Summary
Ce manuscrit décrit un protocole détaillé pour produire des réseaux de microtissus musculaires squelettiques humains en 3D et des tests de fonction in situ en aval mini-invasifs, y compris des analyses de force contractile et de manipulation du calcium.
Abstract
Les modèles in vitro tridimensionnels (3D) du muscle squelettique constituent une avancée précieuse dans la recherche biomédicale, car ils offrent la possibilité d’étudier la réforme et le fonctionnement des muscles squelettiques dans un format évolutif qui se prête à des manipulations expérimentales. Les systèmes de culture musculaire 3D sont souhaitables car ils permettent aux scientifiques d’étudier le muscle squelettique ex vivo dans le contexte des cellules humaines. Les modèles 3D in vitro imitent étroitement certains aspects de la structure tissulaire native du muscle squelettique adulte. Cependant, leur application universelle est limitée par la disponibilité de plates-formes simples à fabriquer, coûteuses et conviviales, et produisant des quantités relativement élevées de tissus musculaires squelettiques humains. De plus, étant donné que le muscle squelettique joue un rôle fonctionnel important qui est altéré au fil du temps dans de nombreux états pathologiques, une plate-forme expérimentale pour les études de microtissu est plus pratique lorsque des mesures de force transitoire et contractile de calcium mini-invasives peuvent être effectuées directement dans la plate-forme elle-même. Dans ce protocole, la fabrication d’une plate-forme de 96 puits connue sous le nom de « MyoTACTIC » et la production en masse de microtissus musculaires squelettiques humains 3D (hMMT) sont décrites. En outre, les méthodes pour une application mini-invasive de la stimulation électrique qui permet des mesures répétées de la force musculaire squelettique et de la manipulation du calcium de chaque microtissu au fil du temps sont rapportées.
Introduction
Le muscle squelettique est l’un des tissus les plus abondants dans le corps humain et soutient les fonctions clés du corps telles que la locomotion, l’homéostasie thermique et le métabolisme1. Historiquement, des modèles animaux et des systèmes de culture cellulaire bidimensionnelle (2D) ont été utilisés pour étudier les processus biologiques et la pathogenèse des maladies, ainsi que pour tester des composés pharmacologiques dans le traitement des maladies musculaires squelettiques2,3. Alors que les modèles animaux ont grandement amélioré nos connaissances sur les muscles squelettiques en santé et en maladie, leur impact translationnel a été entravé par des coûts élevés, des considérations éthiques et des différences inter-espèces2,4. En se tournant vers les systèmes à base de cellules humaines pour étudier le muscle squelettique, les systèmes de culture cellulaire 2D sont favorables en raison de leur simplicité. Cependant, il y a une limite. Ce format échoue souvent à récapituler les interactions cellule-cellule et cellule-matrice extracellulaire qui se produisent naturellement dans le corps5,6. Au cours des dernières années, les modèles de muscles squelettiques tridimensionnels (3D) sont apparus comme une alternative puissante aux modèles animaux entiers et aux systèmes de culture 2D conventionnels en permettant la modélisation de processus physiologiquement et pathologiquement pertinents ex vivo7,8. En effet, une pléthore d’études ont rapporté des stratégies pour modéliser le muscle squelettique humain dans un format de culture 3D bioartificiel1. Une limite pour beaucoup de ces études est que la force active est quantifiée après le retrait des tissus musculaires des plates-formes de culture et la fixation à un transducteur de force, ce qui est destructeur et donc limité à servir de test final9,10,11,12,13,14,15,16,17,18 ,19,20,21. D’autres ont conçu des systèmes de culture qui permettent des méthodes non invasives de mesure de la force active, mais tous ne se prêtent pas à des applications de test de molécules à haute teneur7,8,9,10,14 , 18,22,23, 24,25,26,27,28 ,29.
Ce protocole décrit une méthode détaillée pour fabriquer des microtissus musculaires humains (hMMT) dans la plate-forme de muscle squelettique (Myo) microTissue Array deviCe To Investigate forCe (MyoTACTIC); un dispositif à plaque de 96 puits qui prend en charge la production en vrac de microtissus musculaires squelettiques3D 30. La méthode de fabrication de plaques MyoTACTIC permet la génération d’une plaque de culture de polydiméthylsiloxane (PDMS) de 96 puits et de toutes les caractéristiques de puits correspondantes en une seule étape de coulée, chaque puits nécessitant un nombre relativement faible de cellules pour la formation de microtissu. Les microtissus formés dans MyoTACTIC contiennent des myotubes alignés, striés et multinucléés qui sont reproductibles de puits en puits de l’appareil et, à maturation, peuvent répondre à des stimuli chimiques et électriques in situ30. Ici, la technique de fabrication d’un dispositif de plaque de culture PDMS MyoTACTIC à partir d’une réplique en polyuréthane (PU), une méthode optimisée pour mettre en œuvre des cellules progénitrices myogéniques humaines immortalisées pour fabriquer des hMMT, et l’évaluation fonctionnelle de la génération de force hMMT et des propriétés de manipulation du calcium sont décrites et discutées.
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Protocol
1. Fabrication de plaques MYOCTACTIQUES PDMS
REMARQUE: La fabrication de plaques myotactices PDMS nécessite un moule négatif PU, qui peut être fabriqué comme décrit précédemment30. Le fichier SolidWorks de conception assistée par ordinateur (CAO) pour la conception de plaques MyoTACTIC a été mis à disposition sur GitHub (https://github.com/gilbertlabcode/MyoTACTIC-SolidWork-CAD-file).
- Préparer ~ 110 g de solution de polymère PDMS dans un gobelet en plastique jetable à un rapport de 1:15 de monomère à agent de durcissement en utilisant les composants du kit d’élastomère de silicone. Remuer la solution de polymère pendant 2-3 min à l’aide d’une pipette sérologique jetable de 5 mL jusqu’à ce qu’elle soit complètement mélangée et homogène.
ATTENTION: Évitez le contact de la solution de polymère PDMS avec la peau et les yeux; et éviter l’inhalation. Portez toujours une blouse de laboratoire et des gants jetables lorsque vous manipulez le mélange pdMS liquide et reportez-vous à la fiche de données de sécurité (FDS) pour connaître les protocoles de sécurité spécifiques.
REMARQUE : Protégez les surfaces de l’équipement (p. ex., balance, paillasse, etc.) avec un revêtement jetable en cas de déversement de solution de polymère PDMS. - Dégazez le mélange à température ambiante en plaçant la tasse dans une chambre à vide de paillasse reliée à une pompe à vide sèche de service standard pendant environ 30 minutes, ou jusqu’à ce que toutes les bulles soient éliminées. Cassez le vide toutes les 5-10 minutes pour faciliter le dégazage. Utilisez un barillet de seringue vide de 50 mL pour plonger l’air et souffler les bulles restantes à la surface du mélange de polymères au besoin.
REMARQUE : Un tube ID de 6,35 mm peut être utilisé pour connecter une pointe de pipette P1250 au canon afin d’améliorer la vitesse et la précision du flux d’air. - Pendant que la solution de polymère PDMS est en cours de dégazage, retirez tous les morceaux restants de PDMS collés au moule négatif PU en essuyant doucement les bords et la surface avec une serviette en papier sec. Utilisez de l’air comprimé de l’installation, réglé sur 70-100 kPag pour éliminer les particules fines restantes.
REMARQUE: Protégez le moule négatif pu contre les dommages et l’accumulation de particules en le plaçant dans un sac en plastique scellable et en le rangeant dans un tiroir protégé de la circulation en laboratoire. - Placez le moule en PU dans une hotte chimique qui a été protégée par un revêtement jetable. Placez le moule horizontalement à ~75° et vaporisez la surface active avec une couche uniforme d’agent de démoulage. Vaporisez le moule de haut en bas, puis de gauche à droite, tout en tenant la boîte à 15-20 cm du moule et en utilisant un mouvement de balayage fluide d’avant en arrière. Faites pivoter le moule de 180 ° et répétez les pulvérisations, puis laissez le moule PU reposer dans la hotte chimique pendant 10 à 15 minutes pour sécher.
ATTENTION : Assurez-vous que l’agent de démoulage est utilisé dans une hotte chimique, évitez tout contact avec la peau et les yeux et reportez-vous à la fiche de données de sécurité (FDS) pour connaître les protocoles de sécurité spécifiques.
