Skub godt op A1.
- Høst to krystaller fra drop og flash-cool dem i LN2 (en efter en) ved at kaste med en hurtig lodret bevægelse i LN2 og derefter indsætte prøven i den rette puck position. Tag relevante noter på eksempelsporingsarket.
- Cryoprotection skridt (hvis det er nødvendigt for målet krystaller). I så fald skal du udføre dette trin i stedet for 2.6.
- 0,4 μL blødgøringsopløsning, herunder kryobeskyttelsesmiddel, anbringes på brøndens nederste venstre linse.
- Træk løkken med en krystal monteret fra dråben i øverste venstre linse langsomt gennem opløsningen i nederste venstre linse og samtidig holde krystal i løkken, og derefter flash-cool i LN2. Høst to krystaller på denne måde.
BEMÆRK: I trin 2.6 og 2.7 skal du sørge for, at den tid, krystallen er i løkken og udsat for luft, holdes meget kort. Nedsænkningen (dvs. prøvens lodrette dråbe i LN2-fyldtdewar) skal udføres så hurtigt som muligt. Dette sikrer høj prøvekvalitet og forebyggelse af isringe i dataene. Spor prøverne (dvs. bemærk, hvis krystaller har skader osv.) for at prioritere enten dubletter til følgende røntgenmålinger, brug skabelonen til det. Selv hvis krystaller har revner, "hår" eller andre defekter på grund af blødningen, kan de stadig bruges og bør altid høstes. I tilfælde krystaller brød i flere stykker, to af de største / flotteste stykker bør høstes. Figur 5 viser nogle eksempler på, hvordan sådanne krystaller kan se ud. Alle de viste krystaller gav stadig nyttige datasæt i den respektive kampagne11, der understreger, at det er værd at høste krystaller efter iblødsætningsbehandling, selvom der skete betydelige morfologiske ændringer.
- Gå til den næste brønd og gentag trin 2,5 - 2,6./2.7 indtil alle tre pucke er fyldt.
- Tilsæt Unipuck baser på toppen af lågene efter forkøling dem i LN2.
- Opbevar Unipucks i opbevaringsstativer i en transport dewar eller opbevaring dewar.
- Gentag de foregående trin, indtil alle screeningspladens brønde er blevet behandlet.
- (valgfrit) Hvis mock-gennemblødte krystaller blev forberedt, høste dem på samme måde som beskrevet på forhånd.
BEMÆRK: Hvis to krystaller for hver af screeningspladens 96 betingelser kan være flashkølet, vil der være plads til 32 mock-gennemblødte apokrystaller, til at fylde de 14 Unipucks. - Opbevar Unipucks i LN2 indtil målingen.
3.Dataindsamling
- Overfør Unipucks til beamline BL14.1. Hvis SPINE puck er blevet brugt i trin 2, overføre dem til beamline BL14.2.
- Der foretages standardmålinger på bjælkelinjen ved hjælp af nedenstående specifikke anbefalinger. Detaljer om anlægget og eksperimentet kontrolprogram MXCuBE2 er blevet præsenteret tidligere15,16. Figur 4 viser det indre af de eksperimentelle hutches af beamlines BL14.1 og BL14.2 samt et eksempel screenshot af MXCuBE2 kontrol software på beamline BL14.1.
- For at maksimere tidseffektiviteten og gennemløbet skal du springe samlingen af testbilleder over. Prøve-til-detektor-afstanden vil blive fastsat til en værdi, der er egnet til den øvre opløsningsgrænse for krystalsystemet bestemt i tidligere forsøg. Hvis dataindsamlingsstrategien ikke er optimeret på forhånd, skal du indsamle 1800 billeder af 0,2 grader hver med en eksponeringstid på 0,1 s pr. billede.
- Ideelt set skal du teste dataindsamlingsstrategien i tidligere eksperimenter ved hjælp af mock-gennemblødte apokrystaller. For højere symmetrirumsgrupper vil 1200 billeder eller endda 900 billeder (dvs. henholdsvis 240° eller 180°) allerede give komplette datasæt med god statistik uafhængigt af startvinklen for dataindsamling.
