Summary
Kristallografisk fragmentscreening på Helmholtz-Zentrum Berlin utförs med hjälp av ett arbetsflöde med dedikerade sammansatta bibliotek, kristallhanteringsverktyg, snabba datainsamlingsanläggningar och till stor del automatiserad dataanalys. Det presenterade protokollet syftar till att maximera resultatet av sådana experiment för att ge lovande utgångspunkter för nedströms strukturbaserad liganddesign.
Abstract
Fragment screening är en teknik som hjälper till att identifiera lovande utgångspunkter för ligand design. Med tanke på att kristaller av målproteinet finns tillgängliga och visar reproducerbart högupplösta röntgendiffraktionsegenskaper är kristallografi bland de mest föredragna metoderna för fragmentscreening på grund av dess känslighet. Dessutom är det den enda metoden som ger detaljerad 3D-information om fragmentens bindande läge, vilket är avgörande för efterföljande rationell sammansatt utveckling. Den rutinmässiga användningen av metoden beror på tillgången till lämpliga fragmentbibliotek, dedikerade medel för att hantera ett stort antal prover, toppmoderna synkrotronstrålar för snabba diffraktionsmätningar och till stor del automatiserade lösningar för analys av resultaten.
Här presenteras det kompletta praktiska arbetsflödet och de medföljande verktygen för hur man utför kristallografisk fragmentscreening (CFS) på Helmholtz-Zentrum Berlin (HZB). Före detta arbetsflöde optimeras kristall blötläggnings villkor samt data insamlings strategier för reproducerbara kristallografiska experiment. Sedan, vanligtvis i en en till två dagars procedur, används ett 96-medlems CFS-fokuserat bibliotek som tillhandahålls som torkade färdiga tallrikar för att suga 192 kristaller, som sedan flashkyls individuellt. De sista diffraktionsexperimenten kan utföras inom en dag vid de robotmonterade strållinjerna BL14.1 och BL14.2 vid BESSY II elektronlagringsring som drivs av HZB i Berlin-Adlershof (Tyskland). Bearbetningen av kristallografiska data, förfining av proteinstrukturerna och träffidentifiering är snabb och till stor del automatiserad med hjälp av specialiserade programvarupipeliner på dedikerade servrar, vilket kräver lite användarinmatning.
Genom att använda CFS-arbetsflödet på HZB möjliggör rutinmässiga screeningexperiment. Det ökar chanserna för framgångsrik identifiering av fragmentträffar som utgångspunkter för att utveckla mer potenta bindemedel, användbara för farmakologiska eller biokemiska tillämpningar.
Introduction
Det första steget i läkemedelsutvecklingen är screening av föreningar mot ett mål av intresse. Traditionellt används stora sammansatta bibliotek i storleksordningen 100 000-1 000 000 poster i biokemiska analyser med hög genomströmning inom läkemedelsindustrin. Denna strategi kompletterades med fragmentbaserad läkemedelsdesign (FBDD), en nyare metod som tog en brant ökning under de senaste 20 åren och blev en mainstream-strategi för att generera högkvalitativa ledande kandidater på grund av flera inneboende fördelar med metoden1. Termen "fragment" avser en liten organisk molekyl som vanligtvis innehåller mindre än 20 icke-väte eller tunga atomer (HAs). Således är ett fragment betydligt mindre än de läkemedels- eller blyliknande molekyler (vanligtvis mindre än 30 HAs) som utforskas vid konventionell screening med hög genomströmning. Fragment är bindemedel med svag affinitet. Men jämfört med större molekyler är fragment mer mångsidiga, eftersom även en liten samling av dem bättre kan representera respektive kemiskt utrymme för molekyler av samma storlek2. Dessutom är utvecklande fragmentscreening träffar i blymolekyler betydligt effektivare än att optimera redan störremolekyler 2,3,4,5. Det innebär att screening av fragment kan användas effektivt i avvaktan på tillräcklig känslighet för upptäckten och ger högkvalitativa utgångspunkter för ytterligare sammansatt utveckling. Flera biofysiska metoder kan tillämpas för fragment screening, den mest populära är kärnmagnetisk resonans, röntgen kristallografi, ytan plasmon resonans och termiska skift analyser. Dessa metoder används antingen parallellt eller i sekventiellt sätt, i syfte att öka förtroendet för träffarna och minska antalet falska positiva eller falska negativ. En nyligen genomförd jämförande studie6 föreslog dock att sekventiella screening kaskader ska undvikas på grund av den låga överlappningen mellan de olika metoderna.
Röntgenkristallografi är en väletablerad metod för strukturbestämning vid atomdetaljer men har nyligen också utvecklats som ett verktyg förscreeningändamål 7,8. Eftersom proteinkristaller tolererar höga fragmentkoncentrationer (t.ex. 100 mM) kan kristallografisk fragmentscreening (CFS) konkurrera med andra biofysiska metoder för screening av fragment eller till och med överträffa dem som en första stegs screeningmetod6,9. En viktig förförfrågan för CFS är dock ett validerat kristalliseringssystem för målproteinet som reproducerbart levererar kristaller med diffraktionsegenskaper till betydligt hög upplösning, vanligtvis bättre än 2 Å.
En exklusiv fördel med CFS jämfört med alla andra fragmentscreeningsmetoder är tillhandahållandet av detaljerad 3D-information om det bindande läget för de identifierade fragmenten. Denna strukturella information är helt avgörande för den rationella optimeringen av fragmentträffarna till pärmar med högre affinitet. Etablerade utarbetande strategier växer, slås samman och länka fragment träffar5. Därmed ges relativt hög ligand effektivitet från början, och införandet av onödiga eller rumsligt inte lämpliga grupper kan undvikas, vilket minskar kostnaderna för kemisk syntes. Sammantaget har CFS oöverträffade fördelar som en startstrategi för läkemedelsdesign.
