Summary
लेख जीभ पर एक इंट्राविटल इमेजिंग खिड़की में माइक्रोफ्लुइडिक्स को एकीकृत करके वीवो में कार्यात्मक स्वाद सेल इमेजिंग के लिए μTongue (माइक्रोफ्लुइडिक्स-ऑन-ए-जीभ) डिवाइस का परिचय देता है।
Abstract
इंट्राविटल फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी एक उपकरण है जो जीवित जानवर में बहुकोशिकीय गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए व्यापक रूप से उपयोग किया जाता है। हालांकि, स्वाद संवेदी अंग में इसका सफलतापूर्वक उपयोग नहीं किया गया है। इंट्राविटल जीभ इमेजिंग विंडो में माइक्रोफ्लुइडिक्स को एकीकृत करके, μTongue कई टैक्ट्स के लिए नियंत्रित जोखिम के तहत वीवो में स्वाद कोशिकाओं की विश्वसनीय कार्यात्मक छवियां प्रदान करता है। इस पत्र में, μTongue प्रणाली का उपयोग करने के लिए एक विस्तृत कदम-दर-कदम प्रक्रिया प्रस्तुत की गई है। पांच उपधाराएं हैं: टैक्टेंट समाधानों की तैयारी, माइक्रोफ्लुइडिक मॉड्यूल की स्थापना, नमूना बढ़ते, कार्यात्मक छवि डेटा प्राप्त करना, और डेटा विश्लेषण। μTongue का उपयोग करते समय उत्पन्न होने वाले व्यावहारिक मुद्दों को हल करने के लिए कुछ सुझाव और तकनीक भी प्रस्तुत की जाती हैं।
Introduction
इंट्राविटल फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप का उपयोग जीवित ऊतकों पर स्पेटियोटेम्परल गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए व्यापक रूप से किया जाता है। शोधकर्ता तेजी से आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड सेंसर विकसित कर रहे हैं जो जैविक प्रक्रियाओं के विशिष्ट और संवेदनशील परिवर्तनों को फ्लोरेसेंस संकेतों में प्रदान करते हैं - जिन्हें फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप का उपयोग करके आसानी से दर्ज किया जा सकता है जो व्यापक रूप से उपलब्ध हैं1,2. यद्यपि कृंतक में अधिकांश आंतरिक अंगों की माइक्रोस्कोप का उपयोग करके जांच की गई है, लेकिन जीभ पर इसका सफल अनुप्रयोग अभी तक सफल नहीं हुआ है3।
स्वाद कोशिकाओं के कैल्शियम इमेजिंग पर पिछले अध्ययनों को जीभ के ऊतकों को पतला-खंडित करके पूर्व वीवो आयोजित किया गया था ताकि परिधि स्वाद प्राप्त किया जा सके4,5,6 या कवकरूप स्वाद प्राप्त करने के लिए स्वाद एपिथेलियम को छीलकर7,8। इन नमूनों की तैयारी अनिवार्य रूप से आक्रामक थी, इस प्रकार नसों के अंतर्मन, पारमेबिलिटी बाधाओं और रक्त परिसंचरण जैसे प्राकृतिक माइक्रोएनवायरमेंट काफी हद तक बेफिक्र थे। पहली इंट्राविटल जीभ इमेजिंग विंडो 2015 में चोई एट अल द्वारा सूचित की गई थी, लेकिन तरल टैक्टेंट उत्तेजनाओं के कारण आंदोलन और ऑप्टिकल कलाकृतियों के कारण विश्वसनीय कार्यात्मक रिकॉर्डिंग प्राप्त नहीं की जा सकतीथी।
हाल ही में, माइक्रोफ्लुइडिक्स-ऑन-ए-जीभ (μTongue)10पेश किया गया था । यह डिवाइस माउस जीभ पर इमेजिंग विंडो के साथ एक माइक्रोफ्लुइडिक सिस्टम को एकीकृत करता है। इमेजिंग अवधि के दौरान टैक्टेंट उत्तेजनाओं के अर्ध-स्थिर-राज्य प्रवाह को प्राप्त करके, तरल गति से कलाकृतियों को कम किया जासकता है (चित्र 1)। इनपुट पोर्ट को मल्टीचैनल प्रेशर कंट्रोलर्स की एक श्रृंखला द्वारा खिलाया जाता है, जबकि आउटपुट पोर्ट एक सिरिंज पंप से जुड़ा होता है, जो ०.३ एमएल/मिन रखता है । इसके अतिरिक्त, टैक्टेंट समाधानों के अपवर्तक सूचकांकों में अंतर के कारण ऑप्टिकल कलाकृतियों को कैल्शियम-असंवेदनशील संकेतक (tdTomato) के साथ-साथ कैल्शियम संकेतक (GCaMP6)11शुरू करने वाले अनुपातमेट्रिक विश्लेषण द्वारा कम किया गया था। इस डिजाइन ने तरल चैनलों के बीच अचानक स्विचिंग के साथ वीवो में स्वाद कोशिकाओं की सूक्ष्म स्थिरता प्रदान की। नतीजतन, μTongue वीवो मेंमाउस स्वाद कलियों के लिए कई टैंट्स की एक विश्वसनीय कार्यात्मक स्क्रीनिंग को लागू करता है।