BEMÆRK: Højere redundans og finere udskæring kan give overlegen datakvalitet17. Men ved hjælp af denne "nok, men ikke mere" strategi, der foreslås her, er en fremragende afvejning mellem kvalitet, dataindsamling tid, samt beregningsmæssige krav til analyse senere. På den beskrevne måde er 200 dataindsamlinger på 24 timer godt mulige ved beamlines BL14.1 og BL14.2. Ikke desto mindre bør prøver prioriteres. - Indsaml først diffraktionsdatasæt for én prøve pr. fragmentbetingelse baseret på prioriteringen i trin 2.6./2.7 (dvs. indsamle dataene for den højere prioriterede dublet).
- For de forsøg i 3.2.3, hvor dataindsamlingen mislykkedes, gik diffraktion tabt, eller der opstod alvorlige isringe, indsamlede data for den anden dublerede prøve af den respektive fragmenttilstand.
- Der indsamles diffraktionsdatasæt for apokrystaller (hvis de forberedes i henhold til trin 1.24 og 2.12).
- Indsaml diffraktionsdatasæt for de resterende dubletter af hver fragmentbetingelse.
- I MXCuBE2-programmet skal du tilpasse datasæt-id'erne for en CFS-kampagne til følgende mønster:
- -[ABCDEFGH][01][0123456789][ab] (f.eks. MyProtein-F2XEntry-B05a, hvor "B05" står for brønden (dvs. fragmentet tilstand på skærmen) og følgende "a" for den første dublet.)
4.Databehandling
- Til dataanalyse af CFS-kampagnen skal du bruge FragMAXapp, en webbaseret løsning til at styre en multiplexanalyse til behandling af automatisk raffinement og PanDDA-hitevaluering af CFS-data18 (Lima et al. FragMAXapp, ikke-offentliggjorte data). I FragMAXapp-versionen, der er implementeret ved HZB, er følgende programmer/pipelines tilgængelige: XDSAPP19, Xia2-DIALS og Xia2-XDS20, fspipeline7, DIMPLE21, Phenix LigFit22, PanDDA13,23. Brug en velforfinet inputmodel af målproteinet som input til automatisk raffinement; ellers udføre omhyggelig raffinement af en høj opløsning mock-gennemblødt krystal, der blev indsamlet under kampagnen.
BEMÆRK: Et nøgleelement til identifikation af hit er PanDDA. Nærmere oplysninger forklares i de respektive publikationer13,23. Kort sagt beregner PanDDA automatisk elektrontæthedskort over et sæt datasæt i en CFS-kampagne. Disse antages derefter som ikke-bindende fragmentbetingelser og gennemsnit for at generere den såkaldte jordtilstandsmodel. Jordtilstandsmodellen bruges derefter til at udlede lokale uoverensstemmelser mellem hvert elektrontæthedskort og jordtilstandskortet ved hjælp af voxel-tilknyttede Z-scores. Derefter, for områder med høj Z-score en såkaldt PanDDA-kort er skabt af finjusteret subtraktion af jordens tilstand tæthed fra de respektive kort. Dette øger i høj grad synligheden af fragmentbindingshændelser. - For at maksimere resultatet af PanDDA skal du bruge en totrinstilgang. For det første udfører en PanDDA-kørsel (pandda.analyse) med standardindstillinger. Selv hvis mock-gennemblødt krystaller er blevet indsamlet, vil deres identitet ikke indgå som en parameter (hvilket er muligt alligevel) for at muliggøre en upartisk generation af jorden tilstand model af PanDDA fra alle tilgængelige data. Derefter evalueres outputdataene af brugeren via en såkaldt PanDDA-inspektion i Coot24. Her skal hits med relativt høj tillid bemærkes og afslutte det første skridt.
- For det andet skal du køre pandda.analyse-trinnet igen, bortset fra de foreløbige hits (bestemt i første trin) fra jordtilstandsmodellen via kommandolinjeparameteren --exclude_from_characterisation="
". Yderligere oplysninger er beskrevet på PanDDA-hjælpesiderne (https://pandda.bitbucket.io/). På denne måde ignoreres datasæt, der er klare hits og dermed ville skjule jordtilstandsmodellen, hvis den medtages. Dette fører til en forbedret jordtilstandsmodel og dermed til forbedrede resultater generelt. Endelig udføres en grundig PanDDA-inspektion for at fuldføre hitidentifikationen.
BEMÆRK: FragMAXapp indeholder også en outputmulighed for at gemme de modellerede bundne tilstande eller forberede data til PDB-indsendelse, for yderligere detaljer se FragMAX websider (https://fragmax.github.io/).
