Summary
L'articolo introduce il dispositivo μTongue (microfluidica su una lingua) per l'imaging funzionale delle cellule gustative in vivo integrando la microfluidica in una finestra di imaging intravitale sulla lingua.
Abstract
La microscopia a fluorescenza intravitale è uno strumento ampiamente utilizzato per studiare la dinamica multicellulare in un animale vivo. Tuttavia, non è stato utilizzato con successo nell'organo sensoriale del gusto. Integrando la microfluidica nella finestra di imaging della lingua intravitale, μTongue fornisce immagini funzionali affidabili delle cellule del gusto in vivo sotto esposizione controllata a più detastanti. In questo documento, viene presentata una procedura dettagliata passo-passo per utilizzare il sistema μTongue. Ci sono cinque sottosezioni: preparazione di soluzioni tastant, creazione di un modulo microfluidico, montaggio del campione, acquisizione di dati di immagine funzionali e analisi dei dati. Vengono inoltre presentati alcuni suggerimenti e tecniche per risolvere i problemi pratici che possono sorgere quando si utilizza la μTongue.
Introduction
Il microscopio a fluorescenza intravitale è ampiamente utilizzato per studiare le dinamiche spaziotemporali sui tessuti viventi. I ricercatori stanno rapidamente sviluppando sensori geneticamente codificati che forniscono trasformazioni specifiche e sensibili dei processi biologici in segnali di fluorescenza - che possono essere registrati facilmente utilizzando microscopi a fluorescenza che sono ampiamente disponibili1,2. Sebbene la maggior parte degli organi interni nei roditori siano stati studiati utilizzando il microscopio, la sua applicazione di successo alla lingua non ha ancora avuto successo3.
Precedenti studi sull'imaging del calcio delle cellule del gusto sono stati condotti ex vivo sezionando un tessuto della lingua per ottenere papille gustative circumvallate4,5,6 o staccando l'epitelio gustatico per ottenere papille gustative fungiformi7,8. La preparazione di questi campioni era inevitabilmente invasiva, quindi i microambienti naturali come l'innervazione dei nervi, le barriere di permeabilità e la circolazione sanguigna erano in gran parte perturbati. La prima finestra di imaging della lingua intravitale è stata segnalata nel 2015 da Choi et al., ma una registrazione funzionale affidabile non era raggiungibile a causa del movimento e degli artefatti ottici causati dagli stimoli tastanti fluidici9.
Recentemente, la microfluidica su una lingua (μTongue) è stata introdotta10. Questo dispositivo integra un sistema microfluidico con una finestra di imaging sulla lingua del mouse. Raggiungendo un flusso quasi stazionario di stimoli tastanti per tutto il periodo di imaging, gli artefatti del movimento fluidico potrebbero essere ridotti al minimo (Figura 1). La porta di ingresso è alimentata da una serie di regolatori di pressione multicanale, mentre la porta di uscita è collegata a una pompa a siringa, che mantiene 0,3 ml / min. Inoltre, gli artefatti ottici causati dalla differenza negli indici di rifrazione delle soluzioni tastant sono stati ridotti al minimo dall'analisi quantoometrica introducendo un indicatore insensibile al calcio (tdTomato) e l'indicatore del calcio (GCaMP6)11. Questo design ha fornito la stabilità microscopica delle cellule del gusto in vivo anche con bruschi passaggi tra canali fluidici. Di conseguenza, la μTongue implementa uno screening funzionale affidabile di più degustanti alle papille gustative del topo in vivo.
In questo protocollo, le procedure sperimentali sono spiegate in dettaglio per l'imaging del calcio delle papille gustative fungiformi del topo in vivo usando μTongue. In primo luogo, viene descritta la preparazione di saliva artificiale e soluzioni tastant. In secondo luogo, viene introdotta la creazione del sistema microfluidico per raggiungere il flusso quasi stazionario. In terzo luogo, vengono delineate le procedure utilizzate per montare la linguetta del mouse sulla μTongue per consentire l'acquisizione dell'immagine. Infine, viene specificato ogni passaggio per l'analisi delle immagini, compresa la correzione degli artefatti di movimento laterale e la ratiometria. Questo protocollo può essere adattato facilmente a qualsiasi laboratorio di ricerca con una struttura per topi e un microscopio a due fotoni o apparecchiature equivalenti.