Med tanke på att ett visst biologiskt mål uppfyller cfs höga krav på kristallkvalitet finns det några huvudfaktorer som maximerar chanserna för ett framgångsrikt resultat av sådana screeningkampanjer. Det beror på kvaliteten på det fragmentbibliotek som används, på ett effektivt arbetsflöde för att utföra experimenten före diffraktionsexperimentet, på synkrotronstrålar med tillräcklig automatisering och datainsamlingshastighet, samt på sätt och medel för till stor del automatiserad databehandling och analys. Här presenteras det fullständiga arbetsflödet från kristallindränkta experiment till träffidentifiering, på det sätt som det framgångsrikt etableras vid de makromolekylära kristallografistrålarna vid BESSY II (Figur 1). Anläggningen är öppen för akademiska och industriella användare för samarbete. Dessutom kan akademiska användare av EU-länder utanför Tyskland enkelt ansöka om finansiering via iNEXT Discovery-projektet.
Det finns oumbärliga förutsättningar för att kunna starta en CFS-kampanj och genomföra det protokoll som beskrivs i detta arbete: väldriffande kristaller av målproteinet finns tillgängliga som kan odlas reproducerbart i stort antal, som är stabila vid omgivningstemperatur och som odlades med hjälp av en kristalliseringscocktail utan mycket flyktiga ingredienser. En annan förutsättning är att kristallgitteret är lämpligt för experimentet. I ett lämpligt gitter måste målproteinens intressanta platser exponeras mot lösningsmedelskanalerna och därmed vara tillgängliga. Ett annat föregående steg som är valfritt men ändå starkt rekommenderat för att säkerställa framgång i arbetsflödet för CFS-kampanjen är optimeringen av blötläggnings villkoret för experimentet. Viktig referensstatistik här är kristallens diffraktionskraft och relevanta datakvalitetsindikatorer, som bestäms under dataskalningsförfarandet. Typiska faktorer att optimera är DMSO-tolerans, buffertkoncentration och kryoskyddsmedel. Även om det inte är en strikt förutsättning som beskrivs ytterligare nedan, dmso som medlösningsmedel kan bidra till att öka fragmentlöslighet. Typiska tester bör inkludera blötläggning av 0, 3, 6 eller 10% (v/v) DMSO över natten. En ökning av buffertkoncentrationen till 200 eller 300 mM bidrar till att förhindra förlust av diffraktionskvalitet på grund av tillfälliga pH-skiftande effekter som härrör från de höga fragmentkoncentrationer som ska användas. Slutligen är det avgörande att ta reda på om och vilket ytterligare kryoprotektant som krävs och om det redan kan ingå i blötläggningsförhållandet. I många fall behövs dock inte ett extra kryoskyddsmedel, eftersom DMSO själv kan fungera som ett kryoskyddsmedel. I så fall sparar detta ett hanteringssteg i det slutliga experimentet. De flesta kristaller behöver mindre kryoskyddsmedel om de blixtkyls på slingor av lämplig storlek, minimerar eller undviker omgivande moderlut så mycket som möjligt. Men i sällsynta fall är ett lager av moderluten verkligen nödvändigt för att förhindra skador på kristallen vid blixtkylning.
Antalet träffar som erhålls i en CFS-kampanj är inte bara beroende av målproteinens läkemedelsanvändning och kristallgitterens lämplighet (se ovan), utan det är också beroende av bibliotekets kvalitet. Bibliotekets kvalitet omfattar två aspekter: valet av föreningar för biblioteket och konfektyr av föreningarna (dvs. i vilken fysisk form de presenteras för experimentet). För sammansatt urval kan olika strategier användas. De flesta biblioteksdesigner inkluderar maximering av fragmentens kemiska mångfald. Ett strategiskt fokus skulle kunna vara att inkludera fragmentens kemiska dragbarhet för uppföljningsdesign, som har tillämpats till exempel i Diamond-SGC-iNEXT-biblioteket10. Ett annat strategiskt fokus för biblioteksdesign kan vara att maximera representationen av kommersiellt tillgängligt kemiskt utrymme av fragment genom form- och farmakoforbaserad klustring, vilket har exemplifierats av F2X-biblioteken som utvecklats vid HZB11. Mer specifikt har det 1103-medlemmar f2X-universella biblioteket och representativ 96-sammansatt delmängd för inledande CFS-kampanjer, som kallas F2X-Entry Screen, utvecklats och F2X-Entry Screen har validerats framgångsrikt11. F2X-entry screen är det primära valet för CFS-kampanjer på HZB. Därefter kan större kampanjer sedan genomföras med F2X-Universal Library eller det 1056-medlemmars EU-OPENSCREEN fragmentbibliotek12 som också erbjuds på HZB. För närvarande är dessa bibliotek tillgängliga för användare av de makromolekylära kristallografistrålarna i BESSY II-synkrotronen i Berlin utan kostnad på grundval av ett samarbetsavtal. Det gäller även användare via iNEXT Discovery-förslag. Dessutom är F2X-Entry Screen tillgänglig för alla intresserade forskare på grundval av ett materialöverföringsavtal.
När det gäller den fysiska presentationen av ett bibliotek antas ofta två tillvägagångssätt: fragmenten används antingen som DMSO-stamlösningar eller fragmenten torkas och immobiliseras på färdiga plattor. Vid HZB presenteras både F2X-entry Screen och de icke-flyktiga föreningarna i F2X-Universal Library som torkade föreningar i en 3-lins 96-brunns MRC lågprofil kristalliseringsplatta. Presentationen av fragmenten immobiliserade i kristalliseringsplattor har två viktiga fördelar: För det första tillåter det transport av screeningplattorna till användarens hemlabb. Därför kan de blötläggnings- och kristallhanteringsstegen i arbetsflödet som presenteras här (steg 1-3) utföras var som helst. För det andra kan DMSO-fri lösning användas. DMSO-känsliga mål kan således enkelt avskärmas, vilket till stor del bibehåller förväntade träfffrekvenser11. Dmso ökar dock fragmentlösligheten, därför är det värt att kontrollera DMSO-toleransen för ett kristallsystem som i förväg anges ovan.