Representative Results
Som en del af de tidligere rapporterede valideringskampagner på F2X-Entry Screen11blev der gennemført tre kampagner på BioMAX-bjælkelinjen ved MAX IV, og en kampagne blev gennemført på beamline BL14.1 ved HZB. I sidstnævnte kampagne blev et bestemt sæt F2X-Entry Screen-tilstande ved hjælp af en blødgøringstilstand, der ikke indeholdt DMSO, screenet mod proteinproteinkomplekset af gær Aar2 og RNaseH-lignende domæne af gær Prp8 (AR). Det valgte sæt betingelser omfatter de hits, der blev fundet i en tidligere kampagne af F2X-Entry Screen mod AR i en blødgøringstilstand, der indeholder DMSO11, (dvs. i kampagnen udført på HZB blev disse hits screenet igen uden DMSO). Figur 7 viser en oversigt over de hits, der er opnået efter at have analyseret dataene med FragMAXapp-kombinationen af XDSAPP til behandling, fspipeline til automatisk raffinement og efterfølgende hitsøgning ved hjælp af PanDDA.
Figur 1: Skematisk repræsentation af arbejdsgangen i et krystallografisk fragmentscreeningseksperiment (CFS) med fokus på det særlige miljø på Helmholtz-Zentrum Berlin. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Formulering og emballering af F2X-indgangsskærmen. Den 96-sammensatte skærm er tilgængelig på en 3-linse 96-godt MRC lav profil plade, forseglet med folie og vakuum-pakket. De 96 forbindelser af skærmen er tørret fra DMSO løsninger i to af de tre linser af hver brønd. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Fotografering af CFS-arbejdsbænken i HZB-forberedelseslaboratoriet. Der vises samlinger af nødvendigt værktøj til A-iblødsætning og til B- krystalhøst. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Dataindsamlingsslutstationer og kontrolsoftware. A) Fotografi af det eksperimentelle hutch af HZB-MX bjælkelinjer BL14.1 (venstre) og BL14.2 (højre)15. B) Skærmbillede af MXCuBE2-eksperimentkontrolgrænsefladen16, der bruges i BL14.1 til indsamling af diffraktionsdata. Hos BL14.2 anvendes en meget lignende grænseflade. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5:Fotografiske snapshots af nogle krystallinske prøver i kryogene omgivelser før dataindsamling. Dette illustrerer variationen af krystallernes morfologier efter at have udført fragmentblødningen og krystalhøsten. Fotografierne blev taget på BioMAX beamline (MAX IV synkrotron, Lund, Sverige) for AR prøver indsamlet der som en del af F2X-Entry Screenvalidering 11. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: Skærmbillede af FragMaxApp18 installeret på HZB for bekvem dataanalyse. Flere detaljer i Lima et al., FragMAXapp, ikke-offentliggjorte data. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 7: Oversigt over resultaterne af CFS-kampagnen F2X-Entry vs. AR (uden DMSO). AR-proteinkomplekset er vist i tegneserievisning, med Aar2 farvet i gråt og RNaseH-lignende domæne Prp8 farvet i blåt. Fragmentet hits af kampagnen er farvet i element farver (C - gul, O - rød, N - blå, S - orange, Cl - lys cyan). Klik her for at se en større version af dette tal.
Supplerende oplysninger. Klik her for at hente denne fil.
Discussion
For en vellykket CFS-kampagne er det vigtigt at overholde de beskrevne forudsætninger (se Introduktion). Et pålideligt krystalliseringssystem er nødvendigt for reproducerbar vækst af mange veldiffrerende krystaller, og der er behov for en velforfinet struktur som input apo-model til automatiseret raffinement. Det er også vigtigt at kontrollere, at målstedet på proteinet (aktivt sted eller grænsefladeområde) er tilgængeligt for fragmenter i krystalgitteret. Det er vigtigt at optimere blødgøringsbetingelserne på forhånd for at sikre, at blødningen ikke forringes væsentligt krystalkvaliteten. Forsømmelse af disse aspekter vil højst sandsynligt føre til et suboptimalt eksperiment, som vil være af begrænset brug og i værste fald vil kræve en gentagelse af hele eksperimentet.