REMARQUE: Un film mince doit recouvrir complètement la surface active, mais un revêtement excessif peut être transféré au PDMS à l’étape suivante, ce qui peut à son tour avoir un impact négatif sur l’ensemencement hMMT. La surface doit être lisse au toucher, mais pas humide. - Versez 100 g de PDMS uniformément dans le moule PU et placez-le dans une chambre à vide reliée à une pompe à vide à palettes rotatives. Dégazez le moule rempli de PDMS pendant environ 45 minutes, en brisant le joint sous vide toutes les 5 à 10 minutes pendant les 20 premières minutes pour accélérer le processus. Laisser dans la chambre à vide jusqu’à ce que le mélange PDMS soit complètement vide de toutes les bulles.
REMARQUE: Une pompe à vide à palettes rotatives est utilisée pour obtenir un vide plus faible et réduire le temps nécessaire à cette étape. Le dégazage du moule rempli de PDMS peut être effectué à l’aide de la chambre à vide de paillasse et de la pompe à vide sèche de service standard, mais le temps nécessaire pour vider le mélange de toutes les bulles sera plus long. Ce qui est essentiel, c’est l’élimination de toutes les bulles de la solution de polymère PDMS, en particulier dans les régions destinées à devenir des poteaux d’ancrage hMMT. Les bulles dans cette région entraîneront une rupture après l’ancrage, la perte de puits de culture et, à son tour, un petit morceau de PDMS restera coincé dans le moule. - Transférer le moule en PU dégazé rempli de PDMS dans un four à 65 °C, en couplant pendant la nuit pour durcir le caoutchouc liquide.
- Retirez la plaque positive PDMS durcie du four et refroidissez la plaque à température ambiante pendant au moins 30 min.
- Avec un scalpel sans lame, détachez doucement le PDMS durci du moule PU en passant l’arrière de la poignée entre le PDMS et les parois du moule. Commencez par le bord supérieur et séparez les 4 côtés, avant de pousser jusqu’à la base du moule et de détacher cette partie. Cette étape est terminée lorsque l’arrière de la poignée fonctionne en douceur entre le PDMS et les 4 parois du moule PU.
REMARQUE: Travaillez lentement et soigneusement avec le scalpel sans lame pour éviter de fissurer le moule PU ou de déchirer le PDMS. Cette étape devrait prendre 15-20 min. - À partir d’une extrémité, utilisez le scalpel sans lame pour soulever le bord du PDMS et travailler les doigts entre la plaque de culture PDMS durcie et le moule PU. Ensuite, à l’aide des deux mains, poussez les doigts plus loin sous la plaque, en vous décollant lentement et en sortant du moule en PU.
REMARQUE: Travaillez lentement et utilisez les deux mains pour peler uniformément l’assiette. Minimisez la flexion pour réduire la probabilité de rupture après l’ancrage. Cette étape devrait prendre 5-10 min. - Utilisez une lame de rasoir à un seul tranchant pour couper la plaque en groupes de 6 ± 2 puits myoTACTIQUES(Figure 1)à des fins d’ensemencement des tissus. Placez des plaques MyoTACTIC complètes, ou des portions de plaque, dans un sac de stérilisation d’instrument et un autoclave pour un cycle sec de 25 min (20 min de temps de stérilisation et 5 min de temps de séchage) à 120 °C et 100-140 kPag.
2. Culture de cellules progénitrices de myoblastes humains immortalisées
NOTE: Les myoblastes immortalisés utilisés dans ce protocole ont été obtenus auprès de l’Institut de Myologie (Paris, France)31.
- Obtenez un flacon de cellules congelées à partir de l’azote liquide dewar et décongelez rapidement le flacon dans un bain-marie à 37 °C (en moins de 1 min). Les cellules sont congelées à une densité de 7,5 x 105 cellules pour 1 mL de milieu de congélation composé de 90 % de sérum fœtal bovin (FBS) et de 10 % de diméthylsulfoxyde (DMSO).
- Transférer doucement le contenu du flacon dans un tube conique de 15 mL contenant 9 mL de milieu de lavage préchauffé composé de 89 % de DMEM 1x, 10 % de FBS et 1 % de stylo/streptocoque pour diluer le DMSO. Faire tourner le tube conique de 15 mL à 400 x g pendant 10 min, puis aspirer le milieu en prenant soin d’éviter la pastille cellulaire.
- Resuspendez la pastille dans 1 mL de milieu de croissance composé de 84 % de milieu basal de cellules musculaires squelettiques avec un mélange de supplément de milieu de croissance de cellules musculaires squelettiques, 15 % de FBS et 1 % de stylo/streptocoque, puis transférez-la dans un tube conique de 50 mL avec 29 mL de milieu de croissance.
- Transférer 10 mL de milieu contenant environ 2,5 x 105 cellules dans une boîte de culture cellulaire de 100 mm x 20 mm. Répétez cette étape avec les 20 mL restants de la solution cellulaire. Transférez ensuite les boîtes de culture cellulaire dans un incubateur de culture cellulaire humidifié réglé à 37 °C et 5 % de CO2.
- Rafraîchissez les médias culturels tous les deux jours. Cultivez les cellules jusqu’à ce qu’elles atteignent ~ 70% à 80% de confluence (généralement 4-5 jours), moment auquel les cellules sont préparées pour l’ensemencement. 1,5 x 105 cellules sont nécessaires pour générer chaque hMMT. Par conséquent, passez les cellules au besoin pour atteindre le nombre requis de cellules.
REMARQUE: Les lignées cellulaires progénitrices de myoblastes immortalisées ne doivent jamais dépasser 80% de confluence avant d’ensemencer les cellules dans des puits myotactiques, de passer les cellules ou de préparer des stocks de congélation. Les hMMT fabriqués à partir de cellules qui ont dépassé 80 % de confluence n’atteignent souvent pas la maturité contractile. Les procédures de passage sont identiques aux méthodes décrites ci-dessous à l’étape 3.
3. Ensemencement de hMMTs d’ingénierie avec MyoTACTIC
- Préparation de puits de culture myotactique et de réactifs pour l’ensemencement hMMT.
REMARQUE: Ce protocole fournit des détails spécifiques pour produire 6 hMMT.- 2-3 h avant l’ensemencement cellulaire, placer une portion de plaque myotactique de 6 puits dans un plat de culture cellulaire de 10 cm. Préparez bien chaque culture MyoTACTIC individuelle en ajoutant 100 μL d’une solution pluronique F-127 à 5% dans chaque puits. Placez le couvercle sur le plat de culture de 10 cm, appliquez de la paraffine pour sceller l’espace entre le plat de 10 cm et le couvercle, puis placez la plaque de 10 cm contenant la partie MyoTACTIC dans une centrifugeuse équipée d’un adaptateur de spinner à plaque.
REMARQUE: Si un adaptateur de spinner de plaque de centrifugeuse n’est pas disponible, une pointe de pipette p20 peut être utilisée pour éliminer soigneusement les bulles derrière les poteaux, garantissant ainsi que toute la surface de culture est uniformément revêtue. - Centrifuger à 1 550 x g pendant 1 min pour éliminer toutes les bulles dans les puits de culture, en particulier derrière les poteaux. Conserver la boîte de culture cellulaire de 10 cm contenant la portion de plaque MyoTACTIC contenant la solution de Pluronic F-127 à 4 °C jusqu’à ce que les cellules soient préparées pour l’ensemencement.
REMARQUE: Le revêtement Pluronic F-127 peut être appliqué pendant aussi peu que 2 h à aussi longtemps que 24 h. Par exemple, les puits peuvent être remplis avec de la solution pluronique F-127 à la fin de la journée pour une utilisation le lendemain. Ne dépassez pas 24 h car cela aura un impact négatif sur le remodelage de la hMMT et ne parviendra pas à former des tissus sains qui atteignent la maturité contractile. - Décongeler lentement une aliquote d’extrait de membrane basale de 50 μL et une aliquote de thrombine de 10 μL (solution mère de 100 U/mL) sur de la glace à l’intérieur de la hotte de culture.