इस प्रोटोकॉल में, प्रायोगिक प्रक्रियाओं को μTongue का उपयोग करके वीवो में माउस कवकरूप स्वाद कलियों के कैल्शियम इमेजिंग के लिए विस्तार से समझाया जाता है। सबसे पहले, कृत्रिम लार और टैस्टेंट समाधान तैयार करने का वर्णन किया गया है। दूसरा, अर्ध-स्थिर-राज्य प्रवाह को प्राप्त करने के लिए माइक्रोफ्लुइडिक प्रणाली की स्थापना शुरू की गई है । तीसरा, छवि अधिग्रहण की अनुमति देने के लिए μTongue पर माउस जीभ माउंट करने के लिए इस्तेमाल किया प्रक्रियाओं चित्रित कर रहे हैं । अंत में, पार्श्व गति कलाकृतियों और अनुपात धातु के सुधार सहित छवि विश्लेषण के लिए प्रत्येक कदम, निर्दिष्ट है । इस प्रोटोकॉल को माउस सुविधा और दो-फोटॉन माइक्रोस्कोप या समकक्ष उपकरण के साथ किसी भी शोध प्रयोगशाला में आसानी से अनुकूलित किया जा सकता है।
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Protocol
सभी शल्य चिकित्सा प्रक्रियाओं को सुंगक्यानवान विश्वविद्यालय और सियोल राष्ट्रीय विश्वविद्यालय की संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) द्वारा अनुमोदित किया गया था ।
1. समाधान की तैयारी: कृत्रिम लार और टैंट्स
- 2 एमएमएल एनएसीएल, 5 एमएमएम केसीएल को भंग करके कृत्रिम लार तैयार करें, 3 m NaHCO3, 3 mM KHCO3, 0.25 mM CaCl2,0.25 mM MgCl2, 0.12 mM K2HPO4, 0.12 m KH2पीओ4,और 1.8 mM एचसीएल आसुत पानी में (>1 एल), और समाधान के पीएच को 7 (सामग्री की तालिकादेखें)12में समायोजित करें।
- खट्टे जैसे टैंट तैयार करें: 10 एमएमएम साइट्रिक एसिड; नमकीन: 400 mM NaCl, वैकल्पिक रूप से 50 माइक्रोन एमिलोराइड के साथ; मीठा: 40 mm acesulfame कश्मीर; कड़वा: चरण 1.1 में तैयार कृत्रिम लार में चखने वाले रसायन को भंग करके 5 एमएल कुनैन, 5 एमएम डेगानियम और 20 माइक्रोन साइक्लोहेक्सिमाइड का मिश्रण।
2. माइक्रोफ्लुइडिक सिस्टम की तैयारी
नोट: टैस्टेंट को दबाव वाले मल्टीचैनल फ्लूइडिक डिलीवरी सिस्टम (चित्र 1 और सामग्री की तालिका काउल्लेख) का उपयोग करके माउस जीभ में वितरित किया गया था।
- कृत्रिम लार और टैस्टेंट के साथ दबाव प्रवाह परफ्यूजन प्रणाली के जलाशयों को भरें।
- कंप्रेस्ड एयर लाइन को रेग्यूलर इनपुट से कनेक्ट करें और फ्लूइड डिलिवरी सिस्टम में 30 से 50 साई के बीच हवा का दबाव सेट करें ।
- नियामक के उत्पादन दबाव को 0.4 साई में सेट करें और जांचें कि क्या तरल इस दबाव में ट्यूब से बाहर आता है।
- जलाशयों से कई गुना μTongue के इनपुट बंदरगाह को कनेक्ट करें।
- एक सिरिंज पंप के लिए μTongue के उत्पादन बंदरगाह कनेक्ट और स्थिर राज्य की स्थिति स्थापित करने के लिए ~ 300 μL∙min-1 के साथ तरल वापस ले। μTongue के तहत एक फांसी की बूंद की निरंतर मात्रा का निरीक्षण करें। नमूना ऊंचाई के आधार पर सेटिंग पैरामीटर के मूल्य को समायोजित करें।
- संकुचित एयर लाइन को डिस्कनेक्ट करें और प्रोटोकॉल चरण 3 पूरा होने तक सिरिंज पंप को रोक दें।
3. वीवो इमेजिंग(चित्रा 2)में माउस की तैयारी।
नोट: सभी पशु तैयारी एक प्रयोगशाला कार्यक्षेत्र पर aseptic शर्तों के तहत दिन के दौरान किया गया ।
- माउस संज्ञाहरण
- या तो सेक्स का 7 सप्ताह पुराना या पुराना माउस तैयार करें। एक आनुवंशिक रूप से संशोधित माउस लाइन का उपयोग करें जो स्वाद कोशिकाओं में कैल्शियम-संवेदन फ्लोरेसेंस प्रोटीन व्यक्त करता है।
- माउस संज्ञाहरण के लिए रोका जाता है। 100 मिलीग्राम प्रति किलो केटामाइन और 10 मिलीग्राम प्रति किलो जाइलाज़ीन का मिश्रण माउस13में इंट्रापेरिटोनली इंजेक्शन लगाया जाता है ।