Den protokol, der er beskrevet ovenfor, skitserer de procedurer, der følges under en standard CFS-kampagne. Hvis alle forudsætninger er opfyldt, skal mindst 90% af alle gennemblødte krystaller vise diffraktion til høj opløsning i et diffraktionseksperiment. Hvis dette ikke er tilfældet, kan blødgøringstiderne forkortes til et par timer eller endda minutter. På grund af den gode opløselighed i de fleste fragmenter skulle dette være tilstrækkeligt til at opnå anstændige belægningsværdier. En typisk CFS-kampagne vil også resultere i et hit på ca. 10% eller derover. For F2X-EntryScreen-valideringskampagnerne 11 og igangværende brugerkampagner med det samme bibliotek er der observeret endnu højere hitrater (20% og derover, data vises ikke).
En generel advarsel om krystallografisk fragmentscreening er tilstedeværelsen af krystallografiske kontaktsteder. Disse kunne enten occlude a priori kendte aktive steder (der skal kontrolleres før screeningen, se ovenfor), eller disse kontakt sites også ofte giver lommer og hot spots, hvor fragmenter kan binde. Sådanne fragment hits vil være artefakter af krystallisering gitter og vil sandsynligvis ikke binde sig til proteinet i opløsning. Disse hændelser har tendens til at forekomme oftere i iblødsætning eksperimenter end i co-krystallisering eksperimenter (sandsynligvis på grund af de højere fragmentkoncentrationer ansat i iblødsætning eksperimenter). Ifølge tidligere erfaringer udgør de dog generelt kun en mindre del af de opnåede hits. For eksempel i F2X-Entry Screen validering kampagne ved hjælp af endothiapepsin (EP) og splejset protein-protein kompleks af Prp8RNaseH og Aar2 (AR), de fleste af de hits fandt sted i lovende steder11. For EP var 27 ud af de 37 observerede bindingshændelser placeret på det aktive sted (dvs. peptidspalten i denne protease). De 10 fjernbindingshændelser omfatter to solventudsatte bindingshændelser og otte krystalkontaktbindingshændelser (svarende til fem unikke hits). Hvis man ser bort fra disse krystalkontakthits, vil det stadig afspejle en samlet sats på 24 % unikke hits for EP-kampagnen. Det er også vigtigt at bemærke, at bindingshændelser, der ligger fjernt fra et kendt aktivt sted (undtagen krystalkontaktbind), også potentielt kan være interessante (f.eks. afslørende nye hot spots eller allosteriske steder af proteinet). For AR-kampagnen (i samme publikation) af de 23 observerede bindingshændelser var syv placeret ved krystalkontakter, den ene var placeret på den direkte grænseflade mellem de to proteiner, syv var placeret på kendte proteinproteininteraktionssteder med andre bindende partnere i den større biologiske kontekst (dermed forskellige samlingsstadier af splejsning), otte bindende begivenheder afslørede to hot spots på AR af endnu ukendt funktion og den ene var på en opløsningsmiddel eksponeret overflade Prp8RnaseH. Derfor, bortset fra begivenhederne på krystal kontakter og Prp8RnaseH singleton, antallet af potentielt nyttige bindende begivenheder er 15 (svarende til 14 unikke hits) og dermed et hit på 15,6%. Disse hits kan være udgangspunkter for design af protein-protein interaktion modulatorer eller for værktøj forbindelser med henblik på at udforske de to opdagede Aar2 hot spots. Samlet set, også i overensstemmelse med gennemførte brugerkampagner, ofte kun en mindre del af hits i krystallografisk fragment screening skal ses bort fra som artefakter. Dette vil dog også i høj grad være afhængigt af mål.
Hvis hitraten er betydeligt lavere, kan dette indikere et af følgende problemer relateret til målproteinet. For eksempel blev der i en CFS-kampagne mod en viral cysteinprotease kun observeret et hit på kun 3% (data vises ikke). Det viste sig, at det anvendte protein sandsynligvis blev kemisk modificeret på dets aktive sted. I et sådant tilfælde kan et andet proteinpræparat løse problemet. Hvis krystaller er meget DMSO intolerante, F2X-Entry Screen kan også bruges uden DMSO, selv om resultaterne kan variere til en vis grad. De fleste af de hits opnået i overværelse af DMSO vil også dukke op i sit fravær. Der vil også være nogle hits, der ikke kan observeres i mangel af DMSO, selv om de kan observeres i sin tilstedeværelse. Og endelig vil der være nogle, der kun dukker op i mangel af DMSO.