Protokollet som beskrivs nedan beskriver ett typiskt experiment med en 96-sammansatt skärm som F2X-ingångsskärmen. För det måste cirka 250 kristaller förberedas i tid för att användas nyligen. Det är mycket tillrådligt att förbereda blötläggningarna för alla 96 föreningar i duplikat. Det rekommenderas, men valfritt, att förbereda ytterligare mock-soaks som senare hjälper till med dataanalys med pan-data density analysis (PanDDA) -metoden för träffidentifiering13. Mock-soaks definieras som blötläggningsexperiment på proteinkristaller med samma blötläggningslösning som fragmentet suger under samma inkubationstid, men inga fragment finns. Om blötläggningslösningen är lika med kristalliseringsförhållandet kan kristallerna skördas direkt från kristalliseringsplattan.
Beroende på robotprovväxlarens kapacitet kan olika puckformat behöva användas. För närvarande måste prover för den HZB-drivna strållinjen BL14.1 beredas i Unipuck-format, prover för den HZB-drivna strållinjen BL14.2 måste beredas i SPINE puckformat. I det här protokollet antas förberedelse i Unipuck-format.
Protocol
1.Blötläggning kristaller
- Ta skärmplattan (här, en F2X-ingångsskärmplatta, figur 2) från frysen -20 °C och placera den på bänken/bordet i ca 30 min för att förvärma den till rumstemperatur, så att kondensfuktighet undviks.
- Ordna arbetsplatsen med två tätt arrangerade mikroskop och alla verktyg som behövs (figur 3A). Materialen listas i materialförteckningen.
- Välj 3-4 slingor av lämplig storlek för överföring av kristallerna som ska blötläggas och placera dem nära mikroskopen.
- Fyll glasfläckens plåthålor med avjoniserat eller destillerat vatten.
- Förbered 5 ml blötläggningslösning.
- Skär upp påsen på screeningplattan som är förvärmd till rumstemperatur.
- Ta bort locket och folien från siktplattan, samtidigt som plattan placeras på bänken/bordet.
- Dekantera 5 ml blötläggningslösning i reagensbehållaren.
- Fyll var och en av de 96 reservoarerna med 40 μL blötläggningslösning med 12-kanalspipetten.
- Placera EasyAccess Frame ovanpå screeningplattan och fäst den med de medföljande klämmorna genom att skjuta dem på vänster och höger sida av enheten.
OBS: EasyAccess Frame är en speciell enhet för hantering av flera kristaller, som utvecklades vid HZB14. Det möjliggör enkel åtkomst till varje brunn genom att flytta de rörliga plattorna samtidigt som de andra brunnarna skyddas från avdunstning. - Placera screeningplattan (inkl. EasyAccess Frame) under det första mikroskopet och kristalliseringsplattan inklusive kristallerna som ska blötläggas under det andra mikroskopet.
- Skjut upp brunn A1 på screeningplattan genom att flytta respektive akrylglasplatta i EasyAccess Frame antingen med ett finger eller det medföljande pennverktyget.
- Tillsätt 0,4 μL blötläggningslösning från behållaren till fragmentet som innehåller brunn (övre vänstra objektivet) med en ny pipettspets. Kontrollera genom mikroskopet att droppen täcker det torkade fragmentet, så att det kan lösas upp.
OBS: Alternativt kan detta steg utföras med hjälp av en rörrobot före monteringen av EasyAccess Frame. På så sätt kan blötläggningsdroppar av alla brunnar placeras i en automatisk procedur. Författarna rekommenderar dock att du lägger till blötläggningslösningen direkt före blötläggningssteget enligt beskrivningen för att säkerställa att fragmentet lösligar långsamt och i närvaro av kristallen. Detta undviker att kristallen upplever en plötslig chock vid överföring till en droppe med hög fragmentkoncentration. - Under det andra mikroskopet skär du upp kristalliseringsplattans tätningsfolie vid en av de brunnar som innehåller målkristallerna.
- Överför två kristaller med en slinga i lämplig storlek monterad på kristallstaven till screeningplattans brunn A1 under det första mikroskopet.
- Tvätta slingan i den beredda glasfläckplattan och torka den genom att försiktigt vidröra vävnaden. Gör detta efter varje överföring för att undvika korskontaminering med fragment som innehåller blötläggningslösningar.
- Använd mikroskopet för att kontrollera att kristallerna har placerats korrekt.
- Gå vidare till nästa brunn (t.ex. B1).
- Upprepa steg 1.13-1.18 med alla 96 brunnar på screeningplattan tills varje blötläggningsdroppe innehåller två kristaller.
- Ta bort screeningplattan (inkl. EasyAccess Frame) under mikroskopet och placera den på bänken/bordet.
- Ta bort EasyAccess Frame från screeningplattan.
- Försegla screeningplattan med tätningsfolie och placera den i kristalliseringsinkubatorn respektive skåpet, där kristallerna odlades.
- Inkubera för den optimerade blötläggningstiden. Över natten är vanligtvis bekvämt.
- (frivillig uppgift) Beredning av cirka 40 apokristaller (dvs. mock soaking)
- Ta en MRC 3-lins 96-brunns lågprofil kristalliseringsplatta och fyll två kolumner med 40 μL blötläggningslösning per brunn med hjälp av 12-kanalspipetten.
- Placera EasyAccess Frame ovanpå kristalliseringsplattan och fäst den med de medföljande klämmorna genom att skjuta dem på vänster och höger sida av enheten.
- Skjut upp akrylglasplattan på brunn A1.
- Placera 0,4 μL blötläggningslösning i var och en av brunnens två vänstra linser.
- Överför 2-3 kristaller till varje droppe. Efter varje överföring, tvätta slingan i den beredda glasfläckplattan och torka genom att försiktigt röra vid vävnaden.
- Flytta till nästa brunn (t.ex. B1).
- Upprepa steg 1.24.4-1.24.6 tills cirka 40 kristaller är redo för inkubation.
- Ta bort kristalliseringsplattan (inkl. EasyAccess Frame) under mikroskopet på bänken/bordet och ta bort EasyAccess Frame.
- Försegla kristalliseringsplattan med tätningsfolie och placera den i ovannämnda kristalliseringsinkubator eller skåp.
- Inkubera samtidigt som screeningplattan.
2.Skörda kristaller
- Ta ut inkubationsplattan(erna) från inkubatorn respektive skåpet.