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Protocol
Tutte le procedure chirurgiche sono state approvate dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) della Sungkyunkwan University e della Seoul National University.
1. Preparazione di soluzioni: saliva artificiale e detastanti
- Preparare la saliva artificiale sciogliendo 2 mM NaCl, 5 mM KCl, 3 mM NaHCO3, 3 mM KHCO3, 0,25 mM CaCl2, 0,25 mM MgCl2, 0,12 mM K2HPO4, 0,12 mM KH2PO4e 1,8 mM HCl in acqua distillata (>1 L), e regolare il pH della soluzione a 7 (vedi Tabella dei materiali)12.
- Preparare i tastants, come l'acido acido: 10 mM di acido citrico; salato: 400 mM NaCl, opzionalmente con amiloride da 50 μM; dolce: 40 mM acesulfame K; amaro: una miscela di 5 mM chinino, 5 mM di denatonio e 20 μM di cicloeximide, sciogliendo la sostanza chimica di degustazione nella saliva artificiale preparata nella fase 1.1.
2. Preparazione del sistema microfluidico
NOTA: i tastants sono stati consegnati alla lingua del topo utilizzando un sistema di erogazione fluidica multicanale pressurizzato (fare riferimento alla Figura 1 e alla Tabella dei materiali).
- Riempire i serbatoi del sistema di perfusione a flusso pressurizzato con la saliva artificiale e i detastanti.
- Collegare la linea dell'aria compressa all'ingresso del regolatore e impostare la pressione dell'aria tra 30 e 50 psi nel sistema di erogazione fluidica.
- Impostare la pressione di uscita del regolatore a 0,4 psi e verificare se il liquido esce dal tubo sotto questa pressione.
- Collegare il collettore dai serbatoi alla porta di ingresso di μTongue.
- Collegare la porta di uscita di μTongue a una pompa a siringa e prelevare il liquido con ~300 μL∙min-1 per stabilire la condizione di stato stazionario. Osservare il volume costante di una goccia appesa sotto la μTongue. Regolare il valore del parametro di impostazione in base all'altezza del campione.
- Scollegare la linea dell'aria compressa e arrestare la pompa della siringa fino al completamento della fase 3 del protocollo.
3. Preparazione del mouse per l'imaging in vivo (Figura 2).
NOTA: Tutti i preparati animali sono stati effettuati durante il giorno in condizioni asettiche su un banco di lavoro di laboratorio.
- Anestesia del topo
- Prepara un topo di 7 settimane o più vecchio di entrambi i sessi. Utilizzare una linea di topo geneticamente modificata che esprima proteine di fluorescenza sensibili al calcio nelle cellule del gusto.
- Il topo è trattenuto per l'anestesia. Una miscela di 100 mg/kg di ketamina e 10 mg/kg di xilazina viene iniettata per via intraperitoneale nel topo13.
- TRITC-destrano (500 kDa) in 2,5% W/V fosfato tampone soluzione salina viene somministrato per via endovenosa nel topo attraverso una via retro-orbitale per osservare la circolazione sanguigna durante una sessione di imaging.
- Attaccare un fissatore di testa sul cranio del mouse per ridurre al minimo gli artefatti di movimento.
- La testa del mouse viene spruzzata con il 70% di ETOH mentre il mouse viene posto in posizione supina. Sollevare leggermente la pelle della testa con una pinza e tagliare circa 7 mm2 con le forbici.
- Pulire i capelli intorno al cuoio capelluto, rimuovere il periosteo sotto la pelle, applicare un adesivo istantaneo sul cranio e attaccare un fissatore per la testa personalizzato.
- Dopo che l'adesivo istantaneo è indurito, applicare la colla dentale attorno al fissatore della testa e illuminare con una luce blu per solidificare la colla dentale.
- Posizionare la linguetta del mouse sull'unità inferiore di μTongue.
- Fissare il labbro inferiore del mouse all'unità inferiore di μTongue con un adesivo istantaneo.
- Posizionare il mouse sulla scheda (scheda di preparazione del mouse nella Figura 1B) e posizionare l'unità inferiore della μTongue ai montanti (μTongue hold post in Figura 1B). Assicurarsi che i fori sul bordo dell'unità inferiore siano allineati al palo.