Den alvorligste vanskelighed opstår, hvis proteinet undergår en induceret-fit bevægelse på stofbinding. Mest sandsynligt vil krystalgitteret ikke tolerere proteinbevægelsen, og krystallerne vil gå i opløsning. I et sådant tilfælde er det eneste valg at ty til co-krystallisering af proteinet og fragmenterne. Dette kan dog føre til nye krystalformer. Derfor vil meget af automatiseringen af hele processen ikke fungere effektivt længere. Heldigvis er der i de fleste CFS-kampagner, der er gennemført på HZB indtil videre, ikke stødt på denne type problemer. Det kan være, at den svage binding af et fragment, ikke giver nok energi til at fremkalde en proteinbevægelse, især hvis den krystalliserede kropsbygning stabiliseres af krystalemballeringskræfter.
En anden alvorlig begrænsning af den metode, som forfatterne er stødt på indtil videre, er, når krystalliseringscocktailen (og dermed blødgøringsopløsningen) indeholder flygtige forbindelser. Så bliver det tæt på umuligt at udføre al krystalhåndtering på en meningsfuld måde.
Forskellige proteiner kan indeholde druggable steder i større eller mindre grad. For eksempel formidles proteinproteininteraktioner normalt af udvidede flade overflader, der er vanskeligere at målrette mod. Den fragmentbindings hitrate vil derfor sandsynligvis afhænge af strukturen af proteinets molekylære overflade. I ekstreme tilfælde indeholder et protein muligvis ikke nogen egnede overflade hot spots, der tjener som målsteder for fragmentbinding. På trods af et omhyggeligt udført eksperiment vil der således ikke opstå fragmenterede hits fra screeningen. Forfatterne har imidlertid hidtil ikke stødt på en sådan situation.
I princippet kan krystalblødningen og høstdelen af en CFS-kampagne ved hjælp af den ovenfor beskrevne protokol udføres i ethvert laboratorium, der er udstyret til krystalhåndtering. Dette adskiller metoden på HZB fra andre CFS-faciliteter og kan i nogle tilfælde være en fordel. Hvis krystallerne f.eks. ikke let kan genproduceres på et andet sted, eller hvis forsøgsfolkenes rejse er begrænset (f.eks. i en verdensomspændende pandemisituation), er brugerne på HZB derfor udstyret med hele udstyret (pucke, værktøjer, EasyAccess Frame, prøveholdere osv.) som et transportabelt sæt.
Kravene til et stort antal prøveholdere og kryogene lagerkapaciteter opfyldes dog endnu mere bekvemt på dedikerede CFS-faciliteter. Desuden er behovet for indsamling af mange diffraktionsdatasæt stærkt fortalere for at lokalisere disse faciliteter tæt på bjælkelinjer, der er rettet mod en høj prøveoverførselshastighed. Eksempler herpå er beamlines I04-1 ved Diamond Light Source og den tilhørende XChem-facilitet i UK8,25, MASSIF-strålelinerne ved ESRF i France26 eller FragMAX-anlægget ved BioMAX-strålelinjen ved MAX IV i Sverige18.
I fremtiden kunne det forestille sig at designe CFS-eksperimenter uden behov for krystalhåndtering helt. De første fremskridt i denne retning er blevet rapporteret. F.eks. ved akustisk væskeoverførsel, der gør det muligt at blande både de krystalholdige opløsninger og fragmentopløsningerne direkte på prøveholdere af masketypen27. En anden tilgang blev brugt til XFEL-baserede ligand-screening. I et proof-of-principle eksperiment blev der fremstillet en krystalslam i batch, og iblødsætning og diffraktion dataindsamling blev udført på en silicium fast målchip28. Disse tilgange er dog stadig under udvikling og kan langt fra anvendes på en lang række proteinmål eller er mulige for CFS-faciliteter som rutine.
Med protokollen i dette arbejde detaljerede instruktioner til at udføre CFS-kampagner ligetil på HZB (og andre steder) er blevet skitseret og generel vejledning og nyttige hands-on tips til at forberede og gennemføre sådanne eksperimenter med større chancer for succes er blevet givet. I sidste ende bidrager bedre odds og succesrater i CFS-screening i vid udstrækning til effektivt at skabe udgangspunkter for downstream-udvikling af værktøjsforbindelser eller lægemiddelkandidater.