- Ordna arbetsplatsen med ett mikroskop och alla verktyg som behövs (bild 3B). Materialen listas i materialförteckningen.
- Förbered en Unipuck skumdewar med 3 Unipuck lock (dvs provhöljen) och fyll den med flytande kväve (LN2).
OBS: Följ lämpliga säkerhetsåtgärder för att arbeta med LN2 (dvs. använd skyddsglasögon och använd lämplig skyddsutrustning). Det är bäst att få färskT LN2 flera gånger under sessionen för att undvika vattenkondens i LN2-förvaringsbehållaren. Genom hela följande förfarande, se till att LN2-nivån i skumdewar alltid når dewarens övre kant. Se också till att LN2 är isfri; Byt ofta ut LN2 (t.ex. en gång var 45:e minut) eller senast om isen börjar ackumuleras. Fyll sedan den andra skumdewar och överför Unipucks till den. Töm det iskalla skumdewaret och ta bort kvarvarande is och fukt med blåstorken. - Ta bort folien från screeningplattan och placera EasyAccess Frame ovanpå.
- Skjut upp brunn A1.
- Skörda två kristaller från droppen och flashkyl dem i LN2 (en efter en) genom att kasta med en snabb vertikal rörelse i LN2 och sedan sätta in provet i rätt puckläge. Anteckna relevant på exempelspårningsbladet.
- Kryoprotection steg (om nödvändigt för målkristaller). I sådana fall utför du detta steg istället för 2,6.
- Placera 0,4 μL blötläggningslösning inklusive kryoskyddsmedel på brunnens nedre vänstra lins.
- Dra slingan med en kristall monterad från droppen i den övre vänstra linsen långsamt genom lösningen i den nedre vänstra linsen samtidigt som kristallen är i slingan och blinka sedan svalt i LN2. Skörda två kristaller på det här sättet.
OBS: I steg 2.6 och 2.7, se till att tiden kristallen är i slingan och utsatt för luft hålls mycket kort. Plungningen (dvs. provets vertikala droppe i LN2-fyllddewar) bör utföras så snabbt som möjligt. Detta säkerställer hög provkvalitet och förebyggande av isringar i data. Spåra proverna (dvs. observera om kristaller har skador etc.) för att prioritera antingen dubbletter för följande röntgenmätningar, använd mallen för det. Även om kristaller har sprickor, "hår" eller andra defekter på grund av blötläggningen, kan de fortfarande användas och bör alltid skördas. Om kristaller bröts i flera bitar bör två av de största / snyggaste bitarna skördas. Figur 5 visar några exempel på hur sådana kristaller kan se ut. Alla visade kristaller gav fortfarande användbara datamängder i respektive kampanj11, vilket understryker att det är värt att skörda kristaller efter blötläggningsbehandling, även om betydande morfologiska förändringar inträffade.
- Gå till nästa brunn och upprepa steg 2,5 - 2,6/2,7 tills alla tre puckarna är fyllda.
- Lägg unipuckbaserna ovanpå locken efter förkylning i LN2.
- Förvara Unipucks i förvaringsställ i en transportdewar eller lagringsdewar.
- Upprepa föregående steg tills alla brunnar på screeningplattan har bearbetats.
- (frivillig uppgift) Om mock-blöta kristaller förbereddes, skörda dem på ett liknande sätt som beskrivits i förväg.
OBS: Om två kristaller för var och en av de 96 förhållandena på screeningplattan kan blixtkylas, kommer det att finnas plats för 32 mock-blöta apokristaller, för att fylla upp 14 Unipucks. - Förvara Unipucks i LN2 tills mätningen.
3.Datainsamling
- Överför Unipucks till beamline BL14.1. Om SPINE-puckar har använts i steg 2, överför dem till beamline BL14.2.
- Utför standardmätningar på strållinjen med hjälp av de specifika rekommendationerna nedan. Detaljer om anläggningen och experimentkontrollprogrammet MXCuBE2 har presenterats tidigare15,16. Figur 4 visar interiören i de experimentella hutchesna av beamlines BL14.1 och BL14.2 samt en exempel skärmdump av MXCuBE2 kontrollprogramvara på beamline BL14.1.
- Om du vill maximera tidseffektivitet och dataflöde hoppar du över samlingen av testbilder. Avståndet mellan prov och detektor kommer att fästas på ett värde som är lämpligt för den övre upplösningsgränsen för det kristallsystem som bestäms i tidigare experiment. Om datainsamlingsstrategin inte optimerades i förväg samlar du in 1800 bilder på 0,2 grader vardera med en exponeringstid på 0,1 s per bild.
- Helst testa datainsamlingsstrategin i tidigare experiment med mock-blöta apokristaller. För högre symmetrirymdgrupper kommer 1200 bilder eller till och med 900 bilder (dvs. 240° respektive 180°) redan att ge fullständiga datamängder med bra statistik, oberoende av startvinkeln för datainsamling.
OBS: Högre redundans och finare skivning kan ge överlägsen datakvalitet17. Men att använda denna "tillräckligt men inte mer"-strategi som föreslås här är en utmärkt kompromiss mellan kvalitet, datainsamlingstid och beräkningskrav för analys senare. På det beskrivna sättet är 200 datainsamlingar på 24 timmar väl möjliga vid strållinjerna BL14.1 och BL14.2. Prover bör dock prioriteras. - Samla först in diffraktionsdatauppsättningar för ett exempel per fragmenttillstånd, baserat på prioriteringen i steg 2.6./2.7 (dvs. samla in data för den högre prioriterade dubbletten).
- För de experiment i 3.2.3 där datainsamlingen misslyckades förlorades diffraktion eller allvarliga isringar uppstod, samla in data för det andra duplicerade provet av respektive fragmenttillstånd.
- Samla in diffraktionsdatauppsättningar av apokristaller (om de bereds enligt steg 1.24 och 2.12).
- Samla in diffraktionsdatauppsättningar för de återstående dubbletterna för varje fragmentvillkor.