- Stringere il fissatore della testa del mouse al supporto del fissatore della testa sulla scheda. Quindi, regolare la distanza tra la testa del mouse e il dispositivo. Ruotare la testa del mouse senza intoppi di circa 45° utilizzando il supporto del fissatore della testa. Questo processo impedisce il contatto fisico del naso del topo con l'obiettivo del microscopio.
- Disegnare delicatamente la linguetta del mouse usando una pinzetta di plastica e attaccare il lato ventrale della lingua al lato superiore dell'unità inferiore della μTongue. Quindi, pulire la superficie della lingua del topo con un batuffolo di cotone bagnato.
- Immergere un pezzo di carta nella saliva artificiale e posizionarlo sulla superficie esposta della lingua del topo per mantenere una condizione umida.
- Posizionare le rondelle curve sui montanti che contengono entrambe le estremità della parte inferiore di μTongue.
- Posizionare la preparazione del mouse sul palco del microscopio. Posizionare la lingua del topo esposta sotto il centro approssimativo dell'area dell'obiettivo del microscopio. Assicurati di non deviare dalla gamma dinamica dello stage. Quindi, stringere la scheda del mouse sul palco con le viti.
- Posizionare la piastra riscaldante sotto il corpo del mouse e mantenere la temperatura a 36,5 °C-37,5 °C. Monitorare la temperatura corporea del mouse con un sensore di temperatura e controllare la temperatura della piastra riscaldante utilizzando un segnale di feedback dal sensore di temperatura.
- Ruotare un sottile pezzo di carta e posizionarlo alla bocca del mouse per evitare che il liquido penetri nella trachea del mouse.
- Rimuovere il tessuto bagnato dalla lingua del topo e posizionare la μTongue preparata sulla lingua del topo. Metti un canale microfluidico sulla lingua e regola la sua posizione per osservare la superficie della lingua attraverso la finestra di imaging.
- Fissare la μTongue avvitando delicatamente entrambe le estremità con una pressione di compressione minima.
4. Acquisizione di immagini
- Accendere il laser a due fotone da 920 nm e il microscopio prima dell'uso.
- Montare l'obiettivo di immersione in acqua (16x, NA 0,80 o 25x, NA 1,1) sul microscopio. Lascia cadere l'acqua distillata sulla finestra di imaging della μTongue e immergi l'obiettivo.
- In modalità fotocamera, accendi la luce usando la lampada al mercurio e illumina la superficie della lingua.
- Regolando l'asse Z, cerca il segnale autofluorescente dalle papille filiformi per trovare il piano focale approssimativo. Quindi, utilizzando la manopola di regolazione X e Y, individuare una papille gusta mobile.
- Passare alla modalità multifotone. Impostare le condizioni di acquisizione dell'immagine come segue: lunghezza d'onda di eccitazione: 920 nm; set di filtri di emissione: 447/60 nm, 525/50 nm e 607/70 nm; modalità di scansione raster bidirezionale, dimensioni del fotogramma: 512 x 512.
- Regola le posizioni X e Y per posizionare la papille gustaá al centro della finestra dell'immagine.
- Cerca i vasi sanguigni che circondano la papille gusta tra le papille gustative a circa due terzi delle papille gustative. Visualizza la circolazione sanguigna mediante iniezione di TRITC-destrano (500 kDa) dal passo di protocollo 3.2. Se il flusso sanguigno si intasa, allentare leggermente le viti di fissaggio per consentire il flusso sanguigno.
- Regola l'asse Z e trova il piano Z della papille gustativa che contiene un numero adeguato di cellule gustative.
- Procedere con l'imaging del calcio con 2-6 Hz per 80 s. Fornire una soluzione di gusto di 20 s accendendo il serbatoio del sistema fluidico dopo l'avvio dell'imaging. Dopo 20 s di stimolazione del gusto, riportare il serbatoio alla saliva artificiale.
- Al termine dell'imaging sequenziale, attendere circa 3-4 minuti in anticipo fino alla sessione di imaging successiva. Mantenere la saliva artificiale che scorre alla lingua del topo per lavare via il tastant remanent dalla precedente sessione di imaging. A seconda della progettazione dell'esperimento, ripetere la sessione come richiesto.