- 2.5% डब्ल्यू/वी फॉस्फेट बफर खारा में TRITC-डेक्सट्रान (500 केडीए) को इमेजिंग सत्र के दौरान रक्त परिसंचरण का निरीक्षण करने के लिए रेट्रो-ऑर्बिटल मार्ग के माध्यम से माउस में नसों के माध्यम से प्रशासित किया जाता है।
- आंदोलन कलाकृतियों को कम करने के लिए माउस खोपड़ी पर एक सिर फिक्सर संलग्न करें।
- माउस सिर को 70% एटोह के साथ छिड़काया जाता है जबकि माउस को एक रीढ़ की स्थिति में रखा जाता है। सिर की त्वचा को हल्के से संदंश के साथ उठाएं और कैंची के साथ लगभग 7मिमी 2 से स्निप करें।
- खोपड़ी के चारों ओर बालों को साफ करें, त्वचा के नीचे पेरिओस्टियम को हटा दें, खोपड़ी में एक पल चिपकने वाला लागू करें, और एक अनुकूलित सिर फिक्सर संलग्न करें।
- तत्काल चिपकने वाला कठोर होने के बाद, सिर फिक्सर के चारों ओर दंत गोंद लागू करें और दंत गोंद को जमना करने के लिए नीली रोशनी से रोशन करें।
- माउस जीभ को μTongue की निचली इकाई पर रखें।
- माउस के निचले होंठ को एक पल चिपकने के साथ μTongue की निचली इकाई में संलग्न करें।
- माउस को बोर्ड (चित्रा 1Bमें माउस तैयारी बोर्ड) पर रखें और μTongue की निचली इकाई को पदों पर रखें (चित्रा 1Bमें μTongue होल्ड पोस्ट)। सुनिश्चित करें कि नीचे इकाई के किनारे पर छेद पोस्ट करने के लिए गठबंधन कर रहे हैं।
- बोर्ड पर हेड फिक्सर धारक को माउस हेड फिक्सर कस लें। फिर, माउस सिर और डिवाइस के बीच की दूरी को समायोजित करें। सिर फिक्सर धारक का उपयोग करके माउस सिर को लगभग 45 डिग्री आसानी से घुमाएं। यह प्रक्रिया माइक्रोस्कोप उद्देश्य के साथ माउस नाक के शारीरिक संपर्क को रोकती है।
- प्लास्टिक चिमटी का उपयोग करके माउस जीभ को धीरे-धीरे आकर्षित करें और जीभ के वेंट्रल साइड को μTongue की निचली इकाई के ऊपरी हिस्से में संलग्न करें। फिर, एक गीले कपास झाड़ू के साथ माउस जीभ की सतह पोंछ।
- कृत्रिम लार में कागज का एक टुकड़ा भिगोएं और गीली स्थिति बनाए रखने के लिए इसे माउस जीभ की उजागर सतह पर रखें।
- घुमावदार वाशर को उन पदों पर रखें जो μTongue के नीचे के हिस्से के दोनों सिरों को पकड़ते हैं।
- माउस की तैयारी को माइक्रोस्कोप स्टेज पर रखें। माइक्रोस्कोप उद्देश्य क्षेत्र के अनुमानित केंद्र के तहत उजागर माउस जीभ की स्थिति। सुनिश्चित करें कि मंच की गतिशील सीमा से विचलित न हों। इसके बाद स्टेज पर माउस बोर्ड को शिकंजा कस लें।
- माउस शरीर के नीचे हीटिंग पैड रखें और तापमान को 36.5 डिग्री सेल्सियस-37.5 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखें। एक तापमान सेंसर के साथ माउस शरीर के तापमान की निगरानी करें और तापमान सेंसर से प्रतिक्रिया संकेत का उपयोग करके हीटिंग पैड के तापमान को नियंत्रित करें।
- कागज के एक पतले टुकड़े को मोड़ें और माउस श्वासनली में प्रवेश करने से तरल को रोकने के लिए इसे माउस के मुंह पर रखें।
- माउस जीभ से गीले ऊतक को हटा दें और तैयार μTongue को माउस जीभ पर रखें। जीभ पर एक माइक्रोफ्लुइडिक चैनल डालें और इमेजिंग विंडो के माध्यम से जीभ की सतह का निरीक्षण करने के लिए अपनी स्थिति को समायोजित करें।
- न्यूनतम संपीड़न दबाव के साथ दोनों सिरों पर धीरे-धीरे पंगा लेकर μTongue सुरक्षित करें।
4. इमेजिंग अधिग्रहण
- उपयोग के अग्रिम में 920 एनएम दो फोटॉन लेजर और माइक्रोस्कोप चालू करें।
- माइक्रोस्कोप पर पानी-विसर्जन उद्देश्य (16x, एनए 0.80 या 25x, एनए 1.1) माउंट करें। μTongue की इमेजिंग खिड़की पर आसुत पानी ड्रॉप और उद्देश्य विसर्जित करते हैं।
- कैमरा मोड में, पारा दीपक का उपयोग करके प्रकाश चालू करें और जीभ की सतह को रोशन करें।