- I MXCuBE2-programmet, matcha datauppsättningsidentifierarna för en CFS-kampanj till följande mönster:
- -[ABCDEFGH][01][0123456789][ab] (t.ex. MyProtein-F2XEntry-B05a, där "B05" står för brunnen (dvs. fragmenttillståndet på skärmen) och följande "a" för den första dubbletten.)
4.Databehandling
- För dataanalys av CFS-kampanjen, använd FragMAXapp, en webbaserad lösning för att styra en multiplexanalys för bearbetning av automatisk förfining och PanDDA-träffutvärdering av CFS-data18 (Lima et al. FragMAXapp, opublicerade data). I FragMAXapp-versionen som distribueras på HZB finns följande program/pipelines tillgängliga: XDSAPP19,Xia2-DIALS och Xia2-XDS20, fspipeline7, DIMPLE21, Phenix LigFit22, PanDDA13,23. Använd en väl förfinad ingångsmodell av målproteinet som insats för automatisk förfining; annars utföra noggrann förfining av en högupplöst mock-soaked kristall som samlades in under kampanjen.
Obs: Ett viktigt element för träffidentifiering är PanDDA. Detaljer förklaras i respektive publikationer13,23. I korthet beräknar PanDDA automatiskt elektrontäthetskartor för en uppsättning datauppsättningar i en CFS-kampanj. Dessa antas sedan vara icke-bindande fragmentvillkor och är genomsnittliga för att generera den så kallade marktillståndsmodellen. Marktillståndsmodellen används sedan för att härleda lokala avvikelser mellan varje elektrontäthetskarta och markstatskartan, med voxel-associerade Z-poäng. Sedan, för områden med höga Z-poäng skapas en så kallad PanDDA-karta genom finjusterad subtraktion av marktillståndstäthet från respektive karta. Detta ökar i stor utsträckning synligheten för fragmentbindningshändelser. - För att maximera resultatet av PanDDA, använd en tvåstegsstrategi. För det första att utföra en PanDDA-körning (pandda.analyse) med standardinställningar. Även om mock-blöta kristaller har samlats in, kommer deras identitet inte att inkluderas som en parameter (vilket är möjligt ändå) för att möjliggöra en opartisk generering av marktillståndsmodellen av PanDDA från alla tillgängliga data. Därefter utvärderas utdata av användaren via en så kallad PanDDA-inspektion i Coot24. Här bör träffar med relativt högt förtroende noteras och avsluta det första steget.
- För det andra, kör om pandda.analyse-steget exklusive de preliminära träffarna (som bestäms i det första steget) från marktillståndsmodellen via kommandoradsalternativet --exclude_from_characterisation="
". Mer information beskrivs på PanDDA:s hjälpsidor (https://pandda.bitbucket.io/). På så sätt ignoreras datamängder som är tydliga träffar och därmed skulle skymma marktillståndsmodellen om de inkluderas. Detta leder till en förbättrad markstatsmodell och därmed till förbättrade resultat totalt sett. Slutligen utförs en grundlig PanDDA-inspektion för att slutföra träffidentifieringen.
FRAGMAXapp innehåller också ett utdataalternativ för att spara de modellerade bundna tillstånden eller förbereda data för PDB-inlämning, för mer information se FragMAX webbsidor (https://fragmax.github.io/).
Representative Results
Som en del av de tidigare rapporterade valideringskampanjerna för F2X-Entry Screen11genomfördes tre kampanjer vid BioMAX-strållinjen vid MAX IV och en kampanj genomfördes vid beamline BL14.1 vid HZB. I den senare kampanjen screenades en viss uppsättning F2X-Entry Screen-förhållanden med hjälp av ett blötläggningstillstånd som inte innehöll DMSO mot proteinproteinkomplexet jäst Aar2 och den RNaseH-liknande domänen jäst Prp8 (AR). Den valda uppsättningen villkor omfattar de träffar som hittades i en tidigare kampanj av F2X-entry Screen mot AR i ett blötläggningsförhållande som innehåller DMSO11, (dvs. i kampanjen som utfördes på HZB visades dessa träffar på nytt i avsaknad av DMSO). Figur 7 visar en översikt över de träffar som erhållits efter att ha analyserat data med FragMAXapp-kombinationen av XDSAPP för bearbetning, fspipeline för automatisk förfining och efterföljande träff med PanDDA.
Figur 1: Schematisk representation av arbetsflödet för ett kristallografiskt fragmentscreeningsexperiment (CFS) med fokus på den speciella miljön vid Helmholtz-Zentrum Berlin.
Figur 2:Formulering och förpackning av F2X-ingångsskärmen. Den 96-sammansatta skärmen finns på en 3-lins 96-brunns MRC lågprofilplatta, förseglad med folie och vakuumförpackad. Skärmens 96 föreningar torkas från DMSO-lösningar i två av de tre linserna i varje brunn. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Bild 3: Fotografering av CFS-arbetsbänken i HZB-förberedelselabbet. Sammansättningar av nödvändiga verktyg för A) blötläggning och för B) kristallskörd visas. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 4: Slutstationer för datainsamling och kontrollprogramvara. A) Fotografi av den experimentella hyddan av HZB-MX strållinjer BL14.1 (vänster) och BL14.2 (höger)15. B) Skärmbild av MXCuBE2 experiment kontrollgränssnitt 16 som används på BL14.1 för diffraktion datainsamling. På BL14.2 används ett mycket liknande gränssnitt. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 5:Fotografiska ögonblicksbilder av vissa kristallina prover i kryogen miljö före datainsamling. Detta illustrerar variationen av kristallens morfologier efter att ha utfört fragment blötläggning och kristallskörd. Fotografierna togs på BioMAX-strållinjen (MAX IV synchrotron, Lund, Sverige) för AR-prover som samlats in där som en del av F2X-Entry Screen valideringen11. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Bild 6:Skärmdump av FragMaxApp18 installerad på HZB för bekväm dataanalys. Mer information i Lima et al., FragMAXapp, opublicerade data. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 7: Översikt över resultaten av CFS-kampanjen F2X-Entry vs. AR (utan DMSO). AR-proteinkomplexet visas i tecknad vy, med Aar2 färgad i grått och den RNaseH-liknande domänen Prp8 färgad i blått. Kampanjens fragmentträffar är färgade i elementfärger (C - gul, O - röd, N - blå, S - orange, Cl - ljuscyan). Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Kompletterande information. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Discussion
För en framgångsrik CFS-kampanj är det viktigt att följa de beskrivna förutsättningarna (se Introduktion). Ett tillförlitligt kristalliseringssystem behövs för reproducerbar tillväxt av många väldriffande kristaller, och en väl förfinad struktur behövs som input apo-modell för automatiserad förfining. Det är också viktigt att kontrollera att målplatsen på proteinet (aktiv plats eller gränssnittsområde) är tillgänglig för fragment i kristallgitteret. Det är viktigt att optimera blötläggningsförhållandena i förväg för att säkerställa att blötläggningen inte försämrar kristallkvaliteten avsevärt. Att försumma dessa aspekter kommer med stor sannolikhet att leda till ett suboptimalt experiment, som kommer att vara av begränsad användning och i värsta fall kommer att kräva en upprepning av hela experimentet.