REMARQUE: Ne pas recongeler les aliquotes d’extrait de membrane basale. Ils sont à usage unique. Les aliquotes de thrombine sont réutilisables, par conséquent, recongelées jusqu’à 5 fois après utilisation. - Peser environ 7 mg de fibrinogène en poudre dans un tube de microcentrifugation de 1,5 mL, puis transférer dans la hotte de culture cellulaire. Ajouter 700 μL de solution de NaCl à 0,9 % (p/vol) dans de l’eau (ou une solution saline) pour obtenir une solution de concentration finale de 10 mg/mL. Ne pas vortexer le fibrinogène pour se dissoudre, placez plutôt le tube dans un incubateur de culture cellulaire à 37 °C pendant 3 à 5 min.
- Retirez et faites glisser doucement le tube, puis faites tourner la solution dissoute dans une mini centrifugeuse de paillasse (microfuge) et retournez à la hotte de culture. Filtrer la solution de fibrinogène à l’aide d’une seringue de 1 mL équipée d’un filtre à seringue de 0,22 μm. Transférer la solution de fibrinogène dissoute dans la glace à côté de l’extrait de membrane basale et des aliquotes de thrombine.
- Enfin, préparez le milieu d’ensemencement hMMT qui sera introduit dans les puits de culture après l’ensemencement des tissus. Ce milieu contient du milieu basal des cellules musculaires squelettiques complété par 20 % de FBS, 1 % de P/S et 3 % d’acide 6-aminocaproïque (ACA ; la concentration finale de 1,5 mg/mL est obtenue par dilution à partir d’une solution mère de 50 mg/mL ; la % est exprimée en v/v). Préchauffer le média à 37 °C avant utilisation.
- 2-3 h avant l’ensemencement cellulaire, placer une portion de plaque myotactique de 6 puits dans un plat de culture cellulaire de 10 cm. Préparez bien chaque culture MyoTACTIC individuelle en ajoutant 100 μL d’une solution pluronique F-127 à 5% dans chaque puits. Placez le couvercle sur le plat de culture de 10 cm, appliquez de la paraffine pour sceller l’espace entre le plat de 10 cm et le couvercle, puis placez la plaque de 10 cm contenant la partie MyoTACTIC dans une centrifugeuse équipée d’un adaptateur de spinner à plaque.
- Préparation des cellules pour l’ensemencement hMMT.
- Recueillir les plaques de culture cellulaire de l’incubateur de culture. Aspirer le milieu de chaque plaque, puis laver les cellules une fois avec du D-PBS en ajoutant 5 mL de D-PBS dans chaque plaque de culture. Ensuite, aspirez le D-PBS et détachez les cellules en ajoutant 1 mL de 0,25% de trypsine-EDTA dans chaque boîte de culture. Placer dans l’incubateur de culture cellulaire pendant 3 min.
- Arrêtez la trypsine en ajoutant 3 mL de milieu de lavage (89% de 1x DMEM + 10% FBS + 1% Pen/Strep) au plat de culture. Transférer la solution cellulaire dans un tube conique de taille appropriée, puis granuler les cellules en centrifugant à 400 x g pendant 10 min. Aspirer le milieu en prenant soin d’éviter la pastille cellulaire. Ensuite, remettez en suspension la pastille de cellule dans 1 mL du milieu de lavage.
- Comptez les cellules à l’aide d’un hémocytomètre et d’un colorant bleu trypan sous microscopie à fond clair.
Si vous utilisez plusieurs plaques de cellules, cette suspension cellulaire sera très concentrée. Diluez les suspensions cellulaires avant de compter au besoin. - Étant donné que chaque tissu nécessite 150 000 cellules remises en suspension dans 15 μL du mélange de matrice extracellulaire (ECM), 900 000 cellules dans 90 μL de mélange ECM sont nécessaires pour 6 tissus. Pour tenir compte de la perte de solution cellule-ECM qui se produit pendant le processus de préparation en raison de la formation de bulles ou de la perte de pipette, préparez un mélange cellulaire-ECM supplémentaire (c.-à-d. 8 tissus ou 1 200 000 cellules dans 120 μL d’ECM). Transférer le volume de suspension cellulaire contenant 1 200 000 cellules dans un nouveau tube conique. Augmenter le volume à 10 mL avec le milieu de lavage et tourner à 400 x g pendant 10 min.
- Pendant que les cellules tournent, préparez un mélange ECM de 150 μL dans un tube de microcentrifugation de 1,5 mL en utilisant la recette suivante. Ajouter d’abord 60 μL de DMEM (40% de volume), puis ajouter 60 μL de solution de fibrinogène 10 mg/mL (40% de volume) et enfin ajouter 30 μL d’extrait de membrane basale (20% de volume). Conserver le mélange ECM sur de la glace jusqu’à utilisation.
REMARQUE: Utilisez toujours des embouts pré-réfrigérés à -20 ° C lorsque vous travaillez avec des solutions contenant de l’extrait de membrane basale. Le mélange ECM contient 4 mg/mL de fibrinogène.
- Ensemencement des hMMT
- Prélever le tube conique contenant les cellules filées et aspirer le milieu en prenant soin d’éviter la pastille cellulaire. Agitez vigoureusement l’extrémité du tube avec un doigt ganté pour déloger la pastille et continuez à la faire glisser jusqu’à ce que la pastille apparaisse comme une boue cellulaire.
REMARQUE: Il est important d’aspirer autant de produits de lavage que possible pour s’assurer que la suspension cell-ECM est à la dilution souhaitée. Utilisez une pipette pour retirer le support de lavage restant si nécessaire. - Transférer 120 μL de la solution ECM dans le tube contenant la pastille cellulaire. Pipette de haut en bas pour remettre en suspension les cellules dans l’ECM afin de générer une suspension à cellule unique. Pipettez lentement et soigneusement pour éviter d’introduire des bulles, ce qui réduirait le volume de travail. Ensuite, placez la solution cell-ECM sur de la glace jusqu’à utilisation.
- Récupérez les portions de plaque MyoTACTIC contenant des puits MyoTACTIC enduits de Pluronic F-127 dans le réfrigérateur à 4 °C et placez le plat de 10 cm contenant les puits MyoTACTIC sur un sac de glace à l’intérieur de la hotte de culture cellulaire.
- Aspirer la solution Pluronic F-127 de chaque puits. Le PDMS est poreux et absorbera la solution Pluronic F-127, surtout si les plaques ont été filées avec une centrifugeuse. Laissez la solution résiduelle de Pluronic F-127 se libérer et se déposer au fond du puits en laissant les puits reposer pendant 5 min, puis aspirer à nouveau.
REMARQUE: Utilisez une pipette Pasteur avec une pointe p1250 attachée à l’extrémité et une pointe p200 sur la pointe p1250 lorsque vous aspirez la solution Pluronic F-127. Cela améliorera la précision pour éviter l’aspiration accidentelle des structures de poteau. Évitez de gratter la zone d’ensemencement cellulaire ovale en forme de piscine au fond du puits avec la pipette, car cela perturbe le revêtement Pluronic F-127 et interfère avec le processus d’auto-organisation hMMT. La bonne technique consiste à survoler la pointe de la pipette juste au-dessus de la piscine ovale tout en aspirant la solution Pluronic F-127. - Pipettez soigneusement la suspension cell-ECM pour remettre en suspension les cellules qui pourraient avoir coulé au fond du tube. Transférer ensuite 105 μL de suspension d’ECM cellulaire dans un tube frais de 1,5 mL pré-réfrigéré. Prenez soin de saisir le tube près du haut pour éviter que la solution ne se réchauffe.
- Ajouter 0,84 μL de la solution mère de thrombine de 100 U/mL à la suspension d’ECM cellulaire de 105 μL pour obtenir une concentration finale de 0,2 U/mg de fibrinogène. Pipettez rapidement, soigneusement et soigneusement pour mélanger, tout en évitant l’introduction de bulles.
REMARQUE: La thrombine initie la conversion rapide du fibrinogène en un caillot de fibrine. En tant que tel, il y a peu de temps pour ensemencer les tissus lors de l’ajout de thrombine. Pour éviter une coagulation prématurée avant que le mélange cellule-ECM ne soit transféré dans les puits de culture, réglez une pipette p20 à 15 μL avant d’ajouter la thrombine. Utilisez des embouts pré-réfrigérés ou trempez l’embout de la pipette dans du DMEM glacé pendant quelques secondes avant de recueillir et de transférer 15 μL du mélange cellule-ECM dans chaque puits. Il est recommandé de préparer des aliquotes de mélange cellule-ECM de manière à ce que pas plus de 6 hMMT soient ensemencés à la fois. - Pour ensemencer les tissus, ajoutez 15 μL de mélange cellule-ECM (c.-à-d. 150 000 cellules) à chaque puits individuel. Ajoutez soigneusement le mélange cellule-ECM au centre de la piscine ovale et évitez d’enfoncer la pointe de la pipette dans le fond du puits. Ensuite, avec deux mouvements légers, étalez la suspension cellulaire derrière chaque poteau dans le puits. Une fois que la surface est uniformément recouverte de la suspension cell-ECM, passez au puits suivant.