Disclosures
Helmholtz-Zentrum Berlin har indgivet en patentansøgning vedrørende EasyAccess Frame til det tyske patent- og varemærkekontor med registreringsnummer DE 10 2018 111 478.8. Derudover er der indgivet en international patentansøgning via PCT-ruten, der anvender prioriteten af det tyske patent.
Acknowledgments
Vi takker de mange brugergrupper, der har udført CFS-kampagner på HZB. Deres feedback førte til en gradvis forbedring af vores arbejdsgang. Vi vil gerne takke lægemiddeldesigngruppen på University of Marburg og FragMAX-gruppen på MAX IV, da det tætte samarbejde var grundlaget for flere udviklingsmæssige spring for forbedret CFS. Vi er taknemmelige for støtten fra det tyske forbundsministerium for undervisning og videnskab (BMBF), via projekterne Frag2Xtal og Frag4Lead (numrene 05K13M1 og 05K16M1). Vi er desuden taknemmelige for støtte via iNEXT-Discovery, projektnummer 871037, finansieret af Europa-Kommissionens Horizon 2020-program.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 µL pipet | Eppendorf | EP3123000012 | |
| 12 channel pipet, 100 µL | Eppendorf | EP4861000791 | |
| Blow dryer | TH-Geyer | 9.106 788 | |
| Crystal containing crystallization plates | Contains crystals to be soaked | ||
| Crystallization incubator | Providing constant temperature for crystallization experiment, at HZB: 20°C | ||
| Dual Thickness MicroLoops (LD) of different aperture sizes | MiTeGen | various, e.g. M5-L18SP-75LD |
250 loops in the appropiate size needed for the protocol, can be provided by HZB |
| EasyAccess Frame | HZB | The EasyAccess Frame is a special device for handling multiple crystals, which was developed at the HZB (Barthel et al., 2021). | |
| F2X-Entry Screen plate | HZB | Developed F2X-Entry Screen (Wollenhaupt et al., 2020) | |
| Glas spot plate | VWR | MARI1406506 | |
| Liquid nitrogen | At least a filled up 5 L can | ||
| Liquid nitrogen storage can | n.a. | n.a. | |
| Magentic crystal wand | MiTeGen | M-R-1013198 | |
| Microscopes | Leica | n.a. | |
| MRC 3-lens 96-well low profile crystallization plate | SwissCI | 3W96TLP-UVP | For mock-soaked crystals (optional) |
| Reagent reservoir | Carl Roth | EKT6.1 | 25 ml volume |
| Sample tracking template | https://www.jove.com/files/ftp_upload/62208/TemplateCFSHZBSampleTracking. xlsx |
||
| Scalpel | B. Braun | BA825SU | |
| Sealing foil for microtiter plates | GreinerBioOne | 676070 | |
| Shelved puck shipping canes (for Unipucks) | MiTeGen | M-CP-111-065 | 2 canes made of aluminum; can be provided by the HZB |
| Soaking solution | At least 5 ml are needed | ||
| Soaking solution including cryo-protectant, 150µL | Only needed if soaking solution is not cryo-protectant already | ||
| Tissues | Roth (Kimberly Clark Professional) | AA64.1 | |
| Transport dewar (Whartington dry shipper) | MiTeGen | TW-CX100 | 2 Travel dewars for storage of the 2 unipuck canes, alternatively a storage dewar of type VHC35 or similar could be used. |
| Unipuck foam dewars with lid | MiTeGen | M-CP-111-022 | two foam dewars especially suited for unipuck handling described in the protocol if SPINE pucks are used, different foam dewars might have to be applied. |
| Unipuck starter set | MiTeGen | M-CP-UPSK001 | Can be provided by the HZB |
| Unipucks | MiTeGen | M-CP-111-021 | 14 unipucks; can be provided by the HZB |
References
- Erlanson, D. A., Fesik, S. W., Hubbard, R. E., Jahnke, W., Jhoti, H. Twenty years on: the impact of fragments on drug discovery. Nature Reviews Drug Discovery. 15 (9), 605-619 (2016).
- Hall, R. J., Mortenson, P. N., Murray, C. W. Efficient exploration of chemical space by fragment-based screening. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 116 (2-3), 82-91 (2014).
- Erlanson, D. A. Introduction to fragment-based drug discovery. Topics in Current Chemistry. 317, 1-32 (2012).