Protokollet som beskrivs ovan beskriver de procedurer som följs under en standard CFS-kampanj. Om alla förutsättningar uppfylls bör minst 90% av alla blöta kristaller visa diffraktion till hög upplösning i ett diffraktionsexperiment. Om så inte är fallet kan blötläggningstiderna förkortas till några timmar eller till och med minuter. På grund av den goda lösligheten hos de flesta fragmenten bör detta räcka för att få anständiga beläggningsvärden. Dessutom kommer en typisk CFS-kampanj att resultera i en träfffrekvens på ungefär 10% eller högre. För valideringskampanjerna F2X-Entry Screen11 och pågående användarkampanjer med samma bibliotek har ännu högre träfffrekvenser observerats (20 % och högre, data visas inte).
En allmän varning av kristallografiska fragment screening är förekomsten av kristallografiska kontaktplatser. Dessa kan antingen ocklusera a priori kända aktiva platser (som ska kontrolleras före screeningen, se ovan), eller dessa kontaktplatser ger också ofta fickor och hotspots där fragment kan binda. Sådana fragmentträffar kommer att vara artefakter av kristalliseringsgitteret och kommer sannolikt inte att binda till proteinet i lösningen. Dessa händelser tenderar att inträffa oftare i blötläggningsexperiment än i samkristalliseringsexperiment (förmodligen på grund av de högre fragmentkoncentrationerna som används i blötläggningsexperiment). Enligt tidigare erfarenheter utgör de dock i allmänhet endast en mindre del av de erhållna träffarna. I valideringskampanjen F2X-entry screen med endopepsin (EP) och det skarveosomala proteinproteinkomplexet Prp8RNaseH och Aar2 (AR) inträffade till exempel de flesta träffarna på lovande platser11. För EP var 27 av de 37 observerade bindande händelserna belägna på den aktiva platsen (dvs. peptidklyven i denna proteas). De 10 fjärrbindningshändelserna omfattar två lösningsmedelsexponerade bindningshändelser och åtta kristallkontaktbindningshändelser (motsvarande fem unika träffar). Att utesluta dessa kristallkontaktträffar skulle fortfarande återspegla en total frekvens på 24% unika träffar för EP-kampanjen. Det är också viktigt att märka att bindande händelser som är avlägsna från en känd aktiv plats (förutom kristallkontaktbindemedel) också kan vara potentiellt intressanta (t.ex. avslöja nya hotspots eller allosteriska platser av proteinet). För AR-kampanjen (i samma publikation) var sju av de 23 observerade bindande händelserna belägna vid kristallkontakter, en var belägen vid det direkta gränssnittet för de två proteinerna, sju var belägna på kända proteinproteininteraktionsplatser med andra bindande partner i det större biologiska sammanhanget (därav olika monteringsstadier i skapliceosomen), åtta bindande händelser visade två heta fläckar på AR av ännu okänd funktion och en var vid en lösningsmedel exponerad yta av Prp8RnaseH. Om man bortser från händelserna vid kristallkontakter och Prp8RnaseH singleton är antalet potentiellt användbara bindande händelser 15 (motsvarande 14 unika träffar) vilket är en träfffrekvens på 15,6%. Dessa träffar kan vara utgångspunkter för design av proteinproteininteraktionsmodulatorer eller för verktygsföreningar som syftar till att utforska de två upptäckta Aar2-hotspotsna. Sammantaget, också i linje med genomförda användarkampanjer, måste ofta endast en mindre del av träffarna i kristallografisk fragmentscreening ignoreras som artefakter. Men detta kommer också till stor del att vara målberoende.
Om träfffrekvensen är betydligt lägre kan detta tyda på ett av följande problem relaterade till målproteinet. Till exempel observerades en träfffrekvens på endast 3% i en CFS-kampanj mot en viral cysteinprotease (data visades inte). Det visade sig att proteinet som användes troligen var kemiskt modifierat på sin aktiva plats. I sådana fall kan ett annat proteinpreparat lösa problemet. Om kristaller är mycket DMSO intoleranta kan F2X-entry Screen också användas utan DMSO, även om resultaten kan skilja sig åt i viss utsträckning. De flesta av de träffar som erhålls i närvaro av DMSO kommer också att dyka upp i dess frånvaro. Det kommer också att finnas några träffar som inte kan observeras i avsaknad av DMSO, även om de kan observeras i dess närvaro. Och slutligen kommer det att finnas några som bara dyker upp i avsaknad av DMSO.
Den allvarligaste svårigheten uppstår om proteinet genomgår en inducerad rörelse på ämnesbindning. Mest sannolikt kommer kristallgitteret inte att tolerera proteinrörelsen och kristallerna kommer att sönderfalla. I ett sådant fall är det enda valet att tillgripa samkristallisering av proteinet och fragmenten. Detta kan dock leda till nya kristallformer. Därför kommer mycket av automatiseringen av hela processen inte att fungera effektivt längre. Lyckligtvis, i de flesta CFS-kampanjer som genomförts på HZB hittills, har denna typ av problem inte stött på. Det kan vara, att den svaga bindningen av ett fragment inte ger tillräckligt med energi för att inducera en proteinrörelse, särskilt om den kristalliserade konformationen stabiliseras av kristallförpackningskrafter.