REMARQUE: Travailler efficacement pour éviter la gélification prématurée du mélange cellule-ECM dans le tube avant que tous les tissus ne soient ensemencés. Lors de l’ensemencement des puits, il est extrêmement important d’éviter de transférer des bulles car la bulle interférera avec le remodelage du hMMT, rendant le hMMT inutilisable. - Placez le couvercle sur la plaque de culture de 10 cm contenant les puits ensemencés et transférez-le dans un incubateur de culture tissulaire à 37 °C pendant environ 5 min.
REMARQUE: Placez le tube de microcentrifugation avec le mélange cellulaire-ECM résiduel dans l’incubateur comme confirmation du processus de polymérisation en gel. - Une fois le mélange cellule-ECM polymérisé, ajouter 200 μL de milieu d’ensemencement hMMT préavertissé à chaque puits MyoTACTIC. Remplacez le couvercle du plat de 10 cm et retournez les portions de la plaque MyoTACTIC dans le plat de 10 cm à l’incubateur. Ce point de temps est appelé Jour -2. Ne dérangez pas les tissus jusqu’à l’étape suivante.
- Prélever le tube conique contenant les cellules filées et aspirer le milieu en prenant soin d’éviter la pastille cellulaire. Agitez vigoureusement l’extrémité du tube avec un doigt ganté pour déloger la pastille et continuez à la faire glisser jusqu’à ce que la pastille apparaisse comme une boue cellulaire.
- Différencier les hMMT
- Après 2 jours d’incubation, prélever soigneusement le milieu d’ensemencement hMMT à l’aide d’une pipette et le remplacer par 200 μL de milieux de différenciation préavertis contenant 2 % de sérum de cheval, 1 % de stylo/streptocoque, 4 % d’ACA (c.-à-d. 2 mg/mL de concentration finale à partir d’une concentration sur le stock de 50 mg/mL; % est exprimé en v/v) et 10 μg/mL d’insuline recombinante humaine dans le DMEM. Ce point temporel est appelé Jour 0 de la différenciation.
- Tous les deux jours par la suite, échangez la moitié des médias avec de nouveaux médias de différenciation jusqu’au jour 12 de différenciation, le dernier jour de la culture (Figure 2a).
REMARQUE: Les détails du protocole pour fabriquer des hMMT à l’aide de myoblastes humains primaires ont été publiésailleurs 30. S’il y a des préoccupations quant à la viabilité cellulaire après l’ensemencement, incuber les hMMT avec de la calcéine et de l’iodure de propidium pour quantifier la viabilité.
4. Stimulation électrique et analyse de la post-déviation induite par hMMT
- Installez un support de scène en verre ou en plastique transparent sur un microscope inversé et fixez une caméra de smartphone à l’oculaire du microscope à l’aide d’un support de caméra de microscope. La microscopie à contraste de phase à grossissement de 10x sera utilisée (Figure 3a).
REMARQUE: Tout microscope à contraste de phase inversé équipé d’un objectif de grossissement 10x sera approprié. Les constructions de puits PDMS seront retirées du plat de 10 cm et placées directement sur le support de l’étage inférieur transparent, et donc ouvertes à l’air. Stériliser toutes les surfaces et l’équipement avec de l’éthanol à 70% et minimiser la circulation dans la zone pendant l’expérimentation. - Pour préparer les électrodes de stimulation électrique, coupez environ 30 cm de fil de cuivre enduit d’étain. Ensuite, en commençant par le moyeu d’une aiguille biseautée régulière de 25 G, enroulez étroitement ~ 10 cm du fil autour de la moitié supérieure, laissant ~ 20 cm de fil en excès. Répétez l’opération pour une deuxième aiguille, puis coupez le moyeu de chaque aiguille.
REMARQUE: Le fil doit être serré autour de l’aiguille pour s’assurer qu’il ne bouge pas et la partie enroulée du fil de l’électrode ne doit pas toucher le PDMS car cela peut entraver la génération de champ électrique. - Connectez le câble du connecteur BNC à clip alligator à un canal de sortie du générateur de forme d’onde et réglez le canal pour des impulsions carrées avec un rapport cyclique de 20%, amplitude de 5 V (intensité du champ électrique de 10 V / cm). La fréquence changera entre 0,5 Hz et 20 Hz pour les contractions des contractions du tétanos, respectivement.
REMARQUE: Les paramètres du générateur de forme d’onde peuvent nécessiter une optimisation spécifique à l’expérience - Placez une partie de plaque myotactique contenant des hMMT sur l’étage du microscope et insérez doucement chaque extrémité de biseau d’électrode dans le PDMS directement derrière chaque poteau dans le bassin ovale. Collez soigneusement les sections de 20 cm de fil excédentaire à l’étage du microscope afin que les aiguilles restent verticales et que ~ 10 cm de chaque fil restent libres pour la connexion (Figure 3a).
ATTENTION : Ne placez jamais un doigt nu sur l’une ou l’autre extrémité de l’électrode. Assurez-vous qu’un dé à coudre est porté sur l’index pour appliquer une légère pression sur l’électrode lors de l’insertion dans le PDMS. - Focalisez le champ de vision du microscope sur l’un des deux poteaux, de sorte que la mise au point soit nette sur le bord du poteau le plus proche de l’électrode. Ensuite, verrouillez la mise au point de l’appareil photo du smartphone sur la zone la plus claire de la publication. Ceci est important pour l’analyse en aval car un changement d’orientation tandis que l’enregistrement interférera avec l’analyse.
- Connectez les extrémités libres des fils collés au générateur de forme d’onde à l’aide de pinces alligator (Figure 3a).
- Démarrez l’enregistrement vidéo sur l’appareil photo du smartphone, puis activez la sortie du canal pour lancer la stimulation. Induire le hMMT à subir 3 contractions de contractions et 3 contractions du tétanos, avec 2 min de repos entre la série de stimulation de la contraction et du tétanos.
- Éteignez la sortie du canal, détachez les clips d’alligator des fils de cuivre enduits d’étain, retirez le ruban adhésif des fils et essuyez chaque électrode avec de l’éthanol à 70% avant de l’insérer dans les puits hMMT suivants. Répétez la procédure de l’étape 4.5 pour tous les hMMT.
REMARQUE: Limitez le temps que les hMMT passent en dehors de l’incubateur en ne stimulant pas plus de 3 tissus à la fois. S’il reste des hMMT supplémentaires dans la partie de la plaque myotactique à analyser, renvoyer la plaque à l’incubateur pendant 10 minutes pour permettre aux hMMT de revenir à 37 °C. - Pour analyser la post-déviation afin de calculer la génération de force hMMT, utilisez le script personnalisé, qui a été mis à disposition sur GitHub (https://github.com/gilbertlabcode/myoTACTIC). Suivez les instructions de README.md pour configurer et lancer le script, puis ouvrez chaque vidéo de suivi de publication pour effectuer l’analyse de la force.
- Sélectionnez une région d’intérêt (ROI) le long du bord de la publication à suivre pour le déplacement de la publication. Appuyez sur Entrée pour confirmer le retour sur investissement et appuyez à nouveau sur Entrée pour exécuter le script (Vidéo supplémentaire 1).
REMARQUE: De grandes déviations entraînent l’échec du tracker. Si le tracker échoue pendant la contraction, la taille du retour sur investissement peut être augmentée pour rendre le suivi moins sensible, mais permettre le suivi des grandes déviations. Trois tailles sont fournies dans le code et peuvent être réglées en ajustant les commentaires du script. - Le script se termine par deux exigences d’entrée. Tout d’abord, entrez y pour confirmer que la vidéo contenait plusieurs contractions. Deuxièmement, entrez y (oui) ou n (non) pour exporter les résultats vers un fichier . Fichier CSV (Vidéo supplémentaire 1).