- जेड-एक्सिस को समायोजित करके, अनुमानित फोकल प्लेन खोजने के लिए फिलीफॉर्म पैपिली से ऑटोफ्लोरेसेंट सिग्नल खोजें। फिर, एक्स और वाई समायोजन घुंडी का उपयोग कर, एक स्वाद कली का पता लगाएं।
- मल्टीफोटो मोड पर स्विच करें। छवि अधिग्रहण की स्थिति को इस प्रकार निर्धारित करें: उत्तेजन तरंगदैर्ध्य: 920 एनएम; उत्सर्जन फिल्टर सेट: 447/60 एनएम, 525/50 एनएम, और 607/70 एनएम; द्विदिशात्मक रैस्टर स्कैन मोड, फ्रेम आकार: 512 x 512।
- छवि खिड़की के केंद्र पर स्वाद कली जगह करने के लिए एक्स और वाई पदों को समायोजित करें।
- स्वाद कली के बारे में दो तिहाई ऊंचाई पर स्वाद कली आसपास के रक्त वाहिकाओं खोजें। प्रोटोकॉल चरण 3.2 से ट्राइटीसी-डेक्सट्रान (500 केडीए) इंजेक्शन द्वारा रक्त परिसंचरण की कल्पना करें। यदि रक्त प्रवाह मोज़री, तो रक्त प्रवाह की अनुमति देने के लिए फिक्सिंग शिकंजा को थोड़ा ढीला करें।
- जेड-एक्सिस को समायोजित करें और स्वाद कली के जेड-प्लेन को ढूंढें जिसमें पर्याप्त संख्या में स्वाद कोशिकाएं हैं।
- 80 एस के लिए 2-6 हर्ट्ज के साथ कैल्शियम इमेजिंग आगे बढ़ें। इमेजिंग शुरू होने के बाद तरल प्रणाली के जलाशय पर स्विच करके 20 एस का स्वाद समाधान प्रदान करें। स्वाद उत्तेजना के 20 एस के बाद, जलाशय को कृत्रिम लार में वापस स्विच करें।
- अनुक्रमिक इमेजिंग समाप्त होने के बाद, अगले इमेजिंग सत्र के लिए अग्रिम में लगभग 3-4 मिनट तक प्रतीक्षा करें। पिछले इमेजिंग सत्र से टैंट रीमैनेंट को धोने के लिए कृत्रिम लार को माउस जीभ पर प्रवाहित रखें। प्रयोग के डिजाइन के आधार पर, सत्र को आवश्यकतानुसार दोहराएं।
- जब वीवो कैल्शियम इमेजिंग में पूरा हो जाता है, तो आईएसीयूसी प्रक्रिया के अनुसार माउस को इच्छामृत्यु दें। संज्ञाहरण के तहत माउस सीओ 2 कक्ष में बलिदान कियाजाता है।
नोट: एक अंगुली चुटकी पलटा का उपयोग कर संज्ञाहरण की गहराई की जांच करें । एक इमेजिंग सत्र के दौरान, जलाशयों से कृत्रिम लार लगातार प्रदान की जानी चाहिए। यदि μTongue की इमेजिंग खिड़की पर बुलबुले दिखाई देते हैं, तो मजबूत तरल दबाव का उपयोग करके इनपुट या μTongue के उत्पादन के माध्यम से उन्हें धक्का देकर बुलबुले को हटा दें।
5. छवि विश्लेषण(चित्र 3)
- छवि रूपांतरण
- फिजी14 या इसी तरह के इमेज एनालिसिस सॉफ्टवेयर का उपयोग करके कच्ची छवि फ़ाइलों को खोलें।
- एनपीएल बड एनालाइजर कोड का उपयोग करने के लिए छवि फ़ाइल को आरजीबी स्टैक फ़ाइल में परिवर्तित करें।
- इमेज > रंग > स्प्लिट चैनल
- इमेज > चैनलों > रंग और चरण 5.2.1 से छवि का चयन करें।
- इमेज > कलर > स्टैक टू आरजीबी
- छवि पंजीकरण
नोट: डेटा विश्लेषण के लिए कस्टम-लिखित कोड का उपयोग करें। कृपया https://github.com/neurophotonic/Tastebud-analyzer का उल्लेख करें।- Taste_GUI.mनाम का कोड चलाएं ; एनपीएल बड एनालाइजर नाम की जीयूआई विंडो पॉप अप करेगी । ऊपरी-दाएं कोने पर नए विश्लेषण बटन पर क्लिक करें, फिर चरण 5.1 से परिवर्तित छवि लोड करें। लोडेड इमेज से ऊपर फ्रेम रेट सेट करें।
- पंजीकरण के लिए लोडेड छवि पर ब्याज (आरओआई) के क्षेत्र को ड्रा करें। चयनित आरओआई पर डबल क्लिक और एक ऑटो गणना पंजीकरण शुरू हो जाएगा।
- सापेक्ष फ्लोरेसेंस तीव्रता परिवर्तन प्राप्त करें(10 एफ/
- चरण 5.2 से पंजीकृत छवि को स्वचालित रूप से दिखाने के लिए एनपीएल बड एनालाइजर विंडो पर वापस जाएं। अगर यूजर के पास पहले से ही रेग फाइल है तो लोड डाटा बटन पर क्लिक करें और फाइल _reg.tif चुनें।
- सर्कल या पॉलीगॉन बटन पर क्लिक करें और स्वाद कली छवि पर स्वाद सेल के आरओआई की स्थिति।
- यह स्वाद कली छवि के तहत स्वचालित रूप से चयनित स्वाद सेल के कच्चे फ्लोरेसेंस तीव्रता और कैल्शियम ट्रेस (ΤF/F)प्रस्तुत करता है।