- Quando l'imaging del calcio in vivo è completo, eutanasizzare il topo secondo la procedura IACUC. Il topo in anestesia viene sacrificato nella camera CO2.
NOTA: Controllare la profondità dell'anestesia utilizzando un riflesso di pizzicamento della dita. Durante una sessione di imaging, la saliva artificiale dai serbatoi deve essere fornita in modo coerente. Se le bolle appaiono nella finestra di imaging della μTongue, rimuovere le bolle spingendole attraverso l'ingresso o l'uscita della μTongue usando una forte pressione del liquido.
5. Analisi delle immagini (Figura 3)
- Conversione di immagini
- Apri i file di immagine raw utilizzando Fiji14 o un software di analisi delle immagini simile.
- Convertire il file di immagine in un file stack RGB per utilizzare il codice NPL Bud Analyzer.
- Immagine > colore > canali divisi
- Image > Color > Merge Channels e selezionare l'immagine dal passaggio 5.2.1.
- Immagine > > a colori in RGB
- Registrazione immagine
NOTA: utilizzare il codice personalizzato per l'analisi dei dati. Si prega di fare riferimento a https://github.com/neurophotonic/Tastebud-analyzer.- Eseguire il nome in codice Taste_GUI.m; verrà visualizzata una finestra GUI denominata NPL Bud Analyzer. Fare clic sul pulsante Nuova analisi nell'angolo in alto a destra, quindi caricare l'immagine convertita dal passaggio 5.1. Impostare la frequenza fotogrammi sopra l'immagine caricata.
- Disegna la regione di interesse (ROI) sull'immagine caricata per la registrazione. Fai doppio clic sul ROI selezionato e inizierà una registrazione calcolata automaticamente.
- Ottenere le relative variazioni diintensità di fluorescenza (ΔF/F)
- Torna alla finestra NPL Bud Analyzer per mostrare automaticamente l'immagine registrata dal passaggio 5.2. Se l'utente dispone già di un file reg, fare clic sul pulsante Carica dati e selezionare il file _reg.tif.
- Fare clic sul pulsante CIRCLE o POLYGON e posizionare il ROI della cella del gusto sull'immagine della pappa gustatica.
- Questo presenta l'intensità di fluorescenza grezza e la traccia di calcio (ΔF/F) della cellula gustatica selezionata automaticamente sotto l'immagine della papille gustatica.
- Clicca su Salva traccia per presentare la traccia di calcio (ΔF/F) sul lato destro della GUI, mentre il ROI viene mostrato sopra l'immagine della papille gustazia. Ripetere i passaggi 5.3.2-5.3.4 fino al termine della selezione del ROI.
NOTA: fare clic sul pulsante Elimina traccia se il ROI è selezionato in modo errate per eliminare l'ultimo ROI selezionato e la traccia di calcio. - Al termine della selezione del ROI, scrivi il nome del file nell'angolo in basso a destra e fai clic sul pulsante Fine per esportare la traccia di calcio ΔF/F come formato .xls e l'immagine del tase bud con ROI in un formato .bmp.
- Analisi della traccia di calcio
- Analizzare la traccia di calcio ottenuta dal passaggio 5.3. Si consideri che le cellule del gusto hanno reagito al tastant quando l'intensità della fluorescenza aumenta di più di due deviazioni standard del basale dopo che il tastant è stato consegnato4e ivalori p sono inferiori a 0,01, utilizzando t-test accoppiati o spaiati10.
- Considera la cellula del gusto come una cellula di risposta, se risponde a un certo tastant più di due volte su tre studi (~ 60%)15.
- Ottenere le tracce di calcio rappresentative facendo la media delle singole tracce di calcio acquisite dal punto 5.4.1.
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Representative Results
Il topo Pirt-GCaMP6f-tdTomato è stato utilizzato per ottenere un'immagine delle papille gustative. La superficie della lingua del topo era ricoperta di papille filiformi autofluorescenti. Le papille gustative sono sparse sulla superficie della lingua (Figura 4A). Le immagini della papille gusta e della sua struttura sono state acquisite utilizzando tre diversi rilevatori di filtri. Utilizzando il set di filtri 607/70 nm, è stato ottenuto il segnale tdTomato dalle cellule del gusto per l'analisi quantoometrica (Figura 4B). Utilizzando il set di filtri da 525/50 nm, è stato acquisito il segnale GCaMP dalle cellule gustative e dai vasi sanguigni che circondano la papille gustaá (Figura 4B). Utilizzando il set di filtri da 447/60 nm, è stato acquisito il tessuto connettivo di collagene, che sostiene strutturalmente la papille gustativa (Figura 4B).