- Assurez-vous que les résultats post-déviation sont signalés sous forme de déplacement en pixels pour chaque contraction. Convertissez les pixels en valeurs μm pour le réglage du grossissement 10x du microscope. Ensuite, convertissez les nombres post-déplacement en forces contractiles absolues (μN) en multipliant les valeurs (μm) par le facteur de conversion force-déplacement de 2,36 μN / μm, ce qui correspond au rapport agent de durcissement / monomère 1:15 du PDMS utilisé dans la fabrication MyoTACTIC30.
5. Analyse des transitoires calciques par stimulation électrique
REMARQUE: Pour les expériences de manipulation du calcium, les myoblastes immortalisés ont été transduis de manière stable avec le rapporteur MHCK7-GCAMP6 comme décrit précédemment11,12. Les cellules transduites ont été triées par FACS pour la GFP afin d’obtenir la population positive, puis utilisées pour fabriquer des hMMT. D’autres méthodes d’imagerie calcique telles que l’utilisation de colorants ratiométriques comme Fura-2 AM et Indo-1 ou l’imagerie par fluorescence de la durée de vie des indicateurs de calcium (par exemple, Fluo-4 ou Oregon Green BAPTA1) peuvent convenir à notre système.
- Configurez l’étage du microscope et l’équipement de stimulation (électrodes, générateur de forme d’onde, etc.) comme décrit précédemment à l’étape 4. Pour cette expérience, utilisez un grossissement 4x.
REMARQUE: Une pièce sombre et un microscope à épifluorescence équipé d’une caméra CCD seront nécessaires. - Lancez le logiciel d’imagerie de microscope, sélectionnez le canal de filtre FITC (lumière bleue) et sélectionnez la fonction d’enregistrement vidéo. Réglé à une exposition de 500 ms et une résolution de 680 x 510 (Binning 2x2).
REMARQUE: Le logiciel d’imagerie peut varier et l’exposition est définie manuellement par l’utilisateur. Prenez soin d’éviter la surexposition hMMT avant la stimulation. Au repos, un contour / ombre de tissu sombre avec fluorescence spontanée est normal tandis qu’une image de tissu claire est surexposée (Vidéo supplémentaire 2). Assurez-vous que l’exposition est cohérente pour tous les hMMT d’une expérience. - Fermez l’obturateur du microscope et gardez le canal FITC éteint jusqu’à ce qu’il soit prêt à enregistrer la manipulation du calcium.
- Lorsque tout l’équipement et les logiciels sont configurés, récupérez la partie de la plaque MyoTACTIC contenant les hMMT à analyser et placez-la directement sur la scène du microscope. Ensuite, insérez et connectez les électrodes comme décrit précédemment à l’étape 4.
- Utilisez le champ lumineux pour focaliser le champ de vision sur le centre de l’hMMT sélectionné. Ensuite, éteignez la lampe.
- Ouvrez l’obturateur de canal FITC du microscope, vérifiez que la lumière bleue est allumée, puis sélectionnez Enregistrement vidéo dans le logiciel.
- Allumez la sortie sur le générateur de forme d’onde pour lancer la stimulation électrique. Induire la hMMT à subir 8 contractions du tétanos et 8 contractions du tétanos. Prévoyez 2 minutes de repos entre les séries de stimulation des contractions et du tétanos, pendant lesquelles l’obturateur FITC est en position fermée.
REMARQUE: Prévoir 10 s d’activité spontanée avant et après la stimulation électrique pour enregistrer la fluorescence minimale à des fins de calcul et d’analyse des données. - Éteignez la sortie du canal, détachez les clips d’alligator des fils de cuivre enduits d’étain, retirez le ruban adhésif des fils et essuyez chaque électrode avec 70% d’éthanol avant de l’insérer dans les puits hMMT suivants. Répétez la procédure de stimulation et d’enregistrement pour tous les hMMT.
- Enregistrez des films au format de fichier TIFF pour analyse dans ImageJ ou un autre logiciel d’imagerie.
REMARQUE: Limitez le temps que les hMMT passent en dehors de l’incubateur en ne stimulant pas plus de 3 tissus à la fois. S’il reste à analyser des hMMT supplémentaires dans la partie de la plaque myoTACTIQUE, remettre l’appareil à l’incubateur pendant 10 minutes pour permettre aux hMMT de revenir à 37 °C. - Pour analyser les données transitoires de calcium, ouvrez d’abord ImageJ. Sélectionnez Analyser, puis Définir les mesures, puis sélectionnez la valeur grise moyenne et désélectionnez toutes les autres options. Lorsque vous avez terminé, ouvrez une vidéo sur le calcium (.tiff) (Vidéo supplémentaire 2).
- Tracez la bordure de la microtissue à l’aide d’un outil de sélection de polygones et enregistrez cette zone en tant que retour sur investissement(Vidéo supplémentaire 2). Sous Plus dans la fenêtre Gestionnaire de retour sur investissement, sélectionnez Multi Measure et mesurez l’intensité fluorescente pour toutes les tranches de fichier à une ligne par tranche ( Vidéo supplémentaire2).
- Copiez toutes les mesures, y compris le numéro de tranche (image), dans une feuille de calcul et comparez l’intensité fluorescente de chaque tranche à l’intensité fluorescente spontanée minimale du fichier en utilisant ΔF/F0 = (Fimmédiat - Fminimum)/Fminimum (Vidéo supplémentaire 2).
- Calculez le temps pour chaque image en multipliant la vitesse de l’image d’enregistrement vidéo par le nombre de tranches (image) et tracez ΔF/F0 par rapport au temps pour la réponse transitoire du calcium hMMT à la stimulation (Vidéo supplémentaire 2).
- Sélectionnez le signal transitoire de pic de calcium pour chacune des 6 contractions consécutives et les valeurs moyennes pour calculer le changement d’intensité fluorescent de crête moyen relatif de chaque hMMT (Vidéo supplémentaire 2).
REMARQUE: Toujours exclure les données résultant de la première contraction de contraction de l’analyse globale. Une feuille de calcul intitulée « Calcium Handling Template.xlsx » a été fournie sur GitHub (https://github.com/gilbertlabcode/Calcium-Handling-Template-) pour faciliter l’analyse transitoire du calcium hMMT. Les cellules remplissables dans lesquelles les valeurs et les entrées doivent être saisies sont surlignées en gris. Assurez-vous d’ajuster les nombres de sélection de pic car il ne s’agit que d’un guide pour faciliter la sélection des pics (Vidéo supplémentaire 2).
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Representative Results
Les méthodes décrites ici sont les méthodes permettant de couler une plate-forme de culture myoTACtique à base de PDMS à 96 puits à partir d’un moule PU, de fabriquer des réseaux de tissus répliques hMMT et d’analyser deux aspects de la fonction hMMT dans la génération de force du dispositif de culture et la manipulation du calcium. La figure 1 offre un aperçu schématique de la préparation des puits de culture myotactique avant l’ensemencement de la hMMT. PDMS est un polymère à base de silicone largement utilisé, qui peut être facilement moulé pour créer des dispositifs complexes32. Un protocole basé sur PDMS a été conçu pour couler un nombre illimité de dispositifs de culture à 96 puits à partir d’un moule PU négatiffabriqué 30. La plaque positive PDMS durcie finale est flexible et peut être facilement découpée en unités fonctionnelles de plus petite taille à l’aide d’une lame de rasoir à un seul bord (Figure 1). Cela permet à l’utilisateur de mettre à l’échelle l’appareil pour répondre aux besoins de réplique hMMT spécifiques à sa conception expérimentale. Ces unités fonctionnelles plus petites sont également bénéfiques pour surmonter une limitation de travail avec un échafaudage ECM qui polymérise rapidement, comme les hydrogels de fibrine, en réglant facilement le nombre de puits pour correspondre à la vitesse d’ensemencement cellulaire de l’utilisateur. De plus, le PDMS est facilement autoclavable et peut être stocké pour une durée indéterminée. Enfin, d’un point de vue logistique, une plaque MyoTACTIC complète peut être recouverte par n’importe quel couvercle de plaque standard de 96 puits, et la dimension et le profil des portions de plaque MyoTACTIC peuvent être immergés dans une plaque de culture de 10 cm, afin d’assurer la stérilité de la culture hMMT. Le revêtement en solution de pluronic F-127 avant l’ensemencement cellulaire joue un double rôle en fournissant une mesure supplémentaire de la stérilisation des puits de culture et, en tant que tensioactif non ionique, empêchant l’adhésion cellulaire en faveur du remodelage cellulaire uniforme - ECM (Figure 1).