- जीयूआई के दाईं ओर कैल्शियम ट्रेस (10एफ/एफ)पेश करने के लिए सेव ट्रेस पर क्लिक करें, जबकि आरओआई को स्वाद कली इमेज पर दिखाया गया है । आरओआई चयन समाप्त होने तक चरण 5.3.2-5.3.4 दोहराएं।
नोट: अंतिम चयनित आरओआई और कैल्शियम ट्रेस को खत्म करने के लिए आरओआई का गलत चयन होने पर डिलीट ट्रेस बटन पर क्लिक करें। - आरओआई चयन समाप्त होने के बाद, नीचे-दाएं कोने पर फ़ाइल का नाम लिखें, और एक .xls प्रारूप के रूप मेंएफ/एफकैल्शियम ट्रेस निर्यात करने के लिए फिनिश बटन पर क्लिक करें, और एक .bmp प्रारूप में आरओआई के साथ टैस बड इमेज।
- कैल्शियम ट्रेस का विश्लेषण
- स्टेप 5.3 से प्राप्त कैल्शियम ट्रेस का विश्लेषण करें। गौर कीजिए कि स्वाद कोशिकाओं ने तब टैक्टेंट पर प्रतिक्रिया व्यक्त की है जब फ्लोरेसेंस तीव्रता टैस्टल के दो मानक विचलन से अधिक बढ़जाती है,जब टैस्टेंट 4 दिया जाता है, और पी-मान0.01 से कम होते हैं, युग्मित या अकर्मित टी-परीक्षण10का उपयोग करते हैं।
- स्वाद सेल को एक उत्तरदाता सेल के रूप में विचार करें, यदि यह तीन परीक्षणों (~ 60%)15में से दो बार से अधिक एक निश्चित टैस्टेंट का जवाब देता है।
- चरण 5.4.1 से प्राप्त व्यक्तिगत कैल्शियम निशान औसत द्वारा प्रतिनिधि कैल्शियम निशान प्राप्त करें।
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Representative Results
एक स्वाद कली छवि प्राप्त करने के लिए पीर्ट-GCaMP6f-tdTomato माउस का उपयोग किया गया था। माउस जीभ की सतह ऑटोफ्लोरेटेंट फिलीफॉर्म पैपिली से ढकी हुई थी। स्वाद कलियों जीभ की सतह पर विरल फैल रहेहै (चित्रा 4A)। स्वाद कली और इसकी संरचना की छवियों को तीन अलग फिल्टर डिटेक्टरों का उपयोग कर प्राप्त किया गया । 607/70 एनएम फिल्टर सेट का उपयोग करते हुए, स्वाद कोशिकाओं से tdTomato संकेत अनुपातमेट्रिक विश्लेषण(चित्रा 4B)के लिए प्राप्त किया गया था । 525/50 एनएम फिल्टर सेट का उपयोग करना, स्वाद कोशिकाओं और रक्त वाहिकाओं है कि स्वाद कली चारों ओर से GCaMP संकेत(चित्रा 4B)का अधिग्रहण किया गया । 447/60 एनएम फिल्टर सेट का उपयोग करना, कोलेजन संयोजी ऊतक, जो संरचनात्मक रूप से स्वाद कली का समर्थन करता है,(चित्रा 4B)का अधिग्रहण किया गया था ।
स्वाद कली और सापेक्ष संरचनाओं की छवियों को प्राप्त करने के बाद, वीवो कैल्शियम इमेजिंग में प्रोटोकॉल का उपयोग करके किया गया था। पीर्ट-जीएएमपी6एफ-टीडीटोमा माउस का उपयोग स्वाद कोशिकाओं(चित्रा 5A)16पर स्क्रीन करने के लिए किया गया था। स्वाद कोशिकाओं ने अपने संबंधित स्वाद उत्तेजनाओं(चित्रा 5B)को बार-बार जवाब दिया। स्वाद कोशिकाओं को टैक्टेंट पर प्रतिक्रिया व्यक्त करने के लिए माना जाता था जब वे प्रोटोकॉल 5.1.4 में प्रस्तुत शर्तों को पूरा करते थे। इस ट्रायल में सेल 2 ने स्वीट और उमामी दोनों ही टैंट्स को जवाब दिया । इसका परिणाम इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी17का उपयोग करके सेलुलर गतिविधि को देखते हुए पिछले शोध के अनुरूप है । सेल 3 ने 400 एमएमएल एनएसीएल और 400 एमएमएम एनएसीएल दोनों को अमिलोराइड के तहत जवाब दिया। यह फंसाता है कि सेल 3 नमकीन स्वाद के जवाब के लिए एक ENaC स्वतंत्र मार्ग का इस्तेमाल किया है । इस प्रयोग में स्वाद कली में खट्टे स्वाद का जवाब देने वाली कोशिका शामिल नहीं थी। स्वाद कोशिकाओं की स्क्रीनिंग स्थिर इमेजिंग स्थितियों के तहत किया गया था, और प्रत्येक स्वाद कोशिका स्वाद का एक अलग प्रकार के लिए एक दोहराने योग्य प्रतिक्रिया दिखाया ।