Dopo aver acquisito le immagini della papille gusta e delle relative strutture, è stata eseguita l'imaging del calcio in vivo utilizzando il protocollo. Il mouse Pirt-GCaMP6f-tdTomato è stato utilizzato per lo screening delle cellule del gusto (Figura 5A)16. Le cellule del gusto hanno risposto ripetutamente ai rispettivi stimoli gustatrici (Figura 5B). Si è ritenuto che le cellule del gusto abbiano reagito al tastant quando hanno soddisfatto le condizioni presentate nel protocollo 5.1.4. In questo studio, la cellula 2 ha risposto sia ai tastants dolci che a quello umami. Il risultato è coerente con la ricerca precedente che osservava l'attività cellulare utilizzando l'elettrofisiologia17. La cella 3 ha risposto sia a 400 mM NaCl che a 400 mM NaCl sotto amiloride. Implica che la cellula 3 ha utilizzato un percorso indipendente dall'ENaC per la risposta al gusto salato. La papille gustatica in questo esperimento non includeva una cellula che rispondeva ai sapori aspri. Lo screening delle cellule del gusto è stato effettuato in condizioni di imaging stabili e ogni cellula del gusto ha mostrato una risposta ripetibile a un tipo distinto di gusto.
Figura 1: La μTongue, una piattaforma di imaging funzionale basata sulla microfluidica. (A) Sistema di erogazione fluidica pressurizzata. (i) Il regolatore di pressione del sistema fluidico è collegato alla fonte d'aria esterna. La pressione della sorgente d'aria viene regolata tra 30-50 psi prima di entrare nel regolatore di pressione. (ii) La pressione dell'aria dal regolatore è di circa 0,4 psi. iii) Serbatoi contenenti saliva artificiale e diverse soluzioni gustative sono collegati all'uscita del regolatore di pressione dell'aria. (iv) Ogni serbatoio converge verso un collettore collegato alla porta di ingresso della μTongue. v) Una pompa a siringa è collegata all'uscita della μTongue e controlla il flusso. (B) La μTongue, una piattaforma di imaging funzionale basata sulla microfluidica. Il nome di ogni parte è specificato nella figura. (i) Scheda di preparazione del mouse. (ii) Scheda di configurazione del sistema fluidico. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Descrizione sequenziale della preparazione del topo. Vengono mostrati passaggi importanti nella preparazione del mouse. (A) Iniezione retro-orbitale di TRITC-destrano. (B) Viene mostrato il processo di fissaggio di un fissatore di testa al cranio del topo. La pelle della testa e il periosteo vengono eliminati. La colla adesiva e la colla dentale sono utilizzate per l'attacco. (C) Il fissatore della testa sul cranio del mouse è avvitato sulla scheda di preparazione del mouse. (D) Procedura di montaggio di una linguetta sull'unità inferiore della μTongue. Un adesivo istantaneo viene utilizzato per la fissazione della lingua. La lingua viene pulita con un batuffolo di cotone bagnato e coperta con fazzoletti di carta bagnati per evitare la secchezza. (E) Le rondelle curve sono applicate su entrambe le estremità dell'unità inferiore della μTongue. (F) Un pezzo di carta intrecciata viene posto nella cavità orale del topo. (G) La scheda di preparazione del mouse è montata sullo stadio del microscopio e avvitata saldamente per garantire condizioni di imaging stabili. (H) La μTongue è posta sulla lingua. Una lente dell'obiettivo viene regolata sopra la finestra di imaging. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Analisi delle immagini. (A) Un'immagine RGB viene convertita da ogni immagine a colore singolo. Barra della scala, 10 μm. (B) Registrazione dell'immagine utilizzando un codice personalizzato condotto. (C) GUI del codice personalizzato. (i) Posizione di input per la frequenza dei fotogrammi. La frequenza fotogrammi predefinita è 0,16 s/frame. (ii) Pulsanti per disegnare ROI. (iii) L'area in cui viene mostrata l'immagine caricata. (iv) Il segnale di calcio del ROI selezionato è mostrato come traccia verde, mentre il segnale insensibile al calcio del ROI selezionato è mostrato come traccia rossa. (v) L'analisi quantometrica e ΔF/F sono calcolati automaticamente. Il grafico ΔF/ F è presentato in magenta. (vi) Pulsanti per il caricamento delle immagini. La nuova analisi è per il caricamento di un'immagine convertita RGB. Load Data è per il caricamento di un'immagine che è già stata sottoposta a registrazione. (vii) Il pulsante Salva traccia deve mantenere il grafico ΔF/F e il ROI selezionato a viii. Il pulsante Elimina traccia è per rimuovere il grafico ΔF/F da viii. (viii) Vengono mostrate le tracce di calcio salvate. (ix) Area per compilare il nome del file. Il pulsante Fine consente di estrarre i dati e salvarli nella stessa directory del codice. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: La superficie della lingua del topo e una papilla gustaglia nelle papille fungiformi. (A) La superficie della lingua del topo viene catturata in un grande campo. Una papille filiforme cheratinizzate di papille gustative e la struttura del collagene sono mostrati. Ogni struttura è indicata utilizzando diversi colori: magenta, giallo e verde, rispettivamente. Barra di scala, 100 μm. (B) Una papille gustamica da (A) viene ingrandita e catturata utilizzando tre diversi rilevatori di filtri di emissione. Le papille filiformi, in giallo, vengono catturate utilizzando un rivelatore a 525/50 nm. Questa struttura è osservata dalla superficie stessa della lingua fino a ~ 25 μm di profondità. I segnali GCaMP in verde e i segnali tdTomato in rosso rappresentano le cellule del gusto. Questi segnali vengono rilevati rispettivamente dai rivelatori 525/50 e 607/70 nm. Il destrano di rodamina che rappresenta la circolazione sanguigna viene catturato da entrambi i rivelatori a 525/50 e 607/70 nm. La struttura del collagene mostrata in blu ciano viene acquisita da rivelatori a 447/60 nm. L'ultima immagine mostra tutte le immagini precedenti unite. Barra della scala, 20 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Screening del gusto di un topo Pirt-GCaMP6f-tdTomato in vivo. (A) Una papille gustanzé rappresentativa del topo Pirt-GCaMP6f-tdTomato. L'immagine viene mostrata come uno pseudo-colore basato sull'intensità. Le linee tratteggiate delimitano ogni cellula del gusto. La luminosità di ogni cellula del gusto dipende dall'espressione della proteina fluorescente e dalla profondità della posizione della cellula del gusto. Scala bar, 10 μm. (B) La traccia di calcio di ogni cellula gustatica per i cinque stimoli gustamenti di base. Ogni prova ripetuta è mostrata in grigio sul retro e la traccia media è presentata sopra ogni prova. Le tracce colorate sono definite reattive mentre le tracce nere sono definite come non reattive. Ogni colore rappresenta un gusto diverso. Salty(L) rappresenta un basso contenuto di sale, con una miscela di 400 mM NaCl e 50 μM di amiloride utilizzati per la stimolazione del gusto. Salty(H) rappresenta un alto livello di sale, con 400 mM di NaCl utilizzati per la stimolazione. La stimolazione del gusto è mostrata come una scatola grigia sul retro di ogni traccia di calcio. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Qui è descritto un protocollo dettagliato per applicare μTongue allo studio delle attività funzionali delle cellule del gusto in vivo. In questo protocollo, viene eseguita l'imaging funzionale sulle cellule del gusto utilizzando indicatori di calcio geneticamente codificati. Oltre all'uso di topi transgenici, il carico elettroforetico di coloranti di calcio (o coloranti sensibili alla tensione) sulle cellule del gusto può essere un'opzione alternativa.
In questo esperimento sono state utilizzate tutte le soluzioni di gusto inferiori a 1,336 di indice di rifrazione. Sebbene μTongue fornisca una consegna fluidica stabile e l'analisi ratiometrica migliori gli artefatti di imaging, sarà difficile per i ricercatori utilizzare una concentrazione più elevata di tastant (ad esempio, >100 mM di saccarosio con indice di rifrazione in 1.338). La grande differenza nell'indice di rifrazione tra saliva artificiale e soluzione gustativa sposta il piano focale dell'immagine più dell'intervallo di compensazione mediante il processo post-immagine. Empiricamente, si ottiene un certo intervallo di indice di rifrazione della soluzione del gusto (inferiore a 1.336) che consente un'imaging cellulare stabile in tempo reale.