Lorsque la population de cellules progénitrices myogéniques immortalisées est prête pour l’expérimentation, les cellules sont ensuite encapsulées dans un hydrogel composé de fibrinogène et d’extrait de membrane basale. Le mélange cellule-ECM est ensuite déposé uniformément dans le bassin ovale au fond de chaque puits MyoTACTIC, puis sur une période de culture de 14 jours, les cellules s’auto-organisent spatialement à travers ces deux poteaux verticaux pour former un microtissu 3D peuplé d’un lit de myotubes alignés, multinucléés et striés qui ressemblent à des aspects de l’organisation tissulaire native (Figure 2a, g,h). Au cours du processus de remodelage, une tension uniaxiale est générée entre les deux points d’ancrage, ce qui guide le processus d’auto-organisation des tissus pour entraîner à son tour la formation d’un tissu compact. Pendant la période de différenciation, la largeur des hMMT construits à partir de myoblastes dérivés de patients sains reste assez constante. Cependant, en cas d’erreurs qui interfèrent avec le remodelage hMMT, cette uniformité est perdue(Figure 2a-f),ce qui rend cette mesure simple utile dans l’évaluation du contrôle de la qualité hMMT. Par exemple, un mélange trop zélé de la suspension cellule -ECM peut entraîner la formation de bulles. Les bulles transportées sur le puits MyoTACTIC entravent le remodelage hMMT. Dans de tels cas, les bulles déplacent une partie ou la totalité des myoblastes de la zone occupée par la bulle, formant éventuellement une crevasse dans le hMMT final (Figure 2b; voir flèche rouge). Un autre exemple concerne l’intégrité du revêtement Pluronic F-127 dans les puits. Pluronic F-127 est un tensioactif non ionique qui empêche les cellules d’adhérer au puits MyoTACTIC. Si le revêtement est gratté pendant l’aspiration, les myoblastes adhéreront à la surface des puits MyoTACTIC, formant de nouveaux points d’ancrage et résultant en myotubes qui ne sont pas alignés sur les deux poteaux (Figure 2c). Des erreurs supplémentaires peuvent également entraîner un remodelage aberrant de hMMT, comme le montre la figure 2d-f. La vitalité cellulaire après l’ensemencement peut également être évaluée à l’aide de tests de coloration à base de calcéine / propidium iodure. Lorsque ces erreurs techniques sont évitées, les hMMT sont remplis par un lit de myotubes alignés et multinucléés qui s’étendent sur toute la longueur de chaque hMMT(Figure 2g). Les myotubes sont de taille assez uniforme sur toute leur longueur et entre différents hMMT (Figure 2h-i). Les myotubes sont caractérisés par la présence de stries de sarcomères qui sont visualisées par immunocoloration pour les α sarcomériques - actinine (SAA; Figure 2h).
Les propriétés fonctionnelles peuvent également être examinées dans les hMMT à partir d’environ 7 jours de différenciation. Le dispositif expérimental mis en place pour compléter ces études fonctionnelles est illustré à la figure 3a. La configuration de la microscopie est représentée sur le dessus d’une table de vibraplane; toutefois, cela n’est pas nécessaire pour effectuer des enquêtes fonctionnelles. Dans les études fonctionnelles, les électrodes générées comme décrit dans la section de stimulation électrique du protocole sont insérées dans le PDMS, de sorte que les électrodes résident derrière les poteaux. Il est important d’avoir une bonne visualisation de la région du poteau avant d’insérer l’électrode, car la nécessité de réinsérer peut entraîner le déplacement du tissu du poteau. Une bonne insertion des électrodes est également importante pour obtenir une mise au point nette du poteau afin que la post-déviation puisse ensuite être suivie avec le script python. La figure 3b montre un déplacement représentatif du poteau de la plaque de puits MyoTACTIC en réponse à une stimulation électrique hMMT de basse fréquence (contraction, 0,5 Hz) et élevée (tétanos, 20 Hz). La quantification du post-déplacement peut être utilisée pour calculer la force contractile induite des hMMT (Figure 3c). Lorsque ces informations sont combinées avec la section transversale hMMT, une force spécifique peut être déterminée30. De plus, les transitoires calciques jouent un rôle important dans la contraction musculaire. La transduction stable des myoblastes des muscles squelettiques avec un indicateur de calcium génétiquement codé tel que GCaMP612,30,33,34, permet une surveillance en direct des transitoires de calcium12,30,34. Les transitoires calciques ont été analysés à l’aide de la configuration de stimulation électrique décrite ci-dessus jusqu’à stimuler les hMMT du jour 12 générés avec des myoblastes immortalisés exprimant le rapporteur MHCK7-GCAMP6(Figure 4a),et quantifiés comme intensité fluorescente maximale moyenne lors d’une stimulation électrique à basse fréquence (contraction, 0,5 Hz) et élevée (tétanos, 20 Hz)(Figure 4b). Il est observé que les propriétés de manipulation du calcium hMMT mesurées dans différentes expériences sont relativement cohérentes(figure 4b). Les méthodes de quantification pour la post-déviation et la manipulation du calcium sont décrites dans la vidéo supplémentaire 1 et la vidéo supplémentaire 2.
Figure 1: Préparation de la plaque PDMS myotactique avant l’ensemencement hMMT. La plate-forme à 96 puits appelée MyoTACTIC est fabriquée en durcissant d’abord le polydiméthylsiloxane (PDMS) dans un moule en polyuréthane négatif (PU). La plate-forme de culture basée sur PDMS est ensuite soigneusement décollée du moule PU négatif. Dans un cadre académique, le dispositif PDMS est ensuite découpé en unités plus petites contenant 6 ± 2 puits fonctionnels. Ces puits sont ensuite placés dans une poche de stérilisation, autoclavés et stockés jusqu’à utilisation. Jusqu’à un jour avant utilisation, le nombre souhaité de portions de l’appareil est placé dans une plaque de culture de 10 cm et Pluronic F-127 est ajouté à chaque puits. Le couvercle du plat de 10 cm est ajouté, le bord est scellé avec un parafilm avant d’incuber la plaque à 4° pendant 2-24 h. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2: MyoTACTIC soutient l’auto-organisation hMMT et la formation de myotubes alignés. (a) (haut) Chronologie schématique de l’auto-organisation hMMT et de la maturation ultérieure des myotubes sur une période de culture de 14 jours. (en bas) Images représentatives à contraste de phase 4x pour illustrer la cinétique de l’auto-organisation des myoblastes immortalisés à travers les deux poteaux verticaux qui aboutissent à la formation d’un hMMT 3D. Barre d’échelle, 500 μm. (b-f) Images représentatives 4x contraste de phase des hMMT au jour 12 de la différenciation montrant les résultats hMMT causés par (b) une bulle dans la cellule - ECM au moment de l’ensemencement (flèche rouge pointe vers la bulle induire des dommages hMMT), (c) aspiration incorrecte du revêtement de solution Pluronic F-127, et (d-f ) Sur-remodelage hMMT qui peut signaler une gélification ECM incorrecte, un manque d’activité ACA dans les milieux de culture, des soins inappropriés de la lignée parentale myoblastique, etc. Barre d’échelle, 500 μm. (g) Image confocale carrelée et aplatie représentative d’un jour 12 hMMT prise à un grossissement de 10x. Les hMMT sont fixés directement dans le moule PDMS, puis soigneusement retirés et placés dans une plaque de culture de 96 puits pour la coloration. Sarcomérique α-actinine (SAA) montré en magenta, et Hoechst 33342 contre-tache nucléaire montré encyan. Barre d’échelle, 500 μm. (h) Image confocale représentative d’un jour 12 hMMT à un grossissement de 40x. Les myotubes et les noyaux hMMT sont visualisés par immunocoloration pour saa (magenta) et contre-coloration avec Hoechst 33342 (cyan). Barre d’échelle, 50 μm. (i) Graphique à points du diamètre moyen du myotube hMMT au jour 12 de la différenciation. Les valeurs sont rapportées comme moyennes ± SEM. n = 8 hMMT de 3 répliques biologiques, distinguées par des formes de symboles, où un minimum de 30 myotubes par hMMT sont analysés. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3: Mesure in situ de la force contractile au sein de la plateforme MyoTACTIC. (a) Représentation de la disposition de stimulation électrique (à gauche). Bien qu’illustré dans cette configuration, une table vibraplane n’est pas nécessaire. Une caméra et une monture de smartphone ont été équipées à l’oculaire d’un microscope inversé équipé d’une lampe à fluorescence pour les enregistrements vidéo des post-déplacements de stimulation électrique hMMT (à gauche). Les aiguilles 25 G ont été enveloppées de fils de cuivre enduits d’étain (en bas à droite), connectées à un câble de connecteur BNC vers alligator clip (en haut à droite) et ont été fixées à un générateur de forme d’onde arbitraire. Le placement des électrodes pendant la stimulation électrique est indiqué en bas à droite. b)Instantanés représentatifs tirés de vidéos post-déviation acquises auprès des hMMT au jour 12 de la différenciation. Les vidéos ont été capturées à un grossissement de 10x. Les lignes verticales blanches pleines montrent le placement des poteaux lorsque les hMMT sont détendus, tandis que les lignes verticales blanches pointillées montrent le déplacement après une stimulation de fréquence élevée (tétanos 20 Hz) ou basse (0,5 Hz). Barre d’échelle, 100 μm. (c) Graphique à points de la contraction moyenne de la contraction hMMT (0,5 Hz) et de la force contractile induite par le tétanos (20 Hz) au jour 12 de la différenciation. Les valeurs sont rapportées comme moyennes ± SEM. n = 9 hMMT à partir de 3 répliques biologiques, distinguées par des formes de symboles. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4: Mesure in situ de la manipulation du calcium au sein de la plateforme MyoTACTIC. ( a ) Images représentatives d’un enregistrement vidéo à grossissement 4x de transitoires spontanés GCaMP6+ calcium et transitoires calciques en réponse àunestimulation électrique à basse fréquence (contraction des contractions, 0,5 Hz) et élevée (contraction du tétanos, 20 Hz). Les hMMT sont soulignés par une ligne jaune pointillée. Barre d’échelle, 200 μm. (b) Graphique à points montrant la quantification de l’intensité fluorescente maximale moyenne par hMMT après une stimulation électrique à basse fréquence (contraction des contractions, 0,5 Hz) et élevée (contraction du tétanos, 20 Hz). Les valeurs sont rapportées comme moyennes ± SEM. n = 9 hMMT à partir de 3 répliques biologiques, distinguées par des formes de symboles. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Vidéo supplémentaire 1 : Démonstration de méthodes d’analyse des données post-déviation. Une vidéo représentative de l’analyse post-déviation au jour 12 de la différenciation suivie par le script personnalisé pendant la stimulation du tétanos. Tout d’abord, la taille du retour sur investissement est sélectionnée directement dans le script de suivi de publication. Ensuite, la vidéo est ouverte en sélectionnant le bouton de lecture pour exécuter le script. Une zone focalisée nette de la publication est sélectionnée comme retour sur investissement et la boîte de suivi bleue de la publication est placée. Entrez est enfoncé pour verrouiller le retour sur investissement et appuyé à nouveau pour exécuter le script. « y » est entré en réponse à l’invite « Vidéo de contraction multiple? [O/N] », puis 'n' est entré en réponse à l’invite « Exporter les emplacements de publication en tant que fichier .csv? [O/N] ». La post-déviation en tant que déplacement relatif en pixels est la sortie finale. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette vidéo.
Vidéo supplémentaire 2 : Démonstration de méthodes d’analyse des données sur les transitoires de calcium GCaMP6. Une vidéo représentative de l’analyse de la manipulation du calcium par épifluorescence au jour 12 de la différenciation pendant la stimulation du tétanos. Tout d’abord, une vidéo des transitoires de calcium (enregistrée sous forme d’une série d’images tiff) a été ouverte dans ImageJ et l’utilisateur a navigué à travers les images jusqu’à ce que le hMMT soit visible. Ensuite, la mesure d’analyse requise « valeur grise moyenne » est confirmée et le hMMT est décrit à l’aide de l’outil de dessin polygonal. Ce contour est enregistré en tant que région d’intérêt et l’intensité fluorescente de chaque tranche vidéo est analysée à l’aide de multi-mesures. Ces mesures sont copiées dans la feuille de calcul « Calcium Handling Template » avec les données de trame et les valeurs de pic transitoire de calcium remplies et confirmées. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette vidéo.
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Discussion
Ce manuscrit décrit des méthodes pour fabriquer et analyser un modèle de culture 3D hMMT qui peut être appliqué à des études de biologie musculaire de base, à la modélisation de maladies ou à des tests de molécules candidates. La plate-forme MyoTACTIC est économique, facile à fabriquer et nécessite un nombre relativement faible de cellules pour produire des microtissus musculaires squelettiques. Les mmTh formés au sein de la plateforme de culture MyoTACTIC sont constitués de myotubes alignés, multinucléés et striés, et répondent aux stimuli électriques en initiant des transitoires calciques qui déclenchent la contraction (Figure 2, Figure 3, Figure 4). Des études antérieures ont montré que les hMMT offrent une réponse similaire aux stimuli biochimiques et peuvent atteindre des niveaux de maturation correspondant à ceux rapportés dans des modèles de muscles squelettiques 3D de plus grand format12,30.
Un thème critique tout au long de la fabrication des plaques MyoTACTIC et de la génération hMMT est de s’assurer que les bulles sont évitées et, si elles se forment, ont été éliminées. Pour faciliter la coulée en une seule étape d’un moule PDMS exploitable, un moule PU avait été généré en aval du moule en plastique initial imprimé en 3D précédemment décrit par Afshar et al.30. Le moule PU qui a été généré permet aux utilisateurs de produire une empreinte de 96 puits de moule PDMS dans laquelle un maximum de 96 puits sont fonctionnels (contiennent deux poteaux), comme le dicte l’étape de fabrication du moule PU. Lors de la fabrication de la plaque PDMS MyoTACTIC, les nouveaux utilisateurs manquent souvent de plus petites bulles qui restent dans le PDMS liquide, même après le dégazage. Les bulles qui se localisent dans les régions du moule PU correspondant aux structures de poteau flexibles d’ancrage entraîneront une rupture après la séparation du moule PU de la plaque de culture PDMS et, ce faisant, laisseront derrière elles un petit morceau de PDMS durci dans le moule PU. L’air comprimé peut être utilisé pour éliminer ces restes de PDMS durcis, et le fait de ne pas le faire réduira efficacement le nombre de puits fonctionnels disponibles pour les futures pièces moulées sur plaques. Par conséquent, il est essentiel de s’assurer que toutes les bulles ont été enlevées avant que la plaque PDMS ne soit durcie, car l’un des avantages de cette plate-forme est qu’il s’agit d’un dispositif autonome, dans lequel toutes les caractéristiques de la plaque sont coulées en une seule étape plutôt que d’exiger que chaque point d’ancrage de microtissue individuel soit introduit manuellement dans les puits de culture35, 36,37. La plupart des études de laboratoire universitaires ne nécessitent pas une plaque de culture MyoTACTIC entière. Pour maximiser l’utilisation de chaque plaque PMDS, elle est découpée manuellement en groupes de 6 ± 2 puits myoctactiques. Pour améliorer ce processus, un moule PU qui permet aux utilisateurs de peler des unités fonctionnelles de 6 ± 2 puits myotactiques peut éliminer complètement cette étape de coupe de plaque. De plus, de grandes bulles introduites dans la solution d’ECM cellulaire lors du mélange ou pendant la procédure d’ensemencement des tissus nuiront à la formation correcte des tissus. Ces grandes bulles déplacent les cellules de la région occupée par la bulle, ce qui entraîne souvent des hMMT avec des régions avec peu de myotubes qui succomberont au stress contractile et se casseront pendant la stimulation électrique.