चित्रा 1:μTongue, एक माइक्रोफ्लुइडिक्स आधारित कार्यात्मक इमेजिंग मंच। (A)दबाव तरल पदार्थ वितरण प्रणाली । (i) द्रवित प्रणाली का दबाव विनियामक बाहरी वायु स्रोत से जुड़ा हुआ है। वायु स्रोत का दबाव नियामक में प्रवेश करने से पहले 30-50 साई के बीच समायोजित किया जाता है। 2 नियामक से वायु दबाव लगभग 04 साई है। (iii) कृत्रिम लार और विभिन्न स्वाद समाधानों वाले जलाशय वायु दाब विनियामक के उत्पादन से जुड़े होते हैं। (iv) प्रत्येक जलाशय कई गुना से एकाग्र होता है जो μTongue के इनपुट बंदरगाह से जुड़ा हुआ है । (v) एक सिरिंज पंप μtongue के उत्पादन से जुड़ा हुआ है और प्रवाह को नियंत्रित करता है । (ख)μTongue, एक माइक्रोफ्लुइडिक्स आधारित कार्यात्मक इमेजिंग मंच । प्रत्येक भाग का नाम आंकड़ा में निर्दिष्ट किया गया है। (i) माउस तैयारी बोर्ड। 2 फ्लूइड सिस्टम सेटअप बोर्ड। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्र 2:माउस तैयार करने का अनुक्रमिक विवरण। माउस तैयार करने में महत्वपूर्ण कदम दिखाए गए हैं। (ए)ट्राइटीसी-डेक्सट्रान का रेट्रो-ऑर्बिटल इंजेक्शन। (ख)माउस खोपड़ी के लिए एक सिर फिक्सर के लगाव की प्रक्रिया को दिखाया गया है । सिर की त्वचा और पेरिओस्टियम को साफ कर दिया जाता है। चिपकने वाला गोंद और दंत गोंद लगाव के लिए उपयोग किया जाता है। (ग)माउस खोपड़ी पर सिर फिक्सर माउस तैयारी बोर्ड पर खराब कर दिया है । (घ)μTongue की निचली इकाई पर एक जीभ बढ़ते की प्रक्रिया । जीभ निर्धारण के लिए एक पल चिपकने वाला प्रयोग किया जाता है। जीभ को गीले सूती झाड़ू का उपयोग करके साफ किया जाता है और सूखापन को रोकने के लिए गीले कागज के ऊतकों से ढका जाता है। (ई)घुमावदार वाशर μTongue के नीचे इकाई के दोनों सिरों पर लागू कर रहे हैं । (च)मुड़ कागज ऊतक का एक टुकड़ा माउस मौखिक गुहा में रखा जाता है। (जी)माउस तैयारी बोर्ड माइक्रोस्कोप चरण पर घुड़सवार है और स्थिर इमेजिंग की स्थिति सुनिश्चित करने के लिए कसकर खराब कर दिया है । (ज)μTongue जीभ पर रखा गया है। इमेजिंग विंडो पर एक ऑब्जेक्टिव लेंस समायोजित किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्र 3:छवि विश्लेषण। (A)एक आरजीबी छवि प्रत्येक एकल रंग छवि से परिवर्तित किया जाता है । स्केल बार, 10 माइक्रोन(ख)इमेज रजिस्ट्रेशन एक संचालित कस्टम कोड का उपयोग करके। (C)कस्टम कोड का जीयूआई। (i) फ्रेम दर के लिए इनपुट स्थान। डिफॉल्ट फ्रेम रेट 016 एस/फ्रेम है। (ii) आरओआई को आकर्षित करने के लिए बटन। 3 जिस क्षेत्र में लोडेड इमेज दिखाई जाती है। 4 चयनित आरओआई के कैल्शियम सिग्नल को ग्रीन ट्रेस के रूप में दिखाया गया है, जबकि चयनित आरओआई के कैल्शियम-असंवेदनशील संकेत को रेड ट्रेस के रूप में दिखाया गया है। (v) रेशियोमेट्रिक एनालिसिस औरएफ/एफकी गणना अपने आप की जाती है । एमेंटा मेंएफ/एफग्राफ प्रस्तुत किया गया है । (vi) इमेज लोडिंग के लिए बटन। नया विश्लेषण आरजीबी परिवर्तित छवि लोड करने के लिए है। लोड डेटा एक छवि लोड करने के लिए है जो पहले से ही पंजीकरण कर चुका है। 7 सेव ट्रेस बटन आठवीं में चयनित एफ/एफग्राफ और आरओआई को रखना है। डिलीट ट्रेस बटन आठवीं सेएफ/एफग्राफ को हटाना है। (viii) सेव किए गए कैल्शियम के निशान दिखाए जाते हैं। (ix) फाइल नाम भरने के लिए क्षेत्र। फिनिश बटन डेटा निकालने और कोड की एक ही निर्देशिका में उन्हें बचाने के लिए है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्र 4:माउस जीभ की सतह और कवकरूप पैपिली में स्वाद की कली। (क)माउस जीभ की सतह एक बड़े क्षेत्र में कैप्चर की जाती है। एक स्वाद कली केराटिनाइज्ड फिलीफॉर्म पैपिली, और कोलेजन संरचना दिखाई जाती है। प्रत्येक संरचना को विभिन्न रंगों का उपयोग करके इंगित किया जाता है: क्रमशः मैजेंटा, पीला और हरा। स्केल बार, 100 माइक्रोन (बी)एक स्वाद कली(ए)को तीन अलग-अलग उत्सर्जन फिल्टर डिटेक्टरों का उपयोग करके बढ़ाया जाता है और कैप्चर