Per i ricercatori esperti nell'imaging a fluorescenza e nella manipolazione degli animali, questo protocollo può essere appreso facilmente attraverso la pratica ripetuta. Tuttavia, contiene passaggi critici, che spesso impediscono l'acquisizione dei dati di successo. In primo luogo, una volta esternalizzata dalla civiltà orale, la lingua deve essere mantenuta umida con saliva artificiale per preservare il microambiente naturale della mucosa. In secondo luogo, la circolazione sanguigna intorno alla papille gustatica dovrebbe essere intatta, per mantenere un apporto fisiologico di ossigeno, sostanze nutritive e fattori trasmissiti dal sangue.
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Disclosures
Gli autori dichiarano interessi finanziari concorrenti: J. Han e M. Choi sono inventori della tecnologia brevettata μTongue descritta in questo articolo e il sistema μTongue è disponibile in commercio tramite SciTech Korea.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto dall'Institute of Basic Science (IBS-R015-D1), dalla sovvenzione della National Research Foundation of Korea (NRF) finanziata dal governo coreano (MSIT) (n. 2019M3A9E2061789) e dalla sovvenzione della National Research Foundation of Korea (NRF) finanziata dal governo coreano (MSIT) (n. 2019M3E5D2A01058329). Siamo grati a Eunsoo Kim e Eugene Lee per la loro assistenza tecnica.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| acesulfame K | Sigma Aldrich | 04054-25G | Artificial saliva / tastant |
| calcium chloride solution | Sigma Aldrich | 21115-100ML | Artificial saliva / tastant |
| citric acid | Sigma Aldrich | C0759-100G | Artificial saliva / tastant |
| cycloheximide | Sigma Aldrich | 01810-5G | Artificial saliva / tastant |
| denatonium | Sigma Aldrich | D5765-5G | Artificial saliva / tastant |
| Dental glue | Denkist | P0000CJT-A2 | Animal preparation |
| Image J | NIH | ImageJ | Data analysis |
| IMP | Sigma Aldrich | 57510-5G | Artificial saliva / tastant |
| Instant adhesive | Loctite | Loctite 4161, Henkel | Animal preparation |
| K2HPO4 | Sigma Aldrich | P3786-100G | Artificial saliva / tastant |
| KCl | Sigma Aldrich | P9541-500G | Artificial saliva / tastant |
| Ketamine | Yuhan | Ketamine 50 | Animal preparation |
| KH2PO4 | Sigma Aldrich | P0662-25G | Artificial saliva / tastant |
| KHCO3 | Sigma Aldrich | 237205-500G | Artificial saliva / tastant |
| MATLAB | Mathwork | MATLAB | Data analysis |
| MgCl2 | Sigma Aldrich | M8266-100G | Artificial saliva / tastant |
| MPG | Sigma Aldrich | 49601-100G | Artificial saliva / tastant |
| Mutiphoton microscope | Thorlab | Bergamo II | Microscope |
| NaCl | Sigma Aldrich | S3014-500G | Artificial saliva / tastant |
| NaHCO3 | Sigma Aldrich | 792519-500G | Artificial saliva / tastant |
| Objective | Nikon | N16XLWD-PF | Microscope |
| Octaflow | ALA Scientific Instruments | OCTAFLOW II | Fluidic control |
| PC | LG | Lg15N54 | Fluidic control |
| PH meter | Thermoscientific | ORION STAR AZ11 | Artificial saliva / tastant |
| Phosphate-buffered saline | Sigma Aldrich | 806562 | Artificial saliva / tastant |
| quinine | Sigma Aldrich | Q1125-5G | Artificial saliva / tastant |
| Syringe pump | Havard Apparatus | PHD ULTRA 4400 | Fluidic control |
| TRITC-dextran | Sigma Aldrich | 52194-1G | Animal preparation |
| Ultrafast fiber laser | Toptica | FFultra920 01042 | Microscope |
| Xylazine | Bayer Korea | Rompun | Animal preparation |
References
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