- Scott, D. E., Coyne, A. G., Hudson, S. A., Abell, C. Fragment-based approaches in drug discovery and chemical biology. Biochemistry. 51 (25), 4990-5003 (2012).
- Lamoree, B., Hubbard, R. E. Current perspectives in fragment-based lead discovery (FBLD). Essays in Biochemistry. 61 (5), 453-464 (2017).
- Schiebel, J., et al. Six Biophysical Screening Methods Miss a Large Proportion of Crystallographically Discovered Fragment Hits: A Case Study. ACS Chemical Biology. 11 (6), 1693-1701 (2016).
- Schiebel, J., et al. High-Throughput Crystallography: Reliable and Efficient Identification of Fragment Hits. Structure. 24 (8), 1398-1409 (2016).
- Krojer, T., et al. The XChemExplorer graphical workflow tool for routine or large-scale protein-ligand structure determination. Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. 73 (3), 267-278 (2017).
- Radeva, N., et al. Active Site Mapping of an Aspartic Protease by Multiple Fragment Crystal Structures: Versatile Warheads to Address a Catalytic Dyad. Journal of Medicinal Chemistry. 59 (21), 9743-9759 (2016).
- Cox, O. B. A poised fragment library enables rapid synthetic expansion yielding the first reported inhibitors of PHIP(2), an atypical bromodomain. Chemical Science. 7 (3), 2322-2330 (2016).
- Wollenhaupt, J., et al. F2X-Universal and F2X-Entry: Structurally Diverse Compound Libraries for Crystallographic Fragment Screening. Structure. 28 (6), 694-706 (2020).
- EU OPENSCREEN fragment library. , Available from: https://www.eu-openscreen.eu/services/compound-collection/fragment-library.html (2020).
- Pearce, N. M., et al. A multi-crystal method for extracting obscured crystallographic states from conventionally uninterpretable electron density. Nature Communications. 8, 15123 (2017).
- Barthel, T., Huschmann, F. U., Wallacher, D., Klebe, G., Weiss, M. S., Wollenhaupt, J. Facilitated crystal handling using a simple device for evaporation reduction in microtiter plates. Journal of Applied Crystallography. 54, (2021).
- Mueller, U., et al. The macromolecular crystallography beamlines at BESSY II of the Helmholtz-Zentrum Berlin: Current status and perspectives. The European Physical Journal Plus. 130 (7), 141 (2015).
- Oscarsson, M., et al. MXCuBE2: The dawn of MXCuBE collaboration. Journal of Synchrotron Radiation. 26 (2), 393-405 (2019).
- Mueller, M., Wang, M., Schulze-Briese, C. Optimal fine φ-slicing for single-photon-counting pixel detectors. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 68 (1), 42-56 (2012).
- Lima, G. M. A., et al. FragMAX: The fragment-screening platform at the MAX IV Laboratory. Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 76 (8), 771-777 (2020).
- Sparta, K. M., Krug, M., Heinemann, U., Mueller, U., Weiss, M. S.
- Winter, G. xia2: an expert system for macromolecular crystallography data reduction. Journal of Applied Crystallography. 43 (1), 186-190 (2010).
- Winn, M. D., et al. Overview of the CCP4 suite and current developments. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 67 (4), 235-242 (2011).
- Terwilliger, T. C., Klei, H., Adams, P. D., Moriarty, N. W., Cohn, J. D. Automated ligand fitting by core-fragment fitting and extension into density. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 62 (8), 915-922 (2006).
- Pearce, N. M., Krojer, T., Von Delft, F. Proper modelling of ligand binding requires an ensemble of bound and unbound states. Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 73 (3), 256-266 (2017).
- Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K.
- Collins, P. M., et al. Chapter Eleven - Achieving a Good Crystal System for Crystallographic X-Ray Fragment Screening. Methods in Enzymology. 610, 251-264 (2018).
- Bowler, M. W., et al. MASSIF-1: a beamline dedicated to the fully automatic characterization and data collection from crystals of biological macromolecules. Journal of Synchrotron Radiation. 22 (6), 1540-1547 (2015).
- Cuttitta, C. M., et al. Acoustic transfer of protein crystals from agarose pedestals to micromeshes for high-throughput screening. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 71 (1), 94-103 (2015).
- Moreno-Chicano, T., et al. High-throughput structures of protein-ligand complexes at room temperature using serial femtosecond crystallography. IUCrJ. 6 (6), 1074-1085 (2019).