किया जाता है। फिलीफॉर्म पैपिली, पीले रंग में, एक 525/50 एनएम डिटेक्टर का उपयोग कर कब्जा कर लिया जाता है । यह संरचना जीभ की सतह से ~ 25 माइक्रोन तक गहराई में देखी जाती है। लाल रंग में हरे और tdTomato संकेतों में GCaMP संकेत स्वाद कोशिकाओं का प्रतिनिधित्व करते हैं। इन संकेतों का पता क्रमश 525/50 और 607/70 एनएम डिटेक्टरों द्वारा लगाया जाता है। रक्त परिसंचरण का प्रतिनिधित्व करने वाले रोडामाइन डेक्सट्रान को 525/50 और 607/70 एनएम डिटेक्टरों दोनों पर कब्जा कर लिया गया है । सियान ब्लू में दिखाई गई कोलेजन संरचना 447/60 एनएम डिटेक्टरों द्वारा अधिग्रहीत की जाती है। अंतिम चित्र सभी पिछले छवियों को मिला दिखाता है। स्केल बार, 20 माइक्रोन । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 5: वीवो में एक Pirt-GCaMP6f-tdTomato माउस की स्वाद स्क्रीनिंग ।(A)पीरट-GCaMP6f-tdTomato माउस का एक प्रतिनिधि स्वाद कली । छवि को तीव्रता-आधारित छद्म रंग के रूप में दिखाया गया है। धराशायी रेखाएं प्रत्येक स्वाद कोशिका का सीमांकन करें। प्रत्येक स्वाद कोशिका की चमक फ्लोरोसेंट प्रोटीन की अभिव्यक्ति और स्वाद सेल स्थान की गहराई पर निर्भर करती है। स्केल बार, 10 माइक्रोन (ख)पांच बुनियादी स्वाद उत्तेजनाओं के लिए प्रत्येक स्वाद कोशिका का कैल्शियम ट्रेस। हर दोहराया परीक्षण पीठ पर ग्रे में दिखाया गया है और औसत ट्रेस प्रत्येक परीक्षण के ऊपर प्रस्तुत किया जाता है । रंगीन निशान को उत्तरदायी के रूप में परिभाषित किया गया है जबकि काले निशान को गैर-उत्तरदायी के रूप में परिभाषित किया गया है। प्रत्येक रंग एक अलग स्वाद का प्रतिनिधित्व करता है। नमकीन (एल) कम नमकीन का प्रतिनिधित्व करता है, 400 mm NaCl और 50 μM amiloride स्वाद उत्तेजना के लिए इस्तेमाल के मिश्रण के साथ। नमकीन (एच) उच्च नमकीन का प्रतिनिधित्व करता है, जिसमें उत्तेजना के लिए उपयोग किए जाने वाले 400 एमएमएल एनएसीएल हैं। स्वाद उत्तेजना प्रत्येक कैल्शियम ट्रेस के पीछे एक ग्रे बॉक्स के रूप में दिखाया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
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Discussion
यहां वर्णित वीवो मेंस्वाद कोशिकाओं की कार्यात्मक गतिविधियों की जांच के लिए μTongue लागू करने के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल है । इस प्रोटोकॉल में, आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड कैल्शियम संकेतकों का उपयोग करके स्वाद कोशिकाओं पर कार्यात्मक इमेजिंग की जाती है। ट्रांसजेनिक चूहों के उपयोग के अलावा, स्वाद कोशिकाओं पर कैल्शियम रंगों (या वोल्टेज संवेदन रंगों) की इलेक्ट्रोफोरेटिक लोडिंग एक वैकल्पिक विकल्प हो सकता है।
इस प्रयोग में अपवर्तक सूचकांक के 1.336 से कम सभी स्वाद समाधानों का उपयोग किया गया था। यद्यपि μTongue एक स्थिर तरल वितरण प्रदान करता है और अनुपातमेट्रिक विश्लेषण इमेजिंग कलाकृतियों को सुधारता है, शोधकर्ताओं के लिए 1.338 में अपवर्तक सूचकांक के साथ टैक्टेंट (जैसे, >100 m सुक्रोज) की उच्च एकाग्रता का उपयोग करना चुनौतीपूर्ण होगा। कृत्रिम लार और स्वाद समाधान के बीच अपवर्तक सूचकांक में बड़ा अंतर छवि के बाद की प्रक्रिया द्वारा मुआवजे की सीमा से अधिक छवि फोकल विमान पाली । अनुभवजन्य रूप से, स्वाद समाधान के अपवर्तक सूचकांक की एक निश्चित श्रृंखला (1.336 से कम) जो वास्तविक समय में स्थिर सेलुलर इमेजिंग की अनुमति देती है।