En annan allvarlig begränsning av metoden som författarna hittills har stött på är när kristalliseringscocktailen (och därmed blötläggningslösningen) innehåller flyktiga föreningar. Då blir det nästan omöjligt att utföra all kristallhantering på ett meningsfullt sätt.
Olika proteiner kan innehålla läkemedelspliktiga platser i större eller mindre utsträckning. Till exempel förmedlas proteinproteininteraktioner vanligtvis av förlängda plana ytor som är svårare att rikta in sig på. Fragmentbindningsträffhastigheten beror därför sannolikt på strukturen hos proteinens molekylära yta. I ett extremt fall kanske ett protein inte innehåller några lämpliga ytfläckar som fungerar som målplatser för fragmentbindning. Således, trots ett noggrant utfört experiment, kommer inga fragmentträffar att bli resultatet av screeningen. Författarna har dock hittills inte stött på en sådan situation.
I princip, med hjälp av protokollet som beskrivs ovan, kan kristall blötläggning och skördedel av en CFS-kampanj utföras i alla laboratorier som är utrustade för kristallhantering. Detta skiljer metoden vid HZB från andra CFS-anläggningar och kan i vissa fall vara en fördel. Om kristallerna till exempel inte lätt kan återproduceras på en annan plats eller om experimentförsökens resande är begränsat (t.ex. i en världsomfattande pandemisk situation), får användare på HZB därför hela utrustningen (puckar, verktyg, EasyAccess Frame, provhållare etc.) som en bärbar uppsättning.
Kraven på ett stort antal provhållare och kryogen lagringskapacitet uppfylls dock ännu bekvämare vid särskilda CFS-anläggningar. Dessutom förespråkar behovet av insamling av många diffraktionsdatauppsättningar starkt för att lokalisera dessa anläggningar nära strållinjer som är inriktade på ett högt provgenomströmning. Exempel på detta är strållinjerna I04-1 på Diamond Light Source och tillhörande XChem-anläggning i UK8,25, MASSIF-strållinjerna vid ESRF i Frankrike26 eller FragMAX-anläggningen vid BioMAX-strållinjen vid MAX IV i Sverige18.
I framtiden kan det tänkas att utforma CFS-experiment utan behov av kristallhantering helt och hållet. De första framstegen i denna riktning har rapporterats. Till exempel genom akustisk vätskeöverföring som gör det möjligt att blanda både de kristallhaltiga lösningarna och fragmentlösningarna direkt på provhållare av masktyp27. Ett annat tillvägagångssätt användes för XFEL-baserad ligand-screening. I ett principiellt experiment förbereddes ett kristallslam i parti, och blötläggning och diffraktionsdatainsamling utfördes på ett kiselfast målchip28. Dessa tillvägagångssätt är dock fortfarande under utveckling och är långt ifrån tillämpliga på ett brett spektrum av proteinmål eller genomförbara för CFS-anläggningar som rutin.
Med protokollet i detta arbete har detaljerade instruktioner för att framgångsrikt utföra CFS-kampanjer rakt fram vid HZB (och på andra ställen) beskrivits och allmän vägledning och användbara praktiska tips för att förbereda och genomföra sådana experiment med högre chanser att lyckas har getts. I slutändan bidrar bättre odds och framgångsgrader inom CFS-screening till stor del till att effektivt tillhandahålla utgångspunkter för utveckling nedströms av verktygsföreningar eller läkemedelskandidater.
Disclosures
En patentansökan avseende EasyAccess Frame har lämnats in av Helmholtz-Zentrum Berlin till det tyska patent- och varumärkesverket med registreringsnummer DE 10 2018 111 478.8. Dessutom har en internationell patentansökan via PCT-rutten, med hjälp av det tyska patentets prioritet, lämnats in.
Acknowledgments
Vi tackar de många användargrupper som har utfört CFS-kampanjer på HZB. Deras feedback ledde till en stegvis förbättring av vårt arbetsflöde. Vi vill tacka läkemedelsdesigngruppen vid University of Marburg och FragMAX-gruppen vid MAX IV, eftersom de nära samarbetena var grunden för flera utvecklingssprång för förbättrad CFS. Vi är tacksamma för stödet från det tyska federala ministeriet för utbildning och vetenskap (BMBF), via projekten Frag2Xtal och Frag4Lead (nummer 05K13M1 och 05K16M1). Vi är dessutom tacksamma för stöd via iNEXT-Discovery, projektnummer 871037, finansierat av Europeiska kommissionens Horisont 2020-program.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 µL pipet | Eppendorf | EP3123000012 | |
| 12 channel pipet, 100 µL | Eppendorf | EP4861000791 | |
| Blow dryer | TH-Geyer | 9.106 788 | |
| Crystal containing crystallization plates | Contains crystals to be soaked | ||
| Crystallization incubator | Providing constant temperature for crystallization experiment, at HZB: 20°C | ||
| Dual Thickness MicroLoops (LD) of different aperture sizes | MiTeGen | various, e.g. M5-L18SP-75LD |
250 loops in the appropiate size needed for the protocol, can be provided by HZB |
| EasyAccess Frame | HZB | The EasyAccess Frame is a special device for handling multiple crystals, which was developed at the HZB (Barthel et al., 2021). | |
| F2X-Entry Screen plate | HZB | Developed F2X-Entry Screen (Wollenhaupt et al., 2020) | |
| Glas spot plate | VWR | MARI1406506 | |
| Liquid nitrogen | At least a filled up 5 L can | ||
| Liquid nitrogen storage can | n.a. | n.a. | |
| Magentic crystal wand | MiTeGen | M-R-1013198 | |
| Microscopes | Leica | n.a. | |
| MRC 3-lens 96-well low profile crystallization plate | SwissCI | 3W96TLP-UVP | For mock-soaked crystals (optional) |
| Reagent reservoir | Carl Roth | EKT6.1 | 25 ml volume |
| Sample tracking template | https://www.jove.com/files/ftp_upload/62208/TemplateCFSHZBSampleTracking. xlsx |
||
| Scalpel | B. Braun | BA825SU | |
| Sealing foil for microtiter plates | GreinerBioOne | 676070 | |
| Shelved puck shipping canes (for Unipucks) | MiTeGen | M-CP-111-065 | 2 canes made of aluminum; can be provided by the HZB |
| Soaking solution | At least 5 ml are needed | ||
| Soaking solution including cryo-protectant, 150µL | Only needed if soaking solution is not cryo-protectant already | ||
| Tissues | Roth (Kimberly Clark Professional) | AA64.1 | |
| Transport dewar (Whartington dry shipper) | MiTeGen | TW-CX100 | 2 Travel dewars for storage of the 2 unipuck canes, alternatively a storage dewar of type VHC35 or similar could be used. |
| Unipuck foam dewars with lid | MiTeGen | M-CP-111-022 | two foam dewars especially suited for unipuck handling described in the protocol if SPINE pucks are used, different foam dewars might have to be applied. |
| Unipuck starter set | MiTeGen | M-CP-UPSK001 | Can be provided by the HZB |
| Unipucks | MiTeGen | M-CP-111-021 | 14 unipucks; can be provided by the HZB |
References
- Erlanson, D. A., Fesik, S. W., Hubbard, R. E., Jahnke, W., Jhoti, H. Twenty years on: the impact of fragments on drug discovery. Nature Reviews Drug Discovery. 15 (9), 605-619 (2016).