Un avantage notable de MyoTACTIC est la capacité de quantifier les propriétés de génération de force active et de manipulation du calcium in situ. Il s’agit d’un défi auquel sont confrontés de nombreux autres systèmes de culture 3D, où l’étude de la force contractile tissulaire 3D est mise en œuvre en tant que test final après le retrait du tissu du dispositif de culture12,37. Par conséquent, MyoTACTIC est bien adapté pour soutenir les études longitudinales, par exemple, comprendre les effets temporels du traitement médicamenteux sur le muscle squelettique. L’une des limites de la méthode décrite ici pour quantifier in situ les propriétés de génération de force active et de manipulation du calcium est le placement manuel des électrodes, ce qui limite l’utilisation de ce système pour les applications de test de molécules à haute teneur. Une solution possible serait de concevoir un couvercle transparent d’électrodes mis en place comme un circuit parallèle qui peut être directement inséré dans un ensemble standardisé de puits fonctionnels permettant la stimulation électrique de plusieurs tissus à la fois. Alternativement, l’utilisation d’une lignée cellulaire progénitrice myogénique exprimant de manière stable une construction de channelrhodopsine permettrait la dépolarisation de la membrane cellulaire musculaire et, par conséquent, la contraction tissulaire induite par l’exposition à la lumière bleue. De plus, la force active est capturée dans les vidéos car la post-déviation et la quantification de la force contractile active peuvent être effectuées de manière impartiale en utilisant un script python semi-automatisé personnalisé pour suivre la post-déviation dans de courtes vidéos. Par conséquent, une évaluation longitudinale impartiale de la force contractile stimulée est rendue possible par MyoTACTIC30. Pour améliorer l’efficacité de l’analyse des données, les applications pour smartphones conçues pour mesurer la force tout en capturant simultanément des vidéos de post-déviation sont idéales pour augmenter le débit.
Enfin, la valeur de cette plate-forme a également été décrite précédemment dans sa capacité à prédire avec précision la réponse aux médicaments. À l’instar des résultats cliniques, nous avons précédemment rapporté que le traitement des hMMT (fabriqués avec des myoblastes primaires) avec des composés myotoxiques (dexaméthasone, cérivastatine) induisait une atrophie myotubeuse et diminuait la force contractile active30. De plus, la valeur prédictive des hMMT générés par MyoTACTIC a été validée en montrant qu’une dose cliniquement pertinente d’un agent chimiothérapeutique utilisé pour traiter le cancer du pancréas, une maladie souvent associée à la cachexie2,réduisait significativement la qualité de la hMMT et la force contractile30. Par conséquent, la fabrication simple de MyoTACTIC et sa facilité d’utilisation dans la génération de hMMT 3D présentent de nombreux avantages pour la capture de données à haut contenu, comme en témoigne sa fiabilité en ce qui concerne les sorties structurelles et fonctionnelles. Une limitation générale des dispositifs de culture cellulaire à base de PDMS est que le PDMS adsorbe les protéines. La méthode décrite ici utilise des milieux de culture contenant du sérum, qui surmontent cette limitation en servant à « bloquer » le dispositif et à permettre d’observer les effets des traitements moléculaires et médicamenteux. Cependant, en raison de cette limitation, des conclusions définitives sur les doses de molécules doivent être évitées et les courbes dose-réponse sont encouragées. Inversement, cette plate-forme ne convient pas à la culture de microtissues sans sérum car les additifs s’adsorbent sur le PDMS, entravant ainsi la santé et le développement des tissus. À l’avenir, l’intégration de techniques telles que la bio-impression 3D et/ou la manipulation automatisée de liquides améliorera le débit dans la fabrication de cultures hMMT.
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Disclosures
Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à déclarer.
Acknowledgments
Nous tenons à remercier Mohammad Afshar, Haben Abraha, Mohsen Afshar-Bakooshli et Sadegh Davoudi d’avoir contribué à l’invention de la plateforme de culture MyoTACTIC et d’avoir établi les méthodes de fabrication et d’analyse décrites ici. HL a reçu un financement d’un programme de formation en génie du Conseil de recherches en sciences naturelles et en génie (CRSNG) en génie et en entrepreneuriat d’organes sur puce et d’une bourse d’études supérieures Wildcat de l’Université de Toronto. PMG est titulaire de la Chaire de recherche du Canada en réparation endogène et a reçu le soutien de l’Institut ontarien de médecine régénérative, du Réseau de cellules souches et de Medicine by Design, un programme d’excellence en recherche Canada First. Des diagrammes schématiques ont été créés avec BioRender.com.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.9% Saline Solution, Sterile | House Brand | 1010 | 10 mL aliquots of the solution are made and stored at 4°C |
| 25G Needle | BD, Medstore, University of Toronto | 2548-CABD305127 | |
| 6-Aminocaproic Acid, ≥99% (titration), Powder | Sigma - Aldrich | A2504-100G | A 50 mg / mL stock solution is generated by dissolving 5 mg of 6-aminocaproic acid powder in 100 mL of autoclaved, distilled water. The solution is vaccum filtered and 10 mL aliquots are stored at 4°C |
| 6.35 mm ID Tubing | VWR | 60985-528 | |
| AB1167 Myoblast Cell Line | Institut de Myologie (Paris, France) | ||
| Arbitrary Waveform Generator | Rigol | DG1022Z | |
| Basement Membrane Extract (Geltrex) | Thermo Fisher Scientific | A14132-02 | Stored as aliquots of 50 µL or 100 µL at -80°C |
| Benchtop Vacuum Chamber | Sigma - Aldrich | D2672 | |
| BNC to Aligator Clip Cable | Ordered from Amazon | ||
| Culture Plastics | Sarstedt | Includes culture plates, serological pipettes, etc | |
| Dimethyl Sulfoxide | Sigma - Aldrich | D8418-250ML | |
| DPBS, Powder, No Calcium, No Magnesium | Thermo Fisher Scientific | 21600069 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) (1X) | Gibco | 11995-065 | This is a high glucose DMEM with L-glutamine and sodium pyruvate |
| Fetal Bovine Serum | Fisher Scientific | 10437028 | |
| Fibrinogen from Bovine Plasma | Sigma - Aldrich | F8630-5G | Aliquots ranging from 7 - 10 mg of fibrinogen powder are made and stored at -20°C |
| Filtropur Syringe Filter, 0.22um Pore Size | Sarstedt | 83.1826.001 | |
| Horse Serum | Gibco | 16050-122 | |
| Human Recombinant Insulin | Sigma - Aldrich | 91077C | Stock solution is 100X and made by dissolving 1 mg of human recombinant insulin in 1 mL of DMEM and 1 µL of NaOH 10N. Solution is filtered and stored as 1 mL aliquots at 4°C |
| Image Acquisition Software | Olympus | cellSens Dimension | |
| Image Processing Software | National Institutes of Health | ImageJ | |
| Isotemp Oven | Thermo Fisher Scientific | 201 | |
| Microscope | Olympus | IX83 | |
| Microscope - Camera Mount | Labcam | Labcam for iPhone | Ordered from Amazon |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140-122 | |
| Plastic Disposable Syringes, 1cc | BD | 2606-309659 | |
| Plastic Disposable Syringes, 50cc | BD | 2612-309653 | |
| Pluronic F-127, Powder, BioReagent | Sigma - Aldrich | P2443-250G | A 5% stock solution of pluronic acid is made by dissolving 5 g of pluronic acid powder in 100 mL of chilled, autoclaved, distilled water. The solution is vaccum filtered and 10 mL aliquots are stored at 4°C |
| Polydimethylsiloxane (Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit) | Dow | 4019862 | Kits are also available at Thermo Fisher Scientific, Sigma - Aldrich, etc. |
| Polyurethane Negative Mold | In House | ||
| Release Agent | Mann Release Technologies | 200 | |
| Rotary Vane Vacuum Pump | Edwards | A65401906 | |
| Scalpel | Almedic, Medstore, University of Toronto | 2586-M36-0100 | |
| Single Edge Razor Blade | VWR | 55411-050 | |
| Skeletal Muscle Cell Basal Medium | Promocell | C-23260 | 30 mL aliquotes are generated and at stored at 4°C. |
| Skeletal Muscle Cell Growth Medium (Ready-to-use) | Promocell | C-23060 | 42 mL aliquots are generated and stored at 4°C. |
| Smartphone (iPhone) | Apple | SE | |
| Standard Duty Dry Vacuum Pump | Welch | 2546B-01 | |
| Sterilization Bag | Alliance | 211-SCM2 | |
| Thimble | Igege | Ordered from Amazon | |
| Thrombin from human plasma | Sigma - Aldrich | T6884-250UN | 100 units of thrombin is dissolved in 1 mL of a 0.1% BSA solution. 10 µL aliquots are prepared and stored at - 20°C. |
| Tin coated copper wire | Arco | B8871K48 | Ordered from Amazon |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Thermo Scientific | 15250061 | |
| Trypsin-EDTA, 0.25% | Thermo FIsher Scientific | 25200072 | |
| Vacuum Chamber 2 | SP Bel-Art | F42027-0000 |
References
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