फ्लोरेसेंस इमेजिंग और पशु हैंडलिंग में अनुभवी शोधकर्ताओं के लिए, इस प्रोटोकॉल को दोहराया अभ्यास पर आसानी से सीखा जा सकता है । हालांकि, इसमें महत्वपूर्ण कदम होते हैं, जो अक्सर सफल डेटा अधिग्रहण में बाधा डालते हैं। सबसे पहले, एक बार मौखिक सभ्यता से बाहरी होने के बाद, प्राकृतिक म्यूकोसल माइक्रोएनवायरमेंट को संरक्षित करने के लिए जीभ को कृत्रिम लार के साथ नम रखा जाना चाहिए। दूसरा, ऑक्सीजन, पोषक तत्वों और रक्त जनित कारकों की शारीरिक आपूर्ति बनाए रखने के लिए स्वाद कली के आसपास रक्त परिसंचरण बरकरार होना चाहिए।
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Disclosures
लेखक प्रतिस्पर्धी वित्तीय हितों की घोषणा करते हैं: जे हान और एम चोई इस लेख में वर्णित पेटेंट μTongue प्रौद्योगिकी के आविष्कारक हैं, और μTongue प्रणाली SciTech कोरिया के माध्यम से व्यावसायिक रूप से उपलब्ध है।
Acknowledgments
इस काम को कोरिया सरकार (एमएसआईटी) (नहीं) द्वारा वित्त पोषित नेशनल रिसर्च फाउंडेशन ऑफ कोरिया (एनआरएफ) ग्रांट इंस्टीट्यूट ऑफ बेसिक साइंस (आईबीएस-आर015-डी1) ने समर्थन दिया । 2019M3A9E2061789), और कोरिया सरकार (MSIT) (No. 2019M3E5D2A01058329) द्वारा वित्त पोषित कोरिया के राष्ट्रीय अनुसंधान फाउंडेशन (एनआरएफ) अनुदान द्वारा। हम यूनू किम और यूजीन ली की तकनीकी सहायता के लिए आभारी हैं ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| acesulfame K | Sigma Aldrich | 04054-25G | Artificial saliva / tastant |
| calcium chloride solution | Sigma Aldrich | 21115-100ML | Artificial saliva / tastant |
| citric acid | Sigma Aldrich | C0759-100G | Artificial saliva / tastant |
| cycloheximide | Sigma Aldrich | 01810-5G | Artificial saliva / tastant |
| denatonium | Sigma Aldrich | D5765-5G | Artificial saliva / tastant |
| Dental glue | Denkist | P0000CJT-A2 | Animal preparation |
| Image J | NIH | ImageJ | Data analysis |
| IMP | Sigma Aldrich | 57510-5G | Artificial saliva / tastant |
| Instant adhesive | Loctite | Loctite 4161, Henkel | Animal preparation |
| K2HPO4 | Sigma Aldrich | P3786-100G | Artificial saliva / tastant |
| KCl | Sigma Aldrich | P9541-500G | Artificial saliva / tastant |
| Ketamine | Yuhan | Ketamine 50 | Animal preparation |
| KH2PO4 | Sigma Aldrich | P0662-25G | Artificial saliva / tastant |
| KHCO3 | Sigma Aldrich | 237205-500G | Artificial saliva / tastant |
| MATLAB | Mathwork | MATLAB | Data analysis |
| MgCl2 | Sigma Aldrich | M8266-100G | Artificial saliva / tastant |
| MPG | Sigma Aldrich | 49601-100G | Artificial saliva / tastant |
| Mutiphoton microscope | Thorlab | Bergamo II | Microscope |
| NaCl | Sigma Aldrich | S3014-500G | Artificial saliva / tastant |
| NaHCO3 | Sigma Aldrich | 792519-500G | Artificial saliva / tastant |
| Objective | Nikon | N16XLWD-PF | Microscope |
| Octaflow | ALA Scientific Instruments | OCTAFLOW II | Fluidic control |
| PC | LG | Lg15N54 | Fluidic control |
| PH meter | Thermoscientific | ORION STAR AZ11 | Artificial saliva / tastant |
| Phosphate-buffered saline | Sigma Aldrich | 806562 | Artificial saliva / tastant |
| quinine | Sigma Aldrich | Q1125-5G | Artificial saliva / tastant |
| Syringe pump | Havard Apparatus | PHD ULTRA 4400 | Fluidic control |
| TRITC-dextran | Sigma Aldrich | 52194-1G | Animal preparation |
| Ultrafast fiber laser | Toptica | FFultra920 01042 | Microscope |
| Xylazine | Bayer Korea | Rompun | Animal preparation |
References
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