- Hall, R. J., Mortenson, P. N., Murray, C. W. Efficient exploration of chemical space by fragment-based screening. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 116 (2-3), 82-91 (2014).
- Erlanson, D. A. Introduction to fragment-based drug discovery. Topics in Current Chemistry. 317, 1-32 (2012).
- Scott, D. E., Coyne, A. G., Hudson, S. A., Abell, C. Fragment-based approaches in drug discovery and chemical biology. Biochemistry. 51 (25), 4990-5003 (2012).
- Lamoree, B., Hubbard, R. E. Current perspectives in fragment-based lead discovery (FBLD). Essays in Biochemistry. 61 (5), 453-464 (2017).
- Schiebel, J., et al. Six Biophysical Screening Methods Miss a Large Proportion of Crystallographically Discovered Fragment Hits: A Case Study. ACS Chemical Biology. 11 (6), 1693-1701 (2016).
- Schiebel, J., et al. High-Throughput Crystallography: Reliable and Efficient Identification of Fragment Hits. Structure. 24 (8), 1398-1409 (2016).
- Krojer, T., et al. The XChemExplorer graphical workflow tool for routine or large-scale protein-ligand structure determination. Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. 73 (3), 267-278 (2017).
- Radeva, N., et al. Active Site Mapping of an Aspartic Protease by Multiple Fragment Crystal Structures: Versatile Warheads to Address a Catalytic Dyad. Journal of Medicinal Chemistry. 59 (21), 9743-9759 (2016).
- Cox, O. B. A poised fragment library enables rapid synthetic expansion yielding the first reported inhibitors of PHIP(2), an atypical bromodomain. Chemical Science. 7 (3), 2322-2330 (2016).
- Wollenhaupt, J., et al. F2X-Universal and F2X-Entry: Structurally Diverse Compound Libraries for Crystallographic Fragment Screening. Structure. 28 (6), 694-706 (2020).
- EU OPENSCREEN fragment library. , Available from: https://www.eu-openscreen.eu/services/compound-collection/fragment-library.html (2020).
- Pearce, N. M., et al. A multi-crystal method for extracting obscured crystallographic states from conventionally uninterpretable electron density. Nature Communications. 8, 15123 (2017).
- Barthel, T., Huschmann, F. U., Wallacher, D., Klebe, G., Weiss, M. S., Wollenhaupt, J. Facilitated crystal handling using a simple device for evaporation reduction in microtiter plates. Journal of Applied Crystallography. 54, (2021).
- Mueller, U., et al. The macromolecular crystallography beamlines at BESSY II of the Helmholtz-Zentrum Berlin: Current status and perspectives. The European Physical Journal Plus. 130 (7), 141 (2015).
- Oscarsson, M., et al. MXCuBE2: The dawn of MXCuBE collaboration. Journal of Synchrotron Radiation. 26 (2), 393-405 (2019).
- Mueller, M., Wang, M., Schulze-Briese, C. Optimal fine φ-slicing for single-photon-counting pixel detectors. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 68 (1), 42-56 (2012).
- Lima, G. M. A., et al. FragMAX: The fragment-screening platform at the MAX IV Laboratory. Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 76 (8), 771-777 (2020).
- Sparta, K. M., Krug, M., Heinemann, U., Mueller, U., Weiss, M. S.
- Winter, G. xia2: an expert system for macromolecular crystallography data reduction. Journal of Applied Crystallography. 43 (1), 186-190 (2010).
- Winn, M. D., et al. Overview of the CCP4 suite and current developments. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 67 (4), 235-242 (2011).
- Terwilliger, T. C., Klei, H., Adams, P. D., Moriarty, N. W., Cohn, J. D. Automated ligand fitting by core-fragment fitting and extension into density. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 62 (8), 915-922 (2006).
- Pearce, N. M., Krojer, T., Von Delft, F. Proper modelling of ligand binding requires an ensemble of bound and unbound states. Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 73 (3), 256-266 (2017).
- Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K.
- Collins, P. M., et al. Chapter Eleven - Achieving a Good Crystal System for Crystallographic X-Ray Fragment Screening. Methods in Enzymology. 610, 251-264 (2018).
- Bowler, M. W., et al. MASSIF-1: a beamline dedicated to the fully automatic characterization and data collection from crystals of biological macromolecules. Journal of Synchrotron Radiation. 22 (6), 1540-1547 (2015).
- Cuttitta, C. M., et al. Acoustic transfer of protein crystals from agarose pedestals to micromeshes for high-throughput screening. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 71 (1), 94-103 (2015).
- Moreno-Chicano, T., et al. High-throughput structures of protein-ligand complexes at room temperature using serial femtosecond crystallography. IUCrJ. 6 (6), 1074-1085 (